CN100431624C

CN100431624C - 可注射聚乳酸微载体/壳聚糖水凝胶复合支架的制备方法

Info

Publication number: CN100431624C
Application number: CNB2005100618683A
Authority: CN
Inventors: 高长有; 洪奕; 沈家骢
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2005-12-07
Filing date: 2005-12-07
Publication date: 2008-11-12
Anticipated expiration: 2025-12-07
Also published as: CN1799644A

Abstract

本发明公开了一种可注射聚乳酸微载体/壳聚糖水凝胶复合支架的制备方法。采用碳二亚胺缩合的方法依次将甲基丙烯酸和乳酸接枝在壳聚糖分子链中，获得可聚合的水溶性壳聚糖衍生物。将聚乳酸微载体与壳聚糖水凝胶预聚物混合，同时加入增稠剂魔芋葡甘聚糖提高预聚物溶液的粘度以确保聚乳酸微载体的悬浮，便于注射过程的操作。采用过硫酸铵和四甲基乙二胺氧化还原引发体系，使上述复合物在体温下原位凝胶化形成细胞微载体/壳聚糖水凝胶的复合支架。本发明工艺简单，制得的复合支架不仅解决了可注射性微载体在体内不易成型和游走的问题，而且能显著提高水凝胶的强度，具有协同作用。该复合支架无毒，具生物降解性和生物相容性，可望用于组织工程中的可注射性支架。

Description

可注射聚乳酸微载体/壳聚糖水凝胶复合支架的制备方法

技术领域

本发明涉及一种可注射聚乳酸微载体/壳聚糖水凝胶复合支架的制备方法，尤其是用于组织工程中的可注射性支架。

技术背景

可注射性支架是将细胞与一种具有流动性的、生物相容性好的材料复合，直接通过注射器注射到机体缺损部位。材料能在原位形成具有一定机械强度、一定形状并且可与体液进行交换的支架，细胞在支架中生长并最终形成组织。也可将材料直接注入体内，利用注射物周围组织的细胞扩展生长增殖形成组织。由于具有微创性、体内培养环境以及低费用等特点，可注射性支架具有重要的临床应用价值和良好的发展前景。可注射性支架主要分为可注射性水凝胶支架和可注射性细胞微载体。可注射性水凝胶支架主要通过溶胶-凝胶转变在体内成型，具有良好的细胞相容性和易成型等特点，但是强度低，降解快。而可注射性细胞微载体需采用液体作为输运载体注射到受损部位在体内堆砌成型，操作方便，但不容易成型，并存在体内游走的问题。目前，国内外基本上都注重于单组分性能的提高，未见将两者结合以获得最优化的性能。

发明内容

本发明的目的是为组织工程提供一种可注射聚乳酸微载体/壳聚糖水凝胶复合支架的制备方法。

本发明的可注射聚乳酸细胞微载体/壳聚糖水凝胶复合支架的制备方法，包括以下步骤：

1)在常温下，将壳聚糖(CS)溶解在含甲基丙烯酸(MA)的溶液中，然后加入水溶性碳二亚胺(EDAC)，于常温下进行反应，水溶性碳二亚胺与甲基丙烯酸的摩尔比为0.25～1.5，反应结束后，置于三蒸水中透析除去未反应物质及副产物，冻干得到接枝甲基丙烯酸的壳聚糖(CM)；

2)在常温下，将接枝甲基丙烯酸的壳聚糖溶解在含乳酸(LA)的溶液中，然后加入水溶性碳二亚胺，于常温下进行反应，水溶性碳二亚胺与乳酸的摩尔比为0.3～1.8，反应结束后，置于三蒸水中透析除去未反应物质及副产物，冻干得到接枝甲基丙烯酸和乳酸的壳聚糖衍生物(CML)；

3)在室温下，将接枝甲基丙烯酸和乳酸的壳聚糖衍生物溶解在水或磷酸盐缓冲液(PBS)中，配制成浓度为1～2.5％的壳聚糖衍生物溶液，然后加入魔芋葡甘聚糖(KGM)粉末，魔芋葡甘聚糖在壳聚糖衍生物溶液中的浓度为0.6～1％。搅拌均匀后，加入2.5～15mM引发体系过硫酸铵(APS)和四甲基乙二胺(TMEDA)，过硫酸铵和四甲基乙二胺的摩尔比为1∶1，混合均匀；

4)将聚乳酸微载体加入到步骤3)的混合液中，其中聚乳酸微载体在混合液中的重量体积比为2.5％～10％，混合均匀后，置于25℃～45℃下反应形成聚乳酸微载体/壳聚糖水凝胶复合支架。

上述的聚乳酸微载体是表面具有胶原的聚乳酸微球，可直接进行复合，也可在其表面预先负载所需的细胞(如软骨细胞、成骨细胞或肝细胞等)后进行复合。

本发明方法操作工艺简单、实施条件温和。利用高粘度的魔芋葡甘聚糖作为增稠剂提高接枝甲基丙烯酸和乳酸的壳聚糖溶液的粘度，确保聚乳酸微载体在溶液中的悬浮，以利于注射的顺利进行。以凝胶预聚物为运输载体将微载体注射到所需部位，并在原位凝胶化形成具有一定形状的微载体/水凝胶复合支架，水凝胶有利于微载体的成型，并且将其包裹，可以防止其在体内的游走；同时微载体可以有效提高水凝胶的强度，二者复合具有一定的协同效应。该复合支架无毒，具生物降解性和生物相容性。本发明方法提供了一种新结构的细胞支架及其制备方法，能够用于组织工程和整形修复中。

附图说明

图1是在不同EDAC与MA的摩尔比下MA接枝量的变化曲线；

图2是在不同EDAC与LA的摩尔比下LA接枝量的变化曲线；

图3是在37℃下，聚乳酸微载体在KGM/CML溶液中悬浮15分钟后的照片；其中CML浓度为1％，图中标记的是KGM浓度；

图4是37℃和5mM APS/TMEDA下，加入不同KGM含量的1％CML的凝胶时间；

图5是在37℃和5mM APS/TMEDA下制备的不同KGM含量的1％CML凝胶在水中24h的平衡溶胀比；

图6是在37℃和5mM APS/TMEDA下制备的不同KGM含量的1％CML凝胶的动态弹性模量，图中标注的为KGM含量；

图7是在37℃和5mM APS/TMEDA下制备的不同聚乳酸微载体含量的0.6％KGM/1％CML复合支架的动态弹性模量，图中标注为微载体的重量体积含量；

图8是在37℃和5mM APS/TMEDA下制备的不同聚乳酸微载体含量的0.6％KGM/1％CML复合支架干燥后的内部结构，图下标注为微载体的重量体积含量，(a)为2.5％，(b)为5％，(c)为10％；

图9是软骨细胞在5％微载体/0.6％KGM/1％CML复合支架中的细胞活性，细胞种植密度为600×10⁴/ml；

图10是采用激光共聚焦显微镜(CLSM)观察软骨细胞在5％微载体/0.6％KGM/1％CML复合支架中的生长行为，图中(a)为1天，(b)为6天，(c)为12天；

图11是采用扫描电子显微镜(SEM)观察软骨细胞在5％微载体/0.6％KGM/1％CML复合支架中的形态，图中(a)，(b)均为1天，(c)，(d)均为6天，(e)，(f)均为12天。

图12是采用SEM观察软骨细胞在5％微载体/0.6％KGM/1％CML复合支架中的形态，图中(a)为球形细胞，(b)为细胞团，(c)为铺展的细胞层。

具体实施方式

实例1

称取壳聚糖(CS)800mg置于250ml锥形瓶中，加入100ml三蒸水和420μlMA(0.48mmol)，待CS完全溶解后，加入930mg EDAC(0.48mmol)，然后在室温下，搅拌反应24h。为去除未反应的MA和其他小分子产物，将反应混合液置入截止分子量为10,000Da透析袋中，在大量三蒸水和室温下透析3d，每天换2～3次三蒸水。最后将此液体冻结，冻干，得到MA接枝的壳聚糖(CM)。CM收率均大于90％，MA接枝量约为23％，见图1；可在水中溶胀。将上述的400mgCM溶解在含210μl LA(0.2mmol)的50ml三蒸水中，完全溶解后加入460mgEDAC(0.24mmol)。此混合液在室温下搅拌24h后，将反应混合液置入截止分子量为10,000Da透析袋中，在大量三蒸水和室温下透析3d，每天换2～3次三蒸水。最后将此液体冻结，冻干，得到接枝MA和LA的壳聚糖(CML)。CML的收率均大于90％，LA接枝量约为52％，见图2。将100mg接枝率为23％的甲基丙烯酸和接枝率为52％的乳酸的壳聚糖衍生物(CML)溶解在水中，配制成10ml 1％CML溶液，然后加入60mg KGM粉末，混合均匀。加入50μl 1M过硫酸铵(APS)和50μl 1M和四甲基乙二胺(TMEDA)溶液，混合均匀。然后加入500mg聚乳酸微载体，在混合液中微载体的重量体积比为5％，混合均匀后，用1ml针筒(无针头)注射到模具中。置于37℃下，8min后得到微载体/水凝胶复合支架。该复合支架的动态弹性模量在频率为0.1～100rad/s时为0.12～1.15MPa，见图7，干燥后其内部结构见图8b。

实例2

称取壳聚糖800mg置于250ml锥形瓶中，加入100ml三蒸水和420μl MA(0.48mmol)，待CS完全溶解后，加入232.5mg EDAC(0.12mmol)，然后在室温下，搅拌反应24h。为去除未反应的MA和其他小分子产物，将反应混合液置入截止分子量为10,000Da透析袋中，在大量三蒸水和室温下透析3d，每天换2～3次三蒸水。最后将此液体冻结，冻干，得到MA接枝的壳聚糖(CM)。CM收率均大于90％，MA接枝量约为11.74％，见图1。

实例3

将实例1得到的MA接枝量约为23％的400mg CM溶解在含210μl LA(0.2mmol)的50ml三蒸水中，完全溶解后加入115mg EDAC(0.06mmol)。此反应混合液在室温下搅拌24h后，置入截止分子量为10,000Da透析袋中，在大量三蒸水和室温下透析3d，每天换2～3次三蒸水。最后将此液体冻结，冻干，得到产物为MA和LA接枝壳聚糖(CML)。CML的收率均大于90％，LA接枝量约为43.2％，见图2。

实例4

将实例1得到的100mg CML溶解在水中，配制成10ml 1％CML溶液，然后加入100mg KGM粉末，混合均匀，KGM含量为1％。然后加入250mg聚乳酸微载体，置于37℃水浴中，15分钟后可见聚乳酸微载体悬浮在1％KGM/1％CML溶液中，有利于注射的进行。见图3。

实例5

将实例1得到的100mg CML溶解在水中，配制成10ml 1％CML溶液，然后加入60mg KGM粉末，混合均匀。加入50μl 1M过硫酸铵(APS)和50μl 1M四甲基乙二胺(TMEDA)溶液，混合均匀后，直接置于37℃下。其凝胶时间为5.4min，见图4。平衡溶胀比为65，见图5。动态弹性模量在频率为0.1～100rad/s时为1.2KPa～24.4KPa，见图6。

实例6

将实例1得到的100mg CML溶解在水中，配制成10ml 1％CML溶液，然后加入60mg KGM粉末，混合均匀。加入50μl 1M过硫酸铵(APS)和50μl 1M四甲基乙二胺(TMEDA)溶液。加入250mg聚乳酸微载体，其微载体含量为2.5％，混合均匀后，用1ml针筒(无针头)注射到模具中，置于37℃下，8min后可得微载体/水凝胶复合支架。该复合支架的动态弹性模量在频率为0.1～100rad/s时为13KPa～258KPa，见图7，干燥后其内部结构见图8a。

实例7

将实例1得到的100mg CML溶解在水中，配制成10ml 1％CML溶液，然后加入60mg KGM粉末，混合均匀。加入50μl 1M过硫酸铵(APS)和50μl 1M四甲基乙二胺(TMEDA)溶液。加入1g聚乳酸微载体，其微载体重量体积含量为10％，混合均匀后，用1ml针筒(无针头)注射到模具中，置于37℃下，8min后可得微载体/水凝胶复合支架。该复合支架的动态弹性模量在频率为0.1～100rad/s时为0.87～2.15MPa，见图7，干燥后其内部结构见图8c。

实例8

将实例1得到的CML、KGM采用紫外光照射消毒；聚乳酸微载体采用75％酒精浸泡消毒；APS和TMEDA与磷酸盐缓冲液(PBS)配制成1M的溶液后，采用孔径为0.22μm醋酸纤维素膜过滤消毒。将软骨细胞预先种植在250mg聚乳酸微载体表面，7天后细胞长满后备用。将50mg CML先溶解在5ml PBS中，配制成1％CML/PBS溶液后，加入30mg KGM粉末，混合均匀。加入引发剂APS/TMEDA的PBS溶液，最终浓度为5mM。先将0.5ml高浓度的细胞悬液加入到凝胶预聚物中，混合均匀，细胞种植密度为600×10⁴/ml。然后加入负载细胞的微载体，含量为5％。用1ml针筒将此混合物注射到模具中，置于37℃下，8min后，形成复合支架。将该复合支架转移到24孔培养板中，加入含20％小牛血清的培养基进行培养，每2～3天换液。软骨细胞活性先增加后不变，见图9。细胞在凝胶化和混合过程中有部分死亡，细胞会向微载体表面迁移、粘附、铺展和增殖，并且有细胞团存在，见图10和图11。凝胶中的细胞为圆形，并存在细胞团，微载体表面的细胞为铺展的细胞层，见图12。

Claims

1.可注射聚乳酸微载体/壳聚糖水凝胶复合支架的制备方法，包括以下步骤：

1)在常温下，将壳聚糖溶解在含甲基丙烯酸的溶液中，然后加入水溶性碳二亚胺，于常温下进行反应，水溶性碳二亚胺与甲基丙烯酸的摩尔比为0.25～1.5，反应结束后，置于三蒸水中透析除去未反应物质及副产物，冻干得到接枝甲基丙烯酸的壳聚糖；

2)在常温下，将接枝甲基丙烯酸的壳聚糖溶解在含乳酸的溶液中，然后加入水溶性碳二亚胺，于常温下进行反应，水溶性碳二亚胺与乳酸的摩尔比为0.3～1.8，反应结束后，置于三蒸水中透析除去未反应物质及副产物，冻干得到接枝甲基丙烯酸和乳酸的壳聚糖衍生物；

3)在室温下，将接枝甲基丙烯酸和乳酸的壳聚糖衍生物溶解在水或磷酸盐缓冲液中，配制成浓度为1～2.5％的壳聚糖衍生物溶液，然后加入魔芋葡甘聚糖粉末，魔芋葡甘聚糖在壳聚糖衍生物溶液中的浓度为0.6～1％，搅拌均匀后，加入2.5～15mM引发体系过硫酸铵和四甲基乙二胺，过硫酸铵和四甲基乙二胺的摩尔比为1∶1，混合均匀；

4)将聚乳酸微载体加入到步骤3)的混合液中，其中聚乳酸微载体在混合液中的重量体积比为2.5％～10％，混合均匀后，于25℃～45℃下反应形成聚乳酸微载体/壳聚糖水凝胶复合支架。

2.根据权利要求1所述的可注射聚乳酸微载体/壳聚糖水凝胶复合支架的制备方法，其特征是聚乳酸微载体是表面具有胶原的聚乳酸微球。

3.根据权利要求2所述的可注射聚乳酸微载体/壳聚糖水凝胶复合支架的制备方法，其特征是在聚乳酸微载体表面负载细胞。