[go: up one dir, main page]

CN100497610C - 人脂酶样基因编码的多肽及利用它的组合物和方法 - Google Patents

人脂酶样基因编码的多肽及利用它的组合物和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN100497610C
CN100497610C CNB2004100384031A CN200410038403A CN100497610C CN 100497610 C CN100497610 C CN 100497610C CN B2004100384031 A CNB2004100384031 A CN B2004100384031A CN 200410038403 A CN200410038403 A CN 200410038403A CN 100497610 C CN100497610 C CN 100497610C
Authority
CN
China
Prior art keywords
polypeptide
llg
cell
nucleic acid
sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CNB2004100384031A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1539849A (zh
Inventor
M·C·扎耶
K-A·T·多恩
J·A·克拉维克
K·J·林克
D·V·阿明
V·J·索斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Aventis Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Aventis Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Aventis Pharmaceuticals Inc filed Critical Aventis Pharmaceuticals Inc
Publication of CN1539849A publication Critical patent/CN1539849A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN100497610C publication Critical patent/CN100497610C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明公开了脂蛋白脂酶样多肽，编码该多肽的核酸、其反义序列和针对该多肽的抗体。本发明也公开了以重组系统制备该多肽和将该多肽用于筛选该多肽的兴奋剂和/或拮抗物的方法。本发明也公开了治疗脂代谢紊乱的方法和组合物。

Description

人脂酶样基因编码的多肽及利用它的组合物和方法
本申请是1997年12月5日申请的中国专利申请97180348.X“人脂酶样基因编码的多肽及利用它的组合物和方法”的分案申请。
本申请要求专利保护1996年12月6日提交的两个共同未决的临时申请60/032,254和60/032,783的权利。
发明领域
本发明涉及三酰甘油脂酶家族的多肽，编码该多肽的核酸，来自该核酸的反义序列和针对该多肽的抗体。本发明也涉及以重组技术制备该多肽以及该多肽用于筛选其兴奋剂和/或拮抗物的用途。本发明也涉及在治疗脂类和脂蛋白代谢紊乱的药物组合物中使用这些多肽和编码这些多肽的核酸序列用于治疗，包括基因治疗的方法。
发明背景
A)脂类
脂类是非水溶性的有机生物分子，它们是多种生物学功能包括能量贮藏、运输和代谢以及膜的结构和流动性的基本成分。在人和动物中，脂类有两个来源：某些脂类以饮食脂肪和油类的形式摄入，其它的脂类由人和动物生物合成。哺乳动物中至少10％的体重是脂类，其大部分以三酰甘油的形式存在。
三酰甘油也称为甘油三酯和三酰甘油酯，是由与甘油酯化的三个脂肪酸组成的。饮食中的三酰甘油酯贮藏于脂肪组织中作为能量来源或由三酰甘油脂酶在消化道内水解，最重要的三酰甘油脂酶是胰脂肪酶。三酰甘油以脂蛋白的形式在组织间运输。
在血浆中发现的脂蛋白是微团样集群，包含各种比例的不同类型的脂类和蛋白(称为脱辅基蛋白质)。有五种主要的血浆脂蛋白种类，其主要功能是脂类运输。按密度增加的顺序，这些种类依次是乳糜微粒，极低密度脂蛋(VLDL)，中密度脂蛋白(IDL)，低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)。尽管发现每种脂蛋白与多种类型的脂类相关，但是每种主要运输一种类型的脂类：上述的三酰甘油在乳糜微粒，VLDL和IDL中运输；而磷酯和胆固醇酯分别在HDL和LDL中运输。
磷脂是磷酸甘油的二脂肪酸酯，也包含一个与磷酸偶联的极性基团。磷脂是细胞膜重要的结构成分。磷脂被磷脂酶水解。磷脂酰胆碱是典型的磷脂，它是大多数真核细胞膜的主要成分。
胆固醇是类固醇激素和胆汁酸的代谢前体，也是细胞膜的基本组成成分。在人和其它动物中，胆固醇可通过饮食摄入，也可由肝脏和其它组织合成。胆固醇可在LDL和其它脂蛋白中以胆固醇酯的形式在组织间运输。
膜包围着每一个活细胞，并作为细胞内和细胞外区室间的屏障。膜也包围着真核细胞核，构成内质网，并在例如围绕轴突的髓鞘中行使特殊功能。典型的膜包含约40％脂类和60％蛋白质，但也有很大差异。主要的脂类组分是磷脂，特别是磷脂酰胆碱，磷脂酰乙醇胺和胆固醇.膜的生理化学特征如流动性可通过调整磷脂中脂肪酸组成或胆固醇含量来改变。调节膜脂类的成分和组成也可调节膜依赖性的细胞功能如受体活性、内吞作用及胆固醇流出。
B)酶
三酰甘油脂酶是在体内脂代谢中发挥几种关键作用的酶家族。已有人三酰甘油脂酶家族的三个成员得到描述：胰脂肪酶、脂蛋白脂酶和肝脂肪酶(Goldberg，I.J.，Le，N.，Ginsberg，H.N.，Krauss，R.M.和Lindgren，F.T.(1988)临床研究杂志，81，561-568；Goldberg，I.J.，Le，N.，Paterniti J.R.，Ginsberg，H.N.，Lindgren，F.T.和Brown，W.V.(1982)临床研究杂志，70，1184-1192；Hide，W.A.，Chan，L.和Li，W.-H.(1992)脂类研究杂志33，167-178)。胰脂肪酶主要负责饮食中脂类的水解。已有多种胰脂肪酶得到描述，但还未确定其生理作用(Giller，T.，Buchwald，P.，Blum-Kaelin，D.和Hunziker，W.(1992)生物化学杂志，267，16509-16516)。脂蛋白脂酶是负责体内三酰甘油分布和利用的主要酶。脂蛋白脂酶水解乳糜微粒和VLDL中的三酰甘油酯。肝脂肪酶水解IDL和HDL中的三酰甘油酯并负责脂蛋白重建。肝脂肪酶也作用为磷脂酶并水解HDL中的磷脂。
磷脂酶在脂蛋白的磷脂成分和膜磷脂的分解代谢和重建中起重要作用。磷脂酶在花生四烯酸的释放及随后的前列腺素、白三烯及参与多种炎症过程的其它脂类的形成中起作用。
由这些脂酶基因编码的脂酶多肽长约450个氨基酸并有促进分泌的前导信号肽。脂酶由两个主要结构域组成(Winkler，K.，D’Arcy，A.和Hunziker，W.(1990)自然，343，771-774)。氨基末端结构域含催化位点而羧基结构域被认为负责底物结合、辅因子结合及与细胞受体相互作用(Wong，H.，Davis，R.C.，Nikazy，J.，Seebart，K.E.和Schotz，M.C.(1991)美国国家科学院院报88，11290-11294；vanTilbeurgh，H.，Roussel，A.，Lalouel，J.-M.和Cambillau，C.(1994)生物化学杂志269，4626-4633；Wong，H.，Davis，R.C.，Thuren，T.，Goers，J.W.，Nikazy，J.，Waite，M.和schotz，M.C.(1994)生物化学杂志269，10319-10323；Chappell，D.A.，Inoue，I.，Fry，G.L.，Pladet，M.W.，Bowen，S.L.，Iverius，P.-H.，Lalouel，J.-M.和Strickland，D.K.(1994)生物化学杂志，269，18001-18006).家族成员间氨基酸同源性的整体水平为22-65％，并具有与酶功能相关并与结构同源性一致的高同源性的部分区域。
天然存在的脂蛋白脂酶蛋白是糖基化的，而且糖基化是LPL酶活性必需的(Semenkovich，C.F.，Luo，C.-C.，Nakanishi，M.K.，Chen，S.-H.，Smith，L.C.和Chan L.(1990)生物化学杂志，265，5429-5433).在肝脂肪酶和脂蛋白脂酶中有两个N-连接的糖基化位点，在胰脂肪酶中有一个N-糖基化位点。另外，四对半胱氨酸形成的二硫键对于维持酶活性的结构完整性是必需的(Lo，J.-Y.，Smith，L.C.，和Chan，L.(1995)生物物理和生物化学通讯206，266-271；Brady，L.，Brzozowski，A.M.，Derewenda，Z.S.，Dodson，E.，DodSon G.，Tolley，S.，Turkenburg，J.P.，Christiansen，L.，Huge-JensenB.，Norskov，L.，Thim，L.和Menge，U.(1990)自然343，767-770)。
三酰甘油酯酶家族的成员有许多共同的保守结构特征。其这样的特征之一是“GXSXG”基序，其中处于中心的丝氨酸残基是组成“催化三联体”的三个残基之一(Winkler，K.，D’Arcy，A.和Hunziker，W.(1990)自然343，771-774；Faustinella，F.，Smith，L.C.和Chan，L.(1992)生物化学31，7219-7223)。保守的天冬氨酸和组氨酸残基构成催化三联体的平衡。19-23个氨基酸的一小段(“盖区”)形成两亲性螺旋结构并覆盖酶的催化口袋(Winkler，K.，D’Arcy，A.和Hunziker，W.(1990)自然343，771-774)。这一区域在家族成员之间不同，并且最近确定这一段赋予酶底物特异性(Dugi，K.A.，Dichek H.L.和Santamarina-Fojo，S.(1995)生物化学杂志270，25396-25401)。肝脂肪酶和脂蛋白脂酶间的比较已表明三酰甘油脂酶的不同，并且酶的磷脂酶活性由此盖区部分调节(Dugi，K.A.，Dichek H.L.和Santamarina-Fojo，S.(1995)生物化学杂志270，25396-25401)。
三酰甘油脂酶有不同程度的肝素结合活性。脂蛋白脂酶具最高的肝素亲和性并且此结合活性已定位于氨基末端结构域带正电荷的区域(Ma，Y.，Henderson，H.E.，Liu，M.-S.，Zhang，H.，Forsythe，I.J.，Clarke-Lewis，l.，Hayden，M.R.和Brunzell，J.D.脂类研究杂志35，2049-2059)。脂蛋白脂酶在内皮细胞表面的定位(Cheng，C.F.，Oosta，G.M.，Bensadoun，A.和Rosenberg，R.D.(1981)生物化学杂志256，12893-12896)主要通过与表面蛋白聚糖的结合来介导(Shimada K.，Gill，P.J.，Silbert，J.E.，Douglas，W.H.J.和Fanburg，B.L.，(1981)临床研究杂志，68，995-1002；Saxena，U.，Klein，M.G.和Goldberg，I.J.(1991)生物化学杂志266，17516-17521；Eisenberg，S.，Sehayek，E.，Olivecrona，T.和Vlodavsky，I.(1992)临床研究杂志90，2013-2021)。此结合活性可作为LDL和细胞表面间的桥梁加速LDL摄入(Mulder，M.，Lombardi，P.，Jansen，H.，van Berkel T.J.，FrantsR.R.和Havekes，L.M.(1992)生物物理和生物化学通讯185，582-587；Rutledge，J.C.和Goldberg，I.J.(1994)脂类研究杂志35，1152-1160；Tsuchiya，S.，Yamabe，M.，Yamaguchi，T.，Kobayashi，Y.，Konno，T.和Tada，K.(1980)国际肿瘤杂志26，171-176)。
已知脂蛋白脂酶和肝脂肪酶与辅激活物蛋白结合作用：对于脂蛋白脂酶，是载脂蛋白CII；而对于胰脂肪酶，是辅脂肪酶。
已有报道编码人胰脂肪酶、肝脂肪酶和脂蛋白脂酶的基因序列(基因库登记号分别为#M93285，#J03540和#M15856)。人肝脂肪酶和胰脂肪酶的信使RNA分别为约1.7和1.8kb。从人脂蛋白脂酶基因合成3.6和3.2kb的两个mRNA转录物。这两个转录物使用交替的多聚腺苷酸化信号，它们的翻译效率不同(Ranganathan，G.，Ong，J.M.，Yukht，A.，Saghizadeh，M.，Simsolo，R.B.，Pauer，A.和Kem，P.A.(1995)生物化学杂志，270，7149-7155)。
C)生理过程
脂类代谢涉及脂类脱辅基蛋白、脂蛋白和酶的相互作用。
肝脂肪酶和脂蛋白脂酶是多功能蛋白，它们介导脂蛋白和磷脂的结合、摄入、分解代谢和重建。脂蛋白脂酶和肝脂肪酶分别在与外周组织和肝脏内皮细胞的腔面结合时起作用。两种酶都参与胆固醇的反向运输，即胆固醇从外周组织到肝脏的运动以从体内排泄或再循环。已知肝脂肪酶和脂蛋白脂酶的遗传缺陷是家族性脂蛋白代谢紊乱的原因。脂蛋白代谢的缺陷导致严重的代谢紊乱包括高胆固醇血症、高脂血症和粥样硬化。
动脉粥样硬化是复杂的多基因疾病，组织学上定义为脂类和其它血液衍生物在血管壁特别是大动脉(主动脉，冠状动脉，颈动脉)上的沉积(脂类或纤维脂类斑块)。根据动脉粥样硬化过程进行的程度，或多或少钙化的这些斑块可能与损害有关并与主要由胆固醇脂组成的脂肪沉积在血管内的积累相关。这些斑块伴随有血管壁变厚、平滑肌肥大、泡沫细胞的出现(聚集的巨噬细胞无限制摄入胆固醇产生的充满脂类的细胞)和纤维组织的积累。动脉粥样化斑块明显地从血管壁上突出，证明它导致了狭窄，应对发生于最易感的那些病人中的动脉粥样化、血栓形成或栓塞引起的血管阻塞负责，这些损害可导致严重的心血管病变如梗塞、猝死、心闭锁不全和中风。
三酰甘油脂酶在诸如动脉粥样硬化的血管病变中的作用一直是集中研究的领域(由Olivecrona，G.和Olivecrona，T.(1995)在现代脂类评论6，291-305中综述)。总的来说，据认为三酰甘油脂酶的作用是抗动脉粥样化，因为这些酶降低了血清三酰甘油水平并促进HDL形成。表达人脂蛋白脂酶或肝脂肪酶的转基因动物具降低的血浆三酰甘油和升高的高密度脂蛋白(HDL)水平(Shimada，M.，Shimano，H.，Gotoda，T.，Yamamoto，K.，Kawamura，M.，Inaba，T.，Yazaki，T.和Yamada，N.(1993)生物化学杂志268，17924-17929；Liu，M.-S.，Jirik，F.R.，LeBoeuf，R.C.，Henderson，H.，Castellani，L.W.，Lusis，A.J.，ma，Y.，Forsythe，I.J.，Zhang，H.，Kirk，E.，Brunzell，J.D.和Hayden，M.R.(1994)生物化学杂志269，11417-11424)。已发现有导致脂蛋白脂酶活性水平下降的遗传缺陷的人患高三酰甘油血症从而患冠心病的危险性没有增加。据报道这是由于缺少中等大小的；可在亚内皮细胞区域内积累的致动脉粥样化的脂蛋白(Zilversmit，D.B.(1972)循环研究，33，633-638).
然而，据推测，在动脉粥样硬化的分布区中，脂酶活性水平的升高加速致动脉粥样化进程(Zilversmit，D.B.(1995)临床化学41，153-158；Zambon，A.，Torres，A.，Bijvoet，S.，Gagne，C.，Moojani，S.，Lupien，P.J.，Hayden M.R.和brunzell，J.D.(1993)Lancet341，1119-1121)。这可能是由于脂酶介导的血管组织结合和摄入的脂蛋白增加(Eisenberg，S.，Sehayek，E.，Olivecrona，T.Vlodavsky，I.(1992)临床研究杂志90，2013-2021；Tabas，I.，Li，I.，Brocia R.W.，Xu，S.W.，Swenson T.L.和Williams，K.J.(1993)生物化学杂志(268，20419-20432；Nordestgaard，B.G.和Nielsen，A.G.(1994)现代脂类评论5，252-257；Williams，K.J.和Tabas，I.(1995)Art.Thromb.and Vasc.Biol.15，551-561)。另外，局部高水平的脂酶活性可导致动脉粥样硬化损伤前体中合成细胞毒性水平的脂肪酸和溶血磷脂酰胆碱。
尽管对脂酶活性在脂类内环境稳定中的作用的理解有所发展，但是本领域内仍有鉴定其它编码调节脂类代谢蛋白的基因的需要。
发明概述
本发明涉及脂酶样基因(LLG)的发现、其表达的多肽产品及利用它的组合物和方法。LLG多肽与肝素结合，与人脂蛋白脂酶和肝脂肪酶有同源性并含有三酰甘油脂酶家族39kD的催化结构域。在进一步的实施方案中，此多肽具有磷脂酶A活性。
本发明提供包含序列SEQ ID NO：10的分离的多肽。
本发明进一步提供包含序列SEQ ID NO：8并在10％ SDS-PAGE凝胶上表现分子量为约55kD或68kD的分离的多肽。
本发明也提供包含序烈SEQ ID NO：6并在10％ SDS-PAGE凝胶上表现分子量为约40kD的分离的多肽。
本发明进一步提供LLG多肽的抗原性片段。
本发明的另一方面是编码具有前述序列多肽的分离的核酸。
本发明的另一方面是包含前述与调控区域如启动子可调控地相连的编码所述多肽的核酸的载体。
本发明的另一方面是包含上述载体的重组细胞。
本发明的另一方面是制备多肽的方法，包括在允许所述多肽表达的条件下培养含有编码该多肽的核酸的重组细胞。
本发明的另一方面是能特异地结合根据本发明所述的多肽和/或中和根据本发明所述的多肽的生物学活性的抗体。确实，本发明多肽的进一步特征是特异组合本发明的抗体，即对LLG多肽特异的抗体。
本发明的另一方面是包含根据本发明所述的多肽、核酸、载体、反义核酸或抗体和药物学可接受的载体的组合物。
本发明的另一方面是筛选本发明多肽表现的酶活性的兴奋剂和拮抗物的方法，包括使可能的兴奋剂或拮抗物与该多肽及其底物接触并测量可能的兴奋剂或拮抗物增强或抑制活性的能力。
本发明的另一方面是磷脂酰胆碱酯的酶促水解方法，包括使该磷脂酰胆碱酯与本发明的多肽接触。
本发明的另一方面是改善具有不合乎要求的脂类分布型的人或其它动物的血清脂类分布型的治疗方法，包括给其施用有效量的根据本发明所述的组合物。
本发明的另一方面是在人或其它动物中治疗或预防动脉粥样硬化的方法，包括给其施用有效量的根据本发明所述的组合物。
本发明的其它方面和优点在附图及其下文优选的实施方案详述中得到进一步描述。
附图简述
图1表示在作为例证的PCR扩增中所用的引物序列(SEQ ID No：17-31)。
图2表示包含脂酶样基因cDNA的差异显示RT-PCR产物的核酸序列(SEQ ID NO：1)和推断的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。在对应于扩增中所用的两个引物的序列下划线。在终止密码子和聚腺苷酸化信号上加框。GAATCC基序和侧翼序列来自其中克隆了产物的pCRII载体。
图3表示LLG cDNA的5’RACE延伸的核酸序列(SEQ ID NO：3)和推测的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。在对应于扩增中所用的两个引物的序列下划线。GAATCC基序和侧翼序列来自其中克隆了产物的pCRII载体。
图4表示含有脂酶样基因LLGXL完整开放阅读框架的cDNA序列(SEQ ID NO：7)。在起始密码子(ATG)和终止密码子(TGA)上加框。在构建表达载体时所用的DraI位点(TTTAAA)和SrfI位点(GCCCGGGC)下划线。
图5表示LLGXL蛋白的推测氨基酸序列(SEQ ID NO：8)。在预测的信号序列下划线。
图6表示三酰甘油脂酶基因家族成员的蛋白序列匹配(SEQ ID No：13-15)。阴影部分的残基与LLGXL蛋白相同(SEQ ID NO：8)。使用CLUSTAL程序时在序列中引入缺口以使匹配值达到最大。
图7表示THP-1细胞中LLG mRNA的Northern分析。以PMA或以PMA和氧化的LDL(PMA+oxLDL)刺激细胞。左边的数字表示RNA标准的位置(按千碱基)。
图8表示以LLG、脂蛋白脂酶(LPL)和人β肌动蛋白cDNA作探针对来自多种人组织的mRNA进行的Northern分析。在LLG和LPL组的左侧表示了4.4kb RNA标准的位置。
图9表示在培养的人内皮细胞和THP-1细胞中LLG和LPL表达的Northern分析。细胞或者是未经刺激的(不与PMA接触)，或者是经PMA刺激的。
图10表示免疫肽的序列(SEQ ID NO：16)及其与LLGXL蛋白序列的关系。肽在阴影框中表示。引入末端半胱氨酸以有助于此肽与载体蛋白偶联。
图11表示对来自培养的内皮细胞的条件培养基中的肝素-Sepharose浓缩蛋白进行的Western分析。印迹以抗LLG抗血清为探针。左边的数字代表以千道尔顿为单位的蛋白标准的位置。
图12表示对来自用含LLGN或LLGXL的cDNA或不含DNA(模拟实验)的表达载体瞬时转染的COS-7细胞的条件培养基中的肝素-Sepharose结合蛋白进行的Western分析。包括来自经PMA刺激的内皮细胞(HCAEC+PMA)的蛋白作为大小参照。左边的数字代表通过与蛋白标准相比确定的主要免疫反应蛋白的表现分子量。
图13表示兔LLG PCR产物的序列(RLLG.SEQ，SEQ ID NO：12)及兔LLG PCR产物和相应的人cDNA序列(LLG7742A)之间的序列对比。相同的核苷酸以阴影表示。
图14表示以磷脂酰胆碱为底物，人LPL、LLGN和LLGXL的磷脂酶A的活性。
图15表示以三油酸甘油酯为底物，人LPL、LLGN和LLGXL的三酰甘油脂酶活性。
图16表示LLG和LPL探针与不同物种的基因组DNA的杂交。
发明详述
本发明涉及脂酶样基因(LLG)的发现及其表达的多肽产物。这些多肽产物是三酰甘油脂酶家族的成员，包含三酰甘油脂酶家族约39kD的催化区域，例如具有序列SEQ ID NO：10。本发明的一个实施方案是有354个氨基酸的LLGN多肽。本发明的第二个实施方案是有500个氨基酸、与人脂蛋脂酶有43％相似性并与人肝脂肪酶有37％相似性的LLGXL多肽。LLGXL多肽有磷脂酶A活性。
本发明人从与佛波酯和氧化的LDL接触的THP-1细胞的mRNA分离部分cDNA。经此部分cDNA的5’RACE延伸后，分离到更小的交替剪接cDNA。从人胎盘cDNA文库中分离到第二个更大的cDNA。
Northern分析表明LLG基因在内皮细胞中表达。针对从cDNA的开放阅读框架推测的多肽产生的抗血清在培养的内皮细胞的条件培养基中检测到具有LLGN和LLGXL预测大小的蛋白。用佛波酯对内皮细胞的处理导致LLG mRNA和蛋白水平的升高。这是第一个发现的由内皮细胞表达的三酰甘油脂酶家族成员。
A)定义
下面定义的术语在本说明书使用，应有助于理解本发明的范围和实施。
“多肽”是包含共价连接的氨基酸的高分子化合物。氨基酸具有下列通用结构：
根据侧链R，将氨基酸分成七类：(1)脂族侧链，(2)含有羟基(OH)的侧链，(3)含有硫原子的侧链，(4)含有酸性或酰胺基因的侧链，(5)含有碱性基因的侧链，(6)含有芳香环的侧链，以及(7)脯氨酸，其中侧链与氨基结合。
“蛋白质”指在活细胞中起结构或功能作用的多肽。
本发明的多肽和蛋白质可以糖基化或非糖基化。
“同源性”是指反映共同进化来源的序列间的相似性。如果多肽或蛋白中相当数量的氨基酸是(1)相同的或(2)具有化学上相似的R侧链，则说它们具同源性或相似性。如果核酸中相当数量的核苷酸是相同的，则说它们具同源性。
“分离的多肽”或“分离的蛋白质”是指基本上与在其天然状态下通常与其结合的化合物(如其它蛋白或多肽，核酸，碳水化合物，脂类)分离的多肽或蛋白。“分离的”并不排除与其它化合物的人工的或合成的混合物；或存在不影响生物学活性的杂质，杂质的存在可能由于例如不完全纯化、稳定剂的加入或复合成药学上可接受的制品。
如果一个分子能特异地与免疫系统的抗原识别分子如免疫球蛋白(抗体)或T细胞抗原受体相互作用，则其是“抗原性的”。抗原性多肽含有至少约5个，优选地约10个氨基酸。分子的抗原性部分可以是对抗体或T细胞受体识别免疫显性的部分，或通过将抗原性部分与载体分子偶联用于产生针对此分子的抗体的部分。抗原性分子本身不一定具免疫原性，即没有载体时能引发免疫反应。
“LLGN多肽”和“LLGN蛋白”指包含序列SEQ ID NO：6的多肽，该多肽是糖基化或非糖基化的。
“LLGXL多肽”和“LLGXL蛋白”指包含序列SEQ ID NO：8的多肽，该多肽是糖基化或非糖基化的。
“LLG多肽”通常描述LLGN多肽和LLGXL多肽。
本发明的LLG多肽或蛋白包括来自LLG多肽并保留LLG多肽的至少一种生物学特性的类似物、片段、衍生物或突变体。自然界存在LLG多肽的各种变体。这些变体可以是以编码这个蛋白的结构基因的核苷酸序列差异为特征的等位变异或可以涉及差异剪接或翻译后修饰。熟练的技术人员能够制备具有单个或多个氨基酸置换、删除、添加或替代的变体。这些变体可包括，特别是(a)其中一个或多个氨基酸残基用保守或非保守氨基酸置换的变体，(b)其中一个或多个氨基酸添加入LLG多肽的变体，(c)其中一个或多个氨基酸包含取代基的变体，和(d)其中LLG多肽与另一个多肽如血清白蛋白融合的变体。本发明的其它LLG多肽包括一个种的保守或非保守位置的氨基酸残基被另一个种的相应残基置换。在另一个实施方案中，非保守位置的氨基酸残基用保守或非保守残基置换。得到这些变体的技术包括遗传的(抑制，删除，突变等)、化学的和酶学技术，这些技术为本领域普通技术人员熟知。
如果这样的等位变异、类似物、片段、衍生物、突变体和修饰物，包括mRNA剪接形式和翻译后修饰形式产生保留LLG多肽任一生物学特性的LLG多肽衍生物，它们都包括在本发明范围之内。
核酸是包含共价连接的称为核苷酸的亚单位的高分子化合物。核酸包括多聚核糖核酸(RNA)和多聚脱氧核糖核酸(DNA)，它们可以是单链或双链的。DNA包括cDNA、基因组DNA、合成DNA和半合成DNA。编码蛋白的核苷酸序列称为有义序列。
“反义核酸”是与有义序列互补的核苷酸序列。反义核酸可用于负调节或阻断由有义链编码的多肽的表达。
“分离的核酸”是指基本上不含有在其天然状态下通常与其结合的化合物的核酸。“分离的”并不排除与其它化合物的人工的或合成的混合物，或存在不影响生物学活性的杂质，杂质的存在可能由于例如不完全纯化、稳定剂的加入或复合成药学上可接受的制品。
短语“在高严谨条件下杂交的核酸”指杂交的核酸能够抵抗高严谨条件下的洗涤。DNA-DNA杂交的高严谨洗涤条件的例子之一是68℃时0.1×SSC，0.5％ SDS。其它的高严谨洗涤条件为本领域普通技术人员熟知.
“调控区域”指调节核酸表达的核酸序列。调控区域可包括天然负责表达特定核酸(同源区域)的序列或包括不同复制起点(负责表达不同蛋白或甚至合成蛋白)的序列。具体地，此序列可以是真核或病毒基因序列或衍生序列，它们可以特异的或非特异的方式和可诱导或不可诱导的方式刺激或抑制基因表达。调控区域包括复制起点，RNA剪接位点，增强子，转录终止序列，引导多肽进入靶细胞中的分泌途径的信号序列以及启动子。
“异源”调控区域是天然不与要表达的核酸相关的调控区域。异源调控区域包括来自不同种的调控区域，来自不同基因的调控区域，杂合调控序列，以及天然不存在的由本领域普通技术人员设计的调控序列。
“载体”是将根据本发明所述的核酸导入宿主细胞的任何方法。术语“载体”包括体外、离体或体内将核酸导入原核或真核细胞的病毒和非病毒方法。非病毒载体包括质粒，脂质体，带电脂类(细胞转染剂)，DNA-蛋白复合物和生物多聚体。病毒载体包括逆转录病毒，腺伴随病毒，痘病毒，杆状病毒，牛痘，单纯疱疹，Epstein-Barr病毒和腺病毒载体。除了根据本发明所述的核酸，载体也可包含一个或多个调控区域和/或用于选择、测定和监测核酸转移结果(转移到哪个组织，表达时间等)的选择标记。
“重组细胞”是含有天然不存在于细胞内的核酸的细胞。“重组细胞”包括高等真核细胞如哺乳动物细胞，低等真核细胞如酵母细胞，原核细胞和古细菌细胞。
“药物上可接受的载体”包括药物上可接受的给药方法中的稀释液和填料，它们是无菌的，可以是用合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂制成的液体或油质悬浮剂。特定的药物上可接受的载体和活性化合物与载体的比例由组合物的溶解性和化学特征、给药的特定方式和标准的药学实践决定。
“脂酶”是可以酶切脂类底物的蛋白。
“磷脂酶”是可以酶切磷脂底物的蛋白。
“三酰甘油脂酶”是可以酶切三酰甘油脂底物的蛋白。
“磷脂酰胆碱”是具有下列结构的甘油磷脂：
Figure C200410038403D00161
R和R’是脂肪酸的烃侧链。磷脂酰胆碱也称为卵磷脂。
“脂类分布型”是指在人类或其它动物体内胆固醇，三酰甘油脂，脂蛋白胆固醇及其它脂类的浓度情况。
“不合乎要求的脂类分布型”是指其中胆固醇、三酰甘油脂或脂蛋白胆固醇的浓度超出了年龄和性别调节的参照范围的情况。通常，总胆固醇浓度>200mg/d1，血浆三酰甘油酯浓度>200mg/dl，LDL胆固醇浓度>130mg/d1，HDL胆固醇浓度>39mg/dl，或总胆固醇与HDL胆固醇的比率>4.0时，认为是不合乎要求的脂类分布型。不合乎要求的脂类分布型与多种病理学情况包括高脂血症、糖尿病高胆固醇血症、动脉粥样硬化和其它形式的冠状动脉疾病相关。
B)多肽
本发明提供三酰甘油脂酶家族成员多肽，它包含三酰甘油脂酶家族39kD的催化结构域，如具有序列SEQ ID NO：10的多肽。本发明的一个实施方案是含序列SEQ ID NO：6并且在10％ SDS-PAGE凝胶上表现分子量为约40kD的分离的LLG多肽。本发明的另一个实施方案是包含序列SEQ ID NO：8并且在10％ SDS-PAGE凝胶上表现分子量为约55kD或68kD的分离的LLG多肽。
本发明的多肽和蛋白可以是重组多肽、天然多肽或合成多肽，并且可来源于人、兔或其它动物。这些多肽的特征在于可重复的单一分子量和/或多套分子量、层析反应和洗脱分布型、氨基酸组成和序列以及生物学活性。
本发明的多肽可通过本领域技术人员熟知的纯化方法从天然来源如胎盘提取物、人血浆或培养细胞如巨噬细胞或内皮细胞的条件培养基分离。
选择性地，本发明的多肽可用重组DNA技术制备，包括将编码此多肽的核酸重组进合适的载体，将产生的载体插入合适的宿主细胞，回收产生的宿主细胞合成的多肽并纯化回收的多肽。
C)核酸
本发明提供编码LLG多肽的分离的核酸。
本发明也提供可用于体外、离体或体内负调控或阻断LLG多肽表达的反义核酸。
重组DNA技术为本领域内普通技术人员熟知。克隆和表示重组分子的通用技术在Maniatis(分子克隆，冷泉港实验室，1982)和Ausubel现代分子生物学方法，Wiley and Sons，1987)进行了描述，在此引用作为参考。
本发明的核酸可与一个或多个调控区域相连。合适调控区域或其它区域的选择是常规方法，在本领域普通技术人员水平之内。调控区域包括启动子，也可包括增强子、抑制子等。
可用于本发明的启动子包括组成型启动子和可调控的(可诱导的)启动子。根据宿主，启动子可以是原核或真核的。用于实施本发明的原核(包括噬菌体)启动子是lacI，lacZ，T3，T7，λPr，PI和Trp启动子。用于实施本发明的真核(包括病毒)的启动子是普遍存在的启动子(如HPRT，波形蛋白，肌动蛋白，微管蛋白)，中间纤维启动子(如桥粒蛋白，神经丝，角蛋白，GFAP)，治疗性基因启动子(如MDR型，CFTR，因子VIII)，组织特异性启动子(如平滑肌细胞内的肌动蛋白启动子，或内皮细胞内有活性的Flt和Flk启动子)，分裂细胞中优先活化的启动子，对刺激反应的启动子(如甾类激素受体，视黄酸受体)，四环素调节的转录调节子，细胞肥大病毒立即早期、逆转录病毒LTR、金属硫蛋白、SV-40、E1a和MLP启动子。四环素调节的转录调节子和CMV启动子在WO96/01313，美国5,168,062和5,385,839中有所描述，其内容在此引用作为参考。
优选地，用于基因治疗的病毒载体是复制缺陷型的，也就是说，它们不能在靶细胞中自主复制。通常，在本发明范围内使用的复制缺陷型病毒载体的基因组缺少至少一个对于病毒在侵染细胞中复制必需的区域。这些区域可用本领域技术人员熟知的任何技术(全部或部分)除去，使之没有功能。这些技术包括全部去除，置换(用其它序列，特别是通过插入核酸)，部分删除或在必需区域内(对于复制)添加一个或多个碱基。这样的技术可在体外(在分离的DNA上)或原位通过遗传操作技术或通过诱突变剂处理实施。
优选地，复制缺陷型病毒保留其对于病毒颗粒壳体化必需的基因组序列。
逆转录病毒是侵染分裂细胞的整合病毒。逆转录病毒包括两个LTR，壳体化序列和三个编码区(gag，pol和env)。已有描述重组逆转录病毒载体的构建：特别见EP453242，EP178220，Bernstein等，基因工程7(1985)235；McCormick，生物技术3(1985)689等。在重组逆转录病毒载体中，gag、pol和env基因通常被全部或部分删除并以异源的目的核酸序列取代。这些载体可从不同类型的逆转录病毒如MoMuLV(“鼠类莫洛尼白血病毒”)；MSV(“鼠类莫洛尼肉瘤病毒”)，HaSV(“Harvey肉瘤病毒”)；SNV(“脾脏坏死病毒”)；RSV(“劳氏肉瘤病毒”)和弗罗德病毒构建。
通常，为了构建含有编码根据发明所述的LLG的序列的重组逆转录病毒，构建含有LTR、壳体化序列和编码序列的质粒。将此构建体用于转染包装细胞系，此细胞系能反式提供质粒缺乏的逆转录病毒功能。通常，包装细胞系能表达gag，pol和env基因。这样的包装细胞系，特别是细胞系PA317(美国4,861,719)；PsiCRIP细胞系(WO90/02806)和GP+envAm-12细胞系(WO89/07150)在现有技术中有描述。另外，重组逆转录病毒载体可在LTR处修饰以抑制转录活性和大量的壳体化序列，其中壳体化序列可能包含gag基因的一部分(Bender等，病素学杂志61(1987)1639)。重组逆转录病毒载体通过本领域普通技术人员熟知的标准技术纯化。
腺伴随病毒(AAV)是相当小的DNA病毒，它可以稳定和位点特异的方式整合到它们所侵染的细胞基因组中。它们在不诱导对细胞生长、形态或分化的任何影响的情况下，能侵染广谱细胞，没有发现它们参与人的病理学。AAV基因组已被克隆，测序和鉴定。它包含约4700碱基并在每一末端含作为病毒复制起点的145个碱基的末端反向重复(ITR)区域，。基因组的剩余部分分为两个带有壳体化功能的基本区域：基因组的左边部分，包含参与病毒复制和病毒基因表达的rep基因；基因组的右边部分，包含编码病毒衣壳蛋白的cap基因。
已有描述使用来自AAV的载体体外和体内转移基因(见WO91/18088；WO93/09239；美国4,797,368，美国5,139,941，EP488,528)。这些公开文献描述了其中rep和/或cap基因被删除并被目的基因取代的各种AAV衍生的构建体及这些构建体用于体外(转入培养细胞)或体内(直接转入生物体)转移目的基因的用途。通过将含有两侧与两个AAV末端反向重复(ITR)区域相连的目的基因的质粒和带有AAV壳体化基因(rep和cap基因)的质粒共转染入用人辅助病毒(如腺病毒)侵染的细胞系中可以制备根据本发明所述的复制缺陷重组AAV。然后通过标准技术纯化制备的AAV重组体。因此，本发明也涉及其基因组包含两侧与AAV ITR相连的编码LLG多肽的序列的AAV衍生的重组病毒。本发明也涉及包含两侧与来自AAV的两个ITR相连的编码LLG多肽的序列的质粒。这样的质粒可用于转移LLG序列，如果合适，此质粒可掺入脂质体载体(假病毒)中。
在优选实施方案中，载体是腺病毒载体。
腺病毒是真核DNA病毒，经修饰后有效地将本发明的核酸转移入多种细胞类型中。
存在腺病毒的各种血清型。在这些血清型中，在本发明范围内，优先使用2型或5型(Ad2或Ad5)人或动物来源的腺病毒(见WO94/26914)。在本发明范围内，可以使用的动物包括犬、牛、鼠(例如MavI，Beard等，病毒学75(1990)81)、羊、猪、鸟和猴(例如SAV)来源的腺病毒。优选地，动物来源的腺病毒是犬腺病毒，更优选地，是CAV2腺病毒(如Manhattan或A26/61株(ATCC VR-80))。
优选地，本发明的复制缺陷腺病毒载体包含ITR，壳体化序列和目的核酸。更优选地，至少腺病毒载体的E1区是无功能的。E1区的删除优选地从Ad5腺病毒序列的455位核苷酸延伸至3329位核苷酸。其它区域也可修饰，特别是E3区(WO95/02697)、E2区(WO94/28938)、E4区(WO94/28152，WO94/12649和WO95/02697)或在晚期基因L1-L5中的任一基因内。缺陷型逆转录病毒载体在WO95/02697中公开。
在一个优选实施方案中，腺病毒载体在E1和E4区有缺失。在另一个实施方案中，腺病毒载体在E1区有缺失，其中插入了E4区域和编码LLG的序列(见FR94 13355)。
根据本发明所述的复制缺陷型重组腺病毒载体可以用本领域熟练技术人员熟知的技术制备(Levrero等，基因101(1991)195，EP185573；Graham EMBO J.3(1984)2917)。特别地，它们可通过腺病毒和尤其是携带目的DNA序列的质粒间的同源重组制备。将该腺病毒和质粒共转染到合适的细胞系中后，实现同源重组。优选地，所采用的细胞系应该(i)可被所述元件转化的，并且(ii)优选地以整合形式包含能够补充复制缺陷型腺病毒基因组部分的序列以避免重组的危险。可选用的细胞系的例子是包含整合到其基因组内的Ad5腺病毒基因组左侧部分(12％)的人胚肾细胞系293(Graham等，普通病毒学杂志36(1977)59)以及如申请WO94/26914和WO95/02697中所述的能补充E1和E4功能的细胞系。用本领域普通技术人员熟知的标准分子生物学技术可回收并纯化重组腺病毒。
使用反义核酸对基因表达的负调控可在翻译或转录水平实现。本发明优选的反义核酸是能特异地与编码LLG的核酸或相应的信使RNA的全部或部分杂交的核酸片段。这些反义核酸可以是选择性修饰以改进其稳定性和选择性的合成寡核苷酸。它们也可以是在细胞内表达产生与LLG mRNA的全部或部分互补的RNA的DNA序列。如EP140308中所述的，可通过反向表达选自SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：11的序列的全部或部分来制备反义核酸。只要能负调节或阻断LLG的表达，反义序列的任何长度对本发明的实施都是适合的。优选地，此反义序列至少长20个核苷酸。反义核酸的制备和应用，编码反义RNA的DNA以及寡和遗传反义的应用公布于WO92/15680，其内容在此引用作为参考。
D)抗体
本发明提供针对LLG多肽的抗体。这些抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。本发明包括嵌合的、单链的和人源化的抗体以及Fab片段和Fab表达文库的产物。
如实施例4A所述，可以针对LLG多肽的抗原性片段制备多克隆抗体。也可针对完整LLG蛋白或多肽，或针对此蛋白或多肽片段、衍生物或表位制备抗体。用本领域已知的技术和方法给动物施用此蛋白、多肽、片段、衍生物或表位后可得到抗体。
用Mishell，B.B等，细胞免疫学精选方法(W.H.Freeman编辑)San Francisco(1980)描述的方法，可制备单克隆抗体。简而言之，用本发明的多肽免疫Balb/C小鼠脾细胞。使免疫后的脾细胞与骨髓瘤细胞融合。通过在杀死两种亲本细胞但允许融合产物存活和生长的HAT培养基上的生长筛选含脾和骨髓瘤细胞特征的融合细胞。
本发明的单克隆抗体可以是“人源化的”以防止宿主产生对抗体的免疫反应。“人源化抗体”是其中补体决定区(CDR)和/或轻链和/或重链可变区构架的其它部分源自非人免疫球蛋白而分子的剩余部分则来自一个或多个人免疫球蛋白的抗体。人源化抗体也包括特征为人源化重链与供体或受体未经修饰的轻链或嵌合轻链结合的抗体，反过来亦可。抗体的人源化可用本领域已知的方法实现(见如G.E.Mark和E.A.Padlan，“第4章：单克隆抗体的人源化”，实验药学手册，第113卷，Springer-Verlag，New York，1994)。转基因动物可用于表达人源化抗体。
可以调整本领域熟知的用于制备单链抗体的技术以制备针对本发明的免疫原性多肽和蛋白的单链抗体。
抗LLG抗体在检测或定量分析LLG水平的实验中有用。在一个实施方案中，这些实验提供各种疾病状况中LLG临床诊断和评估及监测治疗效率的方法。
E)筛选兴奋剂或拮抗物的方法
本发明提供从小分子文库或天然产物来源筛选LLGXL活性的兴奋剂(增强子或辅激活物，包括蛋白性辅激活物)或拮抗物(抑制剂)的方法。使可能的兴奋剂或拮抗物与LLGXL蛋白和LLGXL的底物接触，测定可能的兴奋剂或拮抗物增强或抑制LLGXL活性的能力。
在此方法中使用的LLGXL蛋白可在各种宿主细胞包括哺乳动物细胞(如实施例7中所示)、杆状病毒侵染的昆虫细胞、酵母和细菌中得到制备。LLG在稳定转染的CHO细胞中的表达可通过细胞的氨甲喋呤扩增得到优化。LLGXL蛋白也可从天然来源如人血浆，胎盘提取物或培养的内皮细胞、THP-1细胞或巨噬细胞的条件培养基中纯化得到。
实验参数包括pH、离子浓度、温度、底物浓度和乳化条件的最优化由本领域具有普通技术的人员根据经验决定。
底物的脂肪酸取代基在链长、不饱和的程度和位置方面可以不同。这些底物可在几个位置的任何一个放射性标记。磷脂底物如磷脂酰胆碱可在例如Sn-1或Sn-2脂肪酸位置或在甘油、磷酸或极性头部基因(磷脂酰胆碱中的胆碱)放射性标记。
作为放射性标记底物的替代方法，其它种类的标记底物如荧光底物或含硫底物也可用于筛选方法。
荧光底物在筛选实验中特别有效，因为酶催化作用可在不将产物与底物物理分开(提取)时通过测量荧光强度来连续测定。荧光磷脂酰胆碱底物的一个例子是C6NBD-PC{1-酰基-2-[6-(硝基-2，1，3-苯并二唑-2-酰)氨基]己酰基磷脂酰胆碱}。
含硫底物包括1，2-二(己酰硫代)-1，2-双脱氧-sn-甘油-3-磷酸胆碱(L.J.Reynolds，W.N.Washburm，R.A.Deems和E.A.Dennis，1991，酶学方法，197：3-23；L.Yu和E.A.Dennis，1991，酶学方法197：65-75；L.A.Wittenauer，K.Shirai，R.L.Jackson和J.D.Johnson，1984，生物化学和生物物理研究通讯118：894-901)。
F)磷脂酰胆碱酯的水解
本发明提供例如用于工业或食物加工或洗衣去污剂的酶促水解磷脂酰胆碱酯的方法.本发明的多肽可用于水解溶液中的磷脂酰胆碱酯；或将此酶结合在固体支持物上，然后使之与底物接触。此方法可用于制备溶血磷脂和自由脂肪酸。
G)组合物
本发明提供生物学上相容的(生物相容的)溶液中的包含本发明的多肽、核酸、载体和抗体的组合物。生物学上相容的溶液是本发明的多肽、核酸、载体或抗体在其中保持活性形式，例如以能够实现生物学活性的形式的溶液。例如，本发明的多肽将具磷脂酶活性，核酸将能够复制，翻译信息或与互补核酸杂交；载体将能转染靶细胞；抗体将与本发明的多肽结合。通常，这样的生物学上相容的溶液通常是包含盐离子的水性缓冲液如Tris、磷酸或HEPES缓冲液。通常盐离子的浓度与生理学水平相似。在具体实施方案中，生物相容溶液是药学上可接受的组合物。生物学上相容的液体可包括稳定剂和防腐剂。
可配制这样的组合物以通过体表、口腔、非肠道、鼻内、皮下和眼内途径给药。非肠道给药包括静脉内注射、肌内注射、动脉内注射或灌注技术。组合物可以包含标准的众所周知无毒的生理上可接受的载体、佐剂和介质的剂量单位制剂通过非肠道途径用药。
优选的无菌注射性制剂可以是无毒的非肠道途径可接受的溶剂或稀释液中的溶液或悬浮液。药学上可接受的载体的例子是盐水，缓冲盐水，等渗盐水(如磷酸一钠或二钠，氯化钠，氯化钾，氯化钙或氯化镁；或这些盐的混合物)，林格溶液，葡萄糖，水，无菌水，甘油，乙醇及它们的组合。1，3-丁二醇和无菌的稳定的油是使用方便的溶剂或悬浮介质。包括合成的单或二甘油酯在内的任何稳定的油都可使用。诸如油酸的脂肪酸也可用于制备可注射的制剂。
组合物介质可以是从任何生物相容的或无细胞毒性的(同源或异源)多聚体制备而来的水凝胶，如可作为药物吸收海绵的亲水性聚丙烯酸多聚体。例如，这样的多聚体在申请WO93/08845中得以描述，其全部内容在此引用作为参考。它们中的某一些，例如特别是从乙烯和/或氧化丙烯得到的那些可从商品途径得到。水凝胶可直接例如在手术干预时置于受治疗组织的表面。
本发明的另一优选实施方案涉及包含复制缺陷型重组病毒和聚羟亚烃的药物组合物。更具体地，本发明涉及包含含有编码LLG多肽的核酸的复制缺陷型重组病毒和聚羟亚烃的组合物。优选的聚羟亚烃是聚羟亚烃407，它可商业购买(BASF，Parsippany，NJ)并且是无毒的生物相容的多元醇，是最优选的。浸渍了重组病毒的聚羟亚烃可直接例如在手术干预时放在受治疗组织的表面。尽管粘性较低，聚羟亚烃基本上具有与水凝胶相同的优点。
H)治疗方法
本发明提供治疗方法，包括给人或其它动物施用有效量的本发明的组合物。
有效量随年龄、要治疗病情的类型和严重性、体重、治疗的时间长短、给药方法和其它参数变动。有效量由内科医生或其它有资格的医务专家决定。
根据本发明所述的多肽通常以每天每千克体重约0.01mg至约100mg，优选地约0.1mg至约50mg，更优选地约1mg至约10mg的剂量用药。
根据本发明所述的重组病毒通常以约104至约1014pfu的剂量配制并给药。就AAV和腺病毒而言，优选采用约106至约1011pfu的剂量。术语pfu(“噬斑形成单位”)对应于病毒体悬浮液的侵染力，通过感染适当细胞培养物并测定噬斑形成的数目来测定。现有技术中记录了测定病毒溶液pfu滴度的技术.
本发明提供治疗由LLG多肽活性过量、异常或不充分表达导致的动脉粥样硬化的方法。
本发明进一步提供治疗具有由LLG多肽活性异常高表达或不充分表达导致的不合乎要求的脂类分布型的人或其它动物的方法。
本发明进一步提供治疗由LIG多肽活性异常高表达或未充分表达导致的糖尿病、高脂血症、肝内胆汁郁积或其它代谢紊乱的方法。
1)与LLG多肽表达升高相关的不合乎要求的脂类分布型的治疗
降低LLG多肽的表达以纠正其中LLG多肽活性起作用的与不合乎要求的脂类分布型相关的疾病或紊乱的病情的方法包括并不限于：施用包含反义核酸的组合物，施用包含诸如抗体的细胞内结合蛋白的组合物，施用包含LLGN多肽或LLG其它片段的组合物和施用包含编码LLGN多肽或LLG其它片段的核酸的组合物。
在一个实施方案中，包含反义核酸的组合物用于负调节或阻断LLG的表达。在一个优选实施方案中，此核酸编码反义RNA分子。在此实施方案中，此核酸与使此核酸序列表达的信号可调控地连接并优选地利用重组载体构建体将其入细胞，载体一旦导入细胞，将表达反义核酸。合适的载体包括质粒，腺病毒，腺伴随病毒，逆转录病毒和疱疹病毒。优选地，此载体是腺病毒。最优选地，此载体是包含病毒E1和/或E3区缺失的复制缺陷型腺病毒。
在另一实施方案中，编码能选择性与LLG相互作用的细胞内结合蛋白的核酸序列的表达使LLG的表达受到负调控或阻断。WO94/29446和WO94/02610公开了用编码细胞内结合蛋白的基因进行细胞转染，其内容在此引用作为参考。细胞内结合蛋白包括任何能在其表达的细胞内选择性地与LLG相互作用或结合并中和被结合的LLG功能的蛋白。优选地，此细胞结合蛋白是抗体或抗体的片段。更优选地，此细胞内结合蛋白是单链抗体。
WO94/02610公开了抗体的制备和编码特定抗体的核酸的鉴定。通过本领域熟练技术人员已知的技术，用LLG或其片段制备特异的单克隆抗体。制备随后包含编码细胞内结合蛋白或其部分的核酸并能在宿主细胞内表达的载体以用于本发明的方法。
选择性地，通过将中和抗体施用于循环系统可以阻断LLG活性。此中和抗体可直接以蛋白施用或由载体表达(带有分泌信号)。
在另一实施方案中，通过施用包含LLGN多肽或LLG其它片段的组合物来抑制LLGXL活性。此组合物可以方便的方式施用，如通过口腔，体表，静脉内，腹膜内，肌内，皮下，鼻内或皮内途径。此组合物可直接施用或包入胶囊(如在脂类系统内，在氨基酸序列微球体内或在球状dendrimer内)。在某些情况下，多肽可以结合到另一多聚体如血清白蛋白或聚乙烯吡咯烷酮上。
在另一实施方案中，通过使用小分子量化合物来抑制LLGXL活性，此小分子量化合物阻碍其酶学特性或阻止其细胞结合位点的正确识别。
在另一实施方案中，通过基因治疗的应用，也就是说，通过施用含有编码和指导LLGN多肽或LLG另一片段表达的核酸的组合物来抑制LLGXL活性。
在具体实施方案中，本发明的LLG基因也对肝素有亲和性。LLG多肽与血管腔内的胞外肝素结合使LLG与LDL结合并作用为LDL和胞外肝素的桥梁加速LDL的摄入。据推测在动脉粥样硬化损害的局部区域，脂酶活性水平的升高加速致动脉粥样化进程(Zilversmit，D.B.(1995)临床化学41，153-158；Zambon，A.，Torres，A.，Bijvoet，S.，Gagne，C.，Moojani，S.，Lupien，P.J.，Hayden M.R.和Brunzell，J.D.(1993)Lancet 341，1119-1121)。这可能是由于脂酶介导的血管组织对脂蛋白的结合和摄入增加(Eisenberg，S.，Sehayek，E.，Olivecrona，T.Vlodavsky，I.(1992)临床研究杂志90，2013-2021；Tabas，I.，Li，I.，Brocia R.W.，Xu，S.W.，WwensonT.L.，Williams K.J.(1993)生物化学杂志268，20419-20432；Nordestgaard，B.G.和Nielsen，A.G.(1994)现代脂类评论5，252-257；Williams，K.J.和Tabas，I.(1995)Art.Thromb.and Vasc，Biol.15，551-561。另外，脂酶活性水平的局部升高可导致在动脉粥样硬化损害前体内产生细胞毒性水平的脂肪酸和溶血磷脂酰胆碱。这种特定的LLG活性可能在动脉粥样硬化进程的发展中起作用，特别是在由于饮食或遗传因素受治疗者体内脂类水平过量的情况下。因此，本发明可通过抑制LLG多肽的表达或与脂蛋白(如LDL)的结合抑制脂蛋白的积累。
2)与LLG多肽不足相关的不合乎要求的脂类分布型的治疗
提高LLG的表达以纠正其中LLG多肽活性起作用的与不合乎要求的脂类分布型相关的疾病或紊乱的病情的方法包括但不限于：施用包含LLGXL多肽的组合物和施用包含编码LLGXL多肽的核酸的组合物。
在另一实施方案中，通过施用包含LLGXL多肽的组合物以提高LLGXL活性水平。此组合物可以方便的方式施用，如通过口腔，体表，静脉内，腹膜内，肌内，皮下，鼻内或皮内途径。此组合物可直接使用或包入胶囊(如在脂类系统内，在氨基酸微球体内或在球状dendrimer中)。在某些情况下，多肽可以结合到另一多聚体，如血清白蛋白或聚乙烯吡咯烷酮上。
在另一实施方案中，通过使用小分子量化合物来提高LLGXL的水平，此小分子量化合物能够在转录、翻译或翻译后水平正调控LLGXL表达。
在另一实施方案中，通过基因治疗的应用，也就是说，通过施用含有编码和指导LLGXL多肽表达的核酸的组合物来提高LLGXL的水平。
肝内胆汁郁积的特征可以是血清胆固醇和磷脂水平的升高。最近有所描述，毒伞素药物诱导的大鼠肝内胆汁郁积模型表现血清胆固醇和磷脂水平的明显升高(Ishizaki，K.，Kinbara，S.，Miyazawa，N.，Takeuchi，Y.，Hirabayash，N.，Kasai，H.和Araki，T.(1997)，Toxicol.Letters 90，29-34)。本发明的产物可用以治疗具有增加的血清胆固醇和/或磷脂的肝内胆汁郁积病人。另外，此大鼠模型也表现胆汁胆固醇分泌率的严重降低。
肝内胆汁郁积也以胆汁从肝脏流出的削弱为特征。最近，渐进性家族性肝内胆汁郁积(PFIC或Byler病)和良性复发性肝内胆汁郁积(BRIC)的基因座定位于18q21-q22(分别是Carlton，V.E.H.，Knisely，A.S.和Freimer，N.B.(1995)人分子遗传学，4，1049-1053和Houwen，R.H.，Baharloo，S.，Blankenship，K.，Raymaeker，P.，Juyn，J.，Sandkuijl，L.A.和Freimer，N.B.(1994)，自然遗传学8，380-386)。因为LLG基因定位于染色体区18q21，本发明的LLG基因或产物可用于治疗患由PFIC/BRIC病基因的突变或缺陷型表达引起的肝内胆汁郁积的病人。
在另一实施方案中，本发明的LLG基因或多肽产物可用于治疗患不是由18q21-q22处的PFIC/BRIC病基因的缺陷引起的肝内胆汁郁积的病人。最近研究表明另外一个位于18q21-q22区之外基因座也可产生PFIC表型(Strantnieks，S.S.，Kagalwalla，A.F.，Tanner，M.S.，Gardiner，R.M.和Thompson，R.J.(1996)医学遗传学杂志33，833-836)。然而，直接或通过基因治疗施用LLG多肽可缓和这种形式的病情。
在基因治疗中，将编码多肽的一个或多个核酸及控制其表达的调控区域转移至人或其它动物的靶细胞中。此转移离体进行，方法是在实验室内将核酸转到细胞中，然后将修饰后的细胞施用于人或其它动物的方法；或在体内进行，方法是将核酸直接转移到人或其它动物内的细胞中.核酸转移可用上述的病毒或非病毒载体实现。
可用本领域已知的任何方法转移非病毒载体，包括磷酸钙共沉淀、脂转染(合成的阴离子和阳离子脂质体)、受体介导的基因转移，裸DNA注射，电穿孔和生物弹或颗粒加速作用。
实施例
下文的实施例解释了本发明。这些实施例只是解释性的，不限制本发明的范围。
实施例1差异表达cDNA的鉴定
A)RNA制备
将人单核THP-1细胞(Smith，P.K.，Krohn，R.I.，Hermanson，G.T.，Mallia，A.K.，Gartner，F.H.Provenzano，M.D.，Fujimoto，E.K，Goeke，N.M.，Olson，B.J.和Klenk，D.C.(1985)生物化学年鉴150，76-85)培养于含25mM HEPES，10％胎牛血清，100单位/ml青霉素G钠盐和100单位/ml硫酸链霉素的RPMI-1640培养基(GIBCO)中。将细胞以1.5 x 107细胞/平板接种于15cm组织培养皿上并以40ng/ml的12-豆蔻酸13-乙酸佛波脂(sigma)处理48小时以诱导细胞分化。人低密度脂蛋白(LDL)购自Calbiochem并于4℃对着PBS彻底透析。然后将LDL稀释至500μg/ml并于37℃对着含5μM CuSO4的PBS透析16小时。为终止氧化作用，将LDL对着150mM NaCl，0.3mMEDTA彻底透析，然后过滤除菌。蛋白浓度用BCA方法测定(Schuh，J.Fairclough，G.F.，和Haschemeyer，R.H.(1978)美国国家科学院院报75，3173-317)(Pierce)。氧化程序通过TBARS测定(chomczynski，P.(1993)生物技术15，532-537)为25-30nmol MDA当量/mg蛋白。使分化的THP-1细胞与含10％脂蛋白缺失的胎牛血清(sigma)的RPMI培养基中的50μg/ml氧化的LDL或NaCl-EDTA缓冲液接触24小时。为收获RNA，用10ml PBS洗平板，然后向每个平板加14ml TRIZOL(Liang，P.和Pardee，A.B.(1992)科学257，967-971)(GIBCO)。吹打溶液几次以混匀，然后将样品收集至离心管中，并向每个平板加3ml氯仿并混匀。将此离心管于12000xg离心15分钟。离心后将上清转移至新的离心管，每平板加7.5ml异丙醇并混匀。将此离心管于12000xg离心20分钟，以冰冷的70％乙醇洗涤沉淀并室温干燥。将沉淀悬于500μl TE(Tris-EDTA)中并以200单位的无RNase的DNAseI和200单位RNA酶抑制剂胎盘RNase抑制剂(Promega)于37℃处理30分钟。通过依次以酚、酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)和氯仿/异戊醇(24∶1)抽提RNA，然后用乙醇沉淀来纯化RNA。
B)cDNA合成
用差异显示试剂盒，版本1.0(DisplaySystems Biotechnology，Inc)的方法进行cDNA合成和PCR扩增。此系统基于由Liang和Pardee(Mead，D.A.，Pey，N.K，，Herrnstadt，C.，Marcil，R.A.和Smith，L.M.(1991)生物/技术9,657-663)最初描述的技术。产生包含脂酶样基因最初信息的cDNA片段的引物对是下游引物7和上游引物15。使用来自与缓冲液或氧化的LDL接触的PMA处理的THP-1细胞的RNA，按下述方法合成用于扩增的cDNA：将3μl 25μM的下游引物7和7.5μl焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的水加到300ng(3.0μl)来自任一THP-1 RNA样品的RNA中。70℃加热10分钟然后在冰上冷却。向管中加入3μl 5×PCR缓冲波(250mM Tris-HCl pH8.3，375mMKCl(GIBCO)，3μl 25mM MgCl2，3μl 0.1M DTT，1.2μl 500μM dNTPs，0.7μl RNasin和5.6μl DEPC处理的水。将此管在室温下温育2分钟，然后加入1.5μl(300单位)SuperscriptII RNase H反转录酶(GIBCO)。此管依次在室温下温育2分钟，37℃温育60分钟，95℃温度5分钟，然后在冰上冷却。使用含有117μl 10×PCR缓冲液(500mMKCl，100mM Tris-HCl pH8.3，15mM MgCl2和0.01％(重量/体积)白明胶)，70.2μl 25mM MgCl2，5.9μlα-32P dATP(10mCi/ml；DuPontNEN)，4.7μl 500μM dNTP混合物，11μl Ampli Taq DNA聚合酶(5单位/μl，Perkin-Elmer)和493.3μl DEPC处理水的母混合物进行PCR扩增。对每一反应，将12μl母混合物加入到2μl下游引物#7，1μl cDNA和5μl上游引物#15中。反应混合物于94℃加热1分钟，然后进行40个94℃变性15秒，40℃退火1分钟，72℃延伸30秒的热循环.40个循环后，将反应于72℃温育5分钟并保存于10℃。PCR反应在Perkin-Elmer GeneAmp System 9600热循环仪中进行。
将4μl扩增反应物与等体积的加样缓冲液(0.2％溴酚蓝，0.2％二甲苯腈蓝，10mM EDTA pH8.0和20％甘油)混和。使4μl混合物于1200伏(恒压)在6％非变性丙烯酰胺测序凝胶上电泳3个小时。凝胶于80℃干燥1.5小时并对Kodak XAR膜曝光。只有在含有来自与氧化LDL接触的THP-1细胞的cDNA的反应中发现扩增产物并将它从凝胶上下。将100μl DEPC处理的水加入含切下的凝胶片段的离心管中，室温温育30分钟，然后95℃温育15分钟。
为了再扩增PCR产物，将26.5μl洗脱DNA用于含5μl 10xPCR缓冲液，3μl 25mM MgCl2，5μl 500μM dNTPs，5μl 2μM下游引物7，7.5μl上游引物15和0.5μl Amplitaq聚合酶的扩增反应液中。PCR循环参数和仪器如上所述。扩增后，在琼脂糖凝胶上分析20μl再扩增产物，取4μl用于以TA克隆系统将PCR产物亚克隆入载体pCRII(Frohman，M.A.，Dush，M.K.和Martin，G.R.(1988)美囯国家科学院院报85，8998-9002)(Invitrogen)。14℃连接过夜后，连接产物用以转化大肠杆菌。挑选得到的转化子，3ml过夜培养物用于质粒的小量制备。用EcoRI消化质粒鉴定插入大小，用荧光染料终止试剂(Prism，Applied Biosystems)和Applied System，Biosystems373DNA测序仪对含有合适大小原初PCR产物插入片段的克隆进行测序。PCR产物的序列示于图2。在扩增引物序列下划线。
C)5’RACE反应
用5’RACE系统通过RF-PCR实现鉴定的cDNA的延伸(Loh，E.Y.，Eliot，J.F.，Cwirla，S.，Lanier，L.L.和Davis，M.M.(1989)科学243，217-219；Simms，D.，Guan，N.和Sitaraman，K.(1991)焦点13，997)(GIBCO)。最初用于差异显示反应的1mg THP-1RNA(经氧化的LDL处理的)用于5’RACE方法。
1μl(1μg)RNA与3μl(3pmol)引物2a和11μl DEPC水混合并于70℃加热10分钟，然后在冰上放置1分钟。加入2.5μl 10X反应缓冲液(20mM Tris-HCl pH8.4，500mM KCl)，3μl 25mM MgCl2，1μl 10mM dNTP混合物和2.5μl 0.1M DTT。将混合物于42℃温育2分钟，然后加入1μl Superscript II反转录酶。反应物继续在42℃再温育30分钟，70℃温育15分钟，冰上放1分钟。加入1μl RnaseH(2单位)，混合物于55℃温育10分钟。用试剂盒中的GlassMax柱纯化cDNA(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.(1989)分子克隆：实验室手册，第二版，冷泉港实验室出版社，Plainview，NY)。以50μl dH2O从柱中洗脱cDNA，冷冻干燥并重新悬浮于21μldH2O中。按下列反应进行cDNA加尾：将7.5μldH2O，2.5μl反应缓冲液(200mM Tris-HCl pH8.4，500mM KCl)，1.5μl25mM Mgcl2，2.5μl 2mM dCTP和10μl cDNA在94℃温育3分钟，然后冰浴1分钟。加入1μl(10单位)末端脱氧核苷转移酶并将混合物于37℃温育10分钟。70℃温育10分钟热灭活酶。cDNA的PCR扩增按下列步骤进行：将5μl加尾的cDNA加入含有5μl 10×PCR缓冲液(500mM KCl，100mMTris-KCl pH8.3，15mM MgCl2和0.01％(重量/体积)白明胶)，1μl10mM dNTP混合物，2μl(10pmol)锚定引物，1μl(20pmol)引物3a和35μl dH2O的反应液中。反应液于95℃加热1分钟，然后加入0.9μl(4.5单位)Ampoitaq聚合酶。反应按下列条件循环40次：94℃ 5秒，50℃ 20秒，72℃ 30秒。将1μl此反应物用于巢式再扩增以提高特异产物的水平，便于随后分离。再扩增反应包括：1μl最初扩增物，5μl 10×PCR缓冲液，1μl 10mM dNTP混合物，2μl(20pmol)通用扩增引物，2μl(20pmol)引物4a和38μl dH2O。将反应物于95℃加热1分钟，然后加入0.7μl(3.5单位)Amplitaq聚合酶。反应按下列条件循环40次：94℃ 5秒，50℃ 20秒，72℃ 30秒。用0.8％琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物。检测到约1.2kb的主要产物。将2μl反应产物克隆入TA克隆盒中的PCRII载体中并于14℃温育过夜。连接产物用于转化大肠杆菌。EcoRI消化以确定所得转化子中插入片段的大小。用荧光染料终止试剂(Prism，Applied Biosystems)和AppliedSystem Biosystems 373 DNA测序仪对含有适当大小PCR产物插入片段的克隆进行测序。包含来自TA载体的EcoRI位点的RACE产物的序列示于图3.在扩增引物(通用引物和与5’RACE引物4a互补的)序列下划线.
实施例2 LLGXL基因的克隆和染色体定位
A)cDNA文库筛选
人胎盘cDNA文库(寡脱氧胸苷酸和随机引物的，目录号#5014b，目录号#52033)来自Clontech(Palo，Alto，CA)。通过切割上述的含5’RACE反应PCR产物的质粒的插入片段产生放射性标记的探针。用随机引物技术对探针进行放射性标记：DNA片段(50-100ng)与1ng随机六聚体(Gibco)于95℃温育10分钟，然后冰上作用1分钟。室温下加入：3μl 10 X Klenow缓冲液(100mM Tris-HCl pH7.5，50mM MgCl2，57mM二硫苏糖醇；New England Biolabs)，3μl 0.5mM dATP，dGT，dTTP，100μCi α-32P dCTP(3000Ci/mmol，New England Nuclear)和1μl DNA聚合酶I的Klenow片段(5单位，Gibco)。反应物于室温温育2-3小时，通过用TE(pH8.0)将体积增加至100μl并加入终浓度为1mM的EDTA来终止反应。将反应体积增加至100μl并使其通过G-50离心柱(Boehringer Mannheim)来除去未掺入的核苷酸。所得探针的比活大于5 X 108cpm/ugDNA。
用已建立的方法探测文库(Walter，P.，Gilmore，R.和Blobel，G.(1984)细胞38，5-8)。简而言之，滤膜在4.8 X SSPE(20 X SSPE＝3.6M NaCl，0.2M NaH2PO4，0.02M EDTA，pH7.7)，20mM Tris-HClpH7.6，1 X Denhardt’s溶液(100X＝2％ ficoll 400，2％聚丙烯吡咯烷酮，2％ BSA)，10％葡聚糖硫酸，0.1％ SDS，100μg/ml鲑精DNA和1 X 106cpm/ml放射性探针中于65℃杂交24小时。然后在室温下以2XSSC(1 X SSC＝i50mM NaCl，15mM柠蒙酸pH7.0)，0.1％十二烷基磺酸钠(SDS)洗膜3次，每次15分钟，然后以0.5×SSC，0.1％ SDS于65℃洗3次，每次15分钟。与探针杂交的噬菌体被分离和扩增。用LambdaSorb试剂(Promega)根据厂商说明从扩增的噬菌体纯化DNA。用EcoRI消化以从噬菌体DNA切下插入片段。将插入片段亚克隆入质粒载体(Bluescript.II SK，Strotagene)的EcoRI位点。按上述的自动测序测定cDNA的2.6kb EcoRI片段内所含的开放阅读框架序列。序列示于图4。推测的由此开放阅读框架编码的蛋白的氨基酸序列示于图5并命名为LLGXL。据推测，第一个蛋氨酸由252-254位核苷酸对编码。推测的蛋白长500个氨基酸。前18个氨基酸形成分泌信号肽特有的序列(Higgins，D.G.和Sharp，P.M.(1988)基因73,237-244)。据预测，前肽的分子量为56,800道尔顿。假定信号肽的切割在第18位，未经修饰的成熟多肽的分子量为54,724道尔顿。
这个蛋白和其它已知的三酰甘油脂酶家族成员的总相似性列于图6和表1。在图6所示的序列匹配中，LLG是由实施例1所述的cDNA(SEQID NO：5)编码的多肽(SEQ ID NO：6)，此后称为LLGN。此蛋白与LLGXL蛋白的氨基端345个残基相同。9个特有残基后是终止密码子，产生39.3kD的前肽和37.3kD的成熟蛋白。对LLGN和LLGXL共同的序列是核酸序列SEQ ID NO：9和氨基酸序列SEQ ID NO：10。
有趣地是，从其它脂酶结构区域得知，LLGN和LLGXL蛋白不同的位置在蛋白的氨基端结构域和羧基端结构域。所以，LLGN蛋白看来只由三酰甘油脂酶两个结构域之一组成。此序列在167-171位包含特征性“GXSXG”脂酶基序并包含Ser169，Asp193和His274位催化三联体残基的保守性。在其它脂酶中参与二硫键的半胱氨酸残基(位置64，77，252，272，297，308，311，316，463和483)的保守性表明LLGXL与其它酶有结构相似性。有5个推测的N糖基化位点：在氨基酸位置80，136，393，469和491处。用于比较的蛋白序列是人脂蛋白脂酶(LPL；Genbank登记号#M 15856，SEQ ID NO：13)，人肝脂肪酶(HL；Genbank登记号#J03540，SEQ ID NO：14)，人胰脂肪酶(PL；Genbank，登记号#M93285，SEQ ID NO：15)，人胰脂肪酶相关蛋白-1(PLRP-1；Genbank登记号#M93283)和人胰脂肪酶相关蛋白-2(PLRP-2；Genbank登记号#M93284)。
表1 三酰甘油脂酶基因家族的相似性
 
LLGXL LPL HL PL PLRP1 PLRP2
LLGXL - 42.7 36.5 24.5 22.5 22.6
LPL 42.7 - 40.0 22.8 22.7 20.9
HL 36.5 40.0 - 22.8 24.0 22.0
PL 24.5 22.8 22.8 - 65.2 62.2
PLRP1 22.5 22.7 24.0 65.2 - 61.7
PRLP2 22.6 20.9 22.0 62.2 61.7 -
用Lasergene Biocemputing Software Suite(Dnastar)的Megalign程序中的Clustal算法根据两两序列对比计算相似性百分数(Camps，L.，Reina，M.，Llobera，M.，Vilaro.，S.和Olivecrona，T.(1990)美国生理学杂志258，C673-C681)。
B)染色体定位
来自含有基因组LLG DNA的P1克隆的DNA通过缺口翻译用地高辛UTP标记(Sternberg，N.，Ruether，J.和DeRiel，K.新生物学家2：151-62，1990)。标记的探针与剪切的人DNA混合并在含50％甲酰胺，10％葡聚糖硫酸和2 X SSC的溶液中与来自雄性供体的经PHA刺激的外周血淋巴细胞杂交。通过在荧光素化的抗地高辛抗体中培养杂交细胞，然后用DAPI复染后来检测特异杂交信号。最初的实验导致E群染色体的特异性标记，根据DAPI染色认为是18号染色体。
进行第二个实验，其中生物素标记的18号染色体着丝粒特异的探针与LLG探针共杂交。这个实验使18号染色体着丝粒的特异标记成红色而18号染色体长臂成绿色。测量11个特异标记的杂交的18号染色体表明LLG的Flter为0.67(Fankle测量为0.38)，对应于带18q21。几种遗传性疾病包括肝内胆汁郁积，视椎营养不良(cone roddystrophy)和家族性扩张性骨质溶解被认为涉及此染色体区域的缺陷。
实施例3 LLG RNA分析
A)LLG RNA在THP-1细胞中的表达
通过THP-1 RNA的Northern分析进行cDNA来源的mRNA的分析。按上述方法制备了这些细胞的RNA。通过利用多聚脱氧胸苷酸磁珠系统，从总RNA纯化mRNA(polyattract system，Promega)。3mg含多聚腺苷酸化mRNA在1％琼脂糖-甲醛凝胶上电泳。凝胶在dH2O中洗30分钟.用碱性转移缓冲液(3M NaCl，8mM NaOH，2mM肌氨酰)将RNA真空转移至尼龙膜上。转移后，印迹在200mM磷酸缓冲液pH6.8中温育5分钟中和。用紫外交联仪(Stratagene)使RNA与膜交联。
通过从上述包含5’RACE反应PCR产物的质粒中切下插入片段制备探针。按实施例2中所述用随机引物技术放射性标记探针。
滤膜在QuikHyb快速杂交溶液(Stratagene)中于65℃预杂交30分钟。在加到QuikHyb中的滤膜之前，放射性标记的探针(1-2 X106cpm/ml)和超声处理的鲑精DNA(终浓度100μg/ml)在95℃加热10分钟变性并在冰上迅速冷却。杂交于65℃进行3小时。室温下用2 X SSC，0.1％十二烷基磺酸钠洗膜两次各15分钟，然后在62℃用0.1 X SSC，0.1％ SDS洗两次15分钟以除去未杂交的探针.洗涤后，使膜简单干燥，然后用增感屏于-80℃对Kodak XAR-2胶片曝光。结果示于图7，表示约4.5kb的主要mRNA。也存在少量4.3kb和1.6kb的片段。LLGNcDNA的预期大小为1.6kb。此LLGXL序列可能是由主要mRNA编码。
B)LLG RNA在各种人组织中的表达
商品化制备好的包含3μg每种来自人组织(心脏，脑，胎盘，肺，肝，骨骼肌，肾和胰脏)的mRNA的滤膜购自Clontech(目录号#7760-1)。按上述方法探测和处理滤膜。以放射性标记的LLG片段探测和放射自显影后，通过在65℃温箱内在煮沸的0.1 X SSC，0.1％ SDS洗2次中15分钟以除去探针。然后用编码人脂蛋白脂酶的1.4kb DNA片段探测此膜。此片段通过用图1描述的5’LPL和3’LPL引物对THP-1RNA(PMA和oxLDL处理过的)进行RT-PCR得到RT-PCR条件如上所述。放射自显影后，再次选膜并用人β肌动蛋白cDNA的放射性标记的片段再次探测以使RNA含量标准化。这些分析的结果示于图8。在胎盘RNA中探测到最高水平的LLG信息，来自肺、肝脏和肾组织的RNA中发现的水平较低。与其他人过去的研究(Verhoeven，A.J.M.，Jansen，H.(1994)Biochem.Biophys.Acta 1211，121-124)一致，脂蛋白脂酶信息在多种组织中发现，心脏和骨骼肌组织内发现的水平最高。分析的结果表明LLG表达的组织分布与LPL有很大不同。如其他人所报道的(Wang，C.S.和Hartsuck；J.A.(1993)Biochem.Biophys Acta.1166，1-19；Semenkovich；C.F.，Chen，S.-W.，Wims，M.，Luo C.-C.，Li，W.-H.和Chan，L.(1989)脂类研究杂志30，423-431；Adams，M.D.，Kerlavage，A.R.，Fields，C.和Venter，C.(1993)自然遗传学4，256-265)，LLG表达模式与肝脂肪酶或胰脂肪酶不同。
为测定其它人组织中的表达模式，用LLGXL cDNA探测另一商品化的膜。此点印迹(人RNA Master Blot，Clontech目录号#7770-1)包含50个不同组织的100-500ng mRNA并且已用相当的管家基因表达标准化(chen，L.和Morin，R.(1971)Biochim.Biophys.Acta231，194-197).根据厂商说明，用随机寡核苷酸引物系统(Prime ItII，Stratagene)将LLGXL cDNA的1.6kb DraI-SrfI片段用32PdCTP标记.在65℃预杂交30分钟后，将探针以1.3 X 106cpm/ml加入QuikHyb杂交液。杂交于65℃进行2小时。通过室温下用2 X SSC，0.1％十二烷基磺酸钠洗膜两次各15分钟，然后在62℃用0.1 X SSC，0.1％ SDS洗两次各15分钟以除去未杂交的探针。洗涤后，使膜简单干燥，然后在-80℃用增感屏对Kodak XAR-2胶片曝光不同时间。用光密度测定法对所得图象定量。结果示于表2。多种组织Northern和多种组织点印迹代表的组织相对表达水平相似，胎盘内最高，肺、肝脏和肾脏中更低。胎的肝、肾和肺与成年组织的表达水平大致相同。令人惊奇地是，甲状腺组织表达水平是所有表示的组织中最高的，其表达是胎盘组织中的122％。尽管胎盘中脂酶表达有优先(Rothwell，J.E.，Elphick，M.C.(1982)发育生理学杂志4，153-159；Verhoeren，A.J.M.，Carling D.和Jansen H.(1994)脂类研究杂志35 966-975；Burton，B.K.Mueller，H.W.(1980)Biochim.Biophys Acta 618，449-460)，但以前不知道甲状腺表达任何脂酶。结果表明LLG的表达可能参与胎盘的维持，其中LLG可能起从诸如磷脂的底物释放自由脂肪酸作为能源的作用。胸腺中表达LLG可能为该腺体合成生物活性分子提供前体。
表2.LLG mRNA在各种人组织中的表达
 
全脑 未检测到 黑质 未检测到 子宫 未检测到 乳腺 未检测到 肺 29
扁桃体 未检测到 颞叶 未检测到 前列腺 5 肾 44 气管 12
尾状核 未检测到 丘脑 未检测到 胃 未检测到 肝脏 61 胎盘 100
小脑 4 下丘脑核 未检测到 睾丸 9 小肠 6 胎脑 5
大脑皮层 未检测到 脊髓 未检测到 卵巢 未检测到 脾 未检测到 胎心 未检测到
额叶 未检测到 心脏 未检测到 胰 未检测到 胸腺 未检测到 胎肾 56
海马 未检测到 主动脉 未检测到 垂体腺 未检测到 外周淋巴细胞 未检测到 胎肝 14
延脑 未检测到 骨骼肌 未检测到 肾上腺 未检测到 淋巴结 未检测到 胎脾 未检测到
枕叶 未检测到 结肠 8 甲状腺 122 骨髓 未检测到 胎胸腺 未检测到
豆状核 未检测到 膀胱 未检测到 唾液腺 未检测到 阑尾 7 胎肺 8
给出的数值是表达百分数，任意地将胎盘组织的水平定为100％。数值是两个放射自显影片密度测定的平均值。ND＝未检测到。
C)LLGRNA在培养的内皮细胞中的表达
人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和人冠状动脉内皮细胞(HCAEC)来自Clonetics。HUVEC在加有3mg/ml牛脑提取物的商品化制备好的内皮细胞培养基(EGM，Clonetics)中繁殖(Maciag，T.，Cerundolo，J.，Iisley，S.，Kelley，P.R.和Forand，R.(1979)美国国家科学院院报76，5674-5678)，而HCAEC则在加有3mg/ml牛脑提取物和3％胎牛血清(终浓度5％)的EGM中繁殖。细胞生长至铺满，将培养基换成不含牛脑提取物的培养基。通过加入100ng/ml佛波酯豆蔻酸(sigma)刺激培养物。温育24小时后，用前述的Trizol法提取细胞的RNA。将20mg总RNA电泳分离并转至膜上用于分析。按前述方法用LLG和LPL探测膜。结果示于图9。来自用PMA刺激的THP-1细胞的20mg总RNA在印迹上泳动用于比较。在未经刺激和PMA刺激的HUVEC细胞中检测到与LLG探针杂交的RNA。相反，只有在经PMA刺激后的HCAEC培养物中发现可检测水平的LLG mRNA。与他人过去的研究一致，在任何内皮RNA中都没有检测到可检测水平的脂蛋白脂酶mRNA(Verhoeven，A.J.M.，Jansen，H.(1994)Biochem.Biophys Acta 121，121-124)。
实施例4 LLG蛋白分析
A)抗体制备
针对具有相当于推测的LLG cDNA开放读码框架编码的蛋白区域的序列的肽制备抗血清.选择此肽是因为其预测的抗原性指数高(Jameson B.A.和Wolf，H.(1988)生物科学中的计算机应用4，181-186)。免疫肽的序列未在基因库数据中的任何蛋白或翻译的DNA序列中发现。其在LLG蛋白中的对应位置在图10中表示。此肽羧基端的半胱氨酸不与LLG推测蛋白的残基一致，它的引入是为了有助于与载体蛋白偶联。此肽在Applied Biosystems Model 433A肽合成仪上合成。按照Imject Activated Immunogen Conjugation试剂盒(Piercechemical)中所包含的方法，将2mg肽偶联到2mg顺丁烯二酰亚胺活化的匙孔血蓝蛋白上。脱盐后，偶联物的一半与等体积的完全弗氏佐剂(Pierce)乳化。将此乳化物注射入新西兰白兔。首次接种后4周，用精确按前述但使用不完全弗氏佐剂(Pierce)制备的乳化物加强接种。加强接种后2周，制备待测血样并用固定肽通过ELISA测定特异性抗体的滴度。首次加强后1个月进行再次加强免疫。
B)对来自内皮细胞培养物的培养基的Western分析
按照实施例3C所述培养并用PMA刺激HCEAC细胞，但用PMA刺激细胞48小时。条件培养基(9ml)样品与500μl磷酸缓冲盐水(PBS，150mM氯化钠，100mM磷酸钠，pH7.2)中的50％肝素-Sepharose CL-6B悬浮液一起温育。因为已鉴定LLGXL序列中残基的保守性对LPL肝素结合活性至关重要，所以选用肝素-Sepharose部分纯化和浓缩LLG蛋白(Ma，Y.，Henderson，H.E.，Liu，M.-S.，Zhang，H.Forsythe，I.J.Clarke-Lewis，I.，Hayden，M.R.和Brunzell，J.D.脂类研究杂志35，2049-2059；图6)。在4℃摇动1小时后，将样品在150xg离心5分钟。吸去培养基并用14ml PBS洗Sepharose。离心并吸去上清后，将沉淀的肝素-Sepharose悬浮于200μl 2 X SDS加样缓冲液(4％ SDS，20％甘油，2％β-琉基乙醇，0.002％溴酚蓝和120mM Tris pH6.8)中。样品于95℃加热5分钟，其中40μl加样于10％ Tris-甘氨酸SDS凝胶上。以140V电泳约90分钟后，通过Novex电印迹仪(210V，1小时)将蛋白转移到硝酸纤维素膜上。在封闭液(5％脱脂干奶粉，0.1％ Tween 20，150mM氯化钠，25mM Tris pH7.2)中封闭膜30分钟。抗肽抗血清和正常兔血清用封闭液1∶5000稀释并与膜一起在4℃轻微摇动温育过夜。然后用TBST(0.1％ Tween20，150mM氯化钠，25mM Tris pH7.2)洗膜4次，每次15分钟。羊抗兔过氧化物酶偶联的抗体用封闭液1∶5000稀释并与膜一起摇动温育1小时。如上所述洗膜，并使膜与Renaissance化学发光试剂(DuPont，NEN)反应并对Kodak XAR-2胶片曝光。结果示于图11。未经刺激的HUVEC和HCAEC细胞样品中存在两种免疫反应蛋白。未经刺激的HCAEC样品中免疫反应蛋白的水平比相应的HUVEC样品低得多。一旦用PMA刺激，内皮细胞培养物分泌三种免疫反应蛋白。PMA处理大大提高HCAEC培养物产生的LLG蛋白的水平。PMA诱导LLG蛋白在HUVEC培养物中没有这么明显。
实施例5 重组LLG蛋白的产生
A)LLG表达构建体
将编码LLGN和LLGXL蛋白的cDNA克隆入哺乳动物表达载体pCDNA3(Invitrogen)。此载体可通过使用巨细胞病毒主要晚期启动子在多种哺乳动物细胞中表达外源基因。将LLGN 5’RACE产物克隆入pCDNA3的EcoRI位点。用DraI和SrfI消化LLGXL cDNA以产生1.55kbcDNA(见图4)。载体以限制酶EcoRV消化，并用快速连接试剂盒(Boehringer Mannheim)中的T4DNA连接酶和试剂根据厂商说明连接载体和插入片段。将此连接产物用于转化感受态大肠杆菌。通过限制性分析和测序检测表达载体中插入片段的存在和方向以筛选所得克隆。
B)LLG瞬时转染COS-7细胞
用Lipofectamine阳离子脂试剂(GIBCO)将LLG表达载体导入COS-7细胞.转染前24小时，将COS-7细胞以2 X 105细胞/平板的密度接种于60mm组织培养平板上。细胞在含10％胎牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM；GIBCO)中繁殖。将1mg质粒DNA加入300μl Optimem I无血清培养基(Gibco)中。将10μl Lipofectamine试剂稀释到300μl OptimemI培养基中并与DNA溶液混合，使之在室温下静置30分钟.移去平板中的培养基并用2ml Optimem培养基洗细胞。DNA-Lipofectamine溶液与2.7ml Optimem培养基一起加入平板并将平板于37℃温育5小时。温育后，除去无血清培养基并换上补加2％ FBS和抗生素的DMEM。转染后12小时，某些培养物用0.25mM PefablocSC(Boehringer Mannheim)、蛋白酶抑制剂或10U/ml肝素处理。收获前30分钟，再用40U/ml肝素处理已用肝素处理过的样品。转染后60小时从细胞移去培养基。将肝素-Sepharose CL-4B(200μl PBS中的50％悬浮液，pH7.2)加到1ml培养基中并于4℃混合1小时。Sepharose通过低速离心沉淀并用1ml冷PBS洗3次。沉淀Sepharose并将其悬浮于100μl 2X加样缓冲液中。将样品于95℃加热5分钟。将40μl样品加样到10％ SDS-PAGE凝胶上。按上述方法进行电泳及使用抗LLG抗血清的Western分析。结果示于图12。包含来自HCAEC条件培养基的蛋白作为大小参照。LLGN迁移在约40kD位置，与HCAEC最低条带一致。来自用LLGXL cDNA转染的COS-7细胞的培养基中包含68kD和40kD两种带。当用肝素处理这些细胞时，从培养基回收的68kD和40kD蛋白的量明显增加。当用蛋白酶抑制剂Pefabloc处理细胞时，相对于40kD蛋白，68kD蛋白的量有所增加。这表明这些细胞产生的低分子量蛋白是较大的68kD形式的水解产物。经差异显示鉴定的编码短的40kD蛋白的mRNA的作用未知。然而，已有报道明显地以组织特异方式表达并会产生截短的蛋白的肝脂肪酶的交替剪接形式。
实施例6 动物物种中的LLG
A)LLG兔同源物的克隆
将商业购买的兔肺组织的λcDNA文库(clontech，目录号#TL1010b)用于分离LLG基因兔同源物的片段。将5μl原文库加到45μl水中并于95℃加热10分钟。将下列物质加到终体积100μl:200μM dNTPs，20mM Tris-HCl pH8.4，50mM KCl，1.5mM MgCl2，引物DLIP774和LLGgen2a各100μM和2.5U Taq聚合酶(GIBCO)。反应按以下参数热循环35次：94℃ 15秒，50℃ 20秒，72℃ 30秒。通过琼脂糖凝胶电泳分析10μl反应物。检测到约300碱基对的产物。用TA克隆系统将4μl反应混合物用于克隆产物。对所得克隆的插入片段进行测序(SEQ ID NO：11)。推测的兔氨基酸序列(SEQ ID NO：12)和相应的人cDNA序列之间的对比在图14中表示。非两个扩增引物部分的核苷酸中，兔和人LLG序列有85.8％的相同性。推测的兔cDNA编码的蛋白与人的这个蛋白有94.6％的相同性，大多数的核苷酸替换在密码子的第三位或“摇摆”位置。值得注意的是，此区域跨越推测的LLG蛋白的“盖”序列并且是脂酶基因家族的可变区。这也是这个基因在种之间有高度保守性的证据。
B)其它种中的LLG
为证明其它种存在LLG基因，用EcoRI限制性消化各种物种的基因组DNA，通过琼脂糖凝胶电泳分离并印迹到硝酸纤维素膜上。
在含有6 X SSC，10％葡聚糖硫酸，5 X Dendardt溶液，1％ SDS和5μg/ml鲑精DNA的杂交液中，用2.5 X 106cpm/ml随机引物标记的32p-LLG或32P-LPL(脂蛋白脂酶)探针与膜在65℃杂交过夜。用0.1 XSSC，0.5％ SDS在室温下洗膜10分钟，然后依次在40℃，50℃和55℃洗10分钟。印迹的放射自显影示于图16。
图16表明LLG和LPL基因存在于受检的所有种中，只有LLG探针对大鼠DNA中没有观察到杂交。大鼠中的例外结果可能是由含有LLG序列的反常大小的限制性片段人为引起的.这些的片段可能在琼脂糖凝胶电泳的分离范围之外或者可能是无效转印。由两种探针检测到的不同条带表明LPL和LLG是分开的进化上保守的基因。
实施例7 LLGXL的酶活性
A)磷脂酶活性
分析瞬时表达人脂蛋白脂酶(LPL)、LLGN或LLGXL的COS-7细胞的条件培养基的磷脂酶活性。含10％ FBS的MEM(MEM)用作空白，而反义LLGXL质粒(AS)转染的COS-7细胞的条件培养基用作阴性对照。
磷脂酰胆碱(PC)乳浊液是用10μl磷脂酰胆碱(10mM)，40μl在sn 1和2位标记的14C-磷脂酰胆碱、二棕榈酰(2μCi)和100μl Tris-TCNB[100mM Tris，1％ Triton，5mM CaCl2，200mM NaCl，0.1％BSA)配制的。使此乳浊液蒸发10分钟，使其在Tris-TCNB中的终体积为1ml。
反应物以双份进行，包含50μl PC乳浊液和950μ1培养基。样品在摇动的37℃水浴中温育2-4小时.加入1ml 1N HCl终止反应，然后用4ml2-丙醇∶己烷(1∶1)抽提。使上部1.8ml己烷层通过硅凝胶柱，对含于流过组分中的释放出的无14C的脂肪酸在闪烁计数器内进行定量。这些实验的结果在图14中表示。
B)三酰甘油脂酶活性
分析瞬时表达人脂蛋白脂酶(LPL)、LLGN或LLGXL的COS-7的条件培养基的三酰甘油脂酶活性。含10％ FBS的MEM用作空白，而反义LLGXL质粒(AS)转染的COS-7细胞的条件培养基用作阴性对照。
将浓缩的底物制成无水的含标记的[9，10-3H(N)]三酰甘油脂和未标记三酰甘油脂的乳剂(最终总三酰甘油脂＝150mg，6.25 X 108Cpm)，通过加入100％甘油中的9mg卵磷脂使之稳定。将0.56ml 3H-三油酸甘油酯(0.28mCi)与0.17ml未标记的三油酸甘油酯和90μl卵磷脂(9mg)混和。此混合物在氮流下挥发。干燥的脂类混合物通过超声在2.5ml 100％甘油中乳化(30秒脉冲水平2然后2秒冷却循环进行5分钟)。
通过将1体积浓缩底物用4体积含3％(重量/体积)无脂肪酸牛血清白蛋白的0.2M Tris-HCl缓冲液(pH8.0)稀释制备实验底物。将稀释的底物剧烈振荡5秒。
反应以双份进行，在总体积0.2ml中含0.1ml实验底物和0.1ml所述的条件培养基。反应物于37℃温育90分钟。通过加3.25ml甲醇-氯仿-己烷(1.41∶1.25∶1，体积/体积/体积)后再加1.05ml 0.1M碳酸-硼酸钾缓冲液(pH 10.5)终止反应。剧烈振荡15秒后，样品在1000rpm离心5分钟。在闪烁计数仪中对1.0ml上面水相的样品计数。这些实验的结果示于图15。
实施例8 使用LLG多肽筛选兴奋剂或拮抗物
重组LLG在杆状病毒侵染的昆虫细胞中合成。在肝素-Sepharose上层析，然后在阳性离子交换树脂上层析从含血清或无血清培养基纯化重组LLG.如果需要，在纯化LLG中使用第三个层析步骤如分子筛。在纯化过程中，用抗肽抗体监测LLG蛋白，磷脂酶实验用于跟踪LLG活性。
在荧光实验中，最终实验条件为约10mM Tris-HCl(pH7.4)，100mM KCl，2mM CaCl2；5μM C6NBD-PC{1-酰基-2-(硝基-2，1，3，-苯并二唑-4-酰)氨基]己酰基磷脂酰胆碱}和LLG蛋白(约1-100ng)。反应物用于470nm处荧光激发，通过540nm处荧光发射的测定连续监测酶活性。以二甲基亚砜中10-200mM溶液的形式，加入刺激和/或抑制LLG活性的待测化合物和/或底物。刺激或抑制LLG活性的化合物以540nm处荧光发射的增强或降低来鉴定。
在这个实验中，最终实验条件是约25mM Tris-HCl(pH8.5)，100mM KCl，100mM CaCl2，4.24mM Triton X-100，0.5mM 1，2，-双(己酰硫代)-1，2-双脱氧-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱，5mM 4，4’-二硫吡啶(来自乙醇中的50mM贮存液)和1-100mg重组LLG。通过测定342nm处吸收值的升高确定磷脂酶活性。以二甲基亚砜中10-200mM溶液的形式加入刺激和/或抑制LLG活性的待测化合物和/或底物。刺激或抑制LLG活性的化合物以342nm处吸收的升高或降低来鉴定。
实施例9 表达人LLG的转基因小鼠
为进一步研究LLG的生理作用，制备了表达人LLG的转基因小鼠。
将编码LLGXL的1.53kb DraI/SrfI限制性片段(见图4)克隆入质粒载体(pHMG)普遍表达的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG CoA)还原酶基因启动子的下游。用标准方法制备表达不同水平的人LLGXL的转基因小鼠(见如G.L.Tromp等，基因1565：199-205，1995)。使用转基因小鼠测定LLGXL过量表达对脂类分布型、血管病理学、动脉粥样硬化发展的速度和严重性及其它生理学参数的影响。
实施例10 LLG在动脉粥样硬化组织中的表达
通过用从4个患动脉粥样硬化病人的血管活组织检查材料分离的mRNA进行反转录聚合酶链式反应来检测动粥样硬化中LLGXL的表达。组织样品来自主动脉壁(1个样品)，髂动脉(2个样品)和颈动脉(1个样品).
动脉粥样硬化活组织检查材料来自Gloucestershire Royal医院，英国，制备多聚腺苷酸化mRNA并以0.5μg/μl mRNA浓度重新悬浮于焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的水中。根据GibcoBRL用于第一链cDNA合成的Superscript Preamplification System方法进行反转录酶反应。简而言之，cDNA的合成如下进行：将2μl每一种mRNA加入1μlOligo(dT)12-18引物和9μl DEPC水中。此管在70℃温育10分钟并在冰上放置1分钟。向每一管中加入下列成分：2μl 10 X PCR缓冲液，2μl 25mM MgCl2，1μl 10mM dNTP混合物和2μl 0.1M DTT。42℃5分钟后，加入1μl(200单位)SuperScript II反转录酶。温和地混合反应物，然后于42℃温育50分钟。通过于70℃温育15分钟终止反应，然后置于冰上.向每管中加入1μl RHase H并在37℃温育20分钟以破坏残存的mRNA。
用2μl cDNA反应物进行PCR扩增。向每一管中加入下列物质：5μl 10 X PCR缓冲液，5μl 2mM dNTPs，1μl hllg-gspl引物(20pmol/ml，见图1)，1μl hllg-gsp2a引物(20pmol/ml，见图1)，1.5μl 50mM MgCl2，0.5μl Taq聚合酶(5U/ml)和34μl水。反应物在95℃放置2分钟后，按下列条件进行PCR的30个循环：94℃ 15秒，52℃ 20秒，72℃ 30秒。在用琼脂糖凝胶电泳分析前，将完成的反应物在72℃放置10分钟。hllp-gsp引物是LLG特异的并产生300bp的预期产物。在平行PCR中，使用对管家基因G3PDH(人甘油醛3-磷酸脱氢酶)特异的引物(每种1μl，20pmol/ml)以表明cDNA合成反应是成功的。
G3PDH引物(见图1)在4个血管活组织检查材料中产生了983碱基对的预期产物.在4个样品中的3个中检测到了LLG表达，颈动脉样品中未检测到表达。
此处讨论的所有参考文献引用作为参考。
本领域的技术人员很容易理解，本发明很好地适合于实现目的并取得所述的和其中固有的结果和益处。此处所述的肽、多聚核苷酸、方法、过程和技术是作为优选实施方案的代表提出的，预期作为例证而不是作为本发明范围的限制。其中的变化及其它应用会被本领域技术人员想到，它们包含在本发明的精神或由本发明附加的权利要求书限定的范围之内。
序列表
(1)基本信息
(i)申请人：Jaye，Michel C.
           Doan，Kim-Anh T
           Krawiec，John A.
           Lynch，Kevin J.
           South，Victoria J.
(ii)发明名称：人脂酶样基因编码的多肽及利用它的组合物和方法
(iii)序列数：31
(iv)联系地址：
    (A)名称：Rhone-Poulenc Rorer Inc.
    (B)街道：500 Arcola Rd.3C43
    (C)城市：Collegeville
    (D)州名：PA
    (E)国家：美国
    (F)邮政编号：19426
(v)计算机可读形式：
   (A)介质类型：软盘
   (B)计算机：IBM PC兼容机
   (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
   (D)软件：PatentIn Release #1.0，版本#1.30
(vi)目前申请资料：
   (A)申请号：US
   (B)递交日：
   (C)分类：
(viii)律师/代理人信息
   (A)名称：Fehlner Ph.D.，Paul F.
   (B)登记号：35,135
   (C)参考/著录号：A2582-WO
(ix)电信信息：
   (A)电话：(610)454-3839
   (B)传真：(610)454-3808
(2)关于SEQ ID NO：1的信息
   (i)序列特征
      (A)长度：367个碱基对
      (B)类型：核酸
      (C)链型：双链
      (D)拓扑结构：线型
   (ii)分子类型：cDNA
   (ix)特征：
       (A)名称/关键：CDS
       (B)位置：22..180
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：1：
Figure C200410038403D00481
(2)关于SEQ ID NO：2的信息
   (i)序列特征
   (A)长度：53个氨基酸
   (B)类型：氨基酸
   (D)拓扑结构：线型
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：
Figure C200410038403D00491
(2)关于SEQ ID NO：3的信息
  (i)序列特征
     (A)长度：1382个碱基对
     (B)类型：核酸
     (C)链型：双链
     (D)拓扑结构：线型
   (ii)分子类型：cDNA
   (ix)特征：
       (A)名称/关键：CDS
       (B)位置：312..1370
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：3：
Figure C200410038403D00492
Figure C200410038403D00501
Figure C200410038403D00511
(2)关于SEQ ID NO：4的信息
   (i)序列特征
      (A)长度：353个氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (D)拓扑结构：线型
   (ii)分子类型：蛋白质
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：4：
Figure C200410038403D00521
Figure C200410038403D00531
(2)关于SEQ ID NO：5的信息
   (i)序列特征
      (A)长度：1065个碱基对
      (B)类型：核酸
      (C)链型：双链
      (D)拓扑结构：线型
   (ii)分子类型：cDNA
   (ix)特征：
       (A)名称/关键：CDS
       (B)位置：1..1065
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：5：
Figure C200410038403D00541
(2)关于SEQ ID NO：6的信息
   (i)序列特征
      (A)长度：355个氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (D)拓扑结构：线型
   (ii)分子类型：蛋白质
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：6：
Figure C200410038403D00571
(2)关于SEQ ID NO：7的信息
   (i)序列特征
      (A)长度：2565个碱基对
      (B)类型：核酸
      (C)链型：双链
      (D)拓扑结构：线型
   (ii)分子类型：cDNA
   (ix)特征：
       (A)名称/关键：CDS
       (B)位置：252..1754
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：7：
Figure C200410038403D00581
Figure C200410038403D00611
(2)关于SEQ ID NO：8的信息
   (i)序列特征
      (A)长度：501个氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (D)拓扑结构：线型
   (ii)分子类型：蛋白质
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：8：
Figure C200410038403D00612
Figure C200410038403D00621
(2)关于SEQ ID NO：9的信息
   (i)序列特征
      (A)长度：1035个碱基对
      (B)类型：核酸
      (C)链型：双链
      (D)拓扑结构：线型
   (ii)分子类型：cDNA
   (ix)特征：
       (A)名称/关键：CDS
       (B)位置：1..1035
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：9：
Figure C200410038403D00632
Figure C200410038403D00641
Figure C200410038403D00651
(2)关于SEQ ID NO：10的信息
   (i)序列特征
      (A)长度：345个氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (D)拓扑结构：线型
   (ii)分子类型：蛋白质
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：10：
Figure C200410038403D00652
Figure C200410038403D00661
(2)关于SEQ ID NO：11的信息
   (i)序列特征
      (A)长度：225个碱基对
      (B)类型：核酸
      (C)链型：双链
      (D)拓扑结构：线型
   (ii)分子类型：cDNA
(ix)特征：
   (A)名称/关键：CDS
   (B)位置：1..225
(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：
Figure C200410038403D00671
(2)关于SEQ ID NO：12的信息
   (i)序列特征
      (A)长度：75个氨基酸
      (B)类型：氨基酸
      (D)拓扑结构：线型
   (ii)分子类型：蛋白质
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：12：
Figure C200410038403D00672
(2)关于SEQ ID NO：13的信息：
   (i)序列特征
      (A)长度：472个碱基对
      (B)类型：氨基酸
      (C)链型：
      (D)拓扑结构：线型
   (ii)分子类型：蛋白质
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：13：
Figure C200410038403D00681
(2)关于SEQ ID NO：14的信息：
   (i)序列特征
      (A)长度：499个碱基对
      (B)类型：氨基酸
      (C)链型：
      (D)拓扑结构：线型
   (ii)分子类型：蛋白质
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：14：
Figure C200410038403D00701
Figure C200410038403D00711
(2)关于SEQ ID NO：15的信息
   (i)序列特征
      (A)长度：465个碱基对
      (B)类型：氨基酸
      (C)链型：
      (D)拓扑结构：线型
   (ii)分子类型：蛋白质
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：15：
Figure C200410038403D00722
Figure C200410038403D00731
Figure C200410038403D00741
(2)关于SEQ ID NO：16的信息
   (i)序列特征
      (A)长度：17个碱基对
      (B)类型：氨基酸
      (C)链型：
      (D)拓扑结构：线型
   (ii)分子类型：肽
   (ii)片段类型：内部的
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：16：
Figure C200410038403D00742
(2)关于SEQ ID NO：17的信息
   (i)序列特征
      (A)长度：13个碱基对
      (B)类型：核酸
      (C)链型：单链
      (D)拓扑结构：线型
   (ii)分子类型：其它核酸
       (A)描述：/desc＝“寡核苷酸”
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：17：
Figure C200410038403D00743
(2)关于SEQ ID NO：18的信息
   (i)序列特征
      (A)长度：10个碱基对
      (B)类型：核酸
      (C)链型：单链
      (D)拓扑结构：线型
   (ii)分子类型：其它核酸
      (A)描述：/desc＝“寡核苷酸”
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：18：
Figure C200410038403D00751
(2)关于SEQ ID NO：19的信息
   (i)序列特征
      (A)长度：23个碱基对
      (B)类型：核酸
      (C)链型：单链
      (D)拓扑结构：线型
   (ii)分子类型：其它核酸
      (A)描述：/desc＝“寡核苷酸”
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：19：
Figure C200410038403D00752
(2)关于SEQ ID NO：20的信息
   (i)序列特征
      (A)长度：20个碱基对
      (B)类型：核酸
      (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线型
(ii)分子类型：其它核酸
   (A)描述：/desc＝“寡核苷酸”
(xi)序列描述：SEQ ID NO：20：
Figure C200410038403D00761
(2)关于SEQ ID NO：21的信息：
   (i)序列特征
      (A)长度：19个碱基对
      (B)类型：核酸
      (C)链型：单链
      (D)拓扑结构：线型
   (ii)分子类型：其它核酸
      (A)描述：/desc＝“寡核苷酸”
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：21：
Figure C200410038403D00762
(2)关于SEQ ID NO：22的信息
   (i)序列特征
      (A)长度：48个碱基对
      (B)类型：核酸
      (C)链型：单链
      (D)拓扑结构：线型
   (ii)分子类型：其它核酸
      (A)描述：/desc＝“寡核苷酸”
   (ix)特征：
      (A)名称/关键：修饰的_碱基
   (B)位置：36
   (D)其它信息：/修饰的_碱基＝i
(ix)特征：
   (A)名称/关键：修饰的_碱基
   (B)位置：37
   (D)其它信息：/修饰的_碱基＝i
(ix)特征：
   (A)名称/关键：修饰的_碱基
   (B)位置：41
   (D)其它信息：/修饰的_碱基＝i
(ix)特征：
   (A)名称/关键：修饰的_碱基
   (B)位置：42
   (D)其它信息：/修饰的_碱基＝i
(ix)特征：
   (A)名称/关键：修饰的_碱基
   (B)位置：46
   (D)其它信息：/修饰的_碱基＝i
(ix)特征：
   (A)名称/关键：修饰的_碱基
   (B)位置：47
   (D)其它信息：/修饰的_碱基＝i
(xi)序列描述：SEQ ID NO：22：
Figure C200410038403D00771
(2)关于SEQ ID NO：23的信息
   (i)序列特征
      (A)长度：28个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线型
(ii)分子类型：其它核酸
   (A)描述：/desc＝“寡核苷酸”
(xi)序列描述：SEQ ID NO：23：
Figure C200410038403D00781
(2)关于SEQ ID NO：24的信息
   (i)序列特征
      (A)长度：24个碱基对
      (B)类型：核酸
      (C)链型：单链
      (D)拓扑结构：线型
   (ii)分子类型：其它核酸
      (A)描述：/desc＝“寡核苷酸”
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：24：
Figure C200410038403D00782
(2)关于SEQ ID NO：25的信息
   (i)序列特征
      (A)长度：25个碱基对
      (B)类型：核酸
      (C)链型：单链
      (D)拓扑结构：线型
   (ii)分子类型：其它核酸
      (A)描述：/desc＝“寡核苷酸”
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：25：
Figure C200410038403D00791
(2)关于SEQ ID NO：26的信息
   (i)序列特征
      (A)长度：21个碱基对
      (B)类型：核酸
      (C)链型：单链
      (D)拓扑结构：线型
   (ii)分子类型：其它核酸
      (A)描述：/desc＝“寡核苷酸”
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：26：
Figure C200410038403D00792
(2)关于SEQ ID NO：27的信息
   (i)序列特征
      (A)长度：22个碱基对
      (B)类型：核酸
      (C)链型：单链
      (D)拓扑结构：线型
   (ii)分子类型：其它核酸
      (A)描述：/desc＝“寡核苷酸”
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：27：
Figure C200410038403D00793
(2)关于SEQ ID NO：28的信息
   (i)序列特征
      (A)长度：25个碱基对
      (B)类型：核酸
      (C)链型：单链
      (D)拓扑结构：线型
   (ii)分子类型：其它核酸
      (A)描述：/desc＝“寡核苷酸”
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：28：
Figure C200410038403D00801
(2)关于SEQ ID NO：29的信息：
   (i)序列特征
      (A)长度：25个碱基对
      (B)类型：核酸
      (C)链型：单链
      (D)拓扑结构：线型
   (ii)分子类型：其它核酸
      (A)描述：/desc＝“寡核苷酸”
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：29：
Figure C200410038403D00802
(2)关于SEQ ID NO：30的信息
   (i)序列特征
      (A)长度：26个碱基对
      (B)类型：核酸
      (C)链型：单链
      (D)拓扑结构：线型
   (ii)分子类型：其它核酸
      (A)描述：/desc＝“寡核苷酸”
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：30：
Figure C200410038403D00811
(2)关于SEQ ID NO：31的信息
   (i)序列特征
      (A)长度：24个碱基对
      (B)类型：核酸
      (C)链型：单链
      (D)拓扑结构：线型
   (ii)分子类型：其它核酸
      (A)描述：/desc＝“寡核苷酸”
   (xi)序列描述：SEQ ID NO：31：
Figure C200410038403D00812

Claims (27)

1.一种脂酶样基因编码的分离的多肽，其中的多肽是兔来源的，并且
(a)与肝素结合，
(b)与人脂蛋白脂酶和肝脂肪酶有同源性，且
(c)包含具有与SEQ ID NO：10同源的氨基酸序列之三酰甘油脂酶家族39kD的催化结构域，
其中，分离的多肽含有SEQ ID NO：12的氨基酸序列。
2.权利要求1的分离的多肽，其中多肽具有磷脂酶A活性。
3.包含权利要求1的多肽和生物学上相容的溶液的组合物。
4.包含权利要求1的多肽和药物学上可接受的载体的药物组合物。
5.编码权利要求1的多肽的分离的核酸。
6.权利要求5的分离的核酸，其是cDNA。
7.权利要求6的分离的核酸，其中核苷酸序列是SEQ ID NO：11。
8.包含权利要求7的核酸和药物学上可接受的载体的药物组合物。
9.含有与调控区域可操作性连接的权利要求7的分离的核酸的载体。
10.权利要求9的载体，其中调控区是异源的。
11.权利要求9的载体，其是病毒载体。
12.权利要求11的载体，其是腺病毒载体。
13.包含权利要求12的载体的重组细胞。
14.权利要求13的重组细胞，其中细胞是真核细胞。
15.权利要求14的重组细胞，其中细胞是COS-7细胞。
16.包含权利要求9的载体和生物学上相容的溶液的组合物。
17.包含权利要求9的载体和药物学上可接受载体的药物组合物。
18.一种制备权利要求1所述多肽的方法，包括在允许多肽表达的条件下培养根据权利要求13所述的重组细胞的步骤。
19.能够与权利要求1的多肽特异结合的抗体。
20.能够与权利要求2的多肽特异结合并中和此多肽的磷脂酶活性的抗体。
21.权利要求19或20的抗体，其是单克隆抗体。
22.权利要求19或20的抗体，其是多克隆抗体。
23.一种产生权利要求21的抗体的杂交瘤细胞。
24.包含权利要求19的抗体和生物学上相容的溶液的组合物。
25.包含权利要求19的抗体和药物学上可接受的载体的药物组合物。
26.一种筛选LLG活性的兴奋剂或拮抗物的方法，包括：
(a)使可能的兴奋剂或拮抗物与LLG和LLG的底物接触，并且
(b)测定可能的兴奋剂或拮抗物增强或抑制LLG活性的能力，其中LLG是权利要求1的多肽。
27.一种体外酶促水解磷脂酰胆碱酯的方法，包括使该磷脂酰胆碱酯与权利要求1的多肽接触。
CNB2004100384031A 1996-12-06 1997-12-05 人脂酶样基因编码的多肽及利用它的组合物和方法 Expired - Fee Related CN100497610C (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US3278396P 1996-12-06 1996-12-06
US3225496P 1996-12-06 1996-12-06
US60/032,254 1996-12-06
US60/032,783 1996-12-06

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB97180348XA Division CN1167793C (zh) 1996-12-06 1997-12-05 人脂酶样基因编码的多肽及利用它的组合物和方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1539849A CN1539849A (zh) 2004-10-27
CN100497610C true CN100497610C (zh) 2009-06-10

Family

ID=26708180

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB97180348XA Expired - Fee Related CN1167793C (zh) 1996-12-06 1997-12-05 人脂酶样基因编码的多肽及利用它的组合物和方法
CNB2004100384031A Expired - Fee Related CN100497610C (zh) 1996-12-06 1997-12-05 人脂酶样基因编码的多肽及利用它的组合物和方法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB97180348XA Expired - Fee Related CN1167793C (zh) 1996-12-06 1997-12-05 人脂酶样基因编码的多肽及利用它的组合物和方法

Country Status (22)

Country Link
US (4) US6395530B1 (zh)
EP (1) EP0948609B1 (zh)
JP (2) JP4615634B2 (zh)
KR (1) KR100516561B1 (zh)
CN (2) CN1167793C (zh)
AP (1) AP1313A (zh)
AT (1) ATE291080T1 (zh)
AU (1) AU750891B2 (zh)
BG (1) BG64798B1 (zh)
BR (1) BR9713847A (zh)
CA (1) CA2273823C (zh)
CZ (1) CZ299055B6 (zh)
DE (2) DE69732789T2 (zh)
EA (1) EA003293B1 (zh)
ES (1) ES2239367T3 (zh)
HK (2) HK1024929A1 (zh)
IL (2) IL129986A0 (zh)
NO (1) NO326140B1 (zh)
OA (1) OA11057A (zh)
PL (1) PL191624B1 (zh)
SK (1) SK287687B6 (zh)
WO (1) WO1998024888A2 (zh)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2273823C (en) * 1996-12-06 2007-06-05 Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. Polypeptides encoded by a human lipase-like gene, compositions and methods
US7008776B1 (en) * 1996-12-06 2006-03-07 Aventis Pharmaceuticals Inc. Compositions and methods for effecting the levels of high density lipoprotein (HDL) cholesterol and apolipoprotein AI very low density lipoprotein (VLDL) cholesterol and low density lipoprotein (LDL) cholesterol
US7692067B2 (en) * 2002-09-18 2010-04-06 Mendel Biotechnology, Inc. Yield and stress tolerance in transgenic plants
JP2002540127A (ja) * 1999-03-26 2002-11-26 アベンティス ファーマスーティカルズ プロダクツ インコーポレイテッド コレステロールのレベルをもたらすための組成物および方法
GB9920334D0 (en) * 1999-08-28 1999-11-03 Glaxo Group Ltd Method
US6337187B1 (en) 1999-11-05 2002-01-08 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 18891, a novel human lipase
WO2001032885A2 (en) * 1999-11-05 2001-05-10 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Human lipase
US20030165845A1 (en) * 2000-09-25 2003-09-04 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 47647, a novel human lipase and uses therefor
US7507808B2 (en) * 2002-12-12 2009-03-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of endothelial lipase expression
CN102250854B (zh) * 2011-07-01 2013-03-27 浙江商达环保有限公司 用于处理油脂污染物的脂肪酶、编码基因及其应用
US8268305B1 (en) 2011-09-23 2012-09-18 Bio-Cat, Inc. Method and compositions to reduce serum levels of triacylglycerides in human beings using a fungal lipase
MA41035A (fr) * 2014-08-19 2017-08-15 Shire Human Genetic Therapies Lipoprotéine lipase pour le traitement d'affections liées à une hypertriglycéridémie, y compris la pancréatite aiguë
TWI688575B (zh) * 2014-09-11 2020-03-21 日商塩野義製藥股份有限公司 阻礙血管內皮脂酶之酵素活性的人類化單株抗體
WO2024236336A1 (en) * 2023-05-17 2024-11-21 Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale Lipc variant in the treatment of hypercholesterolemia and atherosclerotic cardiovascular disease

Family Cites Families (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5691181A (en) * 1984-08-21 1997-11-25 Celltech Limited DNA encoding lipase from human gastric mucosal tissue
FR2573436B1 (fr) 1984-11-20 1989-02-17 Pasteur Institut Adn recombinant comportant une sequence nucleotidique codant pour un polypeptide determine sous le controle d'un promoteur d'adenovirus, vecteurs contenant cet adn recombinant, cellules eucaryotes transformees par cet adn recombinant, produits d'excretion de ces cellules transformees et leurs applications, notamment a la constitution de vaccins
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
US4797368A (en) 1985-03-15 1989-01-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
US4861719A (en) 1986-04-25 1989-08-29 Fred Hutchinson Cancer Research Center DNA constructs for retrovirus packaging cell lines
US4987071A (en) 1986-12-03 1991-01-22 University Patents, Inc. RNA ribozyme polymerases, dephosphorylases, restriction endoribonucleases and methods
JP2764264B2 (ja) 1987-10-01 1998-06-11 株式会社ミドリ十字 線溶活性増強剤
US4944944A (en) * 1987-11-19 1990-07-31 Oklahoma Medical Research Foundation Dietary compositions and methods using bile salt-activated lipase
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5693622A (en) 1989-03-21 1997-12-02 Vical Incorporated Expression of exogenous polynucleotide sequences cardiac muscle of a mammal
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
US5364777A (en) 1992-04-03 1994-11-15 American Air Liquide Method of improving lipase activity using noble gases
HRP930935A2 (en) * 1992-06-11 1994-12-31 Astra Ab New dna sequences
DK88892D0 (da) 1992-07-06 1992-07-06 Novo Nordisk As Forbindelse
CA2137558A1 (en) 1992-07-17 1994-02-03 Wayne A. Marasco Method of intracellular binding of target molecules
US5998189A (en) * 1992-12-16 1999-12-07 Warner-Lambert Company Polypeptide derivatives of dog gastric lipase and pharmaceutical compositions containing same
AU686600B2 (en) * 1993-03-05 1998-02-12 Universite Catholique De Louvain LO-CD2a antibody and uses thereof for inhibiting T-cell activation and proliferation
FR2704556B1 (fr) 1993-04-30 1995-07-13 Rhone Poulenc Rorer Sa Virus recombinants et leur utilisation en thérapie génique.
FR2705686B1 (fr) 1993-05-28 1995-08-18 Transgene Sa Nouveaux adénovirus défectifs et lignées de complémentation correspondantes.
FR2706486B1 (fr) 1993-06-16 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Séquences nucléiques, vecteurs les contenant, compositions pharmaceutiques et utilisations thérapeutiques.
HU216871B (hu) 1993-07-13 1999-09-28 Rhone-Poulenc Rorer S.A. Defektív adenovírusvektorok és génterápiai alkalmazásuk
FR2714830B1 (fr) 1994-01-10 1996-03-22 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition contenant des acides nucléiques, préparation et utilisations.
FR2715847B1 (fr) 1994-02-08 1996-04-12 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition contenant des acides nucléiques, préparation et utilisations.
KR970701264A (ko) 1994-02-22 1997-03-17 안네 제케르 지질분해효소의 변이체 제조방법(a method of preparing a viriant of a lipolytic enzyme)
US5807746A (en) 1994-06-13 1998-09-15 Vanderbilt University Method for importing biologically active molecules into cells
FR2730637B1 (fr) 1995-02-17 1997-03-28 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition pharmaceutique contenant des acides nucleiques, et ses utilisations
US6051220A (en) 1995-05-31 2000-04-18 Medzyme N.V. And Simon Lodewijk Scharpe Composition to improve digestibility and utilization of nutrients
CA2273823C (en) 1996-12-06 2007-06-05 Rhone-Poulenc Rorer Pharmaceuticals Inc. Polypeptides encoded by a human lipase-like gene, compositions and methods
US7008776B1 (en) 1996-12-06 2006-03-07 Aventis Pharmaceuticals Inc. Compositions and methods for effecting the levels of high density lipoprotein (HDL) cholesterol and apolipoprotein AI very low density lipoprotein (VLDL) cholesterol and low density lipoprotein (LDL) cholesterol
WO1999032611A1 (en) 1997-12-19 1999-07-01 Progenitor, Inc. A lipase expressed in endothelial cells and methods for its use
US6337187B1 (en) * 1999-11-05 2002-01-08 Millennium Pharmaceuticals, Inc. 18891, a novel human lipase
US6558936B1 (en) * 1999-10-01 2003-05-06 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Human lipase proteins, nucleic acids encoding them, and uses of both of these

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Lipoprotein lipase. VAN Tilbeurgh等.J. Biol. Chem.,Vol.269 . 1994
Lipoprotein lipase. VAN Tilbeurgh等.J. Biol. Chem.,Vol.269 . 1994 *
The structure and the complete nucleotide sequence of the avian lipoprotein lipase gene. COOPER D.A.等.Biochim. Biophys. ACTA,Vol.1129 . 1992
The structure and the complete nucleotide sequence of the avian lipoprotein lipase gene. COOPER D.A.等.Biochim. Biophys. ACTA,Vol.1129 . 1992 *

Also Published As

Publication number Publication date
DE69732789T2 (de) 2005-08-11
US7056720B2 (en) 2006-06-06
CA2273823A1 (en) 1998-06-11
AP9901548A0 (en) 1999-06-30
US20120114660A1 (en) 2012-05-10
CN1167793C (zh) 2004-09-22
IL129986A (en) 2006-07-05
AP1313A (en) 2004-10-04
DE948609T1 (de) 2000-03-09
IL129986A0 (en) 2000-02-29
JP2001505769A (ja) 2001-05-08
JP5416053B2 (ja) 2014-02-12
CA2273823C (en) 2007-06-05
BG103472A (en) 2001-01-31
AU5690598A (en) 1998-06-29
BG64798B1 (bg) 2006-04-28
EP0948609A2 (en) 1999-10-13
KR20000069336A (ko) 2000-11-25
ATE291080T1 (de) 2005-04-15
NO326140B1 (no) 2008-10-06
SK287687B6 (sk) 2011-06-06
NO992735D0 (no) 1999-06-04
CZ299055B6 (cs) 2008-04-09
US8343494B2 (en) 2013-01-01
US20070101451A1 (en) 2007-05-03
BR9713847A (pt) 2000-02-29
US7579447B2 (en) 2009-08-25
US20030108538A1 (en) 2003-06-12
PL191624B1 (pl) 2006-06-30
EP0948609B1 (en) 2005-03-16
EA003293B1 (ru) 2003-04-24
HK1068636A1 (en) 2005-04-29
OA11057A (en) 2002-03-08
HK1024929A1 (en) 2000-10-27
SK75399A3 (en) 2001-02-12
WO1998024888A3 (en) 1998-08-13
JP2010284171A (ja) 2010-12-24
ES2239367T3 (es) 2005-09-16
CN1240000A (zh) 1999-12-29
AU750891B2 (en) 2002-08-01
EA199900522A1 (ru) 2000-02-28
WO1998024888A2 (en) 1998-06-11
US6395530B1 (en) 2002-05-28
KR100516561B1 (ko) 2005-09-22
NO992735L (no) 1999-08-05
CZ9902003A3 (cs) 2000-10-11
DE69732789D1 (de) 2005-04-21
CN1539849A (zh) 2004-10-27
JP4615634B2 (ja) 2011-01-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100887164B1 (ko) Ｌｉｐｇ 폴리펩타이드의 활성을 증가시키고 초저밀도 지단백질(ｖｌｄｌ) 콜레스테롤 및 저밀도 지단백질(ｌｄｌ) 콜레스테롤의 수준을 저하시키는 조성물 및 이를 위해 유용한 화합물을 동정하는 방법
JP5416053B2 (ja) トリアシルグリセロールリパーゼファミリーのｌｌｇポリペプチド、組成物、酵素的加水分解における使用のための方法、タンパク質及び遺伝子治療
US20090208479A1 (en) Compositions and Methods for Effecting the Levels of High Density Lipoprotein (HDL) Cholesterol and Apolipoprotein AI, Very Low Density Lipoprotein (VLDL) Cholesterol and Low Density Lipoprotein (LDL) Cholesterol
WO1998024888A9 (en) Polypeptides encoded by a human lipase-like gene, compositions and methods
EP1366173A2 (en) Isolated human phospholipase proteins, nucleic acid molecules encoding human phospholipase proteins, and uses thereof
US20050196803A1 (en) Isolated human lipase proteins, nucleic acid molecules encoding human lipase proteins, and uses thereof
JP2004514434A (ja) 単離ヒトホスファターゼタンパク質、ヒトホスファターゼタンパク質をコード化する核酸分子及びその使用
WO2002062977A2 (en) Human phospholipase b-like polypeptide and uses thereof
HU227851B1 (hu) Humán lipáz jellegû gén által kódolt polipeptidek, az ezeket tartalmazó kompozíciók és eljárások ezek elõállítására

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1068636

Country of ref document: HK

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: GR

Ref document number: 1068636

Country of ref document: HK

CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20090610

Termination date: 20151205

EXPY Termination of patent right or utility model