CN100490822C - 一种外科手术防粘连凝胶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种外科手术防粘连凝胶及其制备方法，该防粘连凝胶是由1份重量的分子量30～70万道尔顿的羧甲基壳聚糖和20～30份重量的注射用水组成的，它的动力学粘度为800～3000厘泊。制备方法包括除原料中杂蛋白热原、甲壳素的羧甲基化改性、精制羧甲基壳聚糖、配制防粘连凝胶及其制剂。该防粘连凝胶具有优良的生物屏障性能和组织相容性，涂于组织创面，防止术后组织粘连，在人体内中间代谢和最终代谢物是人体正常的代谢产物，易于肌体吸收，无毒性和刺激性。该防粘连凝胶原料来源丰富，价格低，制备简单，在临床医学领域具有广阔的应用前景。

Description

一种外科手术防粘连凝胶及其制备方法

(一)技术领域

本发明涉及一种外科手术防粘连凝胶及其制备方法，属于外科医疗材料技术领域。

(二)背景技术

外科手术后组织粘连一直是临床医学面临的一大难题，在人体腹部、心血管、脊柱、骨关节、腱部、妇科盆腔等外科手术后发生的组织粘连不但给患者带来极大的痛苦，而且造成巨大的经济损失。为解决术后粘连问题，国内外的相关科技工作者一直进行不懈的努力，到目前为止，已经尝试过的多种防粘连材料，大体可划分为三代。第一代材料是人体不可降解的机械屏障材料，如金属片、丝绸、橡胶片、聚四氟乙烯等；第二代材料是人体难以吸收的屏障材料，如矿物油、右旋糖酐、甲壳素等；第三代材料是人体易于吸收的生物材料，如透明质酸、几丁糖、聚乳酸等。其中，第一、二代材料因存在一些不能降解吸收、对组织有刺激、易引起感染等缺陷逐渐被市场淘汰。第三代材料目前大多获得FDA的许可，在临床上得到了广泛应用，但是，这些产品或多或少存在一些纯度和降解速度难以控制等不足之处。

(三)发明内容

本发明针对现有技术外科术后防粘连材料存在的不足，提供一种外科手术防粘连凝胶及其制备方法。

本发明还提供一种外科手术防粘连凝胶制剂。

本发明的技术方案如下：

1、外科手术防粘连凝胶

一种外科手术防粘连凝胶，由分子量为30—70万道尔顿精制羧甲基壳聚糖1重量份和注射用水20—30重量份，防粘连凝胶动力学粘度800—3000厘泊；所述的羧甲基壳聚糖分子量为30—70万道尔顿，分子结构单元为：

其中：R₁为氢(-H)或羧甲基(-CH₂COOH)，R₁为羧甲基时其含量为50％～80％摩尔比，R₂为氢(-H)、乙酰基(-COCH₃)或羧甲基(-CH₂COOH)，R₂为羧甲基时其含量>10％摩尔比，R₁、R₂至少有一个是羧甲基，R₃为氢(-H)或羧甲基(-CH₂COOH)。

上述的精制羧甲基壳聚糖是将甲壳素经除杂蛋白、羧甲基化改性得到羧甲基壳聚糖，再将羧甲基壳聚糖经无热原水溶解、过滤、无水乙醇絮凝后真空干燥制得。

2、外科手术防粘连凝胶的制备

本发明的一种外科手术防粘连凝胶的制备方法，步骤如下，均为重量份：

(1)除去甲壳素原料中杂蛋白热原

称取分子量大于70万道尔顿的甲壳素1份，加入其重量3～6倍的氢氧化钠水溶液，氢氧化钠水溶液浓度为20％～40％(w/v)，在50℃～80℃下搅拌30-60min，用无热原水将甲壳素冲洗至pH中性，甩干备用。

所述甲壳素为市售产品。

(2)甲壳素的羧甲基化改性

称取经步骤(1)处理的甲壳素1份，在室温下用3～4份浓度为45％～50％(w/v)的氢氧化钠水溶液浸泡0.5～5h，100～120rpm转速下充分搅拌。加入15～25份异丙醇，继续在搅拌条件下流加氯乙酸的异丙醇溶液5～10份，该溶液氯乙酸浓度为60％～80％(w/w)，在0℃～10℃条件下反应23～25小时，然后离心过滤反应醪液获得固型物，用75％～80％乙醇洗涤固型物2～6遍，洗涤过程中用稀盐酸中和至pH中性，得羧甲基壳聚糖，甩干备用。

(3)精制羧甲基壳聚糖

在无菌条件下，将上述羧甲基壳聚糖用80～100倍体积的无菌无热原水充分溶解，滤去不溶物，用截留分子量为70-30万道尔顿的膜对羧甲基壳聚糖水溶液进行过滤和透析操作，然后将透析袋内的羧甲基壳聚糖水溶液逐步稀释过滤除菌，稀释至最终液体浓度为0.1％w/v。然后用该溶液2～4倍体积的无水乙醇絮凝羧甲基壳聚糖，将絮凝后的羧甲基壳聚糖真空干燥，得精制的羧甲基壳聚糖。

优选的，上述稀释过滤除菌采用0.22μm过滤膜。

优选的，上述絮凝用无水乙醇是经0.22μm膜过滤的。

经以上步骤制得的精制羧甲基壳聚糖，无菌，无热原，分子量30～70万道尔顿。

(4)配制防粘连凝胶

在无菌条件下，称取步骤(3)的精制羧甲基壳聚糖，用无热原的器具按照如下比例配制防粘连凝胶动力学粘度800～3000厘泊的防粘连凝胶：

精制羧甲基壳聚糖      1份

注射用水              20—30份。

3、外科手术防粘连凝胶制剂的制备

在无菌条件下，将上述防粘连凝胶搅拌，充分溶胀，然后罐装于一次性医用注射器中，得防粘连凝胶制剂，于0℃—10℃条件下保存。

上述防粘连凝胶罐装于一次性医用注射器中，装量规格1毫升～20毫升。

本发明的防粘连凝胶的技术特点是采用了精制羧甲基壳聚糖，选择分子量大于70万道尔顿的甲壳素原料，保证终产品的分子量大于30万道尔顿，通过用碱浓度、用碱量，浸泡时间、氯乙酸用量、反应温度、反应时间等工艺条件的优选控制，确保R1、R2、R3的摩尔含量在所述的范围内。通过对羧甲基壳聚糖水溶液的透析操作，将分子量小于30万道尔顿的小分子杂质去除，使精制羧甲基壳聚糖无菌、无热原，分子量30～70万道尔顿。

本发明的优良效果如下：

本发明的防粘连凝胶采用了精制羧甲基壳聚糖，选择合适的分子量和羧甲基含量，具有优良的生物屏障性能和组织相容性，涂于组织创面，防止术后组织粘连。本发明防粘连凝胶在人体内中间代谢和最终代谢物是人体正常的代谢产物，易于肌体吸收，无毒性和刺激性。另外，该防粘连凝胶原料来源丰富，价格低廉，制备工艺简单，在临床医学领域具有广阔的应用前景。

本发明的防粘连凝胶可以有效地克服现有防粘连材料的缺陷，具有产品纯度高，水溶性和生物相容性好、价格低廉等特点，本发明的防粘连凝胶制剂使用方便，规格任选。本发明的防粘连凝胶的制备方法，操作简便，易于工业化生产，具有良好的工业应用前景。

(四)具体实施方式

实施例1

一种外科手术防粘连凝胶，由分子量为35—40万道尔顿精制改性羧甲基壳聚糖1重量份和注射用水30重量份，防粘连凝胶动力学粘度900厘泊；制备方法步骤如下：

(1)除去甲壳素原料中杂蛋白等热原

称取分子量约75万道尔顿的市售甲壳素2kg，加入6kg氢氧化钠水溶液，氢氧化钠水溶液浓度为20％(w/v)，在70℃下搅拌6小时，用无热原水将甲壳素冲洗至pH中性，甩干备用。

(2)甲壳素的羧甲基化改性

称取步骤(1)处理的甲壳素1kg，在室温下用3kg浓度为45％(w/v)的氢氧化钠水溶液浸泡3小时，100～120rpm转速下充分搅拌。加入18kg异丙醇，继续在搅拌条件下流加氯乙酸的异丙醇溶液5kg，该溶液浓度为60％(w/w)，在5℃条件下反应23小时，然后离心过滤反应醪液获得固型物，用75％乙醇洗涤固型物3遍，洗涤过程中用稀盐酸中和至pH中性，将获得的羧甲基壳聚糖甩干备用。所得羧甲基壳聚糖分子量35—40万道尔顿。

(3)精制羧甲基壳聚糖

将上述改性羧甲基壳聚糖用80倍体积的无热原水充分溶解，滤去不溶物，用截留分子量为45万道尔顿的膜对羧甲基壳聚糖水溶液进行过滤后，收集滤液，再用截留分子量为30万道尔顿的膜对该滤液进行透析操作，然后将透析袋内的羧甲基壳聚糖水溶液逐步稀释过滤除菌(0.22μm膜)，然后用该溶液3倍体积的无水乙醇絮凝羧甲基壳聚糖，该无水乙醇提前用0.22μm膜过滤，将絮凝后精制的羧甲基壳聚糖真空干燥备用。

(4)配制防粘连凝胶

在无菌条件下，称取步骤(3)精制的羧甲基壳聚糖，用无热原的器具按照如下比例配制防粘连凝胶：

精制羧甲基壳聚糖         0.5kg

注射用水                 15kg

防粘连凝胶动力学粘度     900厘泊。

将上述防粘连凝胶充分搅拌均匀，充分溶胀，在无菌条件下，罐装于一次性医用注射器中，得防粘连凝胶制剂，装量规格可从5毫升/支到15毫升/支，于0℃～10℃条件下保存。

实施例2

一种外科手术防粘连凝胶，由分子量为60—65万道尔顿精制改性羧甲基壳聚糖1重量份和注射用水20重量份，防粘连凝胶动力学粘度2800厘泊；其制备方法步骤如下：

(1)除原料中杂蛋白等热原

称取分子量约90万道尔顿的市售甲壳素2kg，加入10kg氢氧化钠水溶液，氢氧化钠水溶液浓度为25％(w/v)，在80℃下搅拌5小时，用无热原水将甲壳素冲洗至pH中性，甩干备用。

(2)甲壳素的羧甲基化改性

称取上述甲壳素1kg，在室温下用4kg浓度为50％(w/v)的氢氧化钠水溶液浸泡5小时，100～120rpm转速下充分搅拌。加入25kg异丙醇，继续在搅拌条件下流加氯乙酸的异丙醇溶液10kg，该溶液浓度为60％(w/w)，在6℃—10℃条件下反应25小时，然后离心过滤反应醪液获得固型物，用80％乙醇洗涤固型物6遍，洗涤过程中用稀盐酸中和至pH中性，将获得的羧甲基壳聚糖甩干备用。所得羧甲基壳聚糖分子量为60—65万道尔顿。

(3)精制羧甲基壳聚糖

将上述羧甲基壳聚糖用100倍体积的无热原水充分溶解，滤去不溶物，用截留分子量为65万道尔顿的膜对羧甲基壳聚糖水溶液进行过滤后，收集滤液，再用截留分子量为60万道尔顿的膜对该滤液进行透析操作，然后将透析袋内的羧甲基壳聚糖水溶液逐步稀释过滤除菌(0.22μm膜)，然后用该溶液4倍体积的无水乙醇(该无水乙醇提前用0.22μm膜过滤)絮凝羧甲基壳聚糖，将絮凝后精制的羧甲基壳聚糖真空干燥备用。

(4)配制剂及灌装

在无菌条件下，称取步骤(3)精制羧甲基壳聚糖，用无热原的器具按照如下比例配制防粘连凝胶制剂：

精制羧甲基壳聚糖        0.5kg

注射用水                10kg

防粘连凝胶动力学粘度    2800厘泊

上述比例的防粘连凝胶充分搅拌均匀，充分溶胀，在无菌条件下，罐装于一次性医用注射器中，装量规格可从2毫升/支到5毫升/支，于0℃—10℃条件下保存备用。

实施例3

在无菌条件下，称取实施例2中精制后干燥的羧甲基壳聚糖，用无热原的器具按照如下比例配制防粘连凝胶制剂：

精制羧甲基壳聚糖         0.1kg

注射用水                 2.5kg

防粘连凝胶动力学粘度     1600厘泊

上述防粘连凝胶充分搅拌，充分溶胀，在无菌条件下，罐装于一次性医用注射器中，装量规格2毫升/支，于0℃—10℃条件下保存，备用。

比较试验例一：

上述实施例中制备的防粘连凝胶与市售透明质酸在体外酶解特性方面进行比较，降解率比较结果如表1所示。

表1：体外酶解72小时和120小时降解率比较

上述体外酶解试验具体方法如下：

1、目的：

观察防粘连材料在体外用生物酶降解的情况，研究该类产品的生物降解性质。

2、材料：

电子天平1台，溶菌酶(SIGMA公司)1g，PH7.4的磷酸盐缓冲液，100mL容量瓶1个，10mL吸管2支，100mL烧杯2各，300mL的三角瓶各20个，恒温振荡器1台，真空干燥器2台。

3、方法：

(1)溶菌酶液的配制：用电子天平称取溶菌酶500mg，放入100mL容量瓶中，用PH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)定容至100mL，配制溶菌酶溶液，此溶菌酶浓度为5mg/mL。

(2)用吸管取高浓度(30mg/mL)样品和低浓度(15mg/mL)样品各10mL，分别加入不同的三角瓶(50mL)中，每种样品10瓶重复，写好标记。

(3)用吸管向各摇瓶中加入溶菌酶液10mL，混匀。

(4)将所有摇瓶放置在恒温摇床上，温度：37℃，摇床转速：60转/分钟。

4、分析检测：

(1)在摇床上培养48小时后，取两种样品的摇瓶2瓶进行处理，先将50mL摇瓶液体分别转入300mL的三角瓶中，分别加入无水乙醇80mL，彻底摇匀，静置20分钟。

(2)将各瓶内的液体6000rpm离心，弃去上清，收集固形物。

(3)将固形物放入烧杯中真空干燥至恒重，分别用电子天平称重并记录。

(4)以后每隔72小时，分别取两种样品的摇瓶各2瓶进行以上同样的操作。

5、结果处理：

(1)样品降解情况以降解率表示：

注：反应前总重量＝反应前样品干物质重量+溶菌酶干物质重量

(2)每次所取两个摇瓶单独处理，然后取两者的平均值作为真正的降解率。

(3)反应前样品干物质重量是指：将产品样品用其4倍体积的无水乙醇沉淀，收集沉淀进行真空干燥后所得的物质的重量。

比较试验例二：

上述实施例中制备的防粘连凝胶与市售透明质酸在预防大鼠肠粘连方面进行实验比较(具体实验方法请见附件2)，粘连程度比较结果如表2所示。

表2：预防大鼠肠粘连试验比较结果

上述大鼠肠粘连试验方法如下：

1、实验材料

1)动物：健康大鼠72只，雄性，体重250～270g，随机分组，每组12只。

2)各级防粘连制剂样品；生理盐水溶液作为空白对照，阳性对照选用透明质酸钠。

3)实验器材：解剖用手术器械两套、干纱布(60-90小块、2～4大块)、解剖盘灭菌备用；消毒酒精或碘酒。手术用缝合丝线(1号)

4)药品：戊巴比妥钠(2％，腹腔注射剂量30mg/kg)

2、实验方法

1)麻醉：全部动物采用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(30mg/kg)。当动物安静，呼吸平稳平衡、血压正常，腹壁肌肉松弛、角膜反射迟钝，无缺氧表现时即可进行各项实验操作。

2)动物麻醉后仰卧位固定，剪毛消毒，无菌操作下取下腹正中切口，长约2-3cm，打开腹腔后找出回盲部，距回盲部5cm处取10cm长的一段回肠，用干纱布反复轻轻擦拭小肠浆膜层使浆膜受损(约0.4cm×10cm)，表面有针尖状出血点，纱布染成淡红色。

3)分组别向创面涂布样品2ml、及对照品均为2ml，涂布范围为整个创面，然后将其放回腹腔，逐层关腹，缝合。

4)术后动物禁食12h，分笼饲养，饲料为全价营养大鼠颗粒饲料。

5)14d后再麻醉或处死大鼠后，开腹检验、取材，判断粘连等级。

3、实验结果

1)观察项目

(1)腹腔内粘连诊断标准

根据仲剑平分级标准确定大鼠的粘连情况。0级：完全无粘连；I级：1-2处局部轻度粘连，用手指易分开；II级：有两处以上I级样的粘连；III级：有广泛的粘连，部分分离困难；IV级：肠管相互之间或腹膜、肠系膜之间紧密粘连，纠缠成团，分离困难。

(2)光镜观察：每组随机各取3只大鼠的创面部位肠管0.5cm，石蜡包埋切片，H-E染色，观察浆膜创面修复情况。

Claims (1)

1.一种外科手术防粘连凝胶的制备方法，步骤如下，均为重量份：

(1)除去甲壳素原料中杂蛋白热原

称取分子量大于70万道尔顿的甲壳素1份，加入其重量3～4倍的氢氧化钠水溶液，氢氧化钠水溶液浓度为20％～40％w/v，在50℃～80℃下搅拌30～60min，用无热原水将甲壳素冲洗至pH中性，甩干；

(2)甲壳素的羧甲基化改性

称取经步骤(1)处理的甲壳素1份，在室温下用3～4份浓度为45％～50％w/v的氢氧化钠水溶液浸泡0.5～5h，100～120rpm转速下充分搅拌，加入15～25份异丙醇，继续在搅拌条件下流加氯乙酸的异丙醇溶液5～10份，该溶液氯乙酸浓度为60％～80％w/w，在0℃～10℃条件下反应23～25h，然后离心过滤反应醪液获得固型物，用75％～80％乙醇洗涤固型物2～6遍，洗涤过程中用稀盐酸中和至pH中性，得羧甲基壳聚糖，甩干；

(3)精制羧甲基壳聚糖

在无菌条件下，将上述羧甲基壳聚糖用80～100倍体积的无菌无热原水充分溶解，滤去不溶物，用截留分子量为30万道尔顿的膜对羧甲基壳聚糖水溶液进行透析操作，然后将透析袋内的羧甲基壳聚糖水溶液逐步稀释过滤除菌，过滤膜0.22μm；最终液体浓度稀释为0.1％w/v，然后用该溶液2～4倍体积的无水乙醇絮凝羧甲基壳聚糖，所述絮凝用无水乙醇是经0.22μm膜过滤的；将絮凝后的羧甲基壳聚糖真空干燥，得分子量为30～70万道尔顿的精制羧甲基壳聚糖；

(4)配制防粘连凝胶

在无菌条件下，称取步骤(3)的精制羧甲基壳聚糖，用无热原的器具按照如下比例配制防粘连凝胶动力学粘度800～3000厘泊的防粘连凝胶：

精制羧甲基壳聚糖       1份

注射用水               20～30份。