CN100457911C

CN100457911C - 含有效b细胞活化因子基因启动子的重组质粒及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN100457911C
Application number: CNB2006100235905A
Authority: CN
Inventors: 仲人前; 周琳; 孔宪涛; 高春芳; 王皓; 屠小卿; 陆慧琦
Original assignee: Second Military Medical University SMMU
Current assignee: Second Military Medical University SMMU
Priority date: 2006-01-24
Filing date: 2006-01-24
Publication date: 2009-02-04
Anticipated expiration: 2026-01-24
Also published as: CN1807648A

Abstract

本发明涉及生物医药工程技术领域。目前有关B细胞活化因子(BAFF)基因上游调控元件的准确定位及其与相应的DNA结合蛋白的相互作用的研究尚属空白，更未见任何有关病理条件下BAFF基因调控元件的功能变化的报道。本发明提供一种含有效BAFF基因启动子的重组质粒，它由人BAFF基因上游启动子序列的-1349～-743bp片段和氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因组成，本发明还提供了该重组质粒的制备方法和用途。本发明构建的重组质粒准确、可靠；报告基因测活比较活性的方法简单、可以定量，是一个在转录水平探索激活/阻断BAFF基因的调控靶点的简便方法；而且部分细胞因子可以一定程度地影响该重组质粒的启动活性，为研究治疗SLE等BAFF相关性疾病的细胞因子类药物的筛选提供了新思路。

Description

含有效B细胞活化因子基因启动子的重组质粒及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及生物医药工程技术领域，具体涉及一种含有效B细胞活化因子基因启动子的重组质粒及其制备方法和用途。

背景技术

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)是一类常见病、多发病，主要表现为B细胞过度增殖活化、产生多种自身抗体(以抗双链DNA抗体最为重要)。该病多发于20～50岁的中青年女性，男女比例约1∶8；如果诊断治疗不及时，60～70％的患者将出现肾功能衰竭，严重影响了劳动力质量。而SLE的发病机理仍若明若暗，至今尚无特定的诊断手段，更无理想的治疗方法。目前在众多可能的SLE的发病机制中，B细胞过度激活的学说已得到广泛认可，但其是否是SLE发病的关键之所在，仍是个未知的重要问题。现已知，对B细胞激活起重要调控作用的B细胞活化因子可能与SLE等自身免疫病的发病非常相关。

B细胞活化因子(B-cell activating factor，BAFF)，又被称为B细胞刺激因子(B-Lymphocyte stimulator，BLyS)、TNF相关的淋巴细胞表达配体1(TNF and ApoL-related leukocyte-expressed ligand 1，TALL-1)、诱导细胞凋亡和活化NF-κB的TNF类似物(TNFhomologue that activates apoptosis，NF-κB，and JNK，THANK)等，是1999年发现的一种多功能的共刺激分子。

BAFF属于肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)家族，由人染色体13q34的基因所编码，其长度为285个氨基酸(aa)，是一种II型膜贯通蛋白。其中在47aa到73aa之间有一编码穿膜蛋白的区域，长度为31个氨基酸。细胞质区由46个氨基酸组成，细胞外区由218个氨基酸组成，有2个N-糖甙部位。该细胞外区(17kDa)能被蛋白水解酶切断，成为可溶型分子而游离。BAFF主要特异表达于单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞等骨髓系细胞，而且IL-10、IFN-γ、IL-4等细胞因子都能明显上调/下调骨髓系细胞对其表达。

纵观近几年来BAFF的研究进展和趋势，主要研究热点是各自从蛋白质和mRNA水平对BAFF与SLE免疫病理的关系进行探索，虽然这些研究为探讨BAFF在SLE中的作用提供了理论依据和实验基础，但还不能在分子水平揭示BAFF作用的实质。这是因为蛋白质的表达调控主要发生在上游的核酸水平和转录水平，mRNA表达的异常会导致其下游蛋白水平的表达异常，而转录水平的任何调控元件的变化，必将会直接导致mRNA表达的异常。所以，研究在不同条件下BAFF基因的异常激活，对阐述SLE的发病机制有特别重要的意义。但是，目前有关BAFF基因上游调控元件的准确定位及其与相应的DNA结合蛋白的相互作用的研究尚属空白，更未见任何有关病理条件下BAFF基因调控元件的功能变化的报道。鉴于此，我们认为有必要联合蛋白质和核酸(mRNA)水平研究BAFF在SLE中的异常表达，探讨BAFF所介导的B细胞激活对SLE的致病机理，并进一步在分子水平开展BAFF基因转录调控机制的研究，形成完整的从转录水平到核酸再到蛋白质水平的调控理论，为揭开BAFF的致病作用、拓展阻断BAFF活化的新技术/方法提供依据，为SLE乃至其他自身免疫病的药物治疗/筛选提供重要的调控靶序列。

发明内容

本发明的目的在于提供含有效B细胞活化因子基因启动子的重组质粒及其制备方法和用途。

本发明根据Genebank(AB730224)中的人BAFF基因上游5’侧翼区-1349～-329bp的片段，经程序DNAassist1.0模拟分析该序列可能存在的主要核因子位点后，挑选-1349～-743bp为研究对象进行克隆表达。以正常人全血基因组DNA为模板，经PCR扩增、定向克隆入含氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因的pCAT3-Enhancer载体，构建出重组质粒。转化入大肠杆菌JM109以扩增，酶切、测序鉴定后，抽提质粒DNA并定量，培养人骨髓白血病细胞株：HL-60，采用脂质体转染试剂，将该重组体质粒DNA转染入靶细胞中培养48小时，对细胞裂解物进行蛋白定量，用CAT报告基因ELISA检测试剂盒测定重组体的CAT活性。

本发明还将所构建的含BAFF基因启动子(-1349～-743bp)的重组质粒转染入HL-60细胞中，培养24小时后，加入不同浓度的细胞因子：IL-10、IL-4、IFN-γ及重组BAFF(rBAFF)分子进行干预，对细胞裂解物进行蛋白定量，用CAT报告基因ELISA检测试剂盒测定其CAT表达的活性，观察其转录活性的变化，探讨不同细胞因子对该BAFF基因启动子活性的影响。

结果表明，经酶切、测序鉴定，所构建的BAFF基因重组启动子片段与Genebank中的序列(-1349～-743bp)一致。IFN-γ、IL-10和rBAFF可以提高该BAFF基因启动子重组体的转录活性，而IL-4抑制其转录活性。说明细胞因子IL-10、IFN-γ、IL-4、rBAFF可以一定程度的在转录水平影响BAFF合成和分泌。

本发明所构建的含有效BAFF基因启动子(-1349～-743bp片段)的重组质粒准确、可靠，而且报告基因测活比较活性的方法简单、可以定量，是一个在转录水平筛选治疗SLE等BAFF相关性疾病药物的简便方法，为进一步研究人BAFF基因激活的调控机制奠定了基础，也为探索SLE等BAFF相关性疾病的防治提供了新思路。

附图说明

图1是本发明pCAT3-enhancer载体质粒结构图

图2是本发明重组质粒酶切后电泳结果

图3是本发明重组质粒的测序结果

图4是人BAFF基因的基因组结构

图5是计算机模拟分析可能的主要核因子结合位点(DNAassist1.0)

图6是不同细胞因子对本发明重组质粒启动子活性的影响

具体实施方式

现结合实施例及附图，对本发明作进一步的描述。

实施例1：含有效BAFF基因启动子重组质粒的制备

人BAFF基因启动子位于该基因上游5’侧翼区大约1020bp的区域(参见Kawasaki A，Tsuchiya N，Fukazawa T，et al.Analysis on theassociation of human BLYS(BAFF，TNFSF13B)polymorphisms withsystemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis[J].Genes Immun，2002，3(7)：424-429)，见图4。本研究目的是对人BAFF基因上游5’侧翼区的部分片段(-1349～-743bp序列)进行启动调控活性分析。将该序列与报告基因组成重组启动子质粒，通过基因转染、报告基因测定活性，观察该重组体的启动活性，为探索在转录水平激活/阻断BAFF基因的调控靶序列奠定了基础。

材料与方法

1 材料

1.1 主要试剂

全血基因组DNA提取试剂盒、ProofSart高保真PCR试剂盒、质粒抽提试剂盒为美国QIAGEN公司产品；限制性内切酶Mlu I、Xhol，T₄ DNA连接酶，DNA marker均购自大连TakaRa生物工程公司；小量胶回收试剂盒购自MBI公司；Fugene 6脂质体转染试剂、CAT ELISA检测试剂盒为美国Roche公司产品；小牛血清、GI1640培养基购自美国Gibco公司；50ml细胞培养瓶，六、十二孔细胞培养板为美国Corning公司产品；引物合成、DNA测序分析均由上海联合基因生物技术公司完成。

1.2 载体、菌株、细胞株

表达载体pCAT3-enhancer Vector、CAT表达阳性质粒、β-gal质粒、大肠杆菌JM109：均购自美国Promega公司；

人骨髓白血病细胞株HL-60：由长海医院血液科惠赠。

1.3 主要仪器

PE-9600 PCR扩增仪(美国PE Biosystems公司)，紫外分光光度计Du-600(美国Backman公司)，水平电泳仪(瑞典Bio-Rad公司)，KUBOTA 5420台式高速离心机(日本Kubota公司)，550型酶联免疫检测仪(Model 550 Microplate Reader，Bio-Rad公司生产)。

2 实验方法

2.1 重组体的构建

pCAT3-enhancer Vector载体质粒不含启动子，但含有SV增强子、氯霉素乙酰基转移酶(CAT)报告基因(见图1)。重组体内所插入的目的片段即为所要研究的BAFF的启动子片段。

2.1.1 引物设计

根据Genebank所报道的人BAFF的启动子序列(Accession：AB730224)，应用程序DNA assist1.0模拟分析该序列可能存在的主要核因子位点(见图5)、Primer Premier 5.0引物设计软件设计引物。在引物的两端分别加入限制性内切酶Mlu I、Xhol的酶切位点，拟插入的片段长度分别为606bp，依此构建含人BAFF基因启动子序列的-1349～-743bp片段与pCAT3-enhancer连接的重组体phBAFF3。扩增该重组启动子片段的引物如下：

正向引物为：5’-AGCCTACTCGAGAGCCTGGGTCTGGAGTTC-3’

反向引物为：5’-ATGTCTACGCGTGGTCGCAGGGTGTTGAGT-3’

正、反向引物的5’端分别含有6个保护碱基和限制性内切酶MluI或Xhol识别位点(下划线部分)。引物由联合基因公司合成。

2.1.2 基因组DNA的提取

取正常人全血200μl，按照QINGEN公司的“QIAamp DNA bloodmini kit”试剂盒说明书操作以提取基因组DNA，在紫外分光光度计上对提取的基因组DNA进行定量，分装-80℃保存备用。

2.1.3 目的片段的获得

以基因组DNA为模板，用QINGEN公司的“ProofStart高保真PCR试剂盒”扩增该重组体目的片段，通过预实验对反应条件进行调整，具体如下：

10×PCR buffer 5μl

2.5mM dNTP 6μl

10μM正向引物 5μl

10μM反向引物 5μl

ProofStart DNA聚合酶 1μl

人基因组DNA(100ng/μl) 3μl

共计 50μl

反应参数：

2.1.4 PCR产物的纯化

PCR产物的纯化按MBI公司“小量胶回收试剂盒”说明书操作，预先按标签提示在Washing Buffer液中加入19倍体积的无水乙醇。

1)DNA片段用1％琼脂糖凝胶电泳分离；

2)对应分子量Marker，将欲回收片段的凝胶条切下，放入1.5ml离心管中，加入3倍体积的Bind Solution；

3)55℃水浴5分钟，每2分钟混匀一次；

4)按2μl悬液/μg DNA，加入Silica Powder Suspension悬液，55℃水浴5分钟，每2分钟涡悬一次；

5)高速离心1分钟后，形成片状沉淀，去除上清；

6)加入500μl冰预冷的Washing Buffer，混匀后离心30秒，去除上清，重复三次；

7)加入50μl TE液，温和重悬沉淀后，55℃水浴5分钟；

8)离心30秒，收集上清，-20℃保存备用；

9)取10μl DNA进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定；取7μl DNA用纯水稀释10倍，用于紫外分光光度仪定量检测。

2.1.5 酶切、连接目的片段和载体质粒

用限制性内切酶Mlu I、Xhol双酶切该段目的片段和载体pCAT3-enhancer Vector，酶切反应体系和参数如下：

DNA片段 30μl

Mlu I(10U) 2μl

Xhol(10U) 2μl

10×Buffer 4μl

去离子H₂O 2μl

共计 40μl

载体质粒 1μl

Mlu I(10U) 2μl

Xhol(10U) 2μl

10×Buffer 4μl

去离子H₂O 31μl

共计 40μl

37℃作用2小时，琼脂糖电泳鉴定酶切效率后，切胶回收酶切后的质粒和目的片段，定量。酶切后的目的片段和线性pCAT3-enhancerVector具有相同的粘末端，经T4连接酶连接。连接反应体系：

T₄ DNA连接酶 1μl

质粒 300ng

目的片段 150ng

10×连接反应缓冲液 2.5μl

补足反应体积(25μl)，16℃连接过夜。

2.1.6 感受态细菌的制备和转化

1)将大肠杆菌JM109接种于LB培养基，振荡培养过夜；

2)按1∶10比例接种过夜的细菌培养物于2ml LB培养基中，振荡培养3小时；

8000g离心后弃上清，加入400μl 0.1mol/L CaCl₂(初始培养物量的1/5)，混匀置冰上冰浴10min；

3)4000g离心10min，小心弃去上清回收细菌。加入初始培养物体积的1/25的0.1mol/L CaCl₂，分装50μl/管；

4)加入上述连接产物5μl，混匀，冰浴30分钟；

5)42℃冲击90秒，冰浴5分钟，加入800μl LB培养基，37℃培养40分钟，振荡培养3小时；

6)离心，弃部分上清，剩余部分混匀，接种于含抗生素的LB平板培养基上，37℃培养12～16h；

7)同时作载体质粒、无质粒连接产物、酶切质粒的对照。

2.2 重组质粒、CAT阳性表达质粒和载体质粒的大量扩增、提取

2.2.1 重组质粒、CAT阳性表达质粒和载体质粒的大量扩增

经氨苄青霉素抗性筛选，小量酶切初步鉴定、测序正确后；将转化有重组质粒、CAT阳性表达质粒、载体质粒的大肠杆菌JM109在含有氨苄青霉素的100ml LB培养基中大量扩增阳性克隆。

2.2.2 重组质粒、CAT阳性表达质粒和载体质粒的大量提取

由于质粒用于下述的细胞转染，因此，提取的过程需要严格无菌操作。用QIAGEN公司的“QIAfilter Plasmid Midi Kits”试剂盒大量提取各重组质粒，操作均按说明进行。预先将RNase A加入P1液中至终浓度为100μg/ml，将P3液在4℃预冷。

1)以50ml无菌离心管收集LB菌液，4500rpm、4℃离心25min，倒尽管内沉淀并扣干；

2)各管中分别加入P1液4ml，反复吹打混匀；

3)各管中分别加入P2液4ml，温和颠倒混匀4～6次，室温静置5min；

4)将QIAGEN收集管的管口用盖子塞住，并将其放入一合适的离心管中，在含细菌裂解液的各管中分别加入P3液4ml，温和颠倒混匀4～6次；

5)立即将上述裂解液倒入准备好的QIAGEN收集管中，室温静置10min；

6)各用QBT液4ml平衡QIAGEN-tip100柱；

7)待此柱完全沥干时，取下收集管的盖子，将收集管连接到QIAGEN-tip100柱上；

8)以活塞加压轻推收集管，使裂解液的上清部分完全流入tip100柱中；

9)待裂解液完全从tip100柱中滤出，各用10ml的QC液分别洗脱tip柱两次；

10)换用15ml无菌离心管作收集管，以5ml的QF液洗脱tip柱；

11)在上述各15ml无菌离心管中各加0.7倍体积的异丙醇沉淀DNA，混匀后4100rpm、4℃离心1小时，吸除上清；

12)再分别用2ml的70％乙醇浓缩DNA，4100rpm、4℃离心1小时，仔细吸除上清，防止破坏DNA沉淀；

13)在空气中干燥10分钟后，各用2ml的灭菌的TE液(pH8.0)溶解DNA；

14)紫外分光光度计进行DNA定量。

2.3 HL-60细胞的培养

人骨髓白血病细胞株HL-60用含10％小牛血清的1640培养基，在37℃，5％CO₂条件下进行培养、传代，选择第3～8代培养细胞进行实验。

2.4 重组DNA转染

DNA转染采用脂质体转染法，操作按FuGENE6脂质体试剂使用说明进行。转染前一天，HL-60细胞以3×10⁵细胞/孔接种于6孔培养板。细胞生长至60％～80％融合时，换新鲜培养基。将1μg上述BAFF基因启动子的重组质粒、1μg作内对照的β-gal阳性表达质粒pSVβ-gal及FuGENE6转染试剂以复合物形式转染至HL-60细胞。同时设置转染1μg的CAT阳性表达质粒作为阳性对照；1μg的pCAT3-enhancer载体质粒作为阴性对照。转染后48小时，转染的细胞裂解、待测CAT报告基因活性。

2.5 蛋白定量

HL-60细胞转染重组体后48h，终止培养的细胞，用预冷的PBS缓冲液(pH7.4)洗涤3遍，以裂解缓冲液(Roche)裂解细胞，细胞裂解液以紫外分光光度计进行蛋白定量。

2.6 β-gal活性测定

100μl细胞裂解液中加入100μl“β-gal assay 2×buffer”(Promega)混匀，置37℃12小时，再加入1M碳酸钠混匀，酶标仪420nm测定光密度。

2.7 CAT活性测定

以ELISA试剂盒(Roche)检测CAT报告基因的活性，操作按使用说明进行。将200μl细胞裂解液加入已包被抗体的96孔板，反应结束后加入底物显色，酶标仪405nm和492nm测定光密度值。

2.8 数据处理

所有CAT测定结果均用相应的转染质粒的摩尔数、蛋白浓度和β-gal活性进行校正，实验重复4次，采用4次实验的均值计算各重组体的相对活性。实验数据的统计处理均采用SAS 6.12软件，计量资料用t检验和方差分析，P＜0.05认为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 含有效BAFF基因启动子重组质粒的鉴定

以人BAFF基因上游5’侧翼区-1349～-329bp片段为靶序列，模板采用正常健康人全血基因组DNA，PCR扩增获得长度为606bp的片段作为启动子，与不含启动子的载体pCAT3-enhancer组成重组体phBAFF3，该重组体经限制性内切酶Mlu I和Xhol双酶切鉴定正确(见图2)。即载体为4.3kb的pCAT3-enhancer，插入启动子的长度为606bp，相应于人BAFF基因上游启动子序列的-1349～-743bp片段。经测序，插入片段与GenBank报道的序列(AB730224)完全一致(见图3)。

图2中相对分子量指示Marker均为wide range DNA marker(TakaRa)，目的条带为phBAFF3(606bp)阳性克隆经Mlu I、Xhol双酶切后的条带。

图3中为重组体phBAFF3的正向测序结果。

3.2 转染重组体的细胞CAT表达水平测定

人骨髓白血病细胞HL-60在转染上述含有效BAFF基因启动子的重组体后48小时，ELISA方法测定细胞CAT表达量。同时测定细胞裂解液的蛋白浓度及β-gal活性，β-gal活性作为内对照以保持转染效率相同条件下观察CAT表达量。CAT测定结果用相应的转染质粒的摩尔数、蛋白浓度和β-gal活性校正后，计算该重组体的相对活性为：(0.17±0.03)。

实施例2：部分细胞因子对BAFF转录调控作用的影响

大量研究表明，BAFF的异常表达与SLE等多种自身免疫病的免疫病理密切相关。国外文献报道，BAFF分子在单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞等骨髓系细胞的表达受IL-10、IFN-γ、IL-4等多种细胞因子的影响，这些细胞因子能明显上调/下调BAFF蛋白的合成和分泌。但这些细胞因子如何调节BAFF分子在骨髓系细胞的表达，是否通过转录水平来影响BAFF的合成和分泌，至今尚无明确解释。本研究以“实施例1”中所构建的、含较强转录活性的-1349～-743bp序列的重组体phBAFF3为实验平台，将其瞬时转染人骨髓白血病细胞HL-60，加入细胞因子IL-10、IFN-γ、IL-4、重组人BAFF标准品(rBAFF)进行干预，探讨这些细胞因子对BAFF基因启动子活性的影响。

材料与方法

1 材料

1.1 质粒、细胞株

“实施例1”中构建的重组质粒phBAFF3；

CAT表达阳性质粒、β-gal质粒：美国Promega公司；

人骨髓白血病细胞HL-60：由长海医院血液科惠赠

1.2 主要试剂

小牛血清、GI1640培养基(美国Gibco公司)；50ml细胞培养瓶，六、十二孔细胞培养板(美国Corning公司)；Fugene转染试剂，CAT ELISA检测试剂盒(Roche公司)；重组人IFN-γ(rh IFN-γ)，重组人IL-10(rh IL-10)，重组人IL-4(rh IL-4)均购自美国R&D公司；重组人BAFF标准品(rBAFF)为美国PeproTech公司产品。

1.3 主要仪器

紫外分光光度计Du-600(美国Backman公司)，水平电泳仪(瑞典Bio-Rad公司)，KUBOTA 5420台式高速离心机(日本Kubota公司)，550型酶联免疫检测仪(Model 550Microplate Reader，Bio-Rad公司生产)。

2 实验方法

2.1 HL-60细胞的培养

2.2 重组DNA转染及细胞因子干预

2.2.1 重组DNA转染

DNA转染采用FuGENE6(Roche)脂质体转染试剂法，操作按试剂使用说明进行。转染前一天，HL-60细胞以3×10⁵细胞/孔接种于6孔培养板。细胞生长至60％～80％融合时，换新鲜培养基。将1μgphBAFF3重组质粒、1μg作内对照的β-gal阳性表达质粒pSV β-gal及FuGENE6转染试剂以复合物形式转染至HL-60细胞。同时设置转染1μg的CAT阳性表达质粒作为阳性对照；1μg的pCAT3-enhancer载体质粒作为阴性对照。转染后24小时，换含2％小牛血清的新鲜1640培养基以静息。

2.2.2 细胞因子干预

HL-60细胞转染重组体后24小时，换含2％小牛血清的新鲜1640培养基，根据预实验和文献设计、选择细胞因子干预剂量为：IFN-γ(5ng/ml)、IL-10(100ng/mL)、IL-4(100ng/mL)、rhBAFF(200ng/mL)，加入上述细胞因子进行干预，培养48小时后，测定CAT报告基因活性。每种细胞因子重复2孔，实验重复进行5次。

2.3 蛋白定量

终止培养的细胞用预冷的PBS缓冲液(pH7.4)洗涤3遍，以裂解缓冲液(Roche)裂解细胞，细胞裂解液以紫外分光光度计进行蛋白定量。

2.4 β-gal活性测定

2.5 CAT活性测定

2.6 数据处理

所有CAT测定结果均用相应的转染质粒的摩尔数、蛋白浓度和β-gal活性进行校正，实验重复5次，采用5次实验的均值计算各重组体的相对活性。实验数据的统计处理均采用SAS 6.12软件，计量资料用t检验和方差分析，P＜0.05认为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 重组体的鉴定

重组体phBAFF3转化大肠杆菌JM109，增菌后大量提取质粒，取少量重组体经限制性内切酶Mlu I和Xhol酶切鉴定鉴定正确(图2)。即载体均为4.3kb的pCAT3-enhancer，插入启动子的长度为：606bp，相应于人BAFF基因上游启动子序列的-1349～-743bp片段。

图2中相对分子量指示Marker为wide range DNA marker(TakaRa)，邻近Marker的750bp处的特异扩增条带为目的DNA条带(606bp)，邻近Marker的5000bp处的扩增条带为pCAT3-enhancer载体的DNA条带。

3.2 细胞因子对BAFF基因启动子活性的影响

HL-60细胞在转染重组启动子phBAFF3培养24h后，换2％小牛血清的新鲜1640培养基静息24h，分别加入细胞因子IFN-γ(5ng/ml)、IL-10(100ng/mL)、IL-4(100ng/mL)、rhBAFF(200ng/mL)干预，48h后收集细胞，ELISA方法测定细胞CAT表达量。同时测定细胞裂解液的蛋白浓度及β-gal活性，β-gal活性作为内对照以保持转染效率相同条件下比较CAT表达量。以未加细胞因子干预的转染phBAFF3的细胞CAT表达量为1，其余各组的CAT相对表达量的结果见表1。

表1.不同细胞因子对BAFF基因启动子活性的影响(n＝5，X±s)

结果表明，细胞以phBAFF3重组体转染后经IFN-γ、IL-10、rBAFF处理，CAT表达量均明显上升(P≤0.05)，而细胞以phBAFF3重组体转染后经IL-4处理，CAT表达量则显著下降(P＜0.05)。其中，IFN-γ(5ng/ml)能使重组体phBAFF3的CAT活性升高3.5倍，IL-10(100ng/ml)可以使重组体的CAT活性升高2.3倍，rBAFF(200ng/ml)能使重组体的CAT活性升高1.4倍，IL-4(100ng/ml)使重组体的CAT活性降低为对照组的72％(图6)。图中Control组为未加细胞因子干预的重组体phBAFF3。

Claims

1、一种含有效B细胞活化因子BAFF基因启动子的重组质粒，其特征在于它由人BAFF基因上游启动子序列的-1349～-743bp片段和不含启动子，但含有SV增强子和氯霉素乙酰基转移酶CAT报告基因的pCAT3-enhancer Vector载体质粒组成。

2、权利要求1所述一种含有效B细胞活化因子BAFF基因启动子的重组质粒的制备方法，包括如下步骤：

I.pCAT3-enhancer Vector载体质粒不含启动子，但含有SV增强子和氯霉素乙酰基转移酶CAT报告基因；

II.人BAFF基因上游启动子序列的-1349～-743bp片段的引物设计：

正向引物：5’-AGCCTACTCGAGAGCCTGGGTCTGGAGTTC-3’

反向引物：5’-ATGTCTACGCGTGGTCGCAGGGTGTTGAGT-3’

引物的5’端分别含有6个保护碱基和限制性内切酶Mlu I或Xhol识别位点；

III.以正常人全血基因组DNA为模板，对人BAFF基因上游启动子序列的-1349～-743bp片段的进行PCR扩增、酶切及纯化，将上述目的片段插入pCAT3-enhancer Vector载体质粒，构建重组启动子质粒；

IV.通过细胞基因转染，CAT报告基因ELISA检测试剂测定重组体的CAT活性，观察重组质粒的启动活性。

3、权利要求1所述的一种含有效B细胞活化因子BAFF基因启动子的重组质粒，其特征在于细胞因子IFN-γ、IL-10和rBAFF提高它的启动活性，细胞因子IL-4抑制它的启动活性。