CN100427087C - 含氧化槐定碱或氧化槐定碱盐的药物组合物、制备方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种含氧化槐定碱或氧化槐定碱盐的药物组合物、制备方法及用途，含氧化槐定碱的药物组合物，是将氧化槐定碱与1-6之一种药学上可接受的载体混合，使所述氧化槐定碱的量占该药物组合物总重量的0.5%-60%，试验证明，本发明含氧化槐定碱或氧化槐定碱盐的药物组合物毒性低，代谢快，不易蓄积，抑瘤谱广，肿瘤抑制率高，用于治疗恶性肿瘤效果好。

Description

含氧化槐定碱或氧化槐定碱盐的药物组合物、制备方法及用途

技术领域

本发明涉及一种含半合成生物碱或含半合成生物碱盐的药物组合物、制备方法及用途，特别是涉及一种含氧化槐定碱或含氧化槐定碱盐的药物组合物、制备方法及在制备抗肿瘤和抗肿瘤转移药物中的应用。

背景技术

苦豆子(Sophora alopecuroides L)为豆科槐属植物，始载于《新疆草药手册》，维吾尔名“布亚”，别名苦甘草、苦参草、苦豆根及西豆根。它集中分布在我国西北地区，尤以宁夏、甘肃、青海、新疆及内蒙古为多。全株味极苦，性寒，有毒，具有清热解毒、抗菌消炎、祛风杀虫等多种功效。民间用其根治疗喉痛、咳嗽、痢疾及湿疹等。

苦豆子植物体内化学成分主要是蛋白、糖类、有机酸、色素及生物碱等。国内外研究的重点是放在生物碱上。苦豆子生物碱属喹诺里西啶(quinolizidine)生物碱，是由三价氮原子形成稠合的哌啶环，所以又称双稠哌啶，仍属于哌啶或吡啶(piperidine)的衍生物，一般称之为羽扇豆生物碱(Lupin alkoloids)。

苦豆子种子中生物碱含量约8.11％，目前已分离出的生物碱有23种之多。按其结构可分为四个类型：①羽扇豆碱(Lupinine)——二环型，②金雀花碱(Cytisine)——三环型，③鹰爪豆碱(Sparteine)——四环型，④苦参碱(Matrine)——四环型。这些生物碱包括苦参碱、槐定碱、槐果碱、拉马宁碱、槐胺碱、新槐胺碱、3α-羟基槐定碱，13，14-脱氢槐定碱、N-羟基槐定碱、氧化苦参碱、氧化槐定碱、氧化槐果碱、苦豆碱、臭豆碱、金雀花碱等。研究发现苦豆子生物碱在抗肿瘤、抗菌、抗心律失常、抗乙肝、免疫调节等方面具有重要的药理活性和应用前景。

中国专利CN1739510A公开了一种“氧化槐定碱在制备抗癌药的用途”在这篇专利中提到，“氧化槐定碱可从豆科槐属野生植物苦参、苦豆子、白刺花、沙生槐中分离提取”。从自然界的上述植物中获取的氧化槐定碱为反式构型、N-O键为直立键。构型如图所示：

原植物苦豆子仅含氧化槐定碱不足0.01％，故从植物中提取分离氧化槐定碱产率较低，且工艺繁杂，产品难于纯化，无法满足作为药物原料的需要，而苦豆子中含槐定碱0.6％，故原料槐定碱易得，若以槐定碱为原料对其进行半合成反应制备氧化槐定碱，可以使其产率提高，因而可以满足大规模生产的需要并可成为药物的原料。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种含氧化槐定碱的药物组合物。

本发明的第二个目的是提供一种含氧化槐定碱盐的药物组合物。

本发明的第三个目的是提供一种含氧化槐定碱的药物组合物在制备抗肿瘤及其转移药物中的应用。

本发明的第四个目的是提供一种含氧化槐定碱盐的药物组合物在制备抗肿瘤及其转移药物中的应用。

本发明的技术方案概述如下：

一种含氧化槐定碱的药物组合物，是将结构为：

的氧化槐定碱与1-6之-种药学上可接受的载体混合，使所述氧化槐定碱的量占该药物组合物总重量的0.5％-60％。

一种含氧化槐定碱盐的药物组合物，是将氧化槐定碱盐与1-6之一种药学上可接受的载体混合，使所述氧化槐定碱盐的量占该药物组合物总重量的1％-60％，所述氧化槐定碱盐是将1摩尔权利要求1所述的氧化槐定碱用水或甲醇或乙醇或四氢呋喃或异丙醇或二氧六环中至少一种溶解，加入1-1.5摩尔有机酸或无机酸的溶液，15℃-30℃反应1-2小时，过滤，滤液减压浓缩至干，真空干燥，即制成一种氧化槐定碱盐。

所述有机酸为C₁-C₁₅的一元酸或C₂-C₁₅的二元酸或C₂-C₉的氨基酸或C₁-C₁₂的磺酸，所述无机酸为盐酸或硫酸或磷酸。

所述一元酸为甲酸、乙酸、十酸、十三酸或十五酸。

所述二元酸为乙二酸、丁二酸、十三二酸、十五二酸。

所述氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸。

所述磺酸为甲磺酸、乙磺酸、丁磺酸、十二烷基磺酸。

一种如权利要求1所述的含氧化槐定碱的药物组合物在制备抗肿瘤及其转移药物中的应用。

一种如权利要求1所述的含氧化槐定碱盐的药物组合物在制备抗肿瘤及其转移药物中的应用。

本发明含氧化槐定碱的药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。

本发明的施药量可根据用药途径、患者年龄、体重、疾病类型和严重程度等诸多因素加以调整，日剂量一般为10～300mg/kg；较好为30～200mg/kg；最佳为50～150mg/kg。可根据临床的病例表现适当加以改变。

本发明的优点是：通过仪器检验和分析证明，本发明的一种氧化槐定碱其结构式与现有技术公开的从天然物质中提取的氧化环定碱并非同一个化合物，两者系一对立体异构体，本发明的氧化槐定碱的喹诺里西啶环为顺式构型、N-O键为平伏键，而现有技术中的氧化槐定碱的喹诺里西啶环为反式构型、N-O键为直立键。在大量的调查和药效学、毒理学、药代动力学研究后证明，以本发明的氧化槐定碱及其盐类为活性成分配制的药物组合物用于治疗恶性肿瘤有意想不到的效果，本发明氧化槐定碱的产率为72.4％，可以满足大规模生产和作为医药原料的需求。

以本发明的氧化槐定碱及其盐类为活性成分的药物组合物具有如下特点：①毒性低，小鼠LD₅₀仅为4362mg/kg，CN 1739510A所述氧化槐定碱LD₅₀为560mg/kg，慢性毒性实验和迟缓性毒性实验也未见药物毒副作用，三致实验也未发现致畸、致癌、致突变作用；②代谢快，不易蓄积，药物消除T_1/2β仅0.3442h，2h仅存痕量，4h完全测不出；③抑瘤谱广，对淋巴瘤、乳腺癌、Lewis肺癌、肝癌、实体瘤、宫颈癌等多种肿瘤具有良好的抑瘤效果，且抑瘤率为50％-70％，比中国专利CN 1739510A所述氧化槐定碱的肿瘤抑制率45％要高。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1  片剂

取10kg氧化槐定碱，加入5kg淀粉、1kg硬脂酸镁、2kg羧甲基纤维素、27kg乙醇(体积百分比含量为70％)、25kg微晶纤维素、32kg玉米淀粉，充分搅拌混合制成湿颗粒，在60～70℃干燥2～4小时压制成片，每片含氧化槐定碱30mg。

在实际操作时，可用氧化槐定碱盐替代氧化槐定碱，氧化槐定碱盐可以是氧化槐定碱的盐酸盐或硫酸盐或磷酸盐。

氧化槐定碱盐还可以是氧化槐定碱的甲酸盐或乙酸盐或十酸盐或十三酸盐或十五酸盐。

氧化槐定碱盐还可以是氧化槐定碱的乙二酸盐或丁二酸盐或十三二酸盐、十五二酸盐。

氧化槐定碱盐还可以是氧化槐定碱的甘氨酸盐或丙氨酸盐或缬氨酸盐或亮氨酸盐或谷氨酸盐或苯丙氨酸盐。

氧化槐定碱盐还可以是氧化槐定碱的甲磺酸盐或乙磺酸盐或丁磺酸盐或十二烷基磺酸盐。

实施例2胶囊剂

取30kg氧化槐定碱，加入2kg硬脂酸镁、20kg羧甲基纤维素、48kg微晶纤维素，充分搅拌混合制成湿颗粒，将制成的湿颗粒直接在60～70℃干燥2～4小时，然后充填入空胶囊壳中，每粒胶囊含氧化槐定碱50mg。

实施例3缓释片剂

取30kg氧化槐定碱盐(盐可以是实施例1中所举的任意一种)，加入7kg羟丙基甲基纤维素、25kg羧甲基纤维素、37kg乙醇(体积百分比浓度为70％)、1kg硬脂酸镁等充分搅拌混合制成湿颗粒，在60～70℃干燥2～4小时压制成片。

或取60kg氧化槐定碱，加入28kg羟丙基甲基纤维素、3kg硬脂酸、8kg乳糖、1kg硬脂酸镁，充分搅拌混合干法制粒，压片，每片含氧化槐定碱100mg。

实施例4滴丸

取10kg氧化槐定碱盐(盐可以是实施例1中所举的任意一种)，加入90kg的聚乙二醇，90℃加热熔融，使原料和辅料充分混熔，将熔融物滴入二甲基硅油接受液体中，自然冷却形成滴丸，使每粒滴丸含氧化槐定碱盐5～25mg。

实施例5颗粒剂

取60kg氧化槐定碱，加入2kg硬脂酸镁、18kg羧甲基纤维素、20kg微晶纤维素，充分搅拌混合用12-14目筛制成颗粒。在60-70℃干燥2-4小时，使每克颗粒剂含氧化槐定碱200mg。

实施例6口服液

取0.5kg氧化槐定碱及其盐类，加入纯水74.5kg和25kg食用糖，搅拌使溶解，分装灭菌，制得。

实施例7冻干粉针

取4.5kg氧化槐定碱盐(盐可以是实施例1中所举的任意一种)，4kg的甘露醇，加入91kg的注射用水中，搅拌使溶解，滴加体积比1∶1的盐酸水溶液，调节pH值至6.2，再加入0.5kg的针剂用活性炭，室温搅拌20分钟，过滤除活性炭，再用0.22μm滤膜过滤除菌，得澄明无菌液，灌入5ml管制瓶中，每瓶3ml，放入真空冷冻干燥器中进行冷冻干燥，制得。

实施例8注射液

取1kg氧化槐定碱盐(盐可以是实施例1中所举的任意一种)、9kg氯化钠与90kg注射用水配液，搅匀，滤过，灌封，于115℃热压灭菌30分钟，制得。

或取1kg氧化槐定碱盐(盐可以是实施例1中所举的任意一种)、10kg葡萄糖与89kg注射用水配液，滴加体积比1∶1的盐酸水溶液，调节pH值至4.0，加活性炭0.1kg，在搅拌下煮沸30分钟，过滤除活性炭，再用0.22μm滤膜过滤除菌，得澄明无菌液，灌封，于115℃热压灭菌30分钟，制得。

实施例9

一种氧化槐定碱：

的制备方法，包括如下步骤：

1)在150ml 30％(V/V)的H₂O₂水溶液中，加入50g槐定碱，用浓盐酸调pH＝2，30℃反应8小时；

2)用1，2-二氯乙烷萃取未反应的槐定碱，直至反应液经薄层色谱检查无槐定碱为止，用10％NaOH水溶液调反应液pH为8.5；

3)将反应液减压浓缩至原体积的1/15，无水乙醇溶解，过滤，滤液减压浓缩至干，真空干燥至完全固化；

4)用无水乙醇∶丙酮(1∶3)混合溶剂重结晶3次，得到白色氧化槐定碱粉末36.2g。

薄层色谱检查方法为取薄层层析硅胶板，将萃取液样品及对照品点于薄层板底部，以体积比为1∶1∶1的正丙醇∶氯仿∶甲醇为展开剂，进行薄层层析，再用改良碘化铋钾试液显色。

实施例10

一种氧化槐定碱盐，用如下步骤制成：将实施例9制备的1摩尔氧化槐定碱用水溶解，再加1摩尔有机酸(或无机酸的溶液)，20℃反应2小时，过滤，滤液减压浓缩至干，真空干燥，即制成一种氧化槐定碱盐。(溶解氧化槐定碱的溶剂换成甲醇、乙醇、四氢呋喃、异丙醇、二氧六环中至少一种，其它步骤与上述相同，构成新的实施例)

有机酸为C₁-C₁₅的一元酸或C₂-C₁₅的二元酸或C₂-C₁₅的氨基酸或C₁-C₁₅的磺酸，所述无机酸为盐酸或硫酸或磷酸。

本发明的一种含氧化槐定碱的药物组合物，可以是口服制剂、液体制剂。其中口服制剂为普通片剂、胶囊剂、缓释片、滴丸或颗粒剂；液体制剂为口服液、冻干粉针、注射液、大小输液或静脉滴注液等。

所述的药学上可接受的载体，包括制剂中常规的稀释剂、填充剂(如甘露醇、乳糖、聚乙二醇)，粘合剂(淀粉、微晶纤维素)，崩解剂(如羧甲基纤维素、低取代羟丙基纤维素)，润滑剂(如滑石粉、硬脂酸镁)，湿润剂(如丙二醇、乙醇)，稳定剂(EDTA-2Na、硫代硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、乙醇胺、碳酸氢钠、烟酰胺)等。上述辅料可以是常用剂量，以常用的配比与氧化槐定碱或与氧化槐定碱盐类混合，当氧化槐定碱及其盐类的用量确定后，各药用辅料之间的配比可以根据需要适当调节。本发明的含氧化槐定碱的药物组合物优选含有重量比为0.5％-60％。

压片制成片剂的使用，用作赋型剂的辅料有MgSO₄、玉米淀粉、滑石粉，规格有：25mg、50mg、100mg、150mg、200mg。

实施例11

实施例9所制备的氧化槐定碱的经元素分析、IR、MS、¹H-NMR、UV、熔点、TLC及性状分析，分子式为C₁₅H₂₄N₂O₂，分子量(MW)：264。¹H-NMR的图中有δ4.08(1H，dd，17-He，J＝13.5和7.5Hz)和δ3.41(1H，dd，17-Ha，J＝13.5和8Hz)的吸收峰，在UV中无2800cm^-1的吸收峰，说明制备的氧化槐定碱立体结构为顺式喹诺里西啶结构。产品质量检验合格，并对其稳定性进行了研究。

氧化槐定碱具有如下理化性质：

本品为白色固体粉末，在水中极易溶解，在乙醇中易溶，在氯仿中溶解，在乙醚中不溶，极易引湿。

Mp 216-217℃。

TLC Rf值：0.17(展开剂为正丙醇∶氯仿∶甲醇＝1∶1∶4)

结构确证：

1.元素分析：

分子式：C₁₅H₂₄N₂O₂，分子量：264

理论值：C％68.18％  H％9.09％  N％10.61％

实测值：C％68.27％  H％8.66％  N％10.42％

2.红外光谱：

IR(KBr)cm^-1：3423(OH)，2940，2873(CH)，1616(C＝O)，1459，1145(CN)，962(N→O)。

3.质谱：

氧化槐定碱的分子量为264.30，(理论计算值264.37)，ESI-MS m/z(％)：265(M+H，100)，247(M-OH，13.7)。

4.氢核磁共振谱：

δ4.08(1H，dd，17-He)，δ3.41(1H，dd，17-Ha)，δ3.48(2H，m，11-H，10-He)，δ3.13(2H，m，2-2H)，δ3.03(2H，m，14-2H)，δ2.98(1H，m，6-H)，δ2.85(1H，m，10-Ha)，δ2.35(2H，m，5-H，7-H)，δ2.07(2H，m，13-2H)，δ1.94(8H，m，3-2H，4-2H，8-2H，9-2H)，δ1.41(1H，m，12-He)，δ1.23(1H，m，12-Ha)。

5.紫外光谱：

将氧化槐定碱溶于水，配成0.5mg/ml的溶液，进行紫外扫描，扫描波长为190-800nm。扫描结果，氧化槐定碱的紫外最大吸收峰位于197nm处。

6.产品质量检验：

取本发明所得氧化槐定碱20g进行检验，结果如下：

检查项目        检查结果

[性状]         白色结晶性粉末

[鉴别]*        (1)正反应

[检查]

水分           8％

炽灼残渣％     0.01

酸碱度         7.8～8.6

澄清度         澄清

重金属         10ppm

有关物质％*        0.5

[含量测定]*        按干燥品计算98.6％

结论：符合规定。

*项目鉴别方法详述如下：

(1)取本品1.0mg，加水5ml溶解，置两只试管中，分别滴加碘化汞钾试液和碘化铋钾试液，即生成淡黄色沉淀和橙红色沉淀。

*项目检查方法详述如下：

有关物质

照高效液相色谱法(中国药典附录V D)测定。

色谱条件与系统适应性试验用氨基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈∶磷酸缓冲液(pH2.0)∶无水乙醇＝80∶13∶8为流动相；流速为1ml/min；检测波长220nm。

取本品适量，精密称定，加水溶解制成每1ml中含1mg的溶液，作为高浓度供试品溶液；精密量取1ml高浓度供试品溶液至25ml量瓶中，用水稀释至刻度，作为低浓度供试品溶液。分别取20μl低浓度和高浓度供试品溶液注入液相色谱仪，并记录色谱图，测量峰面积，按下列公式计算。

(1)最大杂质峰量不得大于2.0％。

                           最大杂质峰量＝100r_i/r_t+25r_v

(2)有关物质的总量不得大于5.0％。

                           有关物质总量＝100r_i/r_t+25r_v

式中r_i为除溶剂峰外高浓度供试品溶液中最大有关物质的峰响应；

    r_t为除溶剂峰以外高浓度供试品溶液中所有有关物质的峰响应之和；

    r_v为低浓度供试品溶液中的氧化槐定碱峰响应。

含量测定照中国药典2005版(中国药典附录V D)高效液相色谱法测定。

色谱条件与系统适应性试验用氨基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-磷酸水溶液(pH2.0)-无水乙醇(80∶13∶8)为流动相；流速为每分钟1ml；检测波长为220nm。理论板数氧化槐定碱峰计算不低于1000。

测定法取本品适量，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含1mg的溶液，精密量取20μl注入液相色谱仪，记录色谱图；另取施普睿达对照品适量，同法测定。按外标法以峰面积计算，即得。

7.对其稳定性进行加速实验考察(高温、高湿、强光照射)，结果发现其对高温、高湿、强光照射稳定、无分解，纯度及理化指标不变。技术指标达到新药报批的要求，工艺适合工业化生产。

实施例12

氧化槐定碱体外抗肿瘤作用

肝癌SMMC-7721：

1实验方法：采用MTT比色分析法

(1)接种细胞：取对数生长期细胞，经0.02％的EDTA消化后加入含有10％胎牛血清的RPMI-1640培养液，将细胞稀释成单细胞悬液，调整细胞数，接种于96孔板。将接种后的细胞置37℃二氧化碳培养箱内培养24小时。

(2)加药：将样品浓度设为10～1000μg/ml等不同浓度，每个浓度设4个复孔，对照设10个以上复孔。实验样品用DMSO助溶，用RPMI-1640培养液稀释。加样后仍将细胞置37℃二氧化碳培养箱内继续培养72小时。

(3)加MTT：MTT以RPMI-1640溶解，每孔加50μL。再置37℃继续培养4小时后取出。

(4)测OD值：弃除96孔板内的上清液，每孔加入DMSO 150μL。在酶标仪490nm测定OD值。

2评价指标：细胞生长抑制率。抑制率＝(1-实验组平均OD值/对照组平均OD值)×100％。以对数直线回归方法计算IC50。

3实验结果：样品对体外培养的肝癌SMMC-7721细胞的生长抑制有明显作用，并呈剂量依赖关系，其IC₅₀为161.5μg/ml。

人肺腺癌A₅₄₉：

1实验方法：采用MTT比色分析法

(1)接种细胞：取对数生长期细胞，经0.02％的EDTA消化后加入含有10％胎牛血清的RPMI-1640培养液，将细胞稀释成单细胞悬液，调整细胞数，接种于96孔板。将接种后的细胞置37℃二氧化碳培养箱内培养24小时。

(2)加药：将样品浓度设为10～1000μg/ml等不同浓度，每个浓度设4个复孔，对照设10个以上复孔。实验样品用DMSO助溶，用RPMI-1640培养液稀释。加样后仍将细胞置37℃二氧化碳培养箱内继续培养72小时。

(3)加MTT：MTT以RPMI-1640溶解，每孔加50μL。再置37℃继续培养4小时后取出。

(4)测OD值：弃除96孔板内的上清液，每孔加入DMSO 150μL。在酶标仪570nm测定OD值。

2评价指标：细胞生长抑制率。抑制率＝(1-实验组平均OD值/对照组平均OD值)×100％。以对数直线回归方法计算IC₅₀。

3实验结果：样品对体外培养的人肺腺癌A₅₄₉细胞有一定的细胞毒作用，其IC₅₀为228.4μg/ml。

实施例13

氧化槐定碱体内抗肿瘤作用

(一)抑制自发淋巴瘤、乳腺癌、Lewis肺癌实验

1.材料：

1.1动物的选择：本研究所自行繁殖IRM-2纯系小鼠，雌雄兼用，体重：22-30g。

1.2瘤株：淋巴瘤，从IRM-2纯种小鼠自发淋巴瘤传代接种；乳腺癌、Lewis肺癌，由天津医科大学提供，本室传代接种。

1.3配制药物：取氧化槐定碱，配制成浓度为50mg/kg，100mg/kg，150mg/kg，溶剂为注射用水。

2.方法

2.1接种：选择肿瘤生长旺盛且无溃破，健康情况良好的荷瘤鼠，脱臼处死，固定于手术板上，用碘酒，新洁尔灭消毒动物皮肤，无菌条件下在超净台内剥肿瘤，切开肿瘤成直径2mm左右的小块，在动物左侧腹股沟处皮下接种。

2.2分组给药：接种后次日将动物随机分组，设对照组及给药组，对照组给予生理盐水，给药组给予3个不同剂量的氧化槐定碱水溶液，每日1次，腹腔注射，每次0.5ml，连续给药10天。

2.3观察指标：停药后24小时处死动物，称体重，解剖剥离瘤块，称瘤重。

抑瘤率＝(1-给药组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100％

3.结果：

测得氧化槐定碱对小鼠淋巴瘤、乳腺癌、Lewis肺癌的抑制率分别见表1-表3。

表1氧化槐定碱对淋巴瘤的抑制作用

表2氧化槐定碱对乳腺癌的抑制作用

表3氧化槐定碱对Lewis肺癌的抑制作用

结果表明，氧化槐定碱对小鼠移植性肿瘤淋巴瘤、乳腺癌及Lewis肺癌都有一定的抑制作用，在实验中使用100mg/kg剂量效果更为明显。

(二)抑制肉瘤S₁₈₀、宫颈癌U₁₄、肝癌H₂₂实验

1.实验材料

1.1实验动物昆明种小鼠210只，体重(20±2g)，雌雄各半，购于中国医学科学院实验动物研究所，动物许可证号SCXK京2004-0001。

1.2瘤种小鼠宫颈癌U₁₄、肉瘤S₁₈₀、肝癌H₂₂瘤株，购于天津医药科学研究所。

1.3药物氧化槐定碱，白色固体粉末，在水中极易溶解，极具引湿性，经HPLC检测纯度大于96％，由本课题组自制。

1.4仪器电子精密天平，瑞士，Mettler Toledo；光学显微镜，日本，OLYMPUS。

2.实验方法

2.1动物模型的建立将小鼠在正常条件下喂养3d，称重后(原始体重)，在无菌条件下抽取接种7d后的小鼠宫颈癌U₁₄、肉瘤S₁₈₀、肝癌H₂₂腹水瘤瘤液，用生理盐水稀释成(1∶2)的液体充分混合，将肿瘤细胞悬液用新鲜配制的0.2％台盼蓝染色，混匀后按白细胞计数方法计数。染蓝色者为死细胞，不染色者为活细胞，按如下公式计算细胞浓度和细胞存活率。

细胞浓度＝4大方格内活细胞数/4×10⁴×稀释倍数＝细胞数/ml

细胞存活率＝活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100％

接种U₁₄、S₁₈₀、H₂₂肿瘤计数分别为4.5～7.5×10⁷个/ml、4.2～5.7×10⁷个/ml、4.1～5.8×10⁷个/ml，细胞存活率均大于95％。用0.25ml注射器以0.2ml/只接种于小鼠的右前肢腋下，制成实体瘤动物模型。

2.2动物分组肿瘤接种后，将70只小鼠严格按随机数字表示分成5组：模型组(空白对照组)，给药组(氧化槐定碱高、中、低剂量组)，阳性对照组(顺铂组)，每组14只，各组同时于接种肿瘤24h后开始给药。

2.3给药剂量与给药途径空白对照组给予生理盐水(0.3ml/d×10d)，氧化槐定碱高、中、低剂量组(50，100，150mg/kg/d×10d)，阳性对照组顺铂(4mg/kg/2d×10d)。样品临用前以注射用水配制，ip给药。

2.4检测指标及方法

2.4.1一般情况每日观察小鼠的自主活动，精神状态，毛发，呼吸，饮食，粪便性状及对外界刺激的反应。

2.4.2实体瘤抑瘤率和体重增长的测定移植瘤株24h后小鼠给药，连续给药10d，于第11d脱颈椎处死小鼠，称取体重(处死体重)，然后用镊子镊住小鼠右腋肿瘤生长部位皮肤，用手术剪子剪开皮肤，暴露肿瘤，用手术剪钝性剥离肿瘤，并用天平称取瘤重，按如下公式计算抑瘤率。

肿瘤抑制率(％)＝[1-(平均实验组瘤重/平均空白对照组瘤重)]×100％

体重增长＝处死体重-原始体重-瘤重

2.4.3肝重、脾指数和胸腺指数的测定采用称重法即剥离肿瘤后的小鼠，再解剖取出肝、脾和胸腺，用天平称取肝重(g)、脾重(mg)和胸腺重(mg)，并按如下公式计算脾指数和胸腺指数。

脾指数＝脾重/处死体重(mg/g)

胸腺指数＝胸腺重/处死体重(mg/g)

2.5统计方法数据用SPSS10.0for windows统计分析软件处理，本实验数据统计均采用t检验和方差分析，以mean±SE表示。

3.实验结果

3.1氧化槐定碱对U₁₄荷瘤小鼠的抑瘤率及体重的影响结果。(见表4)实验表明，氧化槐定碱(50-150mg/kg)对U₁₄小鼠肿瘤具有非常显著的抑制作用(P＜0.01)，并存在一定的剂量依赖关系。虽然阳性对照药顺铂抑瘤效果优于氧化槐定碱，但荷瘤小鼠的体重、肝重及免疫指标(脾指数和胸腺指数)明显下降，氧化槐定碱与空白对照组差异极其显著(P＜0.001)，而组的体重、脾指数、胸腺指数等指标均较空白对照组有所提高，提示氧化槐定碱可能还有一定的改善荷瘤动物免疫机能的作用。(详见表5)

表4氧化槐定碱对U₁₄荷瘤小鼠的抑瘤率及体重的影响(mean±SE，n＝14)

Compared with control group，*P＜0.01。

表5氧化槐定碱对U₁₄荷瘤小鼠各脏器指标的影响(mean±SE，n＝14)

Compared with control group.**P＜0.001。

3.2氧化槐定碱对S₁₈₀荷瘤小鼠的抑瘤率及体重的影响结果。(见表6)实验表明，氧化槐定碱(50-150mg/kg)对S₁₈₀小鼠肿瘤具有极其显著的抑制作用(P＜0.001)，其中中剂量组(100mg/kg)抑瘤率最高为73.9％。尽管阳性对照药抑瘤效果优于氧化槐定碱，但荷瘤小鼠的体重、肝重及免疫指标(脾指数和胸腺指数)明显下降，与空白对照组差异均极其显著(P＜0.001)，而氧化槐定碱组的这些指标与空白对照组比相差无几。(详见表7)

表6氧化槐定碱对S₁₈₀荷瘤小鼠的抑瘤率及体重的影响(mean±SE，n＝14)

Compared with control group，**P＜0.001。

表7氧化槐定碱对S₁₈₀荷瘤小鼠各脏器指标的影响(mean±SE，n＝14)

Compared with control group：**P＜0.001。

3.3氧化槐定碱对H₂₂荷瘤小鼠的抑瘤率及体重的影响结果。(见表8)实验表明，氧化槐定碱(50-150mg/kg)对H₂₂小鼠肿瘤具有极其显著的抑制作用(P＜0.001)，其中中剂量组(100mg/kg)抑瘤率最高为79.3％。尽管阳性对照药抑瘤效果优于氧化槐定碱，但荷瘤小鼠的体重、肝重及免疫指标(脾指数和胸腺指数)明显下降，与空白对照组差异均极其显著(P＜0001)，而氧化槐定碱组的这些指标与空白对照组比相差无几。(详见表9)

表8氧化槐定碱对H₂₂荷瘤小鼠的抑瘤率及体重的影响(mean±SE，n＝14)

Compared with control group，**P＜0.001。

表9氧化槐定碱对H₂₂荷瘤小鼠各脏器指标的影响(mean±SE，n＝14)

Compared with control group：**P＜0.001。

实施例14

氧化槐定碱体外抗转移实验研究

(一)抑制SMMC-7721肝癌细胞粘附实验

1.实验方法：采用MTT比色分析法。

96孔板每孔中分别铺上ECM CEL各50ul，4℃过夜。加入1％BSA 150ul/孔，37℃孵箱内孵育2小时，倒置沥干。氧化槐定碱与细胞共培养24小时，调节细胞浓度为8×10⁴/ml，每孔加0.2ml，吸附1小时，用无血清培养液洗二次，加入200ul完全培养液，加MTT 20ul/孔，37℃孵箱内孵育4小时，加DMSO 150ul/孔。全自动酶标仪测定波长490nm的光密度(A)值。

2.评价指标：粘附抑制率。粘附抑制率(％)＝(1-加药组A值/未加药组A值)×100％

3实验结果：粘附实验是人们创建的模拟肿瘤侵袭转移过程的实验模型之一。氧化槐定碱在本试验剂量范围内，对肝癌细胞的粘附功能有明显抑制作用，并呈剂量依赖关系。当氧化槐定碱药物浓度为3.7879×10^-4mol/L、1.1364×10^-3mol/L、2.2727×10^-3mol/L时，粘附抑制率分别为68％、90％、77％。(详见表10)

表10氧化槐定碱对SMMC——7221肝癌细胞粘附功能的影响

实施例15

氧化槐定碱体外诱导肿瘤细胞凋亡实验研究

(一)SMMC-7721肝癌细胞形态学实验

1.实验方法：

将对数生长期细胞接种于预先置有盖玻片的6孔培养板内，细胞浓度为8×10⁴/ml，每孔2ml，氧化槐定碱终浓度分别为3.7879×10^-4mol/L、1.1364×10^-3mol/L、2.2727×10^-3mol/L与细胞共培养24h，取出盖玻片，Ciemsa染色后光镜下进行细胞形态学观察。

2.实验结果：

观察不同浓度的氧化槐定碱作用于SMMC——7221细胞24h后发现，而氧化槐定碱组细胞稀疏，数目少，形态不规则，有的呈梭形，有的呈圆形，核质比大，染色质较疏松。当氧化槐定碱浓度为1.1364×^10-3mol/L时，可见有明显的凋亡细胞形态出现；细胞体积明显变小，薄膜皱缩，胞核固缩，染色质浓染，有的细胞表现为核碎裂，个别细胞部分胞浆崩解为碎片状，可见由膜裹内容物的所谓凋亡小体形成。

实施例16

氧化槐定碱体内抗转移实验研究

(一)抑制Lewis肺癌自发性肺转移

1.实验材料

1.1实验动物C57BL/6小鼠，体重(20±2g)，雌雄各半，购于中国医学科学院实验动物研究所。

1.2瘤种Lewis肺癌瘤株，购于天津医药科学研究所。

1.3药物氧化槐定碱盐酸盐，白色固体粉末，在水中极易溶解，极具引湿性，经HPLC检测纯度大于96％，由本课题组自制。

2.实验方法：

Lewis肿瘤小鼠，在无菌条件下取瘤块，匀浆液放入无菌小瓶内，生理盐水调整浓度，0.2ml/只鼠接种于C57BL/6小鼠腋部皮下，取接种后的实验小鼠50只，随机分为5组，模型组：给于生理盐水；5-FU：给予5-FU 20mg/kg；氧化槐定碱3个剂量组(50mg/kg，100mg/kg，150mg/kg)。以上各组小鼠均ip给药，每日1次，14d后脱颈处死。解剖取出小鼠完整肺，用Bouin氏液固定24h，然后放入无水乙醇，漂洗至黄色褪去，转移灶成白色小点，用显微镜观察转移灶数，计算转移率：

转移率＝(1-给药组平均转移灶数/对照组平均转移灶数)×100％

3.实验结果：氧化槐定碱3个剂量组均可明显抑制肺转移灶数，与模型组比较有统计学意义(P＜0.01)，肺转移抑制率分别为62.4％，67.1％，68.5％。(详见表11)

表11氧化槐定碱对Lewis肺癌小鼠自发性转移的影响(Mean±SE)

组别	剂量(mg/kg)	体重(g)	肺转移灶数(个)	转移抑制率(％)
					模型组		21.85±2.32	14.75±7.40
5-FU组	20	20.62±2.13	6.30±2.95*	57.3
					氧化槐定碱大剂量组	50	22.87±2.37	5.55±1.85*	62.4
氧化槐定碱中剂量组	100	23.83±2.95	4.85±2.21*	67.1
					氧化槐定碱小剂量组	150	22.95±2.89	4.64±2.32*	68.5

注：与模型组比较，*P＜0.05。

实施例17

氧化槐定碱急性毒性研究

1.材料与方法：

1.1药物：氧化槐定碱，白色固体粉末，易吸湿，可溶于水，纯度大于95％。

1.2动物：昆明种小白鼠，雌雄各半，体重18-22g，由中国医学科学院实验动物研究所提供，合格证书：医动字第01-3001号。

1.3方法：取50只小鼠，雌雄各半，体重18-22g，随机分为5组，每组10只(雌雄各只)。精密称取氧化槐定碱5.41g加注射用水配成17.1ml，此浓度在给最高剂量组8000mg/kg时，20g体重ip 0.5ml，然后按0.7等比递减，将原药液依次稀释，使以下各剂量级即5600mg/kg、3920mg/kg、2744mg/kg及1921mg/kg组均按20g体重ip0.5ml的相应药液，注射后观察各组动物的中毒症状。若有死亡记录死亡数，连续观察7天，除1921mg/kg组外，其他各组均有部分动物在注射后5分钟出现安静、匍伏、少动、行走蹒跚、有的出现震颤随后呼吸停止死亡。一般死亡在48小时发生，7天后根据各组死亡数，按综合计算法测定LD₅₀。

2.结果：各项数据见表12

LD₅₀＝4362±810mg/kg

3.结论：单次腹腔注射氧化槐定碱对小鼠的毒性较小，在剂量达到2744mg/kg以上时，部分动物可出现安静、匍伏、少动、行走蹒跚等症状，严重者可发生震颤及呼吸停止死亡，死亡一般在48小时内发生，测得的LD₅₀为4362±810mg/kg，毒性较低。

表12氧化槐定碱急性毒性的测定(LD₅₀)

实施例18

氧化槐定碱药代动力学研究

1.材料

1.1药物氧化槐定碱，白色固体粉末，引湿性强，纯度大于95％，本研究室自制。

1.2仪器System Gold高效液相色谱仪(Beckman公司产品)，166可变波长紫外检测器

1.3动物昆明种雌性小鼠，体重28~32g，中国医学科学院实验动物所提供(合格证号，医动字第01-3001号)

1.4试剂乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯。

2方法

实验用昆明种雌性小鼠80只，随机分为8组，每组10只，腹腔注射氧化槐定碱生理盐水溶液250mg/kg，给药后0.03-0.04h内分组眼眶取血。血液凝固后，离心取血清。取200ml血清加入乙腈400μL沉淀蛋白，离心后取上清液100μL，直接进样。色谱柱为C₁₈Ultrasphere半制备柱(5U，10mm×250mm)，流动相：20％乙腈-80％磷酸缓冲液(1/15molH₃PO₄+1/15mol KH₂PO₄，pH＝3)，流速2ml/min，检测波长210nm。分别测定不同给药时间的血药浓度。

3结果

见表13。

表13给药后不同时间小鼠氧化槐定碱血清药物浓度(M±s，μg/ml)

用给药0.1h之后的给药时间和相应血清药物浓度的对数值logC作回归分析，得方程Y＝2.1447-0.8753×T，消除系数(K_e)：-2.0133/h；消除相半衰期(T_1/2β)：0.3442h；最大血药浓度(C_max)：125.48μg/ml；血浆浓度达峰时间(T_max)：0.1h；表观分布容积(V_d)：3.29mg/L；清除率(CL)：6.62L/(h·kg)。

4结论

4.1系统中氧化槐定碱分离良好，保留时间t_B7.4～7.5min，药物含量与峰面积线性相关，Y(μg)＝0.0412+0.181/γA(峰面积)，γ＝0.9999，最低检测限为0.1μg。

4.2本方法测定的是血清中游离的氧化槐定碱原型药物，未能测出可能的还原产物。

4.3药物吸收快，给药后0.10h即达到最高浓度，0.5h内维持较高浓度，药物消除T_1/2β仅0.3442h，2h仅存痕量，4h完全测不出。

实施例19

氧化槐定碱盐酸盐体内抗肿瘤研究

1.实验材料

1.1实验动物昆明种小鼠，体重(20±2g)，雌雄各半，购于中国医学科学院实验动物研究所，动物许可证号SCXK京2004-0001。

1.2瘤种小鼠宫颈癌U₁₄、肉瘤S₁₈₀、肝癌H₂₂瘤株，购于天津医药科学研究所。

1.3药物氧化槐定碱盐酸盐，白色固体粉末，在水中极易溶解，极具引湿性，经HPLC检测纯度大于96％，由本课题组自制。

1.4仪器电子精密天平，瑞士，Mettler Toledo；光学显微镜，日本，OLYMPUS。

2.实验方法

2.1动物模型的建立将小鼠在正常条件下喂养3d，称重后(原始体重)，在无菌条件下抽取接种7d后的小鼠宫颈癌U₁₄、肉瘤S₁₈₀、肝癌H₂₂腹水瘤瘤液，用生理盐水稀释成(1∶2)的液体充分混合，用0.25ml注射器以0.2ml/只接种于小鼠的右前肢腋下，制成实体瘤动物模型。

2.4动物分组肿瘤接种后，将小鼠严格按随机数字表示分成5组：模型组(空白对照组)，给药组(氧化槐定碱盐酸盐高、中、低剂量组)，阳性对照组(顺铂组)，每组10只，各组同时于接种肿瘤24h后开始给药。

2.5给药剂量与给药途径空白对照组给予生理盐水(0.3ml/d×10d)，氧化槐定碱盐酸盐高、中、低剂量组(50，100，150mg/kg/d×10d)，阳性对照组顺铂(4mg/kg/2d×10d)。样品临用前以注射用水配制，ip给药。

2.4实体瘤抑瘤率和体重增长的测定移植瘤株24h后小鼠给药，连续给药10d，于第11d脱颈椎处死小鼠，称取体重(处死体重)，然后用镊子镊住小鼠右腋肿瘤生长部位皮肤，用手术剪子剪开皮肤，暴露肿瘤，用手术剪钝性剥离肿瘤，并用天平称取瘤重，按如下公式计算抑瘤率。

肿瘤抑制率(％)＝[1-(平均实验组瘤重/平均空白对照组瘤重)]×100％

体重增长＝处死体重-原始体重-瘤重

3.实验结果：氧化槐定碱盐酸盐3个剂量组对U₁₄、S₁₈₀、H₂₂小鼠肿瘤，均有显著的抑制作用，且抑瘤效果略优于氧化槐定碱。(详见表14-16)

表14氧化槐定碱盐酸盐对U₁₄荷瘤小鼠的抑瘤率及体重的影响(mean±SE，n＝14)

Compared with control group，*P＜0.01。

表15氧化槐定碱盐酸盐对S₁₈₀荷瘤小鼠的抑瘤率及体重的影响(mean±SE，n＝14)

Compared with control group，*P＜0.01。

表16氧化槐定碱盐酸盐对H₂₂荷瘤小鼠的抑瘤率及体重的影响(mean±SE，n＝14)

Compared with control group，**P＜0.001。

实施例20

氧化槐定碱长期毒性实验研究

实验动物选用中国医学科学院实验动物研究所提供的大白鼠和兔，分两大组，大白鼠为一大组，兔为一大组。每大组再按给药量分为小剂量(LD₁₀)、中剂量(LD₁₅)、大剂量(LD₂₀)、空白对照四个小组。每组20只，每只按实际体重和所在组用药比例计算每次给药量，注射给药，每天给药1次，连续给药6个月，停药15天，观察迟缓性毒性反应。

观察指标：

观察给药前后动物体征、生长曲线、外观行为、注射局部反应，血、尿常规，心、肝、肾功能和重要器官的肉眼观察和病理检查等。

结果：慢性毒性实验和迟缓性毒性实验历时6个月，未发现1例动物死亡。观察动物体征、生长曲线、外观行为、注射局部反应，血、尿常规及心、肝、肾功能检测，未发现药物毒副作用。

同时，进行氧化槐定碱三致(致畸、致癌、致突变)实验，也未发现致畸、致癌、致突变的作用。

Claims (7)

1.一种含氧化槐定碱的药物组合物在制备抗肿瘤及其转移药物中的应用，其特征是将结构为：

的氧化槐定碱与1-6种药学上可接受的载体混合，使所述氧化槐定碱的量占该药物组合物总重量的0.5％-60％。

2.一种含氧化槐定碱盐的药物组合物在制备抗肿瘤及其转移药物中的应用，将氧化槐定碱盐与1-6种药学上可接受的载体混合，使所述氧化槐定碱盐的量占该药物组合物总重量的1％-60％，所述氧化槐定碱盐是将1摩尔权利要求1所述的氧化槐定碱用水或甲醇或乙醇或四氢呋喃或异丙醇或二氧六环中至少一种溶解，加入1-1.5摩尔有机酸或无机酸的溶液，15℃-30℃反应1-2小时，过滤，滤液减压浓缩至干，真空干燥，制成。

3.根据权利要求2所述的一种含氧化槐定碱盐的药物组合物在制备抗肿瘤及其转移药物中的应用，其特征是所述有机酸为C₁-C₁₅的一元酸或C₂-C₁₅的二元酸或C₂-C₉的氨基酸或C₁-C₁₂的磺酸，所述无机酸为盐酸或硫酸或磷酸。

4.根据权利要求3所述的一种含氧化槐定碱盐的药物组合物在制备抗肿瘤及其转移药物中的应用，其特征是所述一元酸为甲酸、乙酸、十酸、十三酸或十五酸。

5.根据权利要求3所述的一种含氧化槐定碱盐的药物组合物在制备抗肿瘤及其转移药物中的应用，其特征是所述二元酸为乙二酸、丁二酸、十三二酸或十五二酸。

6.根据权利要求3所述的一种含氧化槐定碱盐的药物组合物在制备抗肿瘤及其转移药物中的应用，其特征是所述氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、谷氨酸或苯丙氨酸。

7.根据权利要求3所述的一种含氧化槐定碱盐的药物组合物在制备抗肿瘤及其转移药物中的应用，其特征是所述磺酸为甲磺酸、乙磺酸、丁磺酸或十二烷基磺酸。