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CN100445388C - 一个可降解线虫体壁的碱性丝氨酸蛋白酶及其应用 - Google Patents

一个可降解线虫体壁的碱性丝氨酸蛋白酶及其应用 Download PDF

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CN100445388C
CN100445388C CNB2005100106882A CN200510010688A CN100445388C CN 100445388 C CN100445388 C CN 100445388C CN B2005100106882 A CNB2005100106882 A CN B2005100106882A CN 200510010688 A CN200510010688 A CN 200510010688A CN 100445388 C CN100445388 C CN 100445388C
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张克勤
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Abstract

本发明涉及一个可降解线虫体壁的碱性丝氨酸蛋白酶及其应用，属于生物技术领域。该蛋白酶来源于食线虫芽孢杆菌(Bacillus nematocidus)B16，B16菌株已于2004年4月5日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：中国·北京·中关村；保藏登记入册的编号CGMCC No.1128。该蛋白酶分子量为28kDa，水解生色底物(azocoll)的最适反应温度为50℃，最适pH为10，在碱性pH范围内有最大酶活性，PMSF能够完全抑制纯化蛋白酶活力，底物特异性实验表明该蛋白酶的底物范围较宽。本发明蛋白酶通过降解线虫体壁而对线虫具有较好的毒杀作用，可应用于植物寄生线虫生物防治。

Description

一个可降解线虫体壁的碱性丝氨酸蛋白酶及其应用
技术领域：
本发明涉及一个可降解线虫体壁的碱性丝氨酸蛋白酶及其应用，属于生物技术领域。
背景技术：
植物寄生线虫对农作物、林木和食用菌等都可造成严重危害。由于传统的轮作与化学防治的局限性和弊端，使植物寄生线虫的生物防治成了植物线虫病害综合治理研究的前言和热点。蛋白酶能有效地降解线虫体壁，协助杀线虫生物完成侵染过程，是线虫侵染的重要毒力因子，但至今没有从杀线虫细菌中获得可降解线虫体壁的蛋白酶。所以在实验细菌中，新的可降解线虫体壁的碱性丝氨酸蛋白酶分离、纯化与鉴定可以为运用基因工程技术进行线虫生防的遗传改良奠定重要基础。
发明内容：
本发明人在开展杀线虫细菌研究中，获得一株具有杀线虫功能的食线虫芽孢杆菌Bacillus nematocidus B16，B16菌株已于2004年4月5日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：中国.北京.中关村；保藏登记入册的编号CGMCC No.1128。
本发明通过分离纯化，从B16菌株中得到一种新的可降解线虫体壁的碱性丝氨酸蛋白酶，并对该蛋白酶的性质进行分析鉴定。该蛋白酶分子量为28kDa，水解生色底物(azocoll)的最适反应温度为50℃，最适pH为10，在碱性pH范围内有最大酶活性，PMSF能够完全抑制纯化蛋白酶活力，底物特异性实验表明该蛋白酶的底物范围较宽。将分离纯化到的碱性丝氨酸蛋白酶作用活体线虫P.redivius，作用24小时后，可以观察到90％以上的线虫死亡；48小时后，大多数死亡线虫体壁降解；而用作阴性对照的缓冲溶液PBS以及经煮沸后的酶液处理线虫24小时后，线虫死亡率在10％以下。同时利用该蛋白酶处理纯化的线虫体壁，在解剖显微镜下可以观察到大量的不完整的线虫体壁碎片，表明该碱性丝氨酸蛋白酶对线虫体壁具有明显的降解作用。
本发明通过分析验证实验，证实该来源于杀线虫细菌的碱性丝氨酸蛋白酶能有效地降解线虫体壁。所以，该蛋白酶可以用来研究在侵染线虫过程中的生化本质，并作为提高生防菌株生物防治效果的毒力因子。
附表1食线虫芽孢杆菌的碱性丝氨酸蛋白酶对活体线虫P.redivivus的毒杀作用
Figure C20051001068800041
附图说明：
图1为本发明碱性丝氨酸蛋白酶的纯化以及SDS-PAGE电泳结果。
图中A.疏水层析结果。其中洗脱峰1具有蛋白酶和杀线虫活性；B.阳离子交换层析结果。图中所标注的洗脱峰同时兼备蛋白酶和杀线虫活性；C.蛋白酶的SDS-PAGE电泳结果。泳道1为标准分子量；泳道2、3为疏水层析后的穿透峰；泳道4为疏水层析后的洗脱峰2；泳道5、6为疏水层析后获得的兼备蛋白酶、杀线虫活性的洗脱峰1；泳道7为阳离子交换层析后的穿透峰；泳道8为阳离子交换层析后获得的洗脱峰，即目标碱性蛋白酶。本发明的目标蛋白酶分子量为28kDa。
图2为本发明碱性丝氨酸蛋白酶处理活体线虫P.redivius24、36、48小时后，线虫死亡以及体壁降解情况(D、E为为阴性对照)。
图3为本发明碱性丝氨酸蛋白酶在24小时内对纯化的线虫体壁的水解作用(B，C为阴性对照)。
具体实施方式：
1、将B16菌株采用LB培养基按常规液体发酵方法扩大培养后，收集发酵液，离心获得上清液，将上清液用(NH4)2SO4饱和盐析出粗蛋白酶液并透析后，作用于线虫，确认了该蛋白酶具有降解线虫体壁的毒杀功能。
2、将菌株的发酵上清液首先用40％-70％的(NH4)2SO4分级盐析，离心，将沉淀用pH7.5的磷酸缓冲液溶解，上疏水离子层析柱HiPrep 16/10分离纯化蛋白酶，收集洗脱峰，获得同时具有蛋白酶活性与杀线虫活性的组分。调节目的组分溶液pH到6.0并透析，再上阳离子交换柱Source 15Q PE4.6/100分离纯化，收集洗脱峰部分得到电泳纯蛋白酶(见图1)。
3、将纯化的蛋白酶加入到活体腐生线虫P.redivius，每12小时观察碱性蛋白酶对线虫生存率的影响(见图2)。
4、将纯蛋白酶液加入纯化的线虫体壁中，每12小时用光学显微镜观察线虫体壁变化，由此再次确定其蛋白酶降解线虫体壁的功能(见图3)。
5、纯化的碱性丝氨酸蛋白酶性质鉴定：
1)SDS-PAGE检验出其分子量约28kDa，水解生色底物(azocoll)的最适反应温度为50℃，最适pH为10，在碱性pH范围内有最大酶活性。
2)PMSF能够完全抑制纯化蛋白酶活力，表明该蛋白酶对作用于巯基的试剂敏感，其活性中心含有丝氨酸残基，属于丝氨酸蛋白酶类。
3)底物特异性实验表明该蛋白酶的底物范围较宽，专一性不高，不但能降解普通蛋白酶底物，如酪蛋白，明胶等，而且能有效地降解线虫体壁，破坏其完整性。
6、采用水浴式电印迹法转移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上进行氨基末端序列分析，HPLC洗脱曲线的PTH氨基酸峰鉴定为NH2-A-Q-S-V-P-Y-G-V-S-Q。
根据上述的研究结果，该发明为一个来源于细菌的可降解线虫体壁的碱性丝氨酸蛋白酶，该蛋白酶能使线虫在24小时内死亡率达90％，并使纯线虫体壁在24小时内被破坏，该蛋白酶是目前唯一明确报道的来自细菌、并具有可以降解线虫体壁的碱性丝氨酸蛋白酶。因此该蛋白酶能用来研究在侵染线虫过程中的生化本质，并具有植物寄生线虫生物防治应用潜能。

Claims (2)

1、一个可降解线虫体壁的碱性丝氨酸蛋白酶，其特征在于分子量为28kDa、其成熟肽的N末端前10个氨基酸序列为A-Q-S-V-P-Y-G-V-S-Q、水解生色底物的最适反应温度为50℃、最适pH为10、其蛋白酶活性能被PMSF完全抑制，该碱性丝氨酸蛋白酶来源于食线虫芽孢杆菌(Bacillus nematocidus)B16，B16菌株已于2004年4月5日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：中国.北京.中关村；保藏登记入册的编号CGMCC No.1128。
2、权利要求1所述的可降解线虫体壁的碱性丝氨酸蛋白酶在植物寄生线虫生物防治中的应用。
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