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CN100526884C - 病理形式朊病毒蛋白的结合 - Google Patents

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CN100526884C CNB038066904A CN03806690A CN100526884C CN 100526884 C CN100526884 C CN 100526884C CN B038066904 A CNB038066904 A CN B038066904A CN 03806690 A CN03806690 A CN 03806690A CN 100526884 C CN100526884 C CN 100526884C
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Abstract

在正常形式蛋白存在情况下，在选择性结合条件下应用一种聚离子结合剂，选择性地结合感染的聚集形式蛋白，诸如PrP、淀粉状蛋白和τ蛋白，所述结合剂诸如为葡聚糖硫酸酯或戊聚糖(阴离子)，或者为聚胺化合物，诸如pDADMAC(阳离子)，所述选择性结合条件包括在轻度碱性pH下应用n-月桂酰肌氨酸，然后可测定这种感染的聚集形式的蛋白。

Description

病理形式朊病毒蛋白的结合
发明领域
本发明涉及抗蛋白酶结合剂的应用，典型地涉及聚离子物质，诸如聚阴离子物质或聚阳离子物质，聚阴离子物质包括戊聚糖聚硫酸酯、葡聚糖硫酸酯或其它聚阴离子多糖苷，聚阳离子物质包括溴化己二甲胺、polyamidoamine树突状聚合物或聚(氯化二丙烯二甲铵)，任选在选择性条件下俘获病理或劣种形式朊病毒蛋白PrPc，以及类似于聚集的异常形式蛋白的蛋白，此蛋白在正常形式下是不聚集的。
发明背景
朊病毒疾病也称为传染性海绵状脑病或TSEs，仅仅是最近才对它有所认识。牛海绵状脑病(BSE)首次报告于1985年。首例变异CreutzfeldtJakob病(vCJD)报告于1996年。VCJD在人类是一种致命性神经变性疾病，相信它是由消费BSE污染的肉类引起的。在人类，从感染至出现临床症状的潜伏期可为许多年。
朊病毒的唯一识别的组分是PrPSc，它是引起朊病毒疾病的原因，它是一种异常的PrPc同种型(PrPSc也称为PrPres，PrPc也称为PrPSen)。先前已经注意到PrPSc与PrPc不同，因为它是比较抗蛋白酶的。但是最近，发表的文献称存在一种蛋白酶敏感形式的PrPSc，即存在一种感染性PrP，它是蛋白酶敏感的。
此感染的，但蛋白酶敏感的PrPSc可能可以聚集(即本质上是聚集的)，但是尚未聚集，或者至少仅是部分聚集。
除了上下文中指明特定的其中之一的含意外，蛋白酶不敏感和蛋白酶敏感形式的PrPSc及部分蛋白酶消化后留下的PrPSc核心部分(经常在现有技术中被看作是PrP27-30)在此都被认为是PrPSc。另外，名词“聚集蛋白”用以包括聚集的抗蛋白酶PrPSc和其它蛋白的类似形式，以及感染性非聚集或部分聚集形式的PrPSc或其它蛋白，其中可包括最近观察到的蛋白酶敏感感染性PrPSc。
PrPc是一种功能不明的GPI锚定糖蛋白。尽管朊病毒疾病其它一些标志已经提示PrPSc不仅仅是一种必须的朊病毒组分，而且也是这类疾病唯一可靠而普遍接受的标志。
目前受推崇的测定PrPSc存在的方法学是：应用蛋白酶K使样品进行蛋白水解，此过程持续足够的时间，以破坏PrPc，然后通过一种免疫测定法测定留下的PrPSc，这种免疫测定法中应用一种抗体，它对于PrPc存在下的PrPSc不是选择性的(Serban等，Neurology，Vol.40，No.1,Jan　1990)。在蛋白水解步骤中，应用蛋白酶自然地排除了作为俘获剂或检测剂的抗体。在可引入抗体之前，必须除去此蛋白酶，或使其失活。避免对操作的这种限制将是十分有利的。
这种方法依赖于完全除去PrPc，以避免假阳性，而且还依赖于不产生降解PrPSc的情况，以避免假阴性。需要为每种类型的待测样品开发这种选择性蛋白水解的条件。所得测定法的敏感性是有限的。例如，在牛脑组织的测定中，其敏感性仅可能是如此，以便大约在此动物可能将表现出BSE临床可见症状时，可获得可靠的阳性结果。因此，此测定法的敏感性限度在1μg/ml范围内，相当于104-105朊病毒感染单位。
对于朊病毒疾病，需要更灵敏更特异的诊断试验。特别是，需要应用血液或其它类型样品的死前试验，来评价特定动物的疾病状态。没有这种方法的情况下，一旦在一群动物中明确一个感染动物，则需要广泛地屠宰家畜。至关重要的是开发一种诊断试验，以筛选人群，并保护个体，避免受到捐献血液、外科手术及器官和组织移植的潜在感染。
US5977324和US6221614两者均描述了应用磷钨酸(PTA)结合PrPSc的方法。PTA是一种非特异性蛋白沉淀剂，除了它不与PrPSc结合外，它可与广泛的蛋白结合，并使其沉淀。样品中蛋白的浓度也将极大地影响应用PTA的回收。
有报告称，对于PrPc而言，纤溶酶原可与PrPSc选择性地结合，并提出纤溶酶原可用于诊断分析(Fischer et al.Nature，2000，Nov23,408(6811)：479-83)。但是，还没有充分地证明此方法可应用于实践中。在相关公开内容，即US 2002/0004586中，也认为纤溶酶原是一种与PrPSc选择性结合的因子。
按照US 6419916及相关的公开内容，聚胺化合物SuperfectTM(一种支链聚胺混合物，它是通过PAMAM树突状聚合物的热诱导降解产生的)及其它类似的支链聚胺可在体外清除细胞中的PrPSc。其机理不清楚。据推测，这些化合物可与按淀粉状蛋白排列并暴露阴性带电部分的PrPSc直接结合，而且在酸性条件下诱导构象改变。据说此结果不能简单地涉及与PrPc的结合和抑制PrPSc的合成，因为存在的PrPSc已被清除了。假如pH低于4，则发现此聚胺可使PrPSc蛋白酶敏感。推测在体外PrPSc清除实验中，此聚胺在酸性细胞隔室中起作用。
从此项工作中得出，可推论这些聚胺与PrPSc结合。还提出了许多其它的可能性。表明或提示与PrPSc无选择性结合超过了PrPc。另外，可以推断，所发生的任何结合仅仅是短暂的，只是用于改变PrPSc的构象，以使蛋白酶进行攻击。另外，这些聚胺的作用需要低pH值。事实上，我们自己的研究表明在如此低的pH值下，这种树突状聚合物聚胺不与PrPSc结合。
戊聚糖聚硫酸酯(聚-b-木糖-2，3-二磺酸酯，PPS)是一系列大聚磺酸盐多糖苷(PGs)(MW 8,000-12,000)中的一种。它产自山毛榉木，是一种廉价的化合物，已作为类似于肝素的抗凝剂应用了多年，还有PG。PGs包括PPS和其它聚阴离子，已知它可与PrPc和重组PrP(recPrP)两者结合。例如参见Brimacombe DB et al，Biochem J，1999 Sep 15；342 pt 3,605-13。因此，已提出PPS可用作潜在的治疗剂，以预防和治疗TSE疾病。然而没有表明在体内或体外中除去已存在的PrPSc。
在生产过程中，提取山毛榉木的锯屑，以生产木糖的可溶性糖聚合物(一种五元环的糖)，它称为戊聚糖。然后应用氯磺酸和吡啶的混合物，对此聚合物进行硫酸化反应，这样导致所有4个糖环羟基中的3个上加有硫酸酯。然后硫酸酯总含量按重量计约为50-55％，此含量大于肝素中的含量，肝素中的含量约为30-35％。接近这种高程度硫酸化的其它唯一类似的分子是葡聚糖硫酸酯(40-45％)。戊聚糖的MW非常低，为3.5-7.0K。
曾有报告，对PrPc结合而言，通过PrPSc聚阴离子或聚阳离子结合没有选择性。令人惊奇的是，我们现在建立了条件，在此条件下，聚离子物质与聚集改变的蛋白，比如PrPSc结合，另外还建立了其它条件，在此条件下这些聚阴离子与这些异常形式结合，但不与它们的非聚集正常形式，比如PrPc结合，这种结合足够强，而且是在优选的条件下进行，为了可用于测定聚集改变蛋白(例如PrPSc)的存在，对这种条件进行了充分地选择。
发明内容
因此，本发明的第一个方面是提供一种方法，此方法用于在一种蛋白的非聚集正常形式存在的情况下，选择性结合此蛋白聚集性异常形式，它包括在选择性结合条件下使一种含有所述异常和正常形式的物质与一种聚离子物质接触，当样品中存在所述的此蛋白聚集形式时，此聚离子物质对其具有结合亲合力。这种结合条件可包括溶液中存在一种竞争剂，此竞争剂与此异常形式蛋白的结合亲合力低于此聚离子物质。
这种聚离子物质可在溶液中，或者可提供一种具有离子表面基团的表面。在后一种情况中，此表面可为一种聚合物的表面，该聚合物具有所述的离子型基团，此基团是在该聚合物的结构内共价结合的，或者是通过对该聚合物的表面基团修饰而产生的。聚阴离子聚合物适宜的实例为Nafion，它是一种全氟化磺酸化烃聚合物，可用作珠或片。也可应用聚阳离子聚合物。
可选择的是，此表面为一种底物的表面，该底物上包被有或在其中结合有具有所述离子基团的物质。具有这种表面基团的适宜聚合物的实例为未带电塑料表面，应用马来酸酐对其进行活化，并用TRIS衍化而产生表面羧基，或者带有聚阳离子物质。也可将聚阳离子和聚阴离子被动地涂在诸如聚苯乙烯的聚合物上。
在聚阴离子物质条件下，无论是用在溶液中，还是涂在固体表面，这种聚阴离子物质优选可为一种聚阴离子多糖苷。
通常，竞争剂离子基团的密度比聚离子物质低。未受到理论的限制，可能在此详述的发现归因于聚集性异常形式的蛋白，此蛋白比非聚集正常形式的相同蛋白具有更多的结合位点，以与离子基团进行相互作用。具有一个或一些离子基团的竞争剂可以以一定的亲合力，既与聚集形式的蛋白相互作用，也可与非聚集形式蛋白相互作用，然而聚离子物质则可以同时通过许多离子基团与此聚集形式的蛋白结合，这样可使它对聚集形式蛋白的亲合力比对非聚集形式蛋白更高。
被感染牛脑的实验结果提示，固定的聚阴离子(诸如葡聚糖硫酸酯)和聚阳离子(诸如聚乙烯亚胺)能够俘获脑均浆中异常形式的朊病毒蛋白PrPSc。应用抗朊病毒蛋白抗体/酶缀合物获得的信号，在最佳聚阳离子俘获表面的比最佳聚阴离子俘获表面约高3～5倍。
在两种情况下，当使用非特异性抗朊病毒蛋白抗体时，去污剂Sarkosyl(N-月桂酰肌氨酸)可充当竞争剂，以利于提高俘获异常蛋白的特异性，并避免正常朊病毒蛋白的信号。另外，当应用聚阳离子，或者应用聚阴离子时，用胰蛋白酶部分消化此样品基本上可增强PrPSc的信号，但对特异性没有任何影响(此提示，在所用的这种条件下，胰蛋白酶除去了PrPSc聚离子结合的抑制剂，而不是优选地消化PrPc，这与从蛋白酶K所观察到的一样)。
科学文献中有报告称，PrPSc天然地与聚阴离子相关联，此聚阴离子诸如为类肝素。可能这些阴性带电聚合物与PrPSc结构的阳性带电区相互作用，并且可能存在与这种聚集蛋白的多种相互作用。
我们提出，诸如葡聚糖硫酸酯或戊聚糖聚硫酸酯的聚阴离子，它可与PrPSc结构结合，其亲合力比天然类肝素更高，而且这样可替代内源性化合物。因此，固定至表面的高阴性带电聚合物可特异性地俘获异常朊病毒蛋白。正常朊病毒蛋白是非聚集性的，而且与内源性类肝素或诸如葡聚糖硫酸酯的聚阴离子都没有如此高亲合力的作用。在所选择的这种测定条件下，较低亲和性阴离子诸如去污剂Sarkosyl的存在，通过与固定的聚阴离子竞争较低亲和性PrPc作用位点，可进一步提高俘获的特异性。
相反，我们提出，根据PrPSc结构，聚阳离子不能替代内源性类肝素。我们提出，它反而必须与内源性类肝素/PrPSc聚集体直接络合-与类肝素上的自由阴性电荷形成离子相互作用。这样，在这种构型中，天然完整的类肝素/PrPSc复合体与固定的聚阳离子稳固地结合，然而在固定的聚阴离子条件下，非天然“代替的”PrPSc结构则被俘获。这说明应用最佳的聚阳离子俘获表面获得的信号较高，因为聚阴离子竞争内源性类肝素不可能100％有效，而且不是所有的PrPSc聚集体都被阴性带电聚合物结合。
当不期望聚集性蛋白被天然类肝素天然地结合时，例如当样品是血液或者血清等而不是组织时，可优选离子俘获剂。
除了所提到的离子相互作用外，这种PrPSc聚集体的其它区域与所用的这些聚合物之间可能还存在其它的疏水性结合。这些将进一步增强这种结合的相互作用。
此处所用的“亲合力”是指具有许多结合位点的分子与多价结合剂的总结合强度，而“亲合性”的意思是此分子的每单个结合位点和结合剂之间的结合强度。
如果使用竞争剂，则此竞争剂优选为脂肪酸的氨基酸酰胺，诸如n-月桂酰肌氨酸。这些物质具有去垢特性，但在本说明书中它们通过其末端COO-基团，仅仅充当单价结合剂，或者通过胶束形成而充当部分多价剂。
在另一个方面，本发明提供一种方法，该方法用于在一种蛋白的非聚集正常形式存在的情况下，选择性结合此蛋白的聚集性异常形式，它包括：在诸如提供所述异常形式的选择性结合的条件下，使含有所述异常和正常形式的物质与聚阴离子多糖苷接触。
本发明每个方面的优选实施方式中，所述蛋白的异常形式为PrPSc，而且其正常形式为PrPc。但是，本发明在其所有形式中，可广泛地应用于蛋白异常聚集形式的选择性结合。
可应用的聚阳离子选择性结合剂包括：聚乙烯亚胺；聚胺，它包括聚赖氨酸、polyamidoamines、例如PAMAM树突状聚合物；聚季铵，诸如聚(氯化二丙烯二甲铵)和1，5-二甲基-1，5-二氮十一撑聚甲溴化物(亦即溴化己二甲胺或溴化己二甲胺)。
优选的聚阴离子多糖苷为聚磺酸化多糖苷。但是，也可应用或替代使用其它的阴离子位点，诸如羧酸基团或者磷酸基团。
这种聚磺酸化多糖苷优选为戊聚糖聚硫酸酯(PPS)或葡聚糖硫酸酯。
其它聚阴离子戊聚糖或葡聚糖衍生物也可用作这种聚阴离子多糖苷。
优选高水平磺化作用(或其它阴离子基团)。
角叉胶、葡聚糖和戊聚糖的磺化水平高。如果低比例潜在磺化位点实际上被硫酸基团占据，那么可能会发现这些化合物不与PrPSc上的结合位点选择性地相互作用。
适宜的阴离子选择性结合剂可包括：
戊聚糖聚硫酸酯(MW 3500-5000)、葡聚糖硫酸酯500(MW 500,000)、ι-角叉菜聚糖、λ-角叉胶和角叉菜聚糖，例如K-角叉菜聚糖、肝素和类肝素、葡聚糖硫酸酯8(MW 8,000)、诸如岩藻依聚糖的磺酸化多糖苷、硫酸角蛋白、透明质酸聚硫酸酯、多聚乙酰神经氨酸(细菌聚唾液酸)、III型角叉菜聚糖和IV型角叉菜聚糖、硫酸皮肤素、硫酸类肝素、帚叉藻胶、硫酸化的市售多糖，例如多乙氧基醚、西咗喃、黄原胶、淀粉、纤维素化合物、果胶、胃粘蛋白、ceratonia、琼脂、阿拉伯胶、硫酸化葡糖苷1、硫酸化葡糖苷2、N-乙酰-D-葡糖胺或者硫酸皮肤素L-艾杜糖醛酸。
可选择这种聚离子物质使具有此能力：在非选择性条件下，可与蛋白的聚集性改变的形式或劣种形式结合，也可与此蛋白非聚集性正常形式结合，而且还具有在适宜条件下与聚集形式选择性结合的能力。
通过适当调节反应条件，可获得所需要的选择性，特别是竞争剂的存在和浓度、pH和去污力。因此优选地选择pH，以获得所述的选择性结合。
优选pH为5.6～9，例如7～9，更优选8～9，例如8.2～8.6，尤其是8.4，特别是在应用下面所述的去污剂时。适宜的缓冲剂包括磷酸盐缓冲剂和Tris缓冲剂。
此盐的浓度优选不高于250mM，而且优选显著更低，例如不超过100mM。
优选应用去污剂，无论是借助于去污力，还是充当竞争剂，它都可促进所述的选择性结合。
为了此目的，特别优选去污剂为一种脂肪酸的氨基酸酰胺，例如n-月桂酰肌氨酸或其它脂肪酸肌氨酸。当选择性结合剂是聚阴离子时，尤其优选这种去污剂/竞争剂。
优选此去污剂的浓度至少为0.05％重量计，更优选至少为0.1％，优选至少0.2％，例如0.2～2％，更优选0.5～1.5％，但是也可应用更大的量。
可应用具有类似作用的其它去污剂，包括CHAPS、Brij、辛基-β-糖苷、Tween 20、Triton X-100和Nonidet P-40。但不希望使用高浓度十二烷基硫酸钠(SDS)。n-月桂酰肌氨酸(或类似的物质)和其它去污剂的组合物是适宜的，优选含有0.5～2％，例如约1％肌氨酸去污剂，例如与0.5～2％上面列举去污剂中的一种，例如约1％，特别是TritonX-100或Nonidet P-40。
我们发现胰蛋白酶、糜蛋白酶、蛋白酶K或另一种这样的蛋白酶的存在有助于防止不明物质的抑制作用，此抑制作用可抑制聚集性蛋白与聚阴离子或聚阳离子选择性结合剂的结合。当样品中含有相当高水平的其它蛋白时尤其如此，如果用PrPSc阴性脑材料稀释PrPSc阳性脑样品时情况就是这样。通过包括具有降解性质的其它酶可防止另外的基质抑制作用，这些酶包括DNase和胶原酶。
与所述的此蛋白聚集性异常形式结合后，这种选择性结合剂可被固定的俘获剂俘获，而且可测定所述选择性结合剂和所述俘获剂之间形成的络合物的存在和量。
所述俘获剂可为外源凝集素(在此结合剂适宜的，例如为多糖苷)或者一种可与所述选择性结合剂反应的抗体。所述选择性结合剂可具有选择性可结合的标记部分，然后所述俘获剂可与所述标记部分结合。
可选择和可替代地，在暴露于所述样品之前，将这种选择性结合剂固定在固体介质上。此选择性结合剂可具有选择性可结合标记部分，而且通过此标记，可将它固定在所述固体介质上。
当存在可结合标记部分时，例如它可为生物素、荧光素、二硝基苯酚、异羟洋地黄毒苷元(digoxygenin)或(His)6。
可将此选择性结合剂直接固定在固体上，而不是通过可结合标记。例如，当使用例如用环氧基或乙烯砜基衍化的固体相时，通过此PG剩余的羟基经共价偶合，可直接偶合PG。
在本发明的各个方面，无论异常蛋白的结合发生在选择性结合剂的固定和俘获之前或之后，优选对固定的选择性结合剂/异常蛋白络合物进行冲洗步骤，以除去正常蛋白，而提高选择性。此冲洗步骤中优选使用含有所述竞争剂的溶液，它可为去污剂溶液，其中优选还包括去污剂，此去污剂或者凭借其去污力或者其它方面而促进选择性结合。这优选为脂肪酸的氨基酸酰胺，例如n-月桂酰肌氨酸或者另一种脂肪酸肌氨酸。优选地，冲洗步骤中此肌氨酸去污剂的浓度至少为0.05％，优选至少为0.1％，更优选至少为0.2％，例如0.2～2％，优选0.5～1.5％。也可使用其它去污剂，而且优选将此冲洗液pH缓冲至5.6～8.4。
将结合PrPSc从未结合PrPSc(或其它正常形式蛋白)分离后，进行PrPSc(或其它聚集性蛋白)的免疫测定，可定性或定量测定所述PrPSc(或其它异常蛋白)的结合。
另外，一旦聚集形式的蛋白被选择性结合，而且可选择的在除去正常形式蛋白后，可将另外的聚阴离子物质，例如阴离子多糖苷(用标记物或可检测的标志适当标记的)与已经结合的聚集性蛋白结合，而形成一种夹心(例如多糖苷-聚集性蛋白-多糖苷标记)，然后可对其进行定量测定或检测。当进行第二部分夹心形成时，选择性结合条件可不是必需的。
如上所述，在与改变的蛋白接触前或者之后，可将选择性结合剂固定在一种固体物质上。然后从此固体物质上分离样品，以从此测定中除去正常形式的蛋白，仅留下改变形式的蛋白进行下一步测定。
在本说明书中，固体支持物质不仅包括宏观或可控制物质，诸如微量滴定板、测量尺和层流仪，而且还包括微珠和超顺磁性微珠，可通过过滤或者磁性俘获而将它们分离。通过标准的化学方法，可将生物素或其它标记物缀合至葡聚糖硫酸酯或PPS等物质上。PPS中约十分之一的糖主链残基是糖醛酸甲基酯，而且这样为通过它们的羧基残基进行偶合提供了一个途径。其它已知进行偶合的途径是羟基(在硫酸化反应后还有四分之一是游离的)，或者是还原糖的末端基团。生物素是适宜的可结合标记部分，它可用于将聚阴离子物质或者其它选择性结合剂结合到一种固体物质上，此固体物质是用抗生物素蛋白或者具有抗生物素蛋白结合特性的物质衍化的，这里的具有抗生物素蛋白结合特性的物质诸如为链霉抗生物素蛋白、Neutravidin或Captavidin。
适宜用作可结合标记部分的其它分子将包括所有容易和聚离子物质缀合，而且有助于被适宜的俘获剂俘获的那些分子。例如，诸如荧光素的分子可与PPS或类似分子缀合，这是在碳二亚胺EDC(1-乙基-3-(3-二甲基-氨基丙基)-碳二亚胺)存在下，通过将一种氨基荧光素衍生物与戊聚糖聚硫酸酯的糖醛酸和侧链反应进行的，而且可用一种适宜的易于获得的抗体将这种分子俘获，这种抗体可固定在固体物质上。适用于此过程中抗体俘获的其它标记物包括二硝基苯酚DNP、异羟洋地黄毒苷元、核酸或核酸类似序列和(His)6。除了抗体，也可应用结合剂，例如互补核酸或核酸类似序列。
但是，可选择的是，可应用可选择性地与此聚离子物质本身，而不是通过标记部分结合的俘获剂。例如，可通过适宜的凝集素或适宜的抗体结合多糖苷。例如Kongtawelert et al；J.Immunol.Methods 1990，Jan 24；126(1)；39-49公开的结合PPS的抗体。固定这些抗体的标准技术是本领域技术人员所熟知的。
一旦此凝集形式被选择性结合剂选择性地结合，而且适当地通过固定结合的形式，冲洗掉剩余未结合的形式，而将未结合正常形式蛋白分离开，任何已知或未来将设计出的可用于测定被凝集的或凝集改变的蛋白的方法，可用来测定此凝集形式的存在或量，这种改变的蛋白诸如为PrPSc(不需要选择性地排除正常的形式，诸如PrPc)。这些方法包括已知的ELISA、RIA、IRMA和其它类型的免疫测定法，例如Bio-RadPlateliaTM BSE检测试剂盒中包含的方法和Serban等描述的方法。
根据所用测定法的类型，在测定之前可要求或需要从选择性结合剂上洗脱被俘获的异常形式蛋白。在这种洗脱步骤中，诸如硫氰酸胍的离液剂所要求的浓度至少为1M，优选2～6M，例如4～6M。也可应用包括尿素的的离液剂。
另外或可选择的，具有较高亲合力的竞争剂可用于替代来自选择性结合剂的蛋白。十二烷基硫酸钠(SDS)适用于此，其应用的浓度优选为0.5～1％重量计，更优选大于0.75％。
按照本发明可被选择性结合和测定的其它蛋白包括β-淀粉样蛋白和τ蛋白，它们形成阿耳茨海默病中的蚀斑。
不欲受到下面理论的限制，认为PPS和类似分子在本发明中发挥作用，它是通过成对阴性硫酸基与相关蛋白中成对阳性氨基酸(赖氨酸和精氨酸)结合，或者通过此蛋白的聚组氨酸金属结合位点而发挥作用。与聚集形式结合可更牢固，这归因于聚集蛋白所提供结合位点的数目增多。适宜的阴离子去污剂，可更有效的竞争与非聚集形式进行的结合，以提高选择性。适宜地，所获得的选择性是如此，以致与聚集蛋白结合的亲合力至少是正常形式的3倍，优选至少为10:1。
在另一方面，本发明包括分离PrPSc与PrPc的方法，它包括在脂肪酸的氨基酸酰胺存在的情况下，选择性地将PrPSc与结合剂结合。这种结合的优选条件如上详述，而且可按照所述来测定这种结合的蛋白。
通过下面的实施例可进一步对本发明进行描述和举例说明，此实施例涉及下面附图，其中：
附图简述
附图1显示实施例9中获得的稀释曲线。
具体实施方式
实施例1：应用生物素化戊聚糖聚硫酸酯以及随后的亲和俘获从劣 种朊病毒蛋白中分离正常朊病毒
介绍
应用标准的化学方法，将生物素与戊聚糖聚硫酸酯缀合。使这种生物素化戊聚糖聚硫酸酯与脑均浆中劣种朊病毒蛋白结合，结合后，应用链霉抗生物素蛋白衍化的超顺磁珠俘获戊聚糖聚硫酸酯/朊病毒复合物。然后从这些珠上洗脱被俘获的劣种朊病毒，并用基于免疫的Bio-RadPlateliaTM BSE检测试剂盒进行测定；此试剂盒不能区分正常和劣种朊病毒蛋白，而且可给出两种蛋白的信号。对一组两个BSE感染和两个非感染牛脑进行研究，用于举例说明在所述的特殊条件下，可应用戊聚糖聚硫酸酯特异性的俘获脑均浆中劣种朊病毒蛋白。
方法
制备超顺磁珠
1、仅在使用前，在3个连续的1ml体积的TBST(50mM Tris、150mMNaCl，pH 7.5，0.05％(v/v)Tween20[Sigma-Aldrich Company Ltd.，P-7949])中，通过磁性俘获冲洗400μl链霉抗生物素蛋白超顺磁珠(Sigma-Aldrich Company Ltd.，S-2415)。
2、最后在400μl TBST中再悬浮这些珠。
3、在4个试管中制备100μl等份，并除去流体。然后准备这些珠备用。
制备脑均浆
1、将每种300-500mg的脑组织加入包含研磨珠的研磨试管中，同时将这些试管装入BSE Purification Kit(Bio-Rad)中。在使用前抽取试剂盒内这些试管中最初装入的流体，并将其弃去。
2、将经过计算的150mM NaCl加入每个试管中，它可产生均化后的50％(w/v)脑均浆。
3、在ribolyzer(从Bio-Rad购得)上将这些试管均化45秒，速度设定在6.5。
4、用150mM NaCl稀释这些均浆。
5、将每种50μl的均浆置于分离试管中。
Rogue朊病毒蛋白的特异性俘获
6、将10μl 20％(w/v)N-月桂酰肌氨酸(Sigma-Aldrich CompanyLtd.，L-9150)加入含均浆的每个试管中，并混合。
7、然后将50μl生物素化戊聚糖聚硫酸酯(在无菌蒸馏水中，浓度为10μg/ml)加入每个试管中，混合，在室温下孵育30分钟。
8、然后将每种反应物加入冲洗的链霉抗生物素蛋白超顺磁珠的试管中，在室温下孵育30分钟。
9、然后在3个1ml TBST中通过磁性俘获冲洗这些珠。
Rogue朊病毒蛋白的洗脱和免疫测定
1、最后，在最终的冲洗后，将每个反应中的珠再悬浮在10μl Cl(与Bio-Rad的PlateliaTM BSE检测试剂盒一起提供)中。
2、将5μl 0.2％(w/v)SDS加入每种珠悬浮液中，混合。
3、在每种珠悬浮液中加入5μl 1M硫氰酸胍(Sigma-AldrichCompany Ltd.，G-9277)，并混合。
4、将此反应在100℃加热5分钟。
5、然后加入100μl R6(与Bio-Rad的PlateliaTM BSE检测试剂盒一起提供)，并混合。
6、然后将每种100μl的洗脱物用于Bio-Rad的PlateliaTM BSE检测试剂盒，并使用此试剂盒一起提供的方案和试剂。简要地，这种试剂盒包括正常和/或劣种朊病毒蛋白的免疫俘获，以及应用辣根过氧化物酶缀合抗体的免疫测定。
结果
在基于微量滴定平板的PlateliaTM测定中进行免疫测定后，应用ELISA读数器，在波长450nm下测量每个孔中的信号。
Figure C03806690D00231
这两种感染BSE脑均浆含有劣种朊病毒，它们的信号显著高于未感染的正常脑均浆的信号。
讨论
这种Bio-Rad的PlateliaTMBSE检测试剂盒不能区别正常或劣种朊病毒蛋白。正常情况下，应用蛋白酶K进行预消化，蛋白酶K除去对蛋白酶敏感的正常朊病毒蛋白，这样获得劣种朊病毒蛋白的特异性。样品中的任何劣种朊病毒蛋白对蛋白酶消化的抵抗性更高，并存留下来，而且随后可通过PlateliaTM测定对其进行检测。在此实验中，我们证明了一种可替代样品蛋白酶消化的方法。应用设定好的条件，在此条件下溶液中生物素化戊聚糖聚硫酸酯可特异性地与样品中的劣种朊病毒蛋白结合。然后应用链霉抗生物素蛋白超顺磁珠俘获劣种朊病毒/戊聚糖聚硫酸酯复合物。冲洗后，随后可洗脱此劣种朊病毒蛋白，并在免疫测定中对其进行检测。通过这种方案，正常朊病毒蛋白未被俘获，并被冲洗掉，因此，在免疫测定中未检测到正常朊病毒蛋白。我们证明通过应用这种技术，可准确地测定两种感染BSE牛脑中的劣种朊病毒蛋白，而且在两种正常牛脑中未观察到任何信号。
实施例2：应用固定的生物素化戊聚糖聚硫酸酯分离正常朊病毒和 劣种朊病毒蛋白
介绍
应用标准化学方法，将生物素与戊聚糖聚硫酸酯缀合。使用这种生物素化戊聚糖聚硫酸酯包被链霉抗生物素蛋白衍化的超顺磁珠。然后应用包被的珠特异地俘获脑均浆中的劣种朊病毒蛋白。随后，从这些珠上洗脱俘获的劣种朊病毒蛋白，并应用基于免疫的Bio-RadPlateliaTMBSE检测试剂盒对其进行检测；此试剂盒不能区别正常和劣种朊病毒蛋白，并可给出两种蛋白的信号。对一组3种感染BSE和3种未感染牛脑进行研究，并用于证明在所述的特殊条件下，戊聚糖聚硫酸酯可特异地俘获这些脑均浆中的劣种朊病毒蛋白。
方法
制备包被戊聚糖聚硫酸酯的磁性珠
1、在3个连续的1ml TBS(50mM Tris、150mM NaCl，pH 7.5)中，通过磁性俘获冲洗600μl链霉抗生物素蛋白超顺磁珠(Sigma-AldrichCompany Ltd.，S-2415)。
2、最后在540μl TBS中再悬浮这些珠，并加入60μl含10mg/ml生物素化戊聚糖聚硫酸酯的TBS。在室温下将这些珠孵育1小时，同时轻轻摇动，以使戊聚糖聚硫酸酯包被这些珠。
3、包被后，在3个连串的1ml 5％(w/v)牛白蛋白(Sigma-AldrichCompany Ltd.，A-7906)、pH8.4的50mM磷酸盐缓冲液中，通过磁性俘获冲洗这些珠，最后将它们再悬浮在60μl的相同缓冲液中。然后将这些珠备用。
制备脑均浆
1、将每种300-500mg的脑组织加入包含研磨珠的研磨试管中，同时将这些试管装入BSE Purification Kit(Bio-Rad)中。在使用前抽取试剂盒内这些试管中最初装入的流体，并将其弃去。
2、将经过计算的150mM NaCl加入每个试管中，它可产生均化后的50％(w/v)脑均浆。
3、在ribolyzer(从Bio-Rad购得)上将这些试管均化45秒，速度设定在6.5。
4、用5％(w/v)牛白蛋白、pH 8.4的50mM磷酸盐缓冲液将此均浆稀释5倍。
5、将每种45μl的均浆置于分离试管中。
6、将5μl 20％(w/v)SDS(十二烷酰硫酸钠)(Sigma-Aldrich CompanyLtd.，L-5750)加入每个试管中，并充分混合。
7、然后在每个试管中加入450μl 5％(w/v)牛白蛋白、pH 8.4的50mM磷酸盐缓冲液，并混合。
8、然后加入50μl 20％(w/v)N-月桂酰肌氨酸(Sigma-AldrichCompany Ltd.，L-9150)，并混合。
特异性俘获劣种朊病毒蛋白
1、将10μl制备好的包被戊聚糖聚硫酸酯的超顺磁珠加入每种稀释的脑均浆中，在室温下孵育1小时，同时进行摇动。
2、然后用3×100μl TBS，通过磁性俘获冲洗每种反应物。
Rogue朊病毒蛋白的洗脱和免疫测定
1、将来自每种反应的珠再悬浮于10μl Cl(与Bio-Rad的PlateliaTMBSE检测试剂盒一起提供)中。
2、将5μl 0.2％(w/v)SDS加入每种珠悬浮液中，并混合。
3、在每种珠悬浮液中加入5μl 1M硫氰酸胍(Sigma-AldrichCompany Ltd.，G-9277)，并混合。
4、将此反应在100℃加热5分钟。
5、然后加入100μl R6(与Bio-Rad的PlateliaTM BSE检测试剂盒一起提供)，并混合。
6、然后将每种100μl的洗脱物用于Bio-Rad的PlateliaTM BSE检测试剂盒，并使用此试剂盒一起提供的方案和试剂。简要地，这种试剂盒包括正常和/或劣种朊病毒蛋白的免疫俘获，以及应用辣根过氧化物酶缀合抗体的免疫测定。
结果
在基于微量滴定平板的PlateliaTM测定中进行免疫测定后，应用ELISA读数器，在波长450nm下测量每个孔中的信号。
Figure C03806690D00271
这三种含有劣种朊病毒蛋白的感染BSE脑均浆的信号显著高于未感染的正常脑均浆的信号。
讨论
这种Bio-Rad的PlateliaTM BSE检测试剂盒不能区别正常或劣种朊病毒蛋白。正常情况下，应用蛋白酶K进行预消化，蛋白酶K除去对蛋白酶敏感的正常朊病毒蛋白，这样获得劣种朊病毒蛋白的特异性。样品中的任何劣种朊病毒蛋白对蛋白酶消化的抵抗性更高，并存留下来，而且随后可通过PlateliaTM测定对其进行检测。在此实验中，我们证明了一种可替代样品蛋白酶消化的方法。应用设定好的条件，在此条件下戊聚糖聚硫酸酯可特异性俘获与样品中的劣种朊病毒蛋白。洗脱这种俘获的劣种朊病毒蛋白，并在免疫测定中对其进行检测。正常朊病毒蛋白未被戊聚糖聚硫酸酯俘获，并被冲洗掉，因此，在免疫测定中未检测到正常朊病毒蛋白。我们证明通过应用这种技术，可准确地测定这三种感染BSE牛脑中的劣种朊病毒蛋白，而且在三种正常牛脑中未观察到任何信号。
实施例3：PPS的生物素化
此方法的原理
用糖醛酸残基取代戊聚糖硫酸酯的聚木糖主链中约十分之一的糖残基，接着用甲基酯在某些羧基上对其进行取代，因此在此分子中存在大量自由羧基，可用碳二亚胺对它们进行衍化，以形成活性的酯。接着可用氨基类对这些进行取代，以产生一种酰胺键。在这种特别的情况下，选择EDC和NHS而形成活性酯，选择生物素酰肼作为氨基类。进行两个反应，第一步反应中，最初存在生物素酰肼，没有加入任何NHS，在第二步反应中，使NHS/EDC与PS和生物素酰肼同时反应。
材料
戊聚糖硫酸酯(Norton Healthcare)由Stephen Dealler赠送。
生物素酰肼100mg，Pierce #21339 mw 258.33批号AH41461
EDC[1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺甲碘化物]Sigma#16，534-4，1g，
NHS[N-羟基琥珀酰亚胺]Sigma #H7377 5g mw 115.1
渗析管mwco 3.5k Pierce #68035
DMSO Sigma
方法
应用下面两种版本的方案进行这两种反应，使用和未使用NHS：
在玻璃瓶中，将100mg生物素酰肼溶解于6ml DMSO中，这可能需要加热和超声粉碎。因此其终浓度为16.7mg/ml或65mM。取1000mg戊聚糖硫酸酯，将其溶解在10ml DMSO和水的50/50混合物中，这个可在一种塑料通用容器中进行。在玻璃瓶中将100mg EDC溶解在1ml DMSO中，它可能需要加热。将NHS(约40-50mg)溶解在1.0ml水中。
在锥形底聚苯乙烯通用容器中进行此反应，在此容器的磁性搅拌器底部具有一个小的环状磁性搅拌器棒(直径约10mm)，并且还安装有一种直径12mm(或更小)的联合pH电极。
实施例3a：未使用NHS的反应
将5.0ml戊聚糖硫酸酯溶液置于反应器皿中，加入1.0ml生物素酰肼溶液，充分搅拌，记录pH值。期望pH值可为7-8。加入0.2ml EDC溶液，在连续搅拌的同时，记录pH值，并且通过一个玻璃微注射器和针头加入10μl等份的1N HCl，在每次添加后均记录pH值。连续加入酸，直至pH在5-6中。因为此反应产生OH离子，所以这是必须的。此反应物应当保持澄清，而且始终无色。如果产生一些生物素酰肼的白色沉淀，那么DMSO的浓度应当升高，此靶值>/＝50％。在室温下使反应进行2-3小时(或过夜，如果这样更方便)。
记录此反应混合物的终pH值。加入等量的1M NaCl，将DMSO稀释至25％，并替换离子性结合的酰肼，并将整个内容物转移至长度为35cm，直径为2.2cm的渗析管中。注意将DMSO浓度降低至25％，以避免破坏此渗析管，还应当在使用前用水试验此渗析管，以检测任何小孔，而且应当只充满至1/3，这样可在渗析时允许膨胀。对2L水渗析过夜，并这样重复数次，渗析次数越多，戊聚糖硫酸酯可更强地保留碱离子，这是借助其强烈的阴电荷，通过非共价离子相互作用进行的。冻干这种渗析溶液，并记录干重量。最终产物应当是一种坚硬的白色块状物。产量可有一些变化，但典型的是50-60％，大部分损耗发生在渗析时，这是由于戊聚糖硫酸酯MW的不均匀性，以及MW小于3500的种类丢失造成的。
实施例3b：应用NHS的反应
基本上按照上面所述进行此反应，除了在加入启动反应的EDC试剂前加入1.0ml(44mg)的NHS外。起始pH值为6～7，并应当用1N HCl将其调节至大约5-6。
质量控制
计算从干燥重量的回收率后，在水中形成一种10mg/ml的溶液，并扫描其光谱为200至400nm。峰值应当在260和280nm，尽管有一个或两者都可为不清晰的肩峰。这种吸附归因于吡啶残基，它在硫酸化步骤中被加入此分子中。它们可用于，例如在色谱法过程中监测戊聚糖硫酸酯的浓度。可通过在260nm的UV吸收，或者在较低的浓度下通过Toluidine Blue异染试验，来监测戊聚糖。
实施例4：血浆中朊病毒蛋白的去除
Rogue朊病毒蛋白的去除
1、将100μl制备好的戊聚糖聚硫酸酯包被的超顺磁珠加入新近制备的人血浆等份的两个中的一个，此血浆中掺加了PrPSc。将两个等份血浆在室温下均孵育1小时，同时摇动。
2、然后通过磁性俘获将这些珠从此掺料的血浆等份中除去。然后检测这种上清液以及剩余血浆等份中的劣种朊病毒蛋白。
检测掺料等份中的劣种朊病毒蛋白
1、用蛋白酶K处理这两种血浆等份，其处理条件是我们已指出的消化正常朊病毒蛋白，而使劣种蛋白完整保留的条件。可凭经验很容易地确定这些条件。然后应用基于免疫的Bio-Rad PlateliaTM BSE检测试剂盒，检测这些蛋白酶K处理样品中的劣种朊病毒蛋白。
结果
在基于微孔板PlateliaTM测定法中进行免疫检测后，应用ELISA读数器在波长450nm下测定每个孔中的信号。在尚未用戊聚糖聚硫酸酯处理的掺料血清样品中，可方便地检测劣种朊病毒蛋白。相反，在此试验中，戊聚糖聚硫酸酯处理的样品中没有任何信号，此表明在这种样品中没有留下任何可检测的劣种朊病毒蛋白。
讨论
此实验表明应用戊聚糖聚硫酸酯可有效地除去所研究样品中的劣种朊病毒蛋白。
实施例5：使戊聚糖聚硫酸酯与劣种朊病毒蛋白特异性结合的去污 剂条件的研究
介绍
应用标准化学方法，将生物素与戊聚糖聚硫酸酯缀合。使用这种生物素化戊聚糖聚硫酸酯包被链霉抗生物素蛋白衍化的超顺磁珠。然后应用这些包被的珠建立去污剂的条件，在此条件下戊聚糖聚硫酸酯可与劣种朊病毒蛋白结合，而不与正常细胞朊病毒蛋白结合。
方法
制备包被戊聚糖聚硫酸酯的磁性珠
1、在3个连串的1ml TBS(50mM Tris、150mM NaCl，pH 7.5)中，通过磁性俘获冲洗600μl链霉抗生物素蛋白超顺磁珠(Sigma-AldrichCompany Ltd.，S-2415)。
2、最后在540μl TBS中再悬浮这些珠，并加入5％(w/v)牛白蛋白(BSA)(Sigma-Aldrich Company Ltd.，A-7906)和60μl含10mg/ml生物素化戊聚糖聚硫酸酯的TBS。在室温下将这些珠孵育1小时，同时轻轻摇动，以使戊聚糖聚硫酸酯包被这些珠。
3、包被后，在3个连串的1ml 5％(w/v)BSA、pH8.4的50mM磷酸盐缓冲液中，通过磁性俘获冲洗这些珠，最后将它们再悬浮在60μl的相同缓冲液中。然后这些珠便可使用了。
制备脑均浆
1、将每种300-500mg的感染BSE的牛脑组织和正常牛脑组织加入包含研磨珠的研磨试管中，同时将这些试管装入BSE Purification Kit(Bio-Rad)中。在使用前抽取试剂盒内这些试管中最初装入的流体，并将其弃去。
2、将经过计算的150mM NaCl加入每个试管中，它可产生均化后的50％(w/v)脑均浆。
3、在ribolyzer(从Bio-Rad购得)上将这些试管均化45秒，速度设定在6.5。
4、用5％(w/v)牛白蛋白、pH 8.4的50mM磷酸盐缓冲液将此均浆稀释5倍。
5、将等份的每种45μl的均浆置于分离试管中。
6、将5μl 20％(w/v)SDS(十二烷酰硫酸钠)(Sigma-Aldrich CompanyLtd.，L-5750)加入每个试管中，并充分混合。
7、然后在每个等份中加入450μl 5％(w/v)牛白蛋白、pH 8.4的50mM磷酸盐缓冲液，并混合。
8、然后将不同去污剂浓度的50μl N-月桂酰肌氨酸(Sigma-AldrichCompany Ltd.，L-9150)加入各种等份，并混合。一组(一个感染BSE的和一个未感染的脑组织)中不加入任何N-月桂酰肌氨酸。
俘获朊病毒蛋白
1、将10μl制备好的包被戊聚糖聚硫酸酯的超顺磁珠加入每种稀释的脑均浆中，在室温下孵育1小时，同时进行摇动。
2、然后用3×100μl TBS，通过磁性俘获冲洗每种反应物。
朊病毒蛋白的洗脱和免疫测定
1、将来自每种反应的珠再悬浮于10μl Cl(与Bio-Rad的PlateliaTMBSE检测试剂盒一起提供)中。
2、将5μl 0.2％(w/v)SDS加入每种珠悬浮液中，并混合。
3、在每种珠悬浮液中加入5μl 1M硫氰酸胍(Sigma-AldrichCompany Ltd.，G-9277)，并混合。
4、将此反应在100℃加热5分钟。
5、然后加入100μl R6(与Bio-Rad的PlateliaTM BSE检测试剂盒一起提供)，并混合。
6、然后将每种100μl的洗脱物用于Bio-Rad的PlateliaTM BSE检测试剂盒，并使用此试剂盒一起提供的方案和试剂。简要地，这种试剂盒包括正常和/或劣种朊病毒蛋白的免疫俘获，以及应用辣根过氧化物酶缀合抗体的免疫测定。
结果
在基于微量滴定平板的PlateliaTM测定中进行免疫测定后，应用ELISA读数器，在波长450nm下测量每个孔中的信号。
Figure C03806690D00341
在所有N-月桂酰肌氨酸的浓度下，感染BSE的脑组织和正常脑组织之间存在差别。0.2％ N-月桂酰肌氨酸是最佳的去污剂浓度，它可使戊聚糖聚硫酸酯结合并俘获劣种朊病毒蛋白，而不结合或俘获正常朊病毒蛋白。在没有N-月桂酰肌氨酸的情况下，即使存在SDS去污剂，戊聚糖聚硫酸酯与劣种朊病毒蛋白结合和与正常朊病毒蛋白结合之间没有差异。在这些条件下戊聚糖聚硫酸酯与正常和劣种朊病毒蛋白两者都结合。
讨论
1、在这些特殊试验条件下，戊聚糖聚硫酸酯与劣种朊病毒蛋白结合的特异性有赖于N-月桂酰肌氨酸或类似去污剂的存在。没有这种去污剂，戊聚糖聚硫酸酯与正常和劣种朊病毒蛋白两者都结合。
实施例6：使戊聚糖聚硫酸酯与劣种朊病毒蛋白特异性结合的pH 条件的研究
介绍
应用标准化学方法，将生物素与戊聚糖聚硫酸酯缀合。使用这种生物素化戊聚糖聚硫酸酯包被链霉抗生物素蛋白衍化的超顺磁珠。然后应用这些包被的珠建立pH的条件，在此条件下戊聚糖聚硫酸酯可与劣种朊病毒蛋白结合，而不与正常细胞朊病毒蛋白结合。
方法
制备包被戊聚糖聚硫酸酯的磁性珠
1、在3个连串的1ml TBS(50mM Tris、150mM NaCl，pH 7.5)中，通过磁性俘获冲洗1ml等份链霉抗生物素蛋白超顺磁珠(Sigma-Aldrich Company Ltd.，S-2415)。
2、最后在1ml TBS中再悬浮每等份的珠，并加入5％(w/v)牛白蛋白(BSA)(Sigma-Aldrich Company Ltd.，A-7906)和100μl含10mg/ml生物素化戊聚糖聚硫酸酯的TBS。在室温下将这些珠孵育1小时，同时轻轻摇动，以使戊聚糖聚硫酸酯包被这些珠。
3、包被后，在3个连串的1ml 5％(w/v)BSA、pH8.4的50mM Tris缓冲液中，通过磁性俘获冲洗每等份的珠。
4、然后将此等份的珠再悬浮在pH5.7、7.5、8.4和9.6的缓冲液中，这些缓冲液均含有5％(w/v)BSA。
在不同pH的缓冲液中制备脑均浆
1、将每种300-500mg的感染BSE的牛脑组织和正常牛脑组织加入包含研磨珠的研磨试管中，同时将这些试管装入BSE Purification Kit(Bio-Rad)中。在使用前抽取试剂盒内这些试管中最初装入的流体，并将其弃去。
2、将经过计算的150mM NaCl加入每个试管中，它可产生均化后的50％(w/v)脑均浆。
3、在ribolyzer(从Bio-Rad购得)上将这些试管均化45秒，速度设定在6.5。
4、在均含有5％(w/v)BSA，pH为5.7、7.5、8.4和9.6的缓冲液中，将50μl的每种均浆稀释5倍。
5、将每种稀释的45μl的均浆置于分离试管中。
6、将5μl 20％(w/v)SDS(十二烷酰硫酸钠)(Sigma-Aldrich CompanyLtd.，L-5750)加入每个试管中，并充分混合。
7、然后在每个中加入450μl与起始稀释缓冲液pH相同的缓冲液，它们均含有5％(w/v)牛白蛋白，并混合。
8、然后加入50μl 20％N-月桂酰肌氨酸(Sigma-Aldrich CompanyLtd.，L-9150)，并混合。
脑均浆的珠俘获
1、将在相应pH值的缓冲液中的10μl制备好的包被戊聚糖聚硫酸酯的超顺磁珠加入每种稀释的脑均浆中，在室温下孵育1小时，同时进行摇动。
2、然后用3×100μl TBS，通过磁性俘获冲洗每种反应物。
劣种朊病毒蛋白的洗脱和免疫测定
1、将来自每种反应的珠再悬浮于10μl Cl(与Bio-Rad的PlateliaTMBSE检测试剂盒一起提供)中。
2、将5μl 0.2％(w/v)SDS加入每种珠悬浮液中，并混合。
3、在每种珠悬浮液中加入5μl 1M硫氰酸胍(Sigma-AldrichCompany Ltd.，G-9277)，并混合。
4、将此反应在100℃加热5分钟。
5、然后加入100μl R6(与Bio-Rad的PlateliaTM BSE检测试剂盒一起提供)，并混合。
6、然后将每种100μl的洗脱物用于Bio-Rad的PlateliaTM BSE检测试剂盒，并使用此试剂盒一起提供的方案和试剂。简要地，这种试剂盒包括正常和/或劣种朊病毒蛋白的免疫俘获，以及应用辣根过氧化物酶缀合抗体的免疫测定。
结果
在基于微量滴定平板的PlateliaTM测定中进行免疫测定后，应用ELISA读数器，在波长450nm下测量每个孔中的信号。
Figure C03806690D00381
PH为7.5和更低时，此包被戊聚糖聚硫酸酯的珠可与正常和劣种朊病毒蛋白都结合。PH为9.6和更高时，此包被戊聚糖聚硫酸酯的珠不能与这两种形式的朊病毒蛋白结合。PH为8.4时，此包被戊聚糖聚硫酸酯的珠俘获劣种朊病毒蛋白，但不俘获正常朊病毒蛋白。在这种pH下，此戊聚糖聚硫酸酯显示出与劣种朊病毒蛋白结合的特异性。
讨论
在此试验条件下，戊聚糖聚硫酸酯与劣种朊病毒蛋白结合的特异性有赖于pH。PH为8.4时，戊聚糖聚硫酸酯与劣种朊病毒蛋白结合，但不能与正常朊病毒蛋白结合。PH为7.5和更低时，戊聚糖聚硫酸酯可与正常和劣种朊病毒蛋白两者都结合，而PH为9.6和更高时，戊聚糖聚硫酸酯不能与劣种或正常朊病毒蛋白结合。因此，为了在这些条件下使戊聚糖聚硫酸酯与劣种朊病毒蛋白特异性结合，所应用的pH值应当接近8.4。
实施例7：应用竞争性较低电荷密度聚阴离子将PrP res (PrP Sc )特 异性俘获至高电荷密度聚阴离子配体，以选择性抑制PrP c 的结合的论证
背景技术
PrP可结合于固定的聚阴离子。俘获缓冲液中无竞争性聚阴离子存在的情况下，PrPres和PrPSc均可被俘获。通过在俘获缓冲液中包括一种聚阴离子，其电荷密度低于俘获聚阴离子的电荷密度，这样可获得特异性的PrPres俘获。在此实施例中，葡聚糖硫酸酯用作高电荷密度俘获聚阴离子，N-月桂酰肌氨酸(它形成多分子去污剂胶束)和戊聚糖聚硫酸酯或岩藻依聚糖用作较弱电荷密度竞争聚阴离子。
方法
1、按照标准步骤，用葡聚糖硫酸酯(500000mwt)包被Maxisorp微量滴定孔。
2、将100μl含有1mg脑组织、pH 8.3的50mM Tris、1％(w/v)BSA、1％(v/v)Triton X-100的脑均浆加入此包被的孔中。在某些情况下，这种俘获缓冲液也可含有1％(w/v)N-月桂酰肌氨酸、岩藻依聚糖、葡聚糖硫酸酯或各种浓度的戊聚糖聚硫酸酯。
3、孵育2小时，以进行朊病毒蛋白的俘获，然后用50mM Tris pH8.3、1％(w/v)BSA、1％(v/v)Triton X-100将此孔冲洗3遍。
4.然后用PBS将这些孔冲洗3遍。
5、将100μl 5M硫氰酸胍加入每个孔中，并在4℃孵育5分钟。
6、用PBS将孔冲洗3遍，然后应用Bio-rad PlateliaTM BSE检测试剂盒的抗朊病毒蛋白缀合物，按照此试剂盒的方案，检测俘获的朊病毒蛋白。
7、在OD450下，在ELISA读数器中测定显影的信号。
结果
讨论
在俘获缓冲液中没有竞争性聚阴离子存在的情况下，所有信号较低，而且感染脑或正常脑的信号没有差别，即不存在PrPres的特异性俘获。但是，在俘获缓冲液中包括一种竞争性聚阴离子后，感染脑的信号则得到提高，而相应正常或未感染脑的信号却被抑制。在这个实施例中，在俘获缓冲液中应用1％(w/v)N-月桂酰肌氨酸，感染脑和正常脑之间则可获得最佳的区别。另外，应用岩藻依聚糖或戊聚糖聚硫酸酯也可获得感染脑和正常脑之间的区别。应用戊聚糖聚硫酸酯时，通过将俘获缓冲液中竞争性聚阴离子戊聚糖聚硫酸酯的浓度从0.1提高到1mg/ml，则可增大这种区别。比较而言，如果俘获缓冲液中包括葡聚糖硫酸酯，则如所期望的那样，此信号被降低到背景值，因为它竞争并抑制PrP与固定的葡聚糖硫酸酯结合。
实施例8：将PrP res 特异性俘获至高电荷密度聚阴离子包被表面的 论证
背景技术
在这个实验中，证明可将PrPres特异性俘获至一种聚阴离子表面。在此实例中，所提供的表面为衍化的马来酸酐聚苯乙烯。对照物为不带电的polysorp和maxisorp孔。在其它实验中，已证明可用聚阴离子葡聚糖硫酸酯衍化这些不带电的表面，然后它们可结合PrPres。
方法
1、在室温下，用TBS 5％(w/v)BSA将马来酸酐活化的聚苯乙烯微量平板孔(Perbio Science UK Ltd.，Cheshire)衍化60分钟。这样在这种塑料上产生一种羧基带电表面(参见产品文献)。也研究作为不带电对照物的polysorp和maxisorp孔(Nunc)。另外，按照实施例9中所述的步骤，也用聚阴离子葡聚糖硫酸酯配体包被maxisorp孔。
2、将100μl脑均浆加入此孔中，其中脑均浆在50mM Tris pH 8.3、1％(w/v)BSA、1％(v/v)Triton X-100、1％(w/v)N-月桂酰肌氨酸中含有1mg感染或未感染的脑组织。
3、孵育2小时，以俘获朊病毒，然后用50mM Tris pH 8.3、1％(w/v)N-月桂酰肌氨酸将这些孔冲洗3遍。
4、然后用PBS将这些孔冲洗3遍。
5、在每个孔中加入100μl 5M硫氰酸胍，并在4℃下孵育5分钟。
6、用PBS将这些孔冲洗3遍，然后应用Bio-Rad PlateliaTM BSE-检测试剂盒的抗朊病毒缀合物，按照此试剂盒中的方案检测俘获的朊病毒。
7、在OD450下，在ELISA读数器中测定增强的信号。
结果
讨论
在本实验所用的条件下，此阴离子聚苯乙烯表面特异性俘获PrPres。不带电塑料没有这种作用，除非用聚阴离子配体包被它。
实施例9：在阴性样品中稀释阳性脑样品的作用的研究
材料
阳性样品：已知PrPSc阳性脑均浆的25％悬浮液
阴性样品：已知PrPSc阴性脑均浆的25％悬浮液
制备
按照下面包被方案包被Maxisorb平板。在pH7.4的碳酸盐缓冲液中，将1mg溴化己二甲胺包被在这些平板上，并使其过夜后，用PBS冲洗3遍。然后用含1mg葡聚糖硫酸酯的PBS包被这些平板，6小时后，用PBS将这些平板冲洗3遍，然后通过加入400μl 5％ BSA溶液并保持30分钟，用5％ BSA将其封阻。然后用PBS将这些平板冲洗3遍，并使其干燥。
样品制备
在阴性脑中稀释样品的制备
 
样品 方法
纯阳性 40μl阳性样品
1/5 8μl阳性样品+32μl阴性样品
1/10 5μl阳性样品+45μl阴性样品
1/100 6μl稀释1/10的阳性样品+54μl阴性样品
1/250 20μl稀释1/100的阳性样品+30μl阴性样品
1/1000 10μl稀释1/250的阳性样品+30μl阴性样品
纯阴性 25μl阴性样品
在水中稀释样品的制备
 
样品 方法
纯阳性 40μl阳性样品
1/5 8μl阳性样品+32μl水
1/10 5μl阳性样品+45μl水
1/100 6μl稀释1/10的阳性样品+54μl水
1/250 20μl稀释1/100的阳性样品+30μl水
1/1000 10μl稀释1/250的阳性样品+30μl水
进行测定前样品的制备
将40μl样品与60μl水和25μl俘获缓冲液混合，此缓冲液含pH 8.4的Tris 250mM，5％ BSA，5％ Triton X-100，5％ Sarkosyl，1.25mg/ml胰蛋白酶。
按照下面的测定方案进行测定：
1、将100μl样品加至平板上，并在室温下孵育120分钟。
2、用50mM Tris pH8.4+1％ Sarkosyl冲洗3遍，并用PBS冲洗3遍。
3、加入100μl含4M GuSCN的20％PEG，并在2-8℃孵育10分钟。
4、用PBS冲洗3遍。
5、加入100μl Bio-Rad PlateliaTM酶抗体缀合物，并在2-8℃孵育60分钟。
6、用Bio-Rad PlateliaTM洗涤剂冲洗5遍。
7、加入100μl Bio-Rad PlateliaTM底物，并在黑暗中孵育30分钟。
8、加入100μl Bio-Rad PlateliaTM终止溶液，并读数。
平板布置图
所得结果如下：
在阴性脑组织中稀释10mg脑均浆
 
样品标签 阴性脑的量mg 阳性脑的量mg 稀释因子 OD
纯阳性 0.00 10.00 1 4
1/5 8.00 2.00 5 1.992
1/10 9.00 1.00 10 1.252
1/100 9.90 0.10 100 0.175
1/250 9.96 0.04 250 0.077
1/1000 9.99 0.01 1000 0.039
纯阴性 10.00 0.00 0 0.021
在水中稀释10mg脑均浆
 
样品标签 阴性脑的量mg 阳性脑的量mg 稀释因子 0D
纯阳性 0.00 10.00 1 4
1/5 0.00 2.00 5 2.377
1/10 0.00 1.00 10 1.395
1/100 0.00 0.10 100 0.145
1/250 0.00 0.04 250 0.053
1/1000 0.00 0.01 1000 0.016
总结
Figure C03806690D00461
附图1是这些结果的图示，它显示分别用水和阴性脑组织稀释阳性脑组织的稀释曲线。这两个曲线基本上是相同的，表明阴性脑组织材料的存在未干扰此测定。
实施例10：阿耳茨海默脑中的聚集τ蛋白和正常年龄相当对照物的 俘获
我们已表明，在设定的条件下，不同选择性俘获剂对聚集的病原性朊病毒蛋白是特异的，这样不会俘获正常未聚集朊病毒。这种聚集的朊病毒蛋白具有一种伸展的β-折叠片结构，而正常的朊病毒在结构上大部分为α螺旋。这个实施例表明其它聚集的β-折叠片蛋白，诸如阿耳茨海默病中发现的τ聚集体可类似地被选择性俘获。
方法
1、在蒸馏水中制备阿耳茨海默病脑组织和年龄相当对照脑组织的25％(w/v)的脑均浆。
2、在俘获缓冲液(50mM Tris pH 8.4、1％(v/v)Triton X-100、1％(w/v)N-月桂酰肌氨酸、1％(w/v)BSA)中将4μl脑均浆制成100μl。
3、在含有25μg胰蛋白酶的俘获缓冲液中，将25μl脑均浆制成100μl。
4、将按照上面步骤2和3制备的双份100μl等份脑均浆加入葡聚糖硫酸酯包被的微量滴定孔中，并在室温下孵育2小时。
5、然后用50mM Tris pH 8.4、1％(w/v)N-月桂酰肌氨酸将这些孔冲洗3遍。
6、用一种在PBS 0.1％(v/v)Tween20中的抗τ单克隆抗体孵育这些样品。
7、在室温下1小时后，用PBS 0.1％(v/v)Tween20将这些孔冲洗3遍。
8、按照标准步骤，用一种抗鼠IgG辣根过氧化物缀合物检测固定的主要抗体。
结果
抗τ抗体的结果
 
脑组织 1mg脑组织无胰蛋白酶 10mg有胰蛋白酶
阿耳茨海默病1 1.32 1.26
阿耳茨海默病2 0.85 0.62
对照1 0.56 0.20
对照2 0.97 0.51
讨论
已知大部分老年个体的脑组织含有聚集τ蛋白，但在阿耳茨海默病中这些聚集体比年龄相当的对照者更多。在这里，选择性俘获剂俘获这些聚集体。在本实施例中，胰蛋白酶的消化作用减少了此蛋白的结合，并降低了信号，但在这些条件下，不能将其降低至背景值。在阿耳茨海默病中，胰蛋白酶处理后信号与未处理的信号的比率比对照更高。这提示，与年龄相当的对照者相比，阿耳茨海默病的脑组织中存在更多的抵抗蛋白酶的τ蛋白聚集体。
实施例11：在PrP Sc 阳性样品上滴定胰蛋白酶的作用
方法
包被葡聚糖硫酸酯的平板：
将1mg溴化己二甲胺(溴化己二甲胺)(100μl在pH 7.4碳酸盐缓冲液中含10mg/ml)包被在Maxisorb平板上，在室温下使其过夜。
然后用PBS将每个平板冲洗3遍，并用1mg葡聚糖硫酸酯(MW500000)(在pH 8.6的Tris缓冲液中含10mg/ml)包被这些平板，并在室温下保持4小时。
然后用PBS将这些平板冲洗3遍，然后用300μl含5％ BSA溶液的TBS封阻，并在室温下保持30分钟。
然后用PBS将平板冲洗3遍。
俘获缓冲液
pH8.4的250mM Tris缓冲液，它含有5％ BSA、5％ Sarkosyl、5％Triton。
样品
按照以下处理弱和强阳性的脑BI63和SV10(25％均浆)，以提供用于测定的样品。
25μl脑均浆+25μl俘获缓冲液+65μl水，此缓冲液含250mM TrispH 8.4、5％ BSA、5％ Triton X-100、5％ Sarkosyl。
将10μl不同浓度的胰蛋白酶加入样品中。
冲洗缓冲液
50mM Tris pH8.4+1％ Sarkosyl
方法
测定方案
1、将100μl样品加至平板上，并在室温下孵育120分钟。
2、用50mM Tris pH8.4+1％Sarkosyl冲洗3遍，并用PBS冲洗3遍。
3、加入100μl 4MGuSCN(在20％ PEG中)，在2-8℃孵育10分钟。
4、用PBS冲洗3遍。
5、加入100μl Bio-RadPlateliaTM酶抗体缀合物，并在2-8℃孵育60分钟。
6、用Bio-Rad PlateliaTM洗涤剂冲洗5遍。
7、加入100μl Bio-Rad PlateliaTM底物，并在黑暗中孵育30分钟。
8、加入100μl Bio-Rad PlateliaTM终止溶液，并读数。
结果
5mg阳性脑Bi63
 
胰蛋白酶(μg) OD
1000 0.135
100 0.14
25 0.169
10 0.173
1 0.068
0 0.068
5mg阳性脑SV10
 
胰蛋白酶(μg) OD
25 2.858
0 0.894
结论
胰蛋白酶的存在似乎可增强此信号。还有，似乎所用胰蛋白酶的浓度范围可以宽泛，这对测定没有不良的影响。
实施例12：通过聚阳离子对PrP Sc 特异性结合的论证
方法
本实施例证明应用不同的聚阳离子进行PrPSc的特异性结合。或者将此配体被动地包被在聚苯乙烯微量平板上，或者适当地，主动地将其包被在马来酸酐平板上(即结合)。
选择性结合剂固定
在16-25℃，以浓度为10μg/ml，将所有选择性结合剂固定在pH9.6的50mM碳酸盐缓冲液中，过夜。固定后，用PBS将这些孔冲洗3遍，然后用含5％(w/v)BSA的PBS封阻30分钟。封阻后，在使用前用PBS将这些\冲洗2遍。将PAMA树突状聚合物starbust、聚L-赖氨酸和\聚乙烯亚胺包被在Maxisorp和马来酸酐微量平\板两者上，而将polybreen和pDADMAC只包被在Maxisorp板上。
PrPSc的俘获
1、按照市售规定的方案，在蒸馏水中均化感染BSE牛脑和未感染牛脑。
2、在总量为100μl的50mM Tris pH8.3、1％(w/v)N-月桂酰肌氨酸、1％(v/v)Triton X-100、1％(w/v)BSA、0.5mg/ml胰蛋白酶(猪胰腺)中，于包被配体的孔中俘获0.5mg均化脑组织。
3、在18-25℃俘获2小时后，用50mM Tris pH 8.3、1％(w/v)N-月桂酰肌氨酸将这些孔冲洗3遍。
4、然后用PBS将这些孔冲洗3遍，并在4-8℃，用100μl4M硫氰酸胍、20％ PEG 8000将这些孔孵育10分钟。
5、用PBS冲洗这些孔3遍，然后用一种抗朊病毒单克隆抗体辣根过氧化物缀合物孵育这些孔。
6、60分钟后，用PBS，0.1％(v/v)Tween20将这些孔冲洗5遍，并加入100μl TMB底物。
7、30分钟后，测定每个反应的OD450，并记录(见下表)。
结果
Figure C03806690D00531
*Aldrich 40903-0-mw 400,000-500,000
讨论
当将pDADMAC和PAMA树突状聚合物starburst聚阳离子被动地包被在聚苯乙烯微量平板上时，它们很好地充当了PrPSc特异性配体。在这一系列结合剂中pDADMAC作用最佳。当将聚乙烯亚胺固定在马来酸酐微量平板上时，它通过氨基发挥一定程度的作用。
这个实验表明，在给定的俘获缓冲液条件下，不同聚阳离子可用于特异性俘获感染脑组织中的PrPSc。可将这些结合剂被动或主动地固定在聚乙烯亚胺表面。其它实验已经表明，在俘获缓冲液中具有1％(w/v)N-月桂酰肌氨酸时，可获得20mg阳性脑组织的最大信号；没有N-月桂酰肌氨酸时，此信号减小。这表明在规定的缓冲条件下这些俘获剂作用最佳。
实施例13：通过聚阳离子结合剂，俘获阿耳茨海默病脑组织和正常 年龄相当对照物中的聚集β淀粉状蛋白和τ蛋白
背景技术
在规定的条件下，已显示出pDADMAC可特异地俘获聚集的病原性朊病毒蛋白；而正常非聚集朊病毒未被俘获。这种聚集的朊病毒蛋白具有一种伸展的β-折叠片结构，而正常的朊病毒在结构上大部分为α螺旋。假定此结合剂可识别其它聚集的β-折叠片蛋白，诸如阿耳茨海默病中发现的β-淀粉状蛋白和τ蛋白聚集体。进行下面的实验，以研究此假说。
方法
1、在蒸馏水中制备阿耳茨海默病脑组织和年龄相当对照脑组织的25％(w/v)的脑均浆。
2、在俘获缓冲液(50mM Tris pH 8.4、1％(v/v)Triton X-100、1％(w/v)N-月桂酰肌氨酸、1％(w/v)BSA)中将80μl脑均浆制成100μl，并将其加至包被聚阳离子的微孔(通过用聚(氯化二烯丙基二甲铵)(pDADMAC)包被这些孔而形成，(Aldrich Chemical Company Inc.，产品目录号40,903-0))上。
3、在室温下孵育2小时后，用50mM Tris pH 8.4，1％(w/v)N-月桂酰肌氨酸将这些孔冲洗3遍，然后用一种在PBS 0.1％(v/v)Tween 20中的抗τ单克隆抗体进行孵育。
4、在室温下1小时后，用PBS 0.1％(v/v)Tween20将这些孔冲洗3遍。
5、按照标准步骤，用抗鼠IgG辣根过氧化物缀合物检测固定的主要抗体。
结果
 
脑组织 脑库分类 OD450
67/97 阳性 1.85
73/97 阳性 0.80
163/97 阳性 0.61
149/97 阳性 0.45
97/97 阴性 0.05
98/98 阴性 0.08
讨论
这些聚阳离子结合剂可俘获τ聚集体。当用抗τ抗体检测俘获的T蛋白时，阿耳茨海默病的脑组织的阳性信号均高，而阴性对照脑组织则为低的阴性信号。总之，在指定条件下用聚阳离子进行俘获，可将阿耳茨海默病脑组织和未患病的脑组织区分开。
实施例14：不同蛋白酶和DNase对pDADMAC俘获PrPSc的基质抑制的影响
背景技术
研究不同蛋白酶对俘获PrPSc效力的影响，此俘获是将PrPSc俘获在聚阳离子包被的平板(通过用聚(氯化二烯丙基二甲铵)(pDADMAC)包被这些孔而形成，(Aldrich Chemical Company Inc.，产品目录号40,903-0))上。
方法
1、加入20μl俘获缓冲液(250mM Tris pH 8.3、5％(v/v)TritonX-100、5％(w/v)N-月桂酰肌氨酸、5％(w/v)BSA)，将80μl脑均浆制成100μl，此缓冲液中含有不同的蛋白酶和/或DNase。
2、然后将这些均浆加至聚阳离子包被的微孔上。
3、在室温下孵育2小时后，用PBS将这些孔冲洗6遍。
4、将100μl 4M硫氰酸胍、20％(w/v)PEG加至每个孔中。
5、在室温下孵育10分钟后，用PBS将这些孔冲洗3遍。
6、加入100μl抗朊病毒蛋白辣根过氧化物缀合物(在PBS 0.1％(v/v)Tween 2C和5％(w/v)BSA中稀释为1:1500)。
7、在室温下1小时后，用PBS 0.1％(v/v)Tween20将这些孔冲洗5遍。
8、按照标准方案，用TMB溶液检测固定的缀合物。
结果
评价俘获缓冲液中糜蛋白酶、胰蛋白酶、DNase和蛋白酶K的作用
 
所用的蛋白酶或DNase 感染的牛脑组织
无蛋白酶或DNase 0.122
糜蛋白酶/胰蛋白酶(浓度均为6.25mg/ml) 0.139
DNase/胰蛋白酶(DNase浓度1mg/ml，胰蛋白酶浓度6.25mg/ml) 0.639
糜蛋白酶/DNase(DNase浓度1mg/ml，糜蛋白酶浓度6.25mg/ml) 0.616
糜蛋白酶/DNase/胰蛋白酶(DNase浓度1mg/ml，糜蛋白酶和胰蛋白酶浓度均为6.25mg/ml)                                  0.460
胰蛋白酶(浓度为6.25mg/ml) 0.568
糜蛋白酶(浓度为6.25mg/ml) 0.171
DNase(浓度为1mg/ml) 0.180
蛋白酶K(浓度为1mg/ml) 0.531
链霉蛋白酶(浓度为1.25mg/ml) 0.222
链霉蛋白酶(浓度为6.25mg/ml) 0.178
滴定俘获缓冲液中胰蛋白酶和糜蛋白酶的浓度
 
所用的蛋白酶 感染的牛脑组织
胰蛋白酶6.25mg/ml 0.732
胰蛋白酶1.25mg/ml 0.726
糜蛋白酶3.125mg/ml 0.568
糜蛋白酶0.625mg/ml 0.433
讨论
已证明，在某些条件下聚阳离子配体可特异性地结合PrPSc。但是，脑均浆的构成产生的基质作用可减小此信号，这种基质作用可干扰结合，并减小信号。应用蛋白酶可减小这种基质作用，并增大感染脑组织中的信号。此研究表明胰蛋白酶、糜蛋白酶和蛋白酶K在去除基质抑制方面是有效的；链霉蛋白酶(在研究的浓度下)的有效性较低。浓度6.25-1.15mg/ml的胰蛋白酶，其有效性是相等的；而随着浓度升高，糜蛋白酶的有效性则更高。在去除基质抑制方面，DNase具有可论证的作用，但此作用较小。
实施例15：pH和盐对pDADMAC俘获朊病毒蛋白的影响
背景技术
研究pH和盐浓度对俘获PrPSc效力的影响，此俘获是将PrPSc俘获在聚阳离子包被的平板(通过用聚(氯化二烯丙基二甲铵)(pDADMAC)包被这些孔而形成，(Aldrich Chemical Company Inc.，产品目录号40,903-0))上。
方法
1、加入20μl俘获缓冲液(250mM Tris，pH见表、5％(v/v)TritonX-100、5％(w/v)N-月桂酰肌氨酸、5％(w/v)BSA和6.25mg/ml胰蛋白酶)，将80μl脑均浆制成100μl，此缓冲液中含有不同浓度的盐，且被调节至不同的pH。
2、然后将这些均浆加至聚阳离子包被的微孔上。
3、在室温下孵育2小时后，用PBS将这些孔冲洗6遍。
4、将100μl 4M硫氰酸胍、20％(w/v)PEG加至每个孔中。
5、在室温下孵育10分钟后，用PBS将这些孔冲洗3遍。
6、加入100μl抗朊病毒蛋白辣根过氧化物缀合物(在PBS 0.1％(v/v)Tween 20和5％(w/v)BSA中稀释为1:1500)。
7、在室温下1小时后，用PBS 0.1％(v/v)Tween20将这些孔冲洗5遍。
8、按照标准方案，用TMB溶液检测固定的缀合物，并测定此反应的OD450。
结果
DH的影响
 
俘获缓冲液pH值 感染的牛脑组织 阴性的牛脑组织
5 0.177 0.119
6 0.082 0.1
7 0.093 0.045
8.4 0.226 0.039
9 0.24 0.038
10 0.25 0.037
盐的影响
 
俘获缓冲液 感染的牛脑组织 未感染的牛脑组织
20mM NaCl 0.476 0.038
100mM NaCl 0.361 0.039
250mM NaCl 0.191 0.028
1M NaCl 0.06 0.024
讨论
当俘获缓冲液的pH值下降时，未感染脑组织的信号升高，但感染脑组织的信号却下降。当pH值大于8.0时，获得最佳的阳性/阴性信号比。
当俘获缓冲液中的盐浓度升高时，感染脑的信号逐渐下降。这表明对于PrPSc俘获，低盐浓度或没有盐是最佳的条件。
实施例16：不同的N-月桂酰肌氨酸和蛋白酶的浓度对pDADMAC俘 获PrP Sc 的影响
背景技术
研究胰蛋白酶存在或不存在情况下，不同N-月桂酰肌氨酸浓度对俘获PrPSc效力的影响，此俘获是将PrPSc俘获在聚阳离子包被的平板(通过用聚(氯化二烯丙基二甲铵)(pDADMAC)包被这些孔而形成，(AldrichChemical Company Inc.，产品目录号40,903-0))上。
方法
1、加入20μl俘获缓冲液(250mM Tris pH8.3、5％(v/v)TritonX-100、5％(w/v)BSA)，将80μl感染的脑均浆制成100μl，此缓冲液中含有不同浓度的蛋白酶和N-月桂酰肌氨酸。
2、然后将这些均浆加至聚阳离子包被的微孔上。
3、在室温下孵育2小时后，用PBS将这些孔冲洗6遍。
4、将100μl 4M硫氰酸胍、20％(w/v)PEG加至每个孔中。
5、在室温下孵育10分钟后，用PBS将这些孔冲洗3遍。
6、加入100μl抗朊病毒蛋白辣根过氧化物缀合物(在PBS 0.1％(v/v)Tween 20和5％(w/v)BSA中稀释为1:1500)。
7、在室温下1小时后，用PBS 0.1％(v/v)Tween20将这些孔冲洗5遍。
8、按照标准方案，用TMB溶液检测固定的缀合物。
结果
Figure C03806690D00611
讨论
在没有N-月桂酰肌氨酸的情况下，具有低浓度胰蛋白酶的感染脑组织没有信号。但是，在较高浓度的胰蛋白酶下，不含N-月桂酰肌氨酸的脑组织恢复一些信号。
尽管通过优选的实施方式对本发明进行了特别的描述，但将会理解到对本发明的许多修改和改变是可能在本发明的一般范围内。如权利要求详述的，按照相同方法产生相同结果的对本发明的任何改变是在申请人所给予的保护范围内。
在本说明书中，除非特意地另作说明，术语“或”用作运算符，当任一或两者所述的条件符合时，它返回一个真值，这与运算符“异或”相反，“异或”运算符需要只有其中一个条件符合。术语“包括”的意思是“包括”，而不是“由...组成”的意思。

Claims (37)

1、在一种蛋白的非聚集正常形式存在的情况下选择性结合此蛋白聚集异常形式的方法，它包括在选择性结合条件下使一种含有所述蛋白聚集异常形式和蛋白非聚集正常形式的物质与一种结合剂接触，此结合剂为聚阴离子多糖苷、聚乙烯亚胺或聚胺。
2.一种权利要求1的方法，其中所述聚胺是聚酰胺胺或聚季铵。
3、一种权利要求1要求的方法，其中所述的选择性结合条件包括溶液中存在一种竞争剂，此竞争剂具有离子基团，此基团对此异常形式蛋白的结合亲和力低于结合剂。
4、一种权利要求1-3任一项所要求的方法，其中结合剂是抗蛋白酶的。
5、一种权利要求1-3任一项所要求的方法，其中在所述结合过程中存在蛋白酶，或者其中在被结合后使所述的蛋白暴露于一种蛋白酶的作用。
6、一种权利要求1或2所要求的方法，其中聚阴离子多糖苷为一种聚磺化多糖苷。
7、一种权利要求6所要求的方法，其中聚阴离子多糖苷为一种聚阴离子戊聚糖或葡聚糖。
8、一种权利要求6所要求的方法，其中聚磺化多糖苷为戊聚糖聚硫酸酯或葡聚糖硫酸酯。
9、一种权利要求1或2所要求的方法，其中所述结合剂为溴化己二甲胺、PAMAM树突状聚合物、聚L-赖氨酸、pDADMAC或聚乙烯亚胺。
10、一种权利要求3所要求的方法，其中竞争剂离子基团的密度低于此结合剂。
11、一种权利要求10所要求的方法，其中此竞争剂是阴离子的。
12、一种权利要求11所要求的方法，其中此竞争剂为一种阴离子去污剂。
13、一种权利要求11所要求的方法，其中此竞争剂为一种脂肪酸的氨基酸酰胺。
14、一种权利要求13所要求的方法，其中此竞争剂为n-月桂酰肌氨酸。
15、一种权利要求1-3任一项所要求的方法，其中此pH值为8～9。
16、一种权利要求15所要求的方法，其中此pH值为8.2～8.6。
17、一种权利要求1-3任一项所要求的方法，其中存在一种去污剂，它促进结合剂与此异常形式蛋白的结合。
18、一种权利要求1-3任一项所要求的方法，其中所述结合剂在与所述聚集异常形式蛋白结合后，用一种固定的俘获剂俘获此结合剂。
19、一种权利要求18所要求的方法，其中所述俘获剂为一种凝集素或一种可与所述结合剂反应的抗体。
20、一种权利要求18所要求的方法，其中提供的所述结合剂具有选择性可结合标记部分，而且所述俘获剂与所述标记部分结合。
21、一种权利要求1-3任一项所要求的方法，其中在此结合剂暴露于所述异常形式蛋白之前，将此结合剂固定在一种固体介质上。
22、一种权利要求21所要求的方法，其中介质为一种所述结合剂包被在其上的底物。
23、一种权利要求21所要求的方法，其中提供的结合剂具有一种选择性可结合标记部分，并且通过所述标记部分将此结合剂固定在所述固体介质上。
24、权利要求20或权利要求23中所要求的方法，其中所述的可结合标记部分为生物素、荧光素、二硝基苯酚、异羟洋地黄毒苷元、核酸或核酸类似物序列或His6。
25、权利要求1-3任一项所要求的方法，其中为固体形式的所述结合剂提供一种表面，此表面具有所述的结合亲和力。
26、一种权利要求25所要求的方法，其中此表面是一种具有离子基团的聚合物的表面，这些离子基团是在此聚合物结构内共价结合的，或者是通过修饰此聚合物的表面基团而产生的。
27、一种测定方法，它用于测定样品中异常聚集形式蛋白的存在，所述方法包括按照上述任一权利要求，结合所述异常形式蛋白，然后测定此蛋白与结合剂的结合的存在或结合量。
28、一种权利要求27所要求的方法，其中通过对此蛋白聚集形式进行免疫测定，定性或定量地测定所述结合。
29、一种权利要求27或28所要求的方法，其中在正常非聚集形式蛋白存在的情况下，选择性地进行蛋白异常聚集形式的结合，然后从非结合正常形式蛋白中分离结合的聚集形式的蛋白，此后测定所述结合的存在或量。
30、一种权利要求27或28要求的方法，其中所述异常形式的蛋白为PrPSc，所述正常形式的蛋白为PrPc。
31、一种从PrPc中分离PrPSc的方法，它包括在一种脂肪酸的氨基酸酰胺存在下，选择性地将PrPSc结合于一种为聚离子物质的结合剂。
32、一种权利要求31所要求的方法，其中脂肪酸的氨基酸酰胺为N-月桂酰肌氨酸。
33、一种权利要求31的方法，此方法在pH为8～9下进行。
34、一种选择性结合剂，它是一种缀合于可结合的标记部分的聚阴离子多糖苷，缀合于可结合的标记部分的己二甲胺，或者是一种缀合于可结合的标记部分的聚阳离子结合剂，结合剂可被固定在固体介质上，由此通过所述可结合标记部分与所述固体介质上的俘获剂结合。
35、一种权利要求34所要求的选择性结合剂，其中此结合剂为聚磺化多糖苷。
36、一种权利要求34所要求的选择性结合剂，其中此结合剂为聚阴离子戊聚糖或葡聚糖。
37、一种权利要求34所要求的选择性结合剂，其中此结合剂为一种聚阳离子物质，它选自溴化己二甲胺、PAMAM树突状聚合物、聚L-赖氨酸、pDADMAC或聚乙烯亚胺。
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