CN100494233C - 一种固载蛋白质的多孔整体基质及其制备 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种固载蛋白质的多孔整体基质，以丙烯酰琥珀酰亚胺、丙烯酰胺和乙叉二甲基丙烯酸作为单体，在二元高级醇的混合溶液中进行原位聚合，得到一种具有多孔结构的刚性基质。通过基质表面的活性基团，蛋白质或蛋白酶分子可以被牢固地结合在整体基质上，制得高活性的固定化酶反应器。该方法具有稳定性高，简单、快速等优点。与传统的蛋白质固定化方法相比，制得的整体基质上具有高活性的反应基团，可以快速地与蛋白质等具有伯胺基的分子进行反应，制备方法简单，也缩短了制备酶反应器的时间。
Description
技术领域
本发明涉及一种固载蛋白质的新型多孔整体基质及其制备，可用于快速固载蛋白质分子。
背景技术
目前人工合成的用于蛋白质固载的基质主要分为颗粒基质和整体基质两大类。颗粒基质的制备一般包括合成和破碎两个步骤。得到的颗粒根据其表而功能基团不同，在固载蛋白质分子时一般还需要进行修饰和活化。此类基质主要应用于柱内填充。在填充柱中，液流主要通过填料之间的空隙，从流动相向固定化酶的传质和从固定化酶向流动相的传质主要由扩散速率决定，依赖于填料、孔的大小、流速和底物的扩散系数。对于蛋白质这种大分子，其扩散速率较低，而填充柱中填料之间存在大量的空隙，即使使用均匀大小的球体，也仍然存在27％的空隙，在实际的应用中，空隙将会更大，所以此类基质作为固定化蛋白酶的载体并不理想。
多孔整体基质是近年来发展起来的一种新的色谱分离介质。整体基质通过改变优化合成的条件，可以同时得到可用于对流的大孔，也能获得可用于扩散的小孔，其孔的直径分布在700-2000纳米范围内。在整体柱基质中，可以允许流动相在其中对流，传质得到显著提高，即使在较高的流速下，也可以得到理想的传质速率。大孔整体材料用作催化剂十分理想，特别是在底物是蛋白质这样扩散系数小的大分子时，更加适用。当使用大孔的整体基质作为固定化蛋白酶的载体时，较快的传质使得底物可以容易地与酶的活性部位接近，大大提高酶解反应的速度。
整体基质虽然都可以用于固载蛋白质分子，但是有些基团的活性不高，所以在进行蛋白质固载时，常需要花费较长的时间。
发明内容
琥珀酰亚胺活性基团是一种高活性的反应基团，可以迅速与蛋白质上的氨基反应。本发明的目的在于提供一种新型的用于蛋白质固载的多孔整体基质，使用丙烯酰琥珀酰亚胺作为功能单体，将琥珀酰亚胺直接进入整体基质的骨架结构中，能够显著缩短蛋白质的固载时间。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种固载蛋白质的多孔整体基质，通过原位聚合的方法以丙烯酰琥珀酰亚胺、丙烯酰胺和乙叉二甲基丙烯酸作为单体，在二元高级醇的混合溶液中进行原位聚合，得到一种具有多孔结构的刚性基质。其可以迅速与蛋白质分子进行反应，快速结合蛋白质分子。
基质为一种连续、均匀的多孔结构高分子物质，其孔径范围在10-9至10-5米；具有良好的通透性，流过床层的流体线流速范围在0-50cm/min；基质具有刚性结构，压力适用范围为0-40MPa。
基质可采用片状、柱状形式，也可以直接在柱管或芯片的通道内制备。
所述固载蛋白质的多孔整体基质制备的具体步骤如下，
1)丙烯酰琥珀酰亚胺、丙烯酰胺和乙叉二甲基丙烯酸作为单体，在二元高级醇的混合溶液中进行混合；
其中三种单体质量占单体总质量的百分比范围为：丙烯酰琥珀酰亚胺20-30％(w/w)；乙叉二甲基丙烯酸40-60％(w/w)；丙烯酰胺20-30％(w/w)。
2)在聚合溶液中加入引发剂，在50-70℃下进行加热引发聚合反应或在200-400nm紫外灯照射下进行光引发聚合反应。
制备基质时使用高级醇混合溶液作为致孔剂，所述高级醇为正丙醇、1，4-丁二醇、环己醇、正癸醇或十二醇；其用量为占聚合物总质量的60-75％；其中良溶剂：正丙醇或环己醇；弱溶剂：1，4-丁二醇、正癸醇或十二醇，在混合溶液中二元高级醇良溶剂与弱溶剂的质量比范围为10-90％，在二元高级醇混合溶液中的良溶剂与弱溶剂质量比范围通常为85-50％；所述引发剂为AIBN，其加入量占单体总质量的0.5-2％；在室温下加入引发剂后，除气，置于50-70℃下反应不少于6小时。
所述三种单体加入混合溶剂中后加热至50-80℃，震荡混匀。
应用时，采用蛋白溶液直接通过整体基质，蛋白可迅速固定于基质上；可在1个小时内完成蛋白质的固载；基质具有良好的通透性和生物亲和性，在固载蛋白质后，可以实现高通量蛋白质酶解；
基质表面带有琥珀酰亚胺功能基团，琥珀酰亚胺功能基团在基质的骨架中均匀分布，可以高活性地进一步与蛋白质分子进行反应。
基质骨架内添加丙烯酰胺单体。
本发明具有如下优点：
1.基质表面具有高活性的反应基团，可以快速结合蛋白质分子。本发明基质表面具有高活性的反应基团，可以快速与蛋白质分子上的胺基进行反应，制得酶反应器。该基质的制备方法简单，基质反应活性高，固载蛋白质分子迅速，可以显著缩短固载时间。
2.使用多孔结构材料作为基质，可以增进底物的传质过程。本发明的基质具有连续、均匀的多孔结构，可以显著提高底物在基质中的传质和对流，使用在基质为载体制得的酶反应器具有较高的反应活性，能够大幅度提高酶与底物的反应速度。
3.具有刚性结构，能够耐受一定范围的机械压力，压力适用范围为0-40MPa。
4.应用简便，适用范围广。本发明使用多种单体在高级醇混合溶液中进行原位聚合，得到连续、均匀的多孔结构整体基质；通过基质表面的活性基团，蛋白质或蛋白酶分子可以被牢固地结合在整体基质上，可制得高活性的固定化酶反应器。该方法具有稳定性高，简单、快速等优点。与传统的蛋白质固定化方法相比，制得的整体基质上具有高活性的反应基团，可以快速地与蛋白质等具有伯胺基的分子进行反应，制备方法简单，也缩短了制备酶反应器的时间。
附图说明
图1为新型整体基质合成示意图。
图2为新型整体基质扫描电镜图。
图3为新型整体基质压力与流量关系图。
图4为本发明一个实施例中新型整体基质的整体柱形式；其中a为整体基质，b为检测窗口，c为空管。
图5为本发明一个实施例中新型整体基质的芯片形式。其中a为整体基质，b为检测窗口，c为空管。
图6为本发明一个实施例中新型整体基质固载胰蛋白酶后，水解小分子底物N-苯酰基-L-精氨酸乙酯(BAEE)的电泳分离谱图。
图7为本发明一个实施例中新型整体基质固载胰蛋白酶后，水解细胞色素c产物的色谱分离谱图。
图8为本发明一个实施例中不同条件下制得新型整体基质压力与流量关系图。
图9为本发明一个实施例中不同条件下制得的新型整体基质在固载胰蛋白酶后，水解小分子底物N-苯酰基-L-精氨酸乙酯(BAEE)的电泳分离谱图。
具体实施方式
实施例1
1.整体基质的制备：按图1所示，选择以丙烯酰琥珀酰亚胺(NAS)和丙烯酰胺作为单体，乙叉二甲基丙烯酸(EDMA)作为交联剂合成多孔整体基质。毛细管内壁预先经带双键功能团的硅烷试剂(甲级丙烯酸(3-三甲氧基硅氧基)丙酯，γ-MAPS)改性，单体在其中聚合并通过化学键固定在毛细管壁上。NAS上的琥珀酰亚胺作为活性反应基团用来衍生固定蛋白质分子，具体是将这样的多孔材料原位聚合在毛细管中制作成整体柱并应用于底物水解实验。称取NAS62.5mg，丙烯酰胺62.5mg和EDMA 125mg、溶于750mg环己醇/十二醇(质量比85/15)的混合溶剂中，加热至60℃，震荡混匀，冷却到25℃后，加入2.5mg引发剂AIBN，通氮气1min后，超声除气5min。在室温下，用注射器取上述溶液注入毛细管中，两端用硅橡胶封闭，置于55℃水浴中反应6小时。
2.整体基质的表征：其扫描电镜如图2，其压力与流量关系如图3。外观为图4的整体柱形式，图5为芯片形式
3.蛋白酶的固定化：将制得的整体基质用甲醇冲洗30min，然后连续通入含50mM苯甲脒、2mg/mL的胰蛋白酶(trypsin)的500mM NaCl/200mMNaHCO3缓冲溶液，反应1h，反应结束后，使用500mM NaCl/200mM NaHCO3缓冲溶液连续冲洗整体基质。
4.使用该整体基质固载胰蛋白酶分子后，制得酶反应器的应用：小分子底物N-苯酰基-L-精氨酸乙酯(BAEE)的水解，如图6；大分子底物细胞色素c的水解，如图7，表1。
表1 本发明实施例1中新型整体基质固载胰蛋白酶后，水解细胞色素c产物经多极质谱检测和数据库检索后的结果。
实施例2
1.整体基质的制备：按图1所示，选择以丙烯酰琥珀酰亚胺(NAS)和丙烯酰胺作为单体，乙叉二甲基丙烯酸(EDMA)作为交联剂合成多孔整体基质。毛细管内壁预先经带双键功能团的硅烷试剂(甲级丙烯酸(3-三甲氧基硅氧基)丙酯，γ-MAPS)改性，单体在其中聚合并通过化学键固定在毛细管壁上。NAS上的琥珀酰亚胺作为活性反应基团用来衍生固定蛋白质分子，具体是将这样的多孔材料原位聚合在毛细管中制作成整体柱并应用于底物水解实验。称取称取如表2所示配比的单体与致孔剂，加热至80℃，震荡混匀，冷却到25℃后，加入引发剂AIBN，通氮气1min后，超声除气5min。在室温下，用注射器取上述溶液注入毛细管中，两端用硅橡胶封闭，置于70℃水浴中反应12小时。
2.整体基质的表征：其压力与流量关系如图8。外观为图4的整体柱形式，图5为芯片形式
3.蛋白酶的固定化：将制得的整体基质用甲醇冲洗30min，然后连续通入含50mM苯甲脒、2mg/mL的胰蛋白酶(trypsin)的500mM NaCl/200mMNaHCO3缓冲溶液，反应1h，反应结束后，使用500mM NaCl/200mM NaHCO3缓冲溶液连续冲洗整体基质。
4.使用该整体基质固载胰蛋白酶分子后，制得酶反应器的应用：小分子底物N-苯酰基-L-精氨酸乙酯(BAEE)的水解，如图9
表2 本发明实施例2中制备新型整体基质各单体以及致孔剂的配比。
Claims (4)
1.一种固载蛋白质的多孔整体基质的制备方法，其特征在于：具体步骤如下，
1)丙烯酰琥珀酰亚胺、丙烯酰胺和乙叉二甲基丙烯酸作为单体，在二元高级醇的混合溶液中进行混合；
所述的二元高级醇为，良溶剂：正丙醇或环己醇；弱溶剂：1，4-丁二醇、正癸醇或十二醇；在二元高级醇混合溶液中的良溶剂与弱溶剂质量比范围为85-50％；
其中三种单体质量占单体总质量的百分比范围为：丙烯酰琥珀酰亚胺20-30％；乙叉二甲基丙烯酸40-60％；丙烯酰胺20-30％；
2)在聚合溶液中加入引发剂，在50-70℃下进行加热引发聚合反应或在200-400nm紫外灯照射下进行光引发聚合反应；所述引发剂为偶氮二异丁腈，其加入量占单体总质量的0.5-2％。
2.按照权利要求1所述固载蛋白质的多孔整体基质的制备方法，其特征在于：在室温下加入引发剂后，除气，置于50-70℃下反应不少于6小时。
3.按照权利要求1所述固载蛋白质的多孔整体基质的制备方法，其特征在于：所述三种单体加入混合溶液中后加热至50-80℃，震荡混匀。
4.一种权利要求1所述的固载蛋白质的制备方法制备得到的固载蛋白质的多孔整体基质。
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Citations (5)
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2005
- 2005-12-14 CN CNB2005100479892A patent/CN100494233C/zh active Active
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