CN100504370C - 电化学超微电极制备工艺 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种电化学超微电极制备工艺，其是将超微工作电极与对/准参比电极组合集成在一起，形成两电极系统，两电极之间用纳米厚度的绝缘层隔离，以使两电极上的扩散层发生重合后电化学可逆的质点在一个电极上氧化或还原，在另一个电极上通过还原或氧化再生，然后再返扩散至原来的电极上，从而使探测细胞之电极上输出的电流信号被放大。本发明能显著降低溶液电阻，极大地提高实际体系分析的可用扫速及检测灵敏度，把对研究体系的损伤降低到最小，其组合电极制作简便，寿命长且容易更新，是一种高性能电化学生物传感器，可用于单细胞释放的高时空分辨动态检测及对细胞内单个囊泡进行实时动态的分析研究。

Description

电化学超微电极制备工艺

【技术领域】

本发明涉及电分析化学、生物传感器技术领域，具体涉及一种超微电极组合方法以及根据该方法制作的超微组合电极结构和制作该电极之工艺方法。

【背景技术】

细胞是生物的基本单元，是进化的起点，是生命科学必须加以认识的基本对象。发展细胞内探测的新技术，对单个细胞以及细胞内单个突触、囊泡中的多巴胺(Dopamine，DA)等神经递质、一氧化氮(NO)、过氧化氢(H₂O₂)和氧自由基等信息分子进行在体、实时和动态的化学探测，是分析化学极具挑战性的前沿课题，也是深入研究脑和神经系统功能的重要切入点。

细胞内神经递质和信息分子的检测技术已经得到广泛的研究，其中荧光组织化学法和免疫组织学法只能间接测定神经递质，而对于一些活性高、寿命短、极不稳定的自由基则很难测定，更无法进行胞内实时检测。电化学伏安法具有时间分辨和空间分辨的特性，为在体、实时、动态分析提供了必要的基础，成为研究中枢神经活动的主要方法。伏安法的应用能力取决于扫描速率上限，扫描速度或频率越高，其所能分辨的动力学时间窗口就越向低端延伸，就可以研究越快的异相电子传递过程及其耦合的均相化学过程，追踪越短寿命的中间体，大大扩展对电子转移和化学反应动力学的认识。由于生理体系中溶液电阻R_s远远大于理想体系的电阻，超快伏安法在生理环境中的可用扫速很少超过几个kV/s，远远小于理想体系中的最高扫速。虽然R_s可以通过正反馈技术进行补偿，但R_s越大，使用的反馈电阻和补偿电阻也越大，导致仪器和电路带宽降低，使其最终不能用于超快伏安分析。常规的细胞内伏安探测，是将超微工作电极插入待测细胞中，对电极和参比电极置于细胞外较远处使之不影响操作，这种探测方法跨越细胞膜，不仅溶液电阻较大，对细胞体系的刺激和扰动也很大，直接影响测量结果的可信度和灵敏度。

目前普通的工作电极体积较大，对待测体系的扰动、损伤较大，无法在活体、现场的超快伏安研究中建立一个低溶液电阻的电极系统，这样导致了仪器和电路带宽的降低，使得检测的灵敏度降低，并最终影响到检测结果的可信度。中国专利局公开了一种复合型微电极的制备工艺(申请号：03137469.7)，其提供了一种复合型微电极中的微型参比电极制作的一种方法，它是采用玻璃毛细管将微米级的银丝、铂丝以及碳纤维经绝缘封装在一个细金属管内腔中，其中，碳纤维电极玻璃毛细管两端用固体石蜡熔化封口；微型银/氯化银(Ag/AgCl)微型参比电极利用玻璃毛细管的毛细现象，在毛细管中封存一段已饱和氯化银的氯化钾饱和溶液；铂丝对电极玻璃毛细管两端用熔化的固体石蜡封口。但是，上述方法采用三级电极系统，依据该方法得到的复合型微电极也仅仅是在细胞测量中由微型参比电极提供了较稳定的参比电位，虽然在一定程度上提高了测量的精确度，但所制得的复合型微电极无法适应、满足神经递质、一氧化氮(NO)、过氧化氢(H₂O₂)和氧自由基等多种信息分子进行在体、实时和动态的化学探测要求。

因此，在进行活体、现场的超快伏安研究中，建立一个低溶液电阻的新型微电极系统，减小对细胞生命活动的干扰，以提高在实际分析环境中的可用扫速和检测灵敏度，非常必要而且重要。

【发明内容】

本发明所要解决的技术问题是克服上述现有普通电极系统检测中存在溶液电阻较大，对细胞体系的刺激和扰动大所带来的对测量结果的可信度和灵敏度影响之缺陷，提供一种适用面广、体积小的超微电极的组合方法及由此方法得到的超微组合电极和该超微组合电极的制备工艺，用于可显著降低溶液电阻，极大地提高在实际体系分析的可用扫速及检测灵敏度，把对研究体系的损伤减小到最少。

为实现上述发明目的，本发明所提出的技术方案是：

一种电化学超微电极的组合方法，其特征在于：其是将超微工作电极与对/准参比电极组合集成在一起，形成两电极系统，所述超微工作电极与对/准参比电极之间通过纳米厚度的绝缘层隔离，使两电极上的扩散层发生重合后电化学可逆的质点在一个电极上氧化或还原，而在另一个电极上通过还原或氧化再生，然后再返扩散至原来的电极上，从而使探测细胞之电极上输出的电流信号被放大。

一种电化学超微组合电极结构，其特征在于：其包括超微工作电极、对/准参比电极以及玻璃毛细管，所述超微工作电极一端密封且固定于玻璃毛细管内，其端点通过导电胶与导线连接；所述超微工作电极另一端表面均匀涂覆或聚合有一纳米厚度的绝缘层，该绝缘层及所述玻璃毛细管外表面均匀镀有一金属层，该金属层由另一导线引出，构成对/准参比电极。

上述结构中，所述超微工作电极为碳材基础电极或金属超微电极，其中碳材基础电极材料可优选碳纤维或碳纳米材料，金属超微电极材料优选为金或铂金属；

所述绝缘层由绝缘漆、环氧树脂或高分子聚合物构成；

所述对/准参比电极由金、铂、银贵金属材料或稀有金属材料构成。

本发明还提供了上述电化学超微组合电极的制备工艺，其特征在于包括下列具体步骤：

先将超微工作电极一端通过导电胶与导线粘接，然后将该端密封固定于毛细管中，导线露出于毛细管外；再于超微工作电极另一端未密封的表面均匀涂覆或聚合一纳米厚度的绝缘层，然后在该绝缘层及玻璃毛细管外表面均匀镀上一金属层，用导线引出使其构成对/准参比电极，最后将涂覆有金属层和绝缘层的电极前端垂直切断，露出的超微工作电极截面作为超微组合电极。

上述方法中，所述绝缘层之涂覆工艺为将超微工作电极浸入绝缘漆或环氧树脂中，经1～5分钟后取出烘干，其绝缘层的厚度控制在100-500nm之间；

所述绝缘层之聚合为将超微工作电极浸入苯酚和2—烯丙基苯酚溶液中，在超微工作电极上施加2V～5V的电压，使上述两种化学物质聚合，在超微工作电极表面形成高分子聚合绝缘层，其绝缘层的厚度控制在10-50nm之间；

所述金属层涂敷采用蒸发或溅射的方法在绝缘层和毛细管外壁镀上一层金、铂、银金属或稀有金属，其金属层厚度控制在50-80nm之间。

作为其制备工艺之进一步，本发明于超微工作电极在粘结导线及密封于毛细管前，由碳材构成的超微工作电极采用丙酮、乙醇、双蒸水或其混合物超声清洗干净并干燥，由金或铂金属材料构成的超微工作电极采用硝酸、王水清洗并干燥。

与现有技术相比，本发明具有下列技术效果：

(1)本发明通过将超微工作电极与对/准参比电极组合集成两电极系统，且超微工作电极与对/准参比电极之间用纳米厚度的绝缘层隔离，由此构成的超微组合电极体积小，工作电极和对/准参比电极可以同时置于待测体系，故而能够极大地减小对细胞生命活动体系的扰动，可把对体系造成的损伤降低到最小；

(2)本发明由于在超微组合电极上扩散层的互相重合，电化学可逆的质点会产生氧化还原再生循环，可使探测细胞之电极上输出电流信号得到放大，从而极大地提高了检测灵敏度；

(3)本发明构成的超微组合电极在很大程度上降低了溶液电阻，所使用的反馈电阻和补偿电阻也会相应减小，因而不会影响仪器和电路的带宽；

(4)本发明超微组合电极能够极大地提高实际体系分析的可用扫速，能够捕捉到瞬间动态的信息，有利于深入研究分析体系的电子转移和化学反应动力学；

(5)本发明超微组合电极使用寿命长，将电极前端垂直切断露出新鲜工作电极，即可实现对电极的更新，操作简单，稳定性好；

(6)本发明超微组合电极制备工艺简单、实用，操作容易，制作条件容易控制，成本低廉，在一般化学实验室均可制作，具有较好的推广应用价值。

本发明提供的超微组合电极能够显著降低溶液电阻，极大地提高在实际体系分析的可用扫速及检测灵敏度，把对研究体系的损伤减小到最少，是一种高性能的电化学生物传感器，可用于单细胞释放的高时空分辨动态检测及对细胞内单个囊泡进行实时动态的分析研究。

【附图说明】

图1为本发明电化学超微组合电极的结构端面和侧面示意图；

图2为12mmol/L蒽在以0.1mol/L四氟硼酸四乙基铵(NEt₄BF₄)支持电解质的乙腈溶液中扫速为1.34MV/s时的循环伏安图；

图3为10μmol/L DA在0.1mol/L磷酸缓冲溶液中在金/铂超微组合电极上扫速为20mV/s时的差分脉冲伏安图；

图4为10μmol/L DA在0.1mol/L磷酸缓冲溶液中在超微金盘电极上扫速为20mV/s时的差分脉冲伏安图；

图5为1.0mmol/L铁氰化钾在0.5mol/l氯化钾溶液中分别在碳纤维/铂超微组合电极和碳纤盘面电极上扫速为100mV/s的循环伏安图。

其图1中：

1、超微工作电极，2、玻璃毛细管，3、导电胶，4、导线，5、绝缘层，6、金属层，7、环氧树脂；M、端面，N、侧面。

【具体实施方式】

本发明提供了一种适用面广、体积小的超微组合电极的组合方法及由此方法得到的超微组合电极和该超微组合电极的制备工艺。

首先，本发明提供了一种电化学超微组合电极的组合方法，其是将超微工作电极与对/准参比电极组合集成在一起，形成两电极系统，超微工作电极与对/准参比电极之间用纳米厚度的绝缘层隔离，这样，可使得两电极上的扩散层发生重合，电化学可逆的质点可在一个电极上得到氧化或还原，而在另一个电极上通过还原或氧化得到再生，然后再返扩散至原来的电极上。由于将超微工作电极和对/准参比电极集成在一起，超微工作电极和对/准参比电极之间用绝缘层隔开后，此时两电极处于短路状态。根据超微圆盘电极的传质扩散理论，传质速率Ms的表达式如下：

$M_s=\frac{4D}{\mathrm{\πr}}$

式中D为质点的扩散系数，r是圆盘电极的半径。在时间t内，质点在扩散场中的移动距离，即扩散层厚度为M_st。假设r＝3μm，质点在水溶液中典型的扩散系数D＝5×10^-6cm²/s，扫速为kV/s时，完成一次扫描所需时间为ms级，因此扩散层厚度可以达到几百nm，随着扫速的提高，扩散层厚度相应变薄。显然，通过合理控制绝缘层的厚度，超微工作电极和对/准参比电极上的扩散层将会重合，此时电化学可逆的质点在一个电极上得到氧化或还原，而在另一个电极上通过还原或氧化得到再生，然后再返扩散至原来的电极上，因此产生氧化还原循环使输出的电流信号得到放大，而放大的倍数取决于所述绝缘层的厚度以及质点的动力学和电化学性质，一般来说，绝缘层愈薄，质点的反应动力学愈快，放大的倍数则愈大。同时分析研究的可用扫速也得到了提高。

有了上述理论基础，再根据图1解读本发明中超微组合电极的结构。如图1所示，本发明根据上述方法所设计的一种电化学超微组合电极，包括超微工作电极1及玻璃毛细管2，所述的超微工作电极1部分置于玻璃毛细管2内，其置入玻璃毛细管7内之超微工作电极1端点通过导电胶3与一导线4.1连接，该导线4.1用环氧树脂7密封固定于玻璃毛细管2内，其端头露出玻璃毛细管2外；在所述的超微工作电极1另一端外表面，均匀涂覆或聚合有一层纳米厚度的绝缘层5，该绝缘层5及所述的玻璃毛细管7外表面均匀镀有一层金属层6，该金属层6由另一导线4.2引出，成为所述的对/准参比电极，形成超微工作电极和对/准参比电极之集成组合电极结构。

上述组合电极结构中，所述超微工作电极1可为碳材基础电极或金属电极，其中碳材基础电极可由碳纤维材料或碳纳米材料构成，金属电极可为金、铂等金属材料制成，采用上述材料的优点是制作的电极生物相容性好，对一些生物分子有电化学催化作用，且购买方便，制作简单。

所述绝缘层5由绝缘漆、环氧树脂或高分子聚合物构成，其中绝缘漆可为阳极电泳漆、阴极电泳漆或汽车底漆等，高分子聚合物可为聚邻苯二胺、聚乙烯吡啶、聚(L-赖氨酸)、苯酚与2—烯丙基苯酚的共聚物等电化学惰性聚合物，采用上述材料的优点是由此构成的绝缘层5绝缘效果好，绝缘膜致密均匀，稳定性好。

所述金属层6由金、铂、银等贵金属材料或稀有金属材料(如铑、铱等)构成，采用上述材料的优点是由此构成的对/准参比电极导电能力强，电化学性质稳定，表面容易清洗，不易被污染。

根据上述组合方法所设计的超微组合电极结构制备工艺是：

先将超微工作电极1一端通过导电胶3与导线4.1粘接，然后将该电极一部分密封固定于玻璃毛细管2中，导线4.1端头露出于玻璃毛细管2外；再在超微工作电极1露出玻璃毛细管2外之未密封的一端表面均匀涂覆或聚合有一纳米厚度的绝缘层5，然后在该绝缘层5及玻璃毛细管2外表面均匀镀上一金属层6，用导线4.2引出使其构成对/准参比电极，最后将涂覆有金属层6和绝缘层5的电极前端垂直切断，露出的超微工作电极截面作为超微组合电极。

上述制作过程中，所述绝缘层5之涂覆工艺为：将超微工作电极1浸入绝缘漆或环氧树脂中，经1～5分钟后取出，然后在60℃～80℃下烘干，其绝缘层5的厚度控制在100-500nm之间。实验证明，选择上述厚度的绝缘层可在中等扫速下电活性质点在工作电极和对/准参比电极上的扩散层发生重合，电化学响应信号得以再生放大，从而提高检测的灵敏度。

所述绝缘层5之聚合工艺为：将超微工作电极1浸入苯酚和2—烯丙基苯酚溶液中，然后在超微工作电极1上施加2V～5V的电压，使上述两种化学物质产生聚合，在超微工作电极1表面可形成高分子聚合绝缘层，其绝缘层5的厚度控制在10-50nm之间。实验证明，选择上述厚度的绝缘层可极大地降低溶液电阻，大大提高实际体系分析的可用扫速，便于研究体系的电子转移和化学反应动力学。

所述金属层6之涂覆工艺为：蒸发或溅射方法(为现有技术工艺)在绝缘层5和玻璃毛细管2外壁镀上一层金、铂、银等贵金属或稀有金属，其金属层6厚度控制在50-80nm之间。实验证明，选择上述厚度的金属层导电性好，稳定，不易脱落。

为去除电极表面杂质，进一步提高检测灵敏度及检测质量，所述超微工作电极1在粘结导线4.1及密封于玻璃毛细管2前，采用清洗工艺对其进行清洗，其中由碳材料构成的超微工作电极1采用用丙酮、乙醇、双蒸水或其混合物超声清洗干净并做干燥处理，由金或铂金属材料构成的超微工作电极1则采用硝酸、王水清洗并做干燥处理。

以下再通过制备工艺的具体实施例以及应用和附图来解析本发明的特点和优点。

实施例1：碳纤维/金(CF/Au)超微组合电极

本实施例中选用碳纤维电极和金来作为两电极的组合，清洗用乙醇、双蒸水超声清洗；导电胶采用银导电胶；绝缘层采用聚合方式形成。其具体制作工艺为：先将碳纤维电极置于丙酮中回流8小时，再用乙醇、双蒸水超声清洗，完全干燥后截取3cm长度，然后用银导电胶粘接于

0.1mm的铜丝末端，置于

1.0mm玻璃毛细管中，在玻璃毛细管拉制器上将碳纤维电极密封于该玻璃毛细管内，玻璃毛细管另一端露出的铜导线用环氧树脂密封固定；再将碳纤维电极浸在苯酚和2—烯丙基苯酚溶液中，在碳纤维电极上维持恒电位4V约5～7min，使苯酚和2—烯丙基苯酚在碳纤维表面发生聚合，经140℃高温烘烤后形成厚度约为10nm的绝缘层，在绝缘层上蒸发镀上一层约70nm厚的金，用铜导线引出后作为对/准参比对电极，最后，将涂覆有金层和绝缘层的碳纤电极前端垂直切断，即获得碳纤维/金(CF/Au)超微组合电极。用上述相同的处理方法，在碳纤电极表面形成绝缘层后，直接将电极前端切断，不镀金层，即获得碳纤盘面电极。

将上述制得的碳纤维/金(CF/Au)超微组合电极和碳纤盘面电极用于检测蒽做比较：分别插入以0.1mol/L NEt₄BF₄为支持电解质的12mmol/L蒽的乙腈溶液中，在1.34MV/s的扫速下测循环伏安特性，得到附图2。图中伏安曲线a使用以碳纤盘面电极为工作电极的传统二电极体系，由于支持电解质浓度低，R_s较大，在维持电路带宽的前提下已不能实现100％补偿，仅能补偿约40％，无法分辨法拉第峰；曲线b使用超微组合电极，由于R_s明显降低，欧姆降减小，可以清楚地看到法拉第峰，但如果不补偿，欧姆降仍有残余，所以峰间距ΔE_p比理论值要大。但此时已经可以通过电子正反馈技术完全补偿欧姆降，如伏安曲线c所示，此时实验曲线c与模拟曲线d基本吻合。

实施例2：金/铂(Au/Pt)超微组合电极

金/铂(Au/Pt)超微组合电极的制备工艺与实施例1类似，确认好使用的各种材料和方法后，首先将直径5nm的金丝在硝酸、双蒸水中清洗，干燥后用导电胶与铜导线粘接，置于毛细管中拉制密封，在金丝表面涂覆绝缘漆，烘干后得到厚度为120nm的绝缘层，然后在绝缘层外溅射上一层50nm厚的铂，用铜导线引出作为对/准参比对电极，最后，将涂覆有铂层和绝缘层的金电极前端垂直切断，即获得金/铂(Au/Pt)超微组合电极。用上述相同的处理方法，在金电极表面形成绝缘层后，直接将电极前端切断，不再溅射铂层，即获得超微金盘电极。

将上述制得的金/铂(Au/Pt)超微组合电极和超微金盘电极用于检测神经递质多巴胺做比较：插入10μmol/L DA的0.1mol/L磷酸缓冲溶液中，在20mV/s下测差分脉冲伏安特性，得到附图3；将超微金盘电极插入上述相同的溶液中，在20mV/s下测差分脉冲伏安特性，得到附图4。将图3曲线与图4曲线相比较可见，DA在Au/Pt超微组合电极上的电化学氧化差分脉冲峰电流，比超微金盘电极上的差分脉冲峰电流提高了近10000倍。

实施例3：碳纤维/铂(CF/Pt)超微组合电极；

碳纤维的清洗处理与实施例1相同，在干净的碳纤维表面均匀涂上一层环氧树脂，完全干燥后约450nm厚，在环氧表面溅射上一层50nm厚的铂，用铜导线引出作为对/准参比对电极，最后，将涂覆有铂层和环氧绝缘层的碳纤电极前端垂直切断，即获得碳纤维/铂(CF/Pt)超微组合电极。用上述相同的处理方法，在碳纤电极表面形成绝缘层后，直接将电极前端切断，不再溅射铂层，即获得碳纤盘面电极。

将上述制得的碳纤维/铂(CF/Pt)超微组合电极和碳纤盘面电极用于检测铁氰化钾做比较：将CF/Pt超微组合电极插入1.0mmol/L铁氰化钾的0.5mol/l氯化钾溶液中，在100mV/s下测循环伏安特性，得到附图5中的曲线a；将碳纤盘面电极插入上述相同的溶液中，在100mV/s下测循环伏安特性，得到附图5中的曲线b。将曲线a与曲线b相比较可见，铁氰化钾在CF/Pt超微组合电极上的电化学响应，比碳纤盘面电极上的响应电流提高了近4倍。

通过以上三个制备工艺的实施例以及具体对比分析后可以看到，依据本发明的组合方法制得的超微组合工作电极，克服了常规电极系统在检测中存在的溶液电阻大、扫速低、对研究体系的干扰大等问题，能够显著降低溶液电阻，电化学可逆的质点在该组合电极上会发生氧化还原再生循环使输出的电流信号得到放大，因此可以极大地提高实际体系分析的可用扫速及检测灵敏度，把对研究体系的损伤降低到最小，该超微组合电极制作方便，寿命长且容易更新，是一种高性能的电化学生物传感器，可用于单细胞释放的高时空分辨动态检测及对细胞内单个囊泡进行实时动态的分析研究。

Claims (4)

1、一种电化学超微组合电极的制备工艺，其特征在于包括下列具体步骤：

先将超微工作电极一端通过导电胶与导线粘接，然后将该端密封固定于毛细管中，导线露出于毛细管外；再于超微工作电极另一端未密封的表面均匀涂覆100-500纳米厚度的绝缘层或聚合10-50纳米厚度的绝缘层，然后在该绝缘层及玻璃毛细管外表面均匀镀上一金属层，用导线引出使其构成对/准参比电极，最后将涂覆有金属层和绝缘层的电极前端垂直切断，露出的超微工作电极截面作为超微组合电极。

2、根据权利要求1所述的电化学超微组合电极的制备工艺，其特征在于：所述超微工作电极在粘结导线及密封于毛细管前，由碳材构成的超微工作电极采用丙酮、乙醇、双蒸水或其混合物超声清洗干净并干燥，由金或铂金属材料构成的超微工作电极采用硝酸、王水清洗并干燥。

3、根据权利要求1所述的电化学超微组合电极的制备工艺，其特征在于：所述绝缘层之涂覆工艺为将超微工作电极浸入绝缘漆或环氧树脂中，经1～5分钟后取出烘干；所述绝缘层之聚合为将超微工作电极浸入苯酚和2—烯丙基苯酚溶液中，在超微工作电极上施加2V～5V的电压，使上述两种化学物质聚合，在超微工作电极表面形成高分子聚合绝缘层。

4、根据权利要求1所述的电化学超微组合电极的制备工艺，其特征在于：所述金属层涂敷采用蒸发或溅射的方法在绝缘层和毛细管外壁镀上一层金、铂、银、铑或铱金属，其金属层厚度控制在50-80nm之间。

Images