CN100431525C - 脂质体悬浮液制造方法及含该法所制脂质体悬浮液的产物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可以大规模地制造脂质体悬浮液的方法，其中将三种选定的脂质组份以预定的比例溶于醇溶剂内，以形成混合物，接着以预定的比例将该混合物直接混合以硫酸铵水溶液，对所形成的混合物进行孔挤压处理(pore-extrusion treatment)，继而以5%～15%的蔗糖水溶液来透析该经孔挤压处理的混合物，借此，得到含有脂质体粒子散浮在内的脂质体悬浮液。可将如此制得的脂质体悬浮液用来包封选定的药物，特别是盐酸阿霉素(doxorubicin HCl)。
Description
技术领域
本发明涉及用以制造脂质体悬浮液的方法，以及含有由该方法所制得的脂质体悬浮液的产物(特别是脂质体包封的药物)。
背景技术
自1960年代，英国的Alec D.Bangham博士揭示脂质体的概念与技术以来，脂质体已成为药物传递系统技术领域中的一个重要研究目标。脂质体主要由磷脂构成，主要是利用磷脂具有由非极性或疏水性的长形结构以及位于该长形结构的一端的极性或亲水性的端部结构所造成的两性特性，借此，可形成具有该亲水性结构被包覆在内的核心区域的胶粒。呈胶粒状的脂质体可具有小至20nm的粒径，而于药物制造上适用作为将具有生物活性的物质带入至人或动物体内的载体。
脂质体依粒径以及包覆层数可被区分为：粒径落在大约0.1至1μm的范围内的多层胞囊(multilamellar vesicle，MLV)；粒径落在大约0.1-1μm的范围内的寡层胞囊(oligolamellar vehicle，OLV)；粒径落在20至100nm的范围内的单层小胞囊(small unilamellar vesicle，SUV)；粒径约为1000nm的单层大胞囊(large unilamellar vesicle，LUV)；以及粒径落在大约1至2μm的范围内并且内部含有数个较小胞囊的大胞囊。有关脂质体的一般性回顾，可以参见，例如R.R.C.New，ed.Liposomes：a practical approach(1990)，Oxford。
关于脂质体的制备，目前已知的方法有，例如，水合法、超声法、透析与稀释法、逆相蒸发法(参见，例如，US 4,235,871)、表面活性剂处理法、干燥水合法(dehydration-rehydration)或干燥水合法(dry-reconstitution)、冻结及融解法(参见，例如US 6,355,267)、孔挤压法以及高压均质法等等(参见，例如，A.D.Bangham，M.M.Standish，J.C.Watkins，J.Mol.Biol.，13，238-252，1965；R.R.C.New，ed.Liposomes：a practical approach(1990)，Oxford；G.Gregoriadis，ed.Liposome Technology，Vol.1，1993，CRC.，H.Talsma and D.J.A.Crommelin，Pharmaceutical Technology，96-106，Oct.1992)。在这些已知方法当中，孔挤压法与高压均质法被认为较有产业上的潜力来供大规模制造脂质体。而若进一步考虑经济效益，孔挤压法被认为是更佳的选择。
US 4,737,323公开了利用挤压法来制造脂质体悬浮液的方法，该脂质体具有均匀的尺寸以及不大于0.4μm的平均粒径，该方法包括下列步骤：提供含有尺寸不一的脂质体的悬浮液，该等脂质体的主要部分具有大于1.0μm的尺寸；以及在加压下使该悬浮液通过一个不对称的陶瓷过滤器，该过滤器的内表面孔径大于所期望的平均脂质体尺寸且不大于大约1.0μm。依据此件美国专利的揭示，将有机溶剂，例如该专利实施例1所示的氯仿用来溶解脂质组份。接着，在真空或惰性气体下将该有机溶剂除去，而形成由脂质所构成的干薄膜。继而将水性基质加至该薄膜上以使脂质膨胀开来，因而于该水性基质内形成尺寸不一的脂质体。
授予Steven Lehigh的US 5,004,611与US 5,053,217揭示用以制备含有具生物活性的化合物的脂质体的水性分散体的方法，其基本上由下列步骤所构成：将呈重量比例为40∶1至1∶20的组份(a)至少一部分的双层形成膜脂质(bilayer forming membrane lipid)以及组份(b)至少一种基本上由作为该脂质的溶剂的与水可互溶的有机液体所构成的非水性液体混合以足量的水，借此，脂质体自发性地形成，该具生物活性的化合物是在水加入之前、当时或之后被加入，并且其最终存在的量足以使得该具生物活性的化合物的生物有效剂量被缔合以脂质体。依据这两件美国专利的实施例1的揭示，首先在50～60℃下制备出预-脂质体组合物(pro-liposome composition)，其中该脂质组份(a)(例如卵磷脂)先被溶于该组份(b)(例如乙醇)内；接着将水分成两个部分来予以加入，其中第一个部分的水中可含有该具生物活性的化合物(例如葡萄糖)，而第二部分的水被用来制造出最后的配方。该预-脂质体组合物经过在氮气下予以平衡后被冷却至25℃，接着分两个阶段来加入磷酸盐缓冲液并予以振荡，如此即形成散浮有内含该具生物活性的化合物的脂质体的水性分散体。因此，依据此二件美国专利的揭示，所用的乙醇会以特定量被包含在所形成的脂质体水性分散体内。
授予Francis C.Szoka，Jr.的US 5,077,057、US 5,277,914以及US5,549,910公开了用以制造脂质体悬浮液的方法，该脂质体具有所界定的粒径且包封有有用的化合物，该化合物于水、醇或卤化烃溶剂内展现出不良的溶解度。依据此三件美国专利的揭示，将溶解度不佳的化合物连同包封量的脂质溶于非质子性溶剂(诸如DMSO)内，而若有需要，可额外地使用低级烷醇(例如乙醇)来帮助脂质的溶解。接着将所形成的混合物挤压或注射至合适的水性溶液内并予以搅拌，即形成脂质体悬浮液。所用的挤压装置可为注射筒、有孔的盘或管或其它可提供大约0.05～5mm的孔洞的合适装置。特别地，此三件美国专利的实施例2例示阿霉素的包封，其中将阿霉素溶于DMSO内，并将其加入至含有卵磷脂酰甘油(EPG)∶卵磷脂酰胆碱(EPC)∶胆固醇(7∶3∶6)的乙醇溶液内。接着，将脂质-阿霉素混合物在30℃下注射至由140mM NaCl-10mM Tris-HCl，pH 4.0所构成的水相内，继而将所形成的脂质悬浮液透析，并利用管柱层析法将被脂质体包封的阿霉素分离出。此实施例所制得的脂质体粒径为227nm，且有41.2％的阿霉素被包封在脂质体内。
另外，对于含有亲脂性、溶解性差的活性化合物(特别是具有如EP-A-560 138中所揭示的化学式的二氢吡啶化合物)的冷冻-干燥的脂质体制剂，US 5,653,998(对应于TW 359616)公开了使用具有特定化学式的短链脂肪酸(含有不超过10个碳原子)或其盐类作为稳定剂，以供形成将该亲脂性、溶解性差的活性化合物包封在磷脂膜内的可供非经肠道给药稳定的脂质体药物制剂。
于授予Martin C.Woodle等人的US 5,013,556中所揭示的脂质体包含有1～20wt％的经聚烷基醚(polyalkylether)予以衍生化的亲水疏水两亲性脂质，此可以经聚乙二醇予以衍生化的磷脂酰乙醇胺为例。该经衍生化的脂质可以使脂质体的循环期间增进数倍。
于授予Francis J.Martin等人的US 5,213,804的实施例10中进一步公开了利用US 5,013,556中所公开的脂质体来制备阿霉素脂质体，其中将选用的脂质组份以选定的比例溶于氯仿内，并添加配于氯仿/乙醇溶液内的α-生育酚，然后除去氯仿溶剂而形成脂质薄膜。该脂质薄膜接着以含有1mM甲磺酸去铁胺的125mM硫酸铵水溶液予以水合，而该水合处理借由使用液态氮与温水浴的冻结及融解法进行。之后，进行挤压处理来调节脂质体的尺寸，继而于5％的蔗糖溶液内进行透析。接着将阿霉素溶液与经透析的脂质体制备物混合，并于60℃的水浴下予以振摇温育，而使得阿霉素被包封于脂质体内。
授予Yechezkel Barenolz等人的US 5,192,549公开了将亲水疏水两亲性药物装填至脂质体内的方法，其中包括在铵溶液内形成脂质体，随后将存在于脂质体的外部水相内的铵移除或稀释，因而于脂质体的内部与外部水相的间生成pH梯度，而使得该亲水疏水两亲性药物被摄入脂质体内，而且该亲水疏水两亲性药物存在于脂质体内部的最终量比存在于脂质体外部的量高。
以上所提到的所有文献、专利前案以及当中所引述的文献的全部公开内容在此引入本案以作为参考资料。
就申请人所知，在上述文献或专利前案中所公开的方法中，有的在操作上涉及到氯仿或其它有毒的有机溶剂的移除；有的在溶液注射法(solvent injection)上有诸多限制而不利于无菌制剂的操作，特别是所采用的溶液转速、注射速率、溶剂比例、注射针孔径等操作条件都会非常容易地影响到微脂体的均一性以及品质；有的在挤压过程中会使操作压力高达150～250psi，而更非为所期望的是挤压速率非常低(约为0.1～0.2L/min)，若要付诸实际量产，这会使得制作过程冗长而完全不符合无菌针剂的生产要求。有鉴于上述文献或专利前案中所公开的方法无一能应用于脂质体悬浮液的大规模生产上，本领域仍存在有需要来开发快速且经济的方法以供脂质体的大规模生产。
发明内容
因此，为了能够大规模生产脂质体悬浮液，且不涉及有毒的有机溶剂的移除，在第一个方面，本发明提供一种用以制造脂质体悬浮液的方法，其包括下列步骤：
(a)将下列组份加入至适量的醇溶剂中以形成混合物：
(i)选自下列的磷脂化合物：卵磷脂、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇、神经鞘磷脂(SM)、磷脂酸，前述化合物的二(C12-C18)酰基衍生物，以及它们的组合，
(ii)胆固醇，以及
(iii)选自下列的聚乙二醇衍生的化合物：聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)、甲氧基聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺(mPEG-PE)，前述化合物的二(C12-C18)酰基衍生物，以及它们的组合，
其中组份(i)、(ii)与(iii)的量呈5～10∶2～10∶1的摩尔比例，而且组份(i)、(ii)与(iii)的总量相对于该醇溶剂的量呈1∶5以上(w/v)的比例；
(b)使得自步骤(a)的混合物直接与硫酸铵水溶液混合，其中该得自步骤(a)的混合物与该硫酸铵((NH4)2SO4)水溶液的量呈1∶2～10(v/v)的比例；
(c)对步骤(b)所形成的混合物进行孔挤压处理；
(d)以5％～15％的蔗糖水溶液来透析从步骤(c)所得到的经孔挤压处理的混合物，借此，得到含有脂质体粒子散浮在内的脂质体悬浮液。
由本发明的方法所制得的脂质体悬浮液可用来包封亲水疏水两亲性药物，因此，在第二个方面，本发明提供一种用以制造脂质体包封的药物的方法，其包括下列步骤：将选定的药物与由上述方法所制得的脂质体悬浮液混合，借此，将该亲水疏水两亲性药物包封在该脂质体悬浮液中的脂质体粒子内。
本发明的其它目的、特征及优点，在参照以下详细说明与优选实施例后，将变得明显。
具体实施方式
申请人发现，目前被本领域技术人员用来生产脂质体悬浮液或脂质体包封的药物的方法，在制造过程上常常涉及到要将用来溶解脂质组份的有害有机溶剂(诸如氯仿或DMSO等等)移除的步骤，且这些方法几乎都无法做到脂质体的大规模生产。为克服这些问题，申请人研究出一种改良方法，其在操作上不需要用到诸如氯仿或DMSO的有害有机溶剂，且其可大规模地生产出所期望的脂质体悬浮液，进而供应用于选定药物的包封。
于是，本发明提供一种用以制备脂质体悬浮液的方法，其包括下列步骤：
(a)将下列组份加入适量的醇溶剂中以形成混合物：
(i)选自下列的磷脂化合物：卵磷脂、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰肌醇、神经鞘磷脂(SM)、磷脂酸，前述化合物的二(C12-C18)酰基衍生物，以及它们的组合，
(ii)胆固醇，以及
(iii)选自下列的聚乙二醇衍生的化合物：聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)、甲氧基聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺(mPEG-PE)，前述化合物的二(C12-C18)酰基衍生物，以及它们的组合，
其中组份(i)、(ii)与(iii)的量呈5～10∶2～10∶1的摩尔比例，而且组份(i)、(ii)与(iii)的总量相对于该醇溶剂的量呈1∶5以上(w/v)的比例；
(b)使得自步骤(a)的混合物直接与硫酸铵水溶液混合，其中该得自步骤(a)的混合物与该硫酸铵((NH4)2SO4)水溶液的量呈1∶2～10(v/v)的比例；
(c)对步骤(b)所形成的混合物进行孔挤压处理；
(d)以5％～15％的蔗糖水溶液来透析从步骤(c)所得到的经孔挤压处理的混合物，借此，得到含有脂质体粒子散浮在内的脂质体悬浮液。
在本发明的方法的步骤(a)中所用的醇溶剂是可与水互溶的无毒性醇溶剂，且优选地选自：脂族醇(诸如甘油、丙二醇)、乙醇、异丙醇、甲醇、乙二醇，以及它们的混合物。在本发明的一个优选具体例中，在本发明的方法的步骤(a)中所用的醇溶剂是乙醇。
优选地，用于本发明的方法的步骤(a)中的组份(i)选自：磷脂酰胆碱(PC)、二月桂酰PC、二肉豆蔻酰PC、二棕榈酰PC、二硬脂酰PC(DSPC)、二油酰PC、二亚麻酰PC(dilinoleoyl PC)、1-棕榈酰-2-油酰PC，以及它们的组合。在本发明的一个优选具体例中，用于本发明的方法的步骤(a)中的组份(i)是DSPC。
优选地，用于本发明的方法的步骤(a)中的组份(iii)选自：PEG-2000-PE、PEG-3000-PE、PEG-4000-PE、PEG-5000-PE、mPEG-2000PE、mPEG-3000PE、mPEG4000PE、mPEG-5000PE，前述化合物的二(C12-C18)酰基衍生物，以及它们的组合。
该等二(C12-C18)酰基衍生物的实例包括，但不限于，PEG-2000-DSPE、PEG-3000-DSPE、PEG-4000-DSPE、PEG-5000-DSPE、1，2-二酰基-SN-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]、1，2-二酰基-SN-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-3000]，其中该酰基是肉豆蔻酰、棕榈酰基、硬脂酰或油酰。在本发明的一个优选具体例中，用于本发明的方法的步骤(a)中的组份(iii)是PEG-2000-DSPE。
优选地，用于本发明的方法的步骤(a)中的组份(i)、(ii)与(iii)的总量相对于该醇溶剂的量呈1∶5以上(w/v)的比例，且更优选为1∶7～10(w/v)。
在本发明的一个更优选的具体例中，于本发明的方法的步骤(a)中，使用DSPC、胆固醇以及PEG-2000-DSPE来作为脂质体粒子的构成组份并将它们溶于乙醇溶剂内。
本发明的方法的步骤(a)在45～70℃的温度范围下进行，优选为55～65℃，更优选为60℃。
在本发明的一个优选具体例中，将DSPC、胆固醇以及PEG-2000-DSPE溶于乙醇中，并于60℃的水浴内均匀混合。
在本发明的方法的步骤(b)中，不像以往方法要使用注射器来将脂质/有机溶剂混合物以小量分次地注射至水性溶液内，以形成脂质体散浮液，可在搅拌下将硫酸铵水溶液直接加入至得自步骤(a)的混合物内，或是将得自步骤(a)的混合物直接加入至硫酸铵水溶液内。
优选地，本发明的方法的步骤(b)在45～70℃的温度范围下进行，优选为55～65℃，更优选为60℃。在此操作温度下，于混合物内初形成的脂质体粒子的双层脂质膜结构是松散的，且该等脂质体粒子会将少量的硫酸铵水溶液包封在内。
优选地，用于本发明的方法的步骤(b)中的硫酸铵水溶液的当量浓度为0.2～0.8N，更优选为0.4～0.6N。
优选地，在本发明的方法的步骤(b)中，该得自步骤(a)的混合物与硫酸铵水溶液的量呈1∶2～10(v/v)的比例，更优选为1∶4～8(v/v)。
优选地，在本发明的方法的步骤(c)中，该孔挤压处理通过使步骤(b)所形成的混合物通过一个孔径范围为0.05～0.45μm的挤压器而进行。
适用于本发明的挤压器可为任一种可提供大约0.05～0.45μm的挤压孔径的注射筒、装有过滤膜的过滤装置、有孔的盘或管或是其它合适的装置。该过滤膜可为陶瓷过滤膜或聚碳酸酯过滤膜。
优选地，在本发明的方法的步骤(c)中，先使于步骤(b)所形成的混合物通过挤压孔径较大的过滤器，继而通过挤压孔径较小的过滤器而进行两阶段的挤压。在本发明的一个优选具体例中，在所用的操作温度(例如，60℃)下，先使于步骤(b)所形成的混合物通过挤压孔径为0.1μm的过滤器，继而通过挤压孔径为0.05μm的过滤器而进行两阶段的挤压。
优选地，本发明的方法的步骤(d)是在环温下进行，这时脂质体粒子的双层脂质膜结构会变成紧密的，而使得被包封在脂质体粒子内的硫酸铵水溶液不会因为透析处理而从脂质体粒子的内部全部地流失至蔗糖溶液内。
由本发明的方法的步骤(d)所得到的脂质体悬浮液可被马上应用，也可被直接低温保存(例如，保存在5℃下)，或是经冷冻干燥处理后再予储存于低温(例如，5℃)下以供日后使用。
与以往方法相较，依据本发明的脂质体悬浮液制备方法可在相对低压(约40～140psi)下进行，而使操作速率得以大幅提升(约为2～10升/分钟)。因此，本发明能以快速且经济的方法来供脂质体的大规模生产。
依据本发明的方法而被制得的脂质体悬浮液可供应用于药物、化妆品等产业上，特别是被用来包封选定的药物，包括，但不限于，蒽环类抗生素、喜树碱类抗癌药。
因此，本发明也提供一种用以制造脂质体包封的药物的方法，其包括下列步骤：使选定的药物与由上述方法所制得的脂质体悬浮液混合，借此，将该药物包封在该脂质体悬浮液中的脂质体粒子内。
优选地，将依据本发明的方法制得的脂质体悬浮液用来包封阿霉素、柔红霉素、伊立替康以及长春瑞宾。
优选地，该药物以超过90μg药物/μmol脂质的量被包封在脂质体内，更优选为120～180μg药物/μmol脂质。
优选地，该药物与脂质体悬浮液的混合在45～70℃的温度范围下进行，优选为55～65℃，更优选为60℃。于该温度下，脂质体粒子的双层脂质膜结构会变成较松散的，而容许该药物进入至脂质体粒子的内部，进而有可能与被包封在内硫酸铵形成离子键。之后，将混合物降温至环温，这时脂质体粒子的双层脂质膜结构即再度成为紧密的，借此，被包封在内的药物即不会渗漏出去。
优选地，在进行药物包封时，可同时使用制药上可接受的添加剂，例如：低温防护剂，包括多元醇(诸如甘油)、单醣(诸如葡萄糖)、二醣(诸如蔗糖、乳糖、海藻糖)以及蛋白质或氨基酸(诸如组氨酸)；稳定剂，诸如抗氧化剂形式的稳定剂，例如丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、α-生育酚及其盐类、抗坏血酸及其盐类与酯类，优选为抗坏血酸及其盐类；pH-调节剂，诸如缓冲物、酸或碱，特别是抗坏血酸与氢氧化钠；渗透活性剂，诸如甘油、甘露糖醇与葡萄糖。
在本发明的一个优选具体例中，将依据本发明的方法制得的脂质体悬浮液用来包封阿霉素，同时使用组氨酸作为稳定剂。
本发明将就下面实施例来作进一步说明，但应了解的是，这些实施例只为例示说明使用，而不应被解释为本发明的实施的限制。
实施例
实验材料的制备：
A.硫酸铵水溶液：
将158g硫酸铵(Showa Co.，日本)加入至注射用水中并调节体积至6L，接着以Posydine(Whatman Inc.，德国)薄膜(142mm，0.22μm)予以过滤并保存在6℃下备用。在使用前，将该硫酸铵水溶液的温度调节至60℃。
B.9％(w/w)蔗糖溶液：
将4500g蔗糖加入至适量注射用水中溶解并稀释至50L，以Posydine薄膜(142mm，0.22μm)予以过滤后备用。
C.组氨酸-蔗糖溶液：
将12.6g的组氨酸一水合物(Ajinomoto Co.，日本)溶于90mL 9％的蔗糖溶液中，以1N NaOH将pH值调至6.2～6.6之间后，加入9％蔗糖溶液至300mL并混合均匀，继而以Posydine薄膜(47mm，0.22μm)予以过滤后备用。
实施例1.脂质体悬浮液的制备
于一玻璃容器内，将PEG-2000-DSPE(16g)(Genzyme Co.，美国)、胆固醇(15.2g)(NOF Co.，日本)以及DSPC(46.4g)(NOF Co.，日本)加入至600mL的乙醇内，并在加热至大约为60℃的温度下混合，以使它们形成均匀混合液。
将上述混合液在大约60℃下持续搅拌，并直接加入4L的先前已备妥且温度维持为60℃的硫酸铵水溶液中。所形成的混合物接着于60℃下使用1.5L过滤组(Advantec Toyo Kaisha，Ltd.，日本)来进行下列的孔挤压处理：
(1)于该过滤组内装配一个0.1μm 142mm滤膜，并将混合物过滤10次；以及
(2)将一个0.05μm 142mm滤膜改装配于该过滤组内，再将混合物过滤10次，
其中将挤压压力控制为3～10kg/cm2(流速约为2～10L/min)。
从上述孔挤压处理所收集到4500mL的过滤液于环温下利用一个30KD的空心管(Hollow Fiber，A/G Technology，UFP-30-C-6A，30,000NM，4800cm2)以及大约30L的先前已备妥的9％(w/w)蔗糖溶液来进行透析，而收集到容积约为3000mL的不含乙醇的脂质体悬浮液。
产品品质分析
对于实施例1所制得的脂质体悬浮液，取出样品并以GC分析仪(Varian，Inc.，美国)来进行分析，结果显示该样品内的脂质体悬浮液不含乙醇；另取样品并以Particle size analyzer(Beckman coulter，Inc.)来进行粒径分析，检测结果显示该样品内所含有的脂质体的平均粒径为72.9nm。
实施例2.制备脂质体包封的阿霉素
将实施例1所得到的3000mL脂质体悬浮液加入至一个内装有8000mg盐酸阿霉素(红色粉末)的玻璃容器内，继而加入200mL先前制备的组氨酸-蔗糖溶液。将所形成的混合物置于60℃的水浴中并振摇30分钟。之后，将混合物冷却至大约35℃，并以先前制备的9％蔗糖溶液稀释至4L并混合均匀。由此即得到所期望的脂质体包封的阿霉素。将所形成的产物进一步分装于无菌玻璃小瓶中，而制作成含有2.0mg盐酸阿霉素/mL的注射制剂。
产品品质分析
对于实施例2所制得的脂质体包封的阿霉素注射制剂，观察被封装在玻璃小瓶内的内含物的色泽，结果发现这些玻璃小瓶都是包含外观看来呈橘红色至红色的注射液。取适量样品以HPLC分析仪(WatersCo.，美国)来进一步与标准品作比较，结果显示测试样品内所含的盐酸阿霉素的保留时间与洗脱图谱(elution profile)跟标准品所具者一致。
另外分析实施例2所制得的脂质体包封的阿霉素注射制剂的药物包覆率，而发现测试样品的药物包覆率是为99.61％。而以Particlesize analyzer(Beckman coulter，Inc.)所进行的粒径检测显示，样品内所含有的脂质体平均粒径为91.0nm。
将实施例2所制得的脂质体包封的阿霉素注射制剂储存于2～8℃下历经一段达30个月的期间后，这些制剂经检测试验被确认是稳定的(表1)，而且这些制剂在脂质体的粒径上也未产生明显的变化。
表1.实施例2的脂质体包封的阿霉素注射制剂的稳定性
本说明书中引述的所有专利和文献以其整体被引入本案作为参考资料。若有所冲突时，本案详细说明(包含界定在内)将占上风。
虽然本发明已参考上述特定的具体例被描述，明显地在不背离本发明的范围和精神的下可作出很多的修改和变化。因此意欲的是，本发明只受如随文所附的权利要求所示者的限制。
Claims (26)
1.一种用以制备脂质体悬浮液的方法，其包括下列步骤：
(a)将下列组份加入适量的醇溶剂中以形成混合物，所述醇溶剂选自甘油、丙二醇、乙醇、异丙醇、甲醇、乙二醇以及它们的混合物：
(i)选自下列的磷脂化合物：卵磷脂及其二(C12-C18)酰基衍生物、磷脂酰胆碱及其二(C12-C18)酰基衍生物、磷脂酰乙醇胺及其二(C12-C18)酰基衍生物、磷脂酰甘油及其二(C12-C18)酰基衍生物、磷脂酰肌醇及其二(C12-C18)酰基衍生物、神经鞘磷脂及其二(C12-C18)酰基衍生物、磷脂酸及其二(C12-C18)酰基衍生物，以及它们的组合，
(ii)胆固醇，以及
(iii)选自下列的聚乙二醇衍生的化合物：聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺及其二(C12-C18)酰基衍生物、甲氧基聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺及其二(C12-C18)酰基衍生物，以及它们的组合，
其中组份(i)、(ii)与(iii)的量呈5～10∶2～10∶1的摩尔比例，而且组份(i)、(ii)与(iii)的总量相对于该醇溶剂的量呈1∶5(w/v)的比例，或者该醇溶剂的量更高，
其中步骤(a)在45～70℃的温度范围下进行；
(b)将得自步骤(a)的混合物直接与硫酸铵水溶液混合，其中该得自步骤(a)的混合物与该硫酸铵水溶液的量呈1∶2～10(v/v)的比例，
其中步骤(b)在45～70℃的温度范围下进行；
(c)对步骤(b)所形成的混合物进行孔挤压处理，
其中步骤(c)在40～140psi的压力范围下进行；
(d)以5％～15％(w/w)的蔗糖水溶液透析从步骤(c)所得到的经孔挤压处理的混合物，借此，得到含有脂质体粒子散浮在内的脂质体悬浮液，
其中步骤(d)在环温下进行。
2.如权利要求1的方法，其特征在于：
其中步骤(a)中所使用的醇溶剂是乙醇。
3.如权利要求1的方法，其特征在于：
其中用于步骤(a)中的组份(i)选自：磷脂酰胆碱、二月桂酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二亚麻酰磷脂酰胆碱、1-棕榈酰-2-油酰磷脂酰胆碱，以及它们的组合。
4.如权利要求3的方法，其特征在于：
其中用于步骤(a)中的组份(i)是DSPC。
5.如权利要求1的方法，其特征在于：
其中用于步骤(a)中的组份(iii)选自：PEG-2000-PE及其二(C12-C18)酰基衍生物、PEG-3000-PE及其二(C12-C18)酰基衍生物、PEG-4000-PE及其二(C12-C18)酰基衍生物、PEG-5000-PE及其二(C12-C18)酰基衍生物、mPEG-2000PE及其二(C12-C18)酰基衍生物、mPEG-3000PE及其二(C12-C18)酰基衍生物、mPEG-4000PE及其二(C12-C18)酰基衍生物、mPEG-5000PE及其二(C12-C18)酰基衍生物，以及它们的组合。
6.如权利要求5的方法，其特征在于：
其中用于步骤(a)中的组份(iii)选自：PEG-2000-DSPE、PEG-3000-DSPE、PEG-4000-DSPE、PEG-5000-DSPE、1，2-二酰基-SN-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]、1，2-二酰基-SN-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-3000]，其中该酰基是肉豆蔻酰、棕榈酰基、硬脂酰或油酰。
7.如权利要求5的方法，其特征在于：
其中用于步骤(a)中的组份(iii)是PEG-2000-DSPE。
8.如权利要求1的方法，其特征在于：
其中在步骤(a)中，组份(i)、(ii)与(iii)的总量相对于该醇溶剂的量呈1∶7～10(w/v)的比例。
9.如权利要求1的方法，其特征在于：
其中在步骤(a)中，将DSPC用作组份(i)，将PEG-2000-DSPE用作组份(iii)，并将乙醇用作溶剂。
10.如权利要求1的方法，其特征在于：
其中步骤(a)在55～65℃的温度范围下进行。
11.如权利要求1的方法，其特征在于：
其中步骤(a)在60℃的温度下进行。
12.如权利要求1的方法，其特征在于：
其中步骤(b)在55～65℃的温度范围下进行。
13.如权利要求1的方法，其特征在于：
其中步骤(b)在60℃的温度下进行。
14.如权利要求1的方法，其特征在于：
其中用于步骤(b)中的硫酸铵水溶液的当量浓度为0.2～0.8N。
15.如权利要求14的方法，其特征在于：
其中用于步骤(b)中的硫酸铵水溶液的当量浓度为0.4～0.6N。
16.如权利要求1的方法，其特征在于：
其中在步骤(b)中，得自步骤(a)的混合物与硫酸铵水溶液的量呈1∶4～8(v/v)的比例。
17.如权利要求1的方法，其特征在于：
其中在步骤(c)中，该孔挤压处理通过使步骤(b)所形成的混合物通过孔径范围为0.05～0.45μm的挤压器而进行。
18.如权利要求17的方法，其特征在于：
其中在步骤(c)中，该孔挤压处理使用选自下列的挤压器：可提供大约0.05～0.45μm的挤压孔径的注射筒、装有陶瓷过滤膜或聚碳酸酯过滤膜的过滤装置，以及有孔的盘或管。
19.如权利要求1的方法，其特征在于：
其中步骤(c)中的孔挤压处理为包括下列的两阶段孔挤压处理：使步骤(b)所形成的混合物通过挤压孔径较大的过滤器，继而通过挤压孔径较小的过滤器。
20.如权利要求19的方法，其特征在于：
其中步骤(c)中的孔挤压处理为包括下列的两阶段孔挤压处理：使步骤(b)所形成的混合物通过挤压孔径为0.1μm的过滤器，继而通过挤压孔径为0.05μm的过滤器。
21.如权利要求1的方法，其特征在于：
其中将步骤(d)所得到的脂质体悬浮液进一步冷冻干燥。
22.一种用以制造脂质体包封的药物的方法，所述方法包括下列步骤：使选定的药物与由权利要求1至21中任一项的方法所制得的脂质体悬浮液混合，借此，将该药物包封在该脂质体悬浮液中的脂质体粒子内。
23.如权利要求22的方法，其特征在于：
其中该选定的药物选自：蒽环类抗生素以及喜树碱类抗癌药。
24.如权利要求23的方法，其特征在于：
其中该选定的药物选自：阿霉素、柔红霉素、伊立替康以及长春瑞宾。
25.如权利要求23的方法，其特征在于：
其中该选定的药物是阿霉素。
26.如权利要求22的方法，其特征在于：
其中将该药物与脂质体悬浮液在45～70℃的温度范围下混合，继而将混合物降温至环温，借此，将该药物包封在该脂质体悬浮液中的脂质体粒子内。
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