CN100451649C - 一种细胞芯片制作方法及其器具 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种细胞芯片。细胞芯片的制作方法为细胞固定、脱水、透明后，将经透明处理后的细胞置于一定规格的条形模具中浸蜡制成条状石蜡细胞芯条，然后直接将一定长度的条状石蜡细胞芯条按序放置于受体石蜡块中，利用胶带转移辅助系统进行切片，制成不同密度的细胞芯片。细胞芯片为基因功能研究提供一种高通量工具，除有组织芯片的用途外，还有组织芯片不可替代的用途。如作蛋白质芯片的替代方法用于证实药物作用的靶；作为一种克隆表达系统用于发现改变细胞生理功能的基因产物；用于转染细胞的基因构型改变的研究；用于高通量地研究药物不同剂量和不同药物作用下细胞中相关基因或蛋白表达的差异，试验药物的敏感性，利于发现新药物。用于转染目的基因克隆的筛选；为长期保存各种细胞提供一种经济简单的方法。

Description

一种细胞芯片制作方法及其器具

技术领域：

本发明涉及细胞的检测方法，具体涉及一种细胞芯片。

背景技术：

目前培养细胞制备细胞芯片的方法有3种：细胞离心沉淀纸包固定的石蜡包埋法、琼脂糖为基质固定的石蜡包埋法以及琼脂糖平板上凿孔，孔内灌注细胞固定的石蜡包埋法。这三种方法各有其缺点，前两种方法导致过于细胞弥散，尽管后一种方法能得到密度较高均匀一致的细胞，但工艺流程多，操作复杂。此外，制作细胞芯片时，上述三种处理方法的最大缺陷在于制作细胞芯片时均需按制作组织芯片的方法对受体石蜡块进行穿刺制作受体细胞芯条，由于培养细胞无间质纤维，穿刺细胞时常导致细胞分散，不利于重复穿刺制作细胞芯片。随着人类基因组计划的完成，后基因组时代的功能基因组学研究方法正朝着大规模、高能量的方向发展。基因芯片、组织芯片、蛋白质芯片等芯片的研制开发为功能基因组学的研究提供了一系列高通量的研究工具，极大地加快了功能基因组的研究步伐。但是目前市场上的各种芯片不能满足于大规模原位检测各种蛋白和基因在永生化的良恶性研究培养细胞株中表达。因此研究开发出一种更为简单实用、一步到位的制作细胞芯片方法，使细胞芯片用于基因原位表达的研究则是需要解决的问题。

发明内容：

本发明旨在提供一种工艺简单，不需要穿刺制作的新方法，制作的细胞芯片可用于基因原位表达的研究。

本发明是通过以下技术方案实现发明目的的。经细胞培养、收集固定细胞、细胞脱水、细胞透明后，浸蜡是将细胞悬液从Tube管移入透明条形模具中，将在条形模具中均匀沉积的细胞与模具直立浸入溶点为58℃的低溶点石蜡溶液中浸蜡三次，受体石蜡块和受体孔的制作是制作间距为2mm的点阵列模具纸贴于按细胞芯片的密度制作的相应规格大小的受体石蜡块上，依次用真空穿刺针在网格纸中穿出受体孔，受体细胞芯片石蜡块的制作是将经置于37℃温箱内软化的细胞石蜡混合物截去条形模具的下端，从切端挤出条形细胞石蜡混合物，并截断成段，放入相应石蜡块受体孔中。浸蜡用一种透明条形模具，该模具底部直径为1.0mm，底部塞有少量阻挡细胞并有利于松节油经模具底部流出的棉花。

下面结合附图进一步详述本发明。

附图说明：

图1为条形模具示意图；其中：1、底部直径1mm模具；2、底部填塞的棉花

图2为条形细胞石蜡混合物；

图3为置于Tube管中的石蜡细胞芯条；

图4为受体细胞点阵图；

图5为受体细胞点阵图；

图6为免疫组化，4×细胞微阵列图；

图7为HE，4×细胞微阵列图；

图8为HE，20×细胞微阵列图；

图9为免疫组化，20×细胞微阵列图；

图10为免疫组化，20×细胞微阵列图。

制作细胞芯片的具体方法如下：(1)培养细胞：培养各种组织和器官来源的永生化恶性肿瘤细胞和良性永生化细胞株于100ml培养瓶，每种细胞培养3瓶。(2)收集固定细胞：待细胞长至90％密度时，收集细胞进行如下处理：D-Hanker’s液洗涤细胞4次，充分洗净残余培养基，培养瓶中加入1ml D-Hanker’s液，塑料细胞刮子轻轻刮下细胞，细胞移入1.0ml～1.5ml Tube管中，离心2500转/分，共5min，倒掉Tube管中液体，滤纸吸净残余液体，加入1.0ml～1.5ml 4％多聚甲醛于Tube管中并轻轻吹打重悬细胞(随后每一步骤的无特殊说明时，均在1.0ml～1.5ml Tube管中进行，试剂为1.0ml～1.5ml)，使其分散为单个细胞悬液，4℃放置固定过夜。(3)细胞脱水：依次按以下6个步骤梯级脱水，每次脱水后，离心5000转/分，5min/次，弃去前一步的脱水剂，70％(酒精中含有0.5％伊红指示剂)酒精脱水40min，80％酒精脱水40min，90％酒精脱水45min，95％酒精脱45min，100％酒精脱水60min共2次。(4)细胞透明：脱水后离心5000转/分，5min/次，滤纸吸尽残余酒精，松节油(二甲苯具有毒性，用松节油代替二甲苯，)使细胞透明二次，每次60min。(5)浸蜡：离心5000转/分，5min/次，吸去上层0.8ml松节油，反复吹打细胞形成松节油细胞悬液，然后把细胞悬液从Tube管移入底部直径为1.0mm的透明条形塑料模具(1)中，模具底部塞有少量棉花(2)阻挡细胞并有利于松节油经模具底部流出，在重力作用下，细胞均匀沉积在条形模具中。依次将装有细胞的条形模具直立浸入3个装有低溶点石蜡溶液烧杯中(溶点为58℃)，每一烧杯中放置有模具架的，浸蜡时间分别为30min，45min，60min，共三次.浸蜡后的条形模具中细胞石蜡混合物编号保存于常温或4℃冰箱中备用。(6)细胞芯片受体石蜡块和受体孔的制作：按所需制作细胞芯片的密度，制作相应规格大小的受体石蜡块。间距为2mm的点阵列模具纸贴于石蜡块上，依次用直径1.0mm真空穿刺针在网格纸中穿出直径为1.0mm，深度为4～10mm的受体孔。(7)受体细胞芯片石蜡块的制作：装有细胞石蜡混合物的条形模具放置于37℃温箱内，30min，目的使细胞石蜡混合物软化。截去条形模具的下端，止血钳夹住条形模具的上端逐步往下移动，从切端挤出直径为1.0mm左右的条形细胞石蜡混合物(图2)。将条形细胞石蜡混合物截断成4-10mm/段，放入相应石蜡块受体孔中。待全部受体孔中填满细胞石蜡条形混合物后，受体石蜡块37℃烤箱中30min，玻璃切片平压受体蜡块表面，使所有细胞芯条在同一平面。(8)细胞芯片切片的制作：在轮转式切片机上先进行粗切修片，HE染色镜下观察证实全部切出所有受体细胞点阵(图4、5)后，利用石蜡胶带转移系统切片，5μm厚切片粘贴于载玻片上，紫外灯下交联1min，切片浸于胶带溶解液中30sec，剥离胶带，常规脱蜡水化，进行各种研究，如需长期保存则快速浸入溶化石蜡中，使切片表面重新履盖薄层石蜡，-20℃贮存。(9)细胞芯片的质量检测和实际应用的评估：随机抽取一张切片进行HE染色，图像分析系统在低倍镜下采集每个完整细胞点阵的图像，体视学分析模块下对每一个细胞株的点阵图像进行分析计数。原位杂交和免疫组化检测LRRC4mRNA和P53蛋白在细胞芯片中表达。

本发明方法制作的细胞芯片为基因功能研究提供了另一种新的高通量工具，具有多个方面的用途。细胞芯片与组织芯片一样，可用于基因原位表达的研究如原位杂交、原位PCR、免疫组化、免疫荧光等。此外，细胞芯片还具有组织芯片不可替代的如下用途。(1)可作为蛋白质微阵列的替代方法来证实药物的作用靶；(2)作为一种克隆表达系统用于发现改变细胞生理功能的基因产物。(3)用于转染细胞的基因构型改变的研究。(4)转染目的基因细胞克隆的筛选。(5)用于高通量地研究药物不同剂量和不同药物作用下细胞中相关基因或蛋白表达的差异，试验药物的敏感性，有利于发现新药物。(6)石蜡细胞混合物具有组织石蜡块一样能长期保存优点，为长期保存各种细胞提供一种经济简单的方法。

具体实施方式：

实施例：含20种细胞系的细胞芯片制备

1.1细胞处理

(1)细胞系的种类与细胞培养：引进并保存的细胞系包括以下15种。COS7：非洲绿猴肾细胞系；3T3：鼠成纤维细胞系；CNE-1和HNE1：中国人鼻咽癌细胞系；Hella：人宫颈癌细胞系；U251：人星形胶质瘤细胞系；C6：大鼠胶质瘤细胞系；HT29和SW480：人结肠癌细胞系；Soas-2和MG-63：人成骨肉瘤细胞系；K562：慢性骨髓性白血病细胞系；B16：鼠恶性黑色素瘤细胞系；293：人肾细胞系；BHK-21：鼠肾细胞系。建立并鉴定稳定转染目的基因细胞系有3种细胞系，共5个克隆。CNE-1-BRD7，CNE-1-LMP1：转染BRD7基因、LMP1基因的人鼻咽癌细胞系；HT29-NGX6-2和HT29-NGX6-10：转染NGX6基因的人结肠癌细胞系克隆2和克隆5；U251-LRRC4：转染LRRC4基因的人星形胶质瘤细胞系。按常规方法复苏上述细胞系并传代，每种细胞用100cm²培养瓶培养5瓶。

(2)收集、固定细胞：待细胞形态良好，细胞长至90％密度时，收集细胞进行如下处理：D-Hanker’s液洗涤细胞4次，充分洗净残余培养基，培养瓶中加入1ml D-Hanker’s液，塑料细胞刮子轻轻刮下细胞，并移入1.5ml Tube管中，离心2500转/分，共5min，倒掉Tube管中D-Hanker’s液，滤纸吸净残余液体，加1.5ml 4％多聚甲醛于Tube管中，1.0ml吸头轻轻吹打细胞使其成为均匀细胞悬液(随后每一步骤无特殊说明时，均在1.5mlTube管中进行，试剂为1.5ml)，4℃放置固定过夜。

(3)细胞脱水：依次按以下6个步骤梯级脱水，每次脱水后，离心5000转/分，5min/次，弃去前一步脱水剂，70％(此步骤酒精中含有0.5％伊红使细胞染成红色便于操作观察细胞)酒精40min，80％酒精40min，90％酒精45min，95％酒精45min，100％酒精60min共2次。

(4)细胞透明：脱水后离心5000转/分，5min/次，滤纸吸尽残余酒精，松节油使细胞透明二次，每次60min。

(5)浸蜡：离心5000转/分，5min/次，吸去上层1.0ml松节油，200μl吸头反复吹打细胞形成细胞松节油悬液后，细胞悬液从Tube管移入底部直径为1.0mm的透明条形塑料模具中，模具底部塞有少量棉花阻挡细胞并有利于松节油经模具底部流出，在重力作用下，细胞均匀沉积在条形模具中。依次将装有细胞的条形模具插入模具架上，模具架依次直立浸入3个装有低溶点石蜡溶液烧杯中(来卡公司，溶点为58℃)，分别浸蜡30min，45min，60min。浸蜡后细胞石蜡混合物的条形模具编号保存于4℃冰箱中备用.

1.2细胞微阵列受体石蜡块和切片的制作

(1)来卡公司的58℃石蜡与蜂蜡按9∶1混合制成2×2×2cm的受体石蜡块，制作间距为2mm的网格纸贴于石蜡块上，依次用直径1.0mm真空的穿刺针在网格纸中穿出直径为1.0mm，深度为10mm的受体孔。

(2)细胞石蜡混合物的条形模具置于37℃温箱加热30min，软化细胞石蜡混合物。手术刀截去条形模具的下端，止血钳夹住条形模具的上端逐步往下移动，从切端挤出直径为1.0mm条形细胞石蜡混合物。手术刀将条形细胞石蜡混合物截断为每段长10mm，放入相应石蜡块受体孔中，用载玻片轻压细胞芯条，使其进入受体蜡块受体孔中。每一细胞系制作5个受体细胞芯条，待全部受体孔中填满石蜡细胞混合物后，受体石蜡块水平放置于37℃温箱内中30min，然后用载玻片轻压受体蜡块表面，使所有细胞芯条在同一平面。如果石蜡细胞芯条暂不用于制作细胞微阵列，亦可放置于Tube管中，编号4℃长期保存。

(3)细胞微阵列切片的制作：受体石蜡块首先在轮转式切片机上进行粗切，HE染色镜下观察证实所有受体细胞点阵都完整切出后(图4、5)，利用石蜡胶带转移辅助系统进行受体石蜡块切片，每次切片时，带有标记的胶带贴于石蜡块表面，5μm厚细胞胶带切片粘贴于特殊粘附基质的载玻片上，紫外灯下交联90sec，玻片浸于胶带溶解液中30sec，溶解并轻轻剥离胶带，然后切片快速浸入溶化石蜡中，使切片表面重新履盖薄层石蜡，便于长期保存，处理完毕的切片可在-20℃长期贮存备用。如果切片立即使用，在胶带剥离后，即可常规脱蜡水化，进行各种研究。每20张切片后，需重新进行HE染色，镜下观察，如果发现有细胞点阵缺失时，需中止切片。

1.3细胞芯片的质量检测和实际应用

(1)质量检测：随机抽取一张切片进行HE染色，图像分析系统在低倍镜下采集每个完整细胞点阵的图像，体视学分析模块下对所有细胞系的点阵图像进行分析计数。

(2)细胞微阵列在免疫组化中的应用：DAKO公司EnVision两步法免疫组化检测试剂盒检测P53和P16在此细胞微阵列中的表达。按常规组织切片的免疫组化操作程序进行。切片脱蜡至水，3％的H₂O₂阻断内源性过氧化物酶30min，切片置于枸椽酸钠缓冲液(PH6.4)中，微波炉中进行抗原修复20min；分别滴加鼠抗人单克隆抗体P53，P21，PTEN和P16(Santa Cruz公司)于切片上，4℃温盒中过夜，PBS洗3×5min，二抗室温孵育45分钟，PBS洗3×5min，DAB显色，镜下控制显色反应；苏木素复染，胶带转移系统专用封片剂封片。

(3)细胞微阵列在原位杂交中的应用：检测BRD7(Genbank：AF179285)，NGX6(Genbank：AF188239)基因在细胞微阵列中的表达；BRD7和NGX6基因阅读框内设计引物，PCR分别扩增350bp，400bp目的片段，胶回收，生物素随机引物标识试剂盒(KPL公司)进行探针标识。原位杂交检测试剂盒(PE公司，有TSA信号放大系统)对杂交信号进行检测。切片脱蜡，入梯级酒精，DEPC水洗，3％双氧水灭活内源性的过氧化物酶。蛋白酶K进行细胞通透性处理暴露细胞中的mRNA，37℃15-20分钟。预杂交，每一切片预杂交液100μl/片，封口膜覆盖，42℃预杂交3小时。不洗，含探针的杂交液95℃变性10min，讯速冰上冷却，滴加杂交液100μl/片，封口膜覆盖，42-45杂交15小时。杂交后2xSSC，0.5xSSC，0.2xSSC洗涤15分钟/次。TNB缓冲液阻断非特异性染色。滴加SA-HRP(链霉卵白素-辣根过氧化物酶)，室温30分钟。TNT缓冲液洗，5分钟/次，加信号放大试剂(Biotinyl Tyamid)，室温10分钟。TNT缓冲液洗，5分钟/次，滴加SA-HRP(链霉卵白素-辣根过氧化物酶)，室温30分钟。TNT缓冲液洗5分钟/次，DAB显色，镜下控制显色反应；苏木素复染，胶带转移系统专用封片剂封片

2、结果

(1)成功地制作100个点阵的细胞微阵列，每种细胞包含5个点阵，所有细胞系点阵的HE染色，镜下观察细胞结构清晰，形态整齐；对所有细胞系点阵图像进行计数分析，细胞数为1150～1324个/细胞点。使用细胞微阵列进行原位杂交和免疫组化检测，结果表明细胞微阵列无完全掉片现象，且检测结果与细胞涂片一致(图6-10)。

Claims (2)

1、一种细胞芯片制作方法，包括细胞培养、收集固定细胞、细胞脱水、细胞透明，浸蜡、细胞芯片受体石蜡块和受体孔的制作、受体细胞芯片石蜡块的制作及细胞芯片切片的制作，其特征在于：

(1)浸蜡是将细胞悬液从Tube管移入透明条形模具(1)中，将在条形模具中均匀沉积的细胞与模具直立浸入溶点为58℃的低溶点石蜡溶液中浸蜡三次，

(2)受体石蜡块和受体孔的制作：制作间距为2mm的点阵列模具纸贴于按细胞芯片的密度制作的相应规格大小的受体石蜡块上，依次用真空穿刺针在网格纸中穿出受体孔，

(3)受体细胞芯片石蜡块的制作：经置于37℃温箱内软化的细胞石蜡混合物截去条形模具的下端，从切端挤出条形细胞石蜡混合物，并截断成段，放入相应石蜡块受体孔中，待全部受体孔中填满细胞石蜡条形混合物后，受体石蜡块置于37℃烤箱中30min，玻璃切片平压受体石蜡块表面，使所有细胞芯条在同一平面，然后制作细胞芯片切片。

2、一种如权利要求1所述的细胞芯片制作方法专用的器具，其特征在于：浸蜡用一种透明条形模具(1)，该模具底部直径为1.0mm，底部塞有阻挡细胞并有利于松节油经模具底部流出的少量棉花(2)。

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