CN100420682C - 丹酚酸b的分离制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种从丹参提取物中快速分离纯化丹酚酸B的分离制备方法，它方法工简便，效率高，制备量大，产品纯度大于95%。将丹参饮片粉碎、醇提、抽滤后的滤液减压浓缩得浓缩液；浓缩液加水，用碱调pH值至7.5，用乙醚萃取；水相用酸调pH值至3，用乙醚萃取，回收溶剂，得红色粉末状丹参粗提物；应用pH区带逆流色谱分离方法，得到丹酚酸B。本发明主要用于制备丹酚酸B。
Description
技术领域
本发明涉及逆流色谱制备分离方法，具体地说是关于应用pH区带精制逆流色谱法从丹参粗提物中分离制备丹酚酸B的方法。
背景技术
丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge.的干燥根及根茎。丹参的主要活性成分有水溶性的丹酚酸类化合物及脂溶性的丹参酮类化合物。丹酚酸是一类既有咖啡酰缩酚酸结构又有新木脂素骨架的水溶性成分，现代药理研究表明，丹酚酸类化合物具有很强的抗氧化作用，可以清除体内的超氧阴离子和羟基自由基，抑制脂质过氧化反应，改善微循环。丹酚酸类化合物中丹酚酸B是主要代表性有效成分之一，约占总酚酸的70％，是丹参水溶性有效成分中含量最高、活性最强的一种，其他丹酚酸类成分在丹参及其提取物中的含量与丹酚酸B成正相关。因此丹酚酸的制备对于丹酚酸系列药物的开发、质量控制具有重要的意义。
目前，丹酚酸类成分的分离多采用柱层析法，但操作起来十分繁琐，且分离效率不高；也有用制备型高效液相分离的，但上样量太少；高速逆流色谱是一种液液分配分离技术，它的分离原理是利用单向流体动力学平衡原理，使2个互不相溶的溶剂相在高速旋转的螺旋管中单向分布，其中一相作固定相，由恒流泵输送载有样品的流动相穿过固定相，利用样品在两相中分配系数(K)的不同实现分离。它完全排除了支撑体对样品的不可逆吸附、玷染、变性、失活等影响。其与一般色谱的分离方式不同，使其特别适用于制备性分离。《高速逆流色谱法分离制备丹酚酸B》(《天然产物研究与开发》2006年第18卷第1期第100～104页)中记载采用高速逆流色谱法分离纯化丹参水溶性成分丹酚酸类物质，制备丹酚酸B化学对照品，一次分离可制备63.4mg丹酚酸B，纯度为98％。
《pH区带逆流色谱研究进展》(《分析化学》，2004，32(4)：529-533.)中记载pH区带逆流色谱(pH-zone-refining counter-current chromatography)是利用待分离有机酸碱的酸(碱)解离常数及疏水性的不同进行分离。与普通逆流色谱相比，其突出特点是在溶剂体系的固定相中加入保留酸(或碱)，同时在流动相中加入洗脱碱(或酸)，不同物质洗脱出来时伴随着pH值的突变。该技术可以得到最小重叠的矩形峰，同时杂质被集中在峰的两侧，具有样品分离容量大、分离纯度和分离效率高等优点，目前已经成功用于多种混合物的分离，如氨基酸衍生物、肽衍生物、氧杂蒽染料、生物碱及立体异构体等。它继承了高速逆流色谱高效、固定相无污染等优点，同时具有制备量大和快速等特点，能够针对具体问题达到更优效果。
发明内容
本发明针对现有技术中的不足提出了一种从丹参提取物中快速分离纯化丹酚酸B的方法，该方法工艺简便，效率高，制备量大，产品纯度大于95％。
本方案是通过如下技术措施来实现的：将丹参饮片粉碎、醇提、抽滤后的滤液减压浓缩得浓缩液；浓缩液加水，用碱性溶液调pH值至7.5，用乙醚萃取；水相用酸性溶液调pH值至3，用乙醚萃取，回收溶剂，得红色粉末状丹参粗提物；
将由醚类和水组成的溶剂系统配置于分液漏斗中充分振摇后静置12小时，分层，上相加1-30mmol/L酸为固定相，下相加1-30mmol/L碱水为流动相，其中所加酸碱浓度相同；
采用北京新技术应用研究所生产的GS10A2型半制备型逆流色谱仪，逆流色谱仪由柱塞泵、进样阀、紫外检测仪、记录仪和色谱分离柱(由聚四氟乙烯管多层缠绕形成的螺旋管柱，容量为230mL)等组成，它的连接顺序为：柱塞泵→进样阀→色谱分离柱→紫外检测仪→记录仪。首先使进样阀处于进样状态，将固定相用泵以一定流速灌满半制备型逆流色谱仪的色谱分离柱，开启速度控制器，使半制备型逆流色谱仪的色谱分离柱正转，转速达800r/min时，称取一定量丹参粗提物放入固定相溶解，用注射器注入逆流色谱仪进样阀的贮液管中，旋转进样阀为接柱状态，使样品进入色谱分离柱。设置流动相流速为2.0mL/min，开始泵流动相；
根据检测器紫外光谱图，对分离的每个峰都进行收集，得到丹酚酸B。
本方案的有益效果可根据对上述方案的叙述得知，由于采用pH区带逆流色谱分离制备丹酚酸B，制备量是普通逆流色谱制备量的8倍，纯度在95％以上，具有分离量达到克量级、分离时间短、样品无损失、回收率高、分离环境缓和、节约溶剂等特点。因此本发明与现有技术相比，实现了技术目的。
本方案的具体特点还有，所述溶剂系统中醚类和水的用量体积比为0.1～1∶1。所述醚类为叔丁基甲醚、乙醚之一。所述固定相中的酸为三氟乙酸，所述流动相中的碱为氨水。所述醇提为用70-95％乙醇回流提取4次，每次1小时。所述水相中用于调PH值的酸性溶液为1mol/L的盐酸、1mol/L的硫酸之一。所述调PH值的碱性溶液为碳酸氢钠溶液、1mol/L氢氧化钠溶液之一。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步详细的描述。
图1实施例1丹参提取物的pH区带逆流色谱分离的色谱图A：丹酚酸B；溶剂系统：叔丁基甲醚∶水＝1∶1；酸碱浓度10mmol/L；上样量2.0g；A为丹酚酸B，纯度95.8％
图2实施例2丹参提取物的pH区带逆流色谱分离的色谱图A：丹酚酸B；溶剂系统：叔丁基甲醚∶水＝1∶1；酸碱浓度20mmol/L；上样量2.0g；A为丹酚酸B，纯度95.5％
图3实施例3丹参提取物的pH区带逆流色谱分离的色谱图A：丹酚酸B；溶剂系统：乙醚∶水＝1∶1；酸碱浓度10mmol/L；上样量0.5g；A为丹酚酸B，纯度96.6％
具体实施方式
实施例1：取丹参饮片2200g粉碎后用95％乙醇回流提取4次(每次1h)，抽滤，滤液减压浓缩，得浓缩液。浓缩液加一倍量水，用碳酸氢钠溶液调pH至7.5，乙醚萃取。水相用1mol/L的盐酸调pH值至3，用乙醚萃取，回收乙醚，得红色粉末状丹参粗提物57.19g。此粗提物用本发明的方法分离制备丹酚酸B。
采用半制备型逆流色谱仪，溶剂选用叔丁基甲醚和水体系从丹参粗提物中分离制备丹酚酸B。首先以1∶1的体积比将上述溶剂体系配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层，待平衡一段时间后将上下两相分开，取上相为固定相，向其中加入10mmol/L三氟乙酸；下相为流动相，加入10mmol/L氨水。采用北京新技术应用研究所生产的GS10A2型半制备型逆流色谱仪，它是由柱塞泵、进样阀、紫外检测仪、记录仪和色谱分离柱(由聚四氟乙烯管多层缠绕形成的螺旋管柱，容量为230mL)等组成，首先使进样阀处于进样状态，将固定相用泵以一定流速灌满色谱分离柱，开启速度控制器，使半制备型逆流色谱仪的色谱分离柱正转，转速达800r/min时，称取2g丹参提取物溶解于25mL固定相中，用注射器注入逆流色谱仪进样阀的贮液管中，旋转进样阀为接柱状态，使样品进入色谱分离柱。设置流动相流速为2.0mL/min，开始泵流动相；然后根据检测器紫外光谱图(图1)接收丹酚酸B，重量为524.2mg，产品纯度为96.8％。
利用HPLC分析分离物。HPLC条件：岛津Shim pack VP-ODS柱(4.6mm×250mm)，柱温25℃，流速：1.0ml/min，进样量：5μL，流动相：甲醇∶5％乙酸＝35∶65，检测波长281nm。
实施例2：取丹参饮片1000g粉碎后用80％乙醇回流提取4次(每次1h)，抽滤，滤液减压浓缩，得浓缩液。浓缩液加一倍量水，用1mol/L的氢氧化钠溶液调pH至7.5，乙醚萃取。水相用1mol/L的稀硫酸液调pH值至3，用乙醚萃取，回收乙醚，得红色粉末状丹参粗提物25.52g。此粗提物用本发明的方法分离制备丹酚酸B。采用半制备型逆流色谱仪，溶剂选用叔丁基甲醚和水体系从丹参粗提物中分离制备丹酚酸B。首先以1∶1的体积比将上述溶剂体系配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层，待平衡一段时间后将上下两相分开，取上相为固定相，向其中加入20mmol/L三氟乙酸；下相为流动相，加入20mmol/L氨水。采用北京新技术应用研究所生产的GS10A2型半制备型逆流色谱仪，它是由柱塞泵、进样阀、紫外检测仪、记录仪和色谱分离柱(由聚四氟乙烯管多层缠绕形成的螺旋管柱，容量为230mL)等组成，首先使进样阀处于进样状态，将固定相用泵以一定流速灌满色谱分离柱，开启速度控制器，使半制备型逆流色谱仪的色谱分离柱正转，转速达800r/min时，称取2g丹参提取物溶解于30mL固定相中，用注射器注入逆流色谱仪进样阀的贮液管中，旋转进样阀为接柱状态，使样品进入色谱分离柱。设置流动相流速为2.0mL/min，开始泵流动相；然后根据检测器紫外光谱图(图2)接收丹酚酸B，重量为516mg，，经HPLC测定，产品纯度为96.5％。
实施例3：取丹参饮片1000g粉碎后用70％乙醇回流提取4次(每次1h)，抽滤，滤液减压浓缩，得浓缩液。浓缩液加一倍量水，用碳酸氢钠溶液调pH至7.5，乙醚萃取。水相用1mol/L的盐酸调pH值至3，用乙醚萃取，回收乙醚，得红色粉末状丹参粗提物23.13g。采用半制备型逆流色谱仪，溶剂选用乙醚和水体系从丹参粗提物中分离制备丹酚酸B。首先以1∶2的体积比将上述溶剂体系配置于分液漏斗中，摇匀后静置分层，待平衡一段时间后将上下两相分开，取上相为固定相，向其中加入5mmol/L三氟乙酸；下相为流动相，加入5mmol/L氨水。采用北京新技术应用研究所生产的GS10A2型半制备型逆流色谱仪，它是由柱塞泵、进样阀、紫外检测仪、记录仪和色谱分离柱(由聚四氟乙烯管多层缠绕形成的螺旋管柱，容量为230mL)等组成，首先使进样阀处于进样状态，将固定相用泵以一定流速灌满色谱分离柱，开启速度控制器，使半制备型逆流色谱仪的色谱分离柱正转，转速达800r/min时，称取0.5g丹参提取物溶解于10mL固定相中，用注射器注入逆流色谱仪进样阀的贮液管中，旋转进样阀为接柱状态，使样品进入色谱分离柱。设置流动相流速为2.0mL/min，开始泵流动相；然后根据检测器紫外光谱图(图3)接收丹酚酸B，重量为130mg，经HPLC测定，产品纯度为95.6％。
虽然本发明已经通过选用的实施例及其附图进行描述并完全公开，但是对本领域技术人员来说，在不超出本发明实质的情况下，任何改变和变化都属于本发明的范围。
Claims (7)
1. 一种丹酚酸B的分离制备方法，其特征是将丹参饮片粉碎、醇提、抽滤后的滤液减压浓缩得浓缩液；
浓缩液加水，用碱性溶液调pH值至7.5，用乙醚萃取；水相用酸性溶液调pH值至3，用乙醚萃取，回收溶剂，得红色粉末状丹参粗提物；
将由醚类和水组成的溶剂系统配置于分液漏斗中充分振摇后静置12小时，分层，上相加1-30mmol/L酸为固定相，下相加1-30mmol/L碱水为流动相，其中所加酸碱浓度相同；
首先使进样阀处于进样状态，将固定相用泵以一定流速灌满半制备型逆流色谱仪的色谱分离柱，开启速度控制器，使半制备型逆流色谱仪的色谱分离柱正转，转速达800r/min时，称取一定量丹参粗提物放入固定相溶解，用注射器注入逆流色谱仪进样阀的贮液管中，旋转进样阀为接柱状态，使样品进入色谱分离柱，设置流动相流速为2.0mL/min，开始泵流动相；
根据检测器紫外光谱图，对分离的每个峰都进行收集，得到丹酚酸B。
2. 根据权利要求1所述的丹酚酸B的分离制备方法，其特征是所述溶剂系统中醚类和水的用量体积比为0.1～1∶1。
3. 根据权利要求2所述的丹酚酸B的分离制备方法，其特征是所述醚类为叔丁基甲醚或者乙醚。
4. 根据权利要求1或2所述的丹酚酸B的分离制备方法，其特征是所述固定相中的酸为三氟乙酸，所述流动相中的碱为氨水。
5. 根据权利要求1所述的丹酚酸B的分离制备方法，其特征是所述醇提为用70-95％乙醇回流提取4次，每次1小时。
6. 根据权利要求1所述的丹酚酸B的分离制备方法，其特征是所述水相中用于调PH值的酸性溶液为1mol/L的盐酸、1mol/L的硫酸之一。
7. 根据权利要求1所述的丹酚酸B的分离制备方法，其特征是所述调PH值的碱性溶液为碳酸氢钠溶液、1mol/L氢氧化钠溶液之一。
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