CN100402049C - 一种治疗疱疹病毒引起的疾病的中药药物组合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种治疗单纯性疱疹-1、单纯性疱疹病毒-11和水痘-带状疱疹病毒引起的疾病的中药复方药物，它是由繁缕、金银花、冰片组成的。该药物对上述三种病毒引发的皮肤感染性疾病疗效与阿昔洛韦相似，但无阿昔洛韦引起的不良反应如：头痛、恶心、腹泻等，且有止痛、消炎作用。本发明药品有喷雾剂及软膏剂等多种剂型；其质量可控，检测方法专属性强；资源丰富、价格低廉；生产中不产生工业污染，有广阔的开发前景。
Description
本发明涉及一种治疗疱疹病毒引起的疾病的中药药物组合物，以及该中药药物组合物的制备方法。
带状疱疹中医称蛇串疮，缠腰火丹，单纯疱疹中医称“热疱”，其病因为肺脾湿热内蕴，心肝之火上炎，外受毒邪而致。现代医学认为其发病是由水痘-带状疱疹和人类疱疹病毒(I、II型)引起。据不完全统计，全国每年有千万人发病，特别是在老人，体弱及机体免疫功能低下人群中较多，如：肿瘤化学放疗病人、吸毒者、艾滋病人、外伤及手术病人等，皮疹出现时的疼痛及疹后神经痛，反射交感性营养不良等。给病人带来很大痛苦，同时还会造成神经系统潜伏感染，极少数甚至可感染中枢神经，引起疱疹病毒脑炎。
目前，临床上主要选用无环鸟苷类药物(阿昔洛韦、法昔洛韦、缬昔洛韦等)进行治疗，该类药物均为仿制国外药品，其抗疱疹作用明确，疗效较好，但止痛作用欠佳，有些患者使用后出现不良反应如：头痛、恶心、腹泻、怠倦等，对肝、肾功能也有影响，且对疹后神经痛也无作用。近年来，国内从中草药中筛选发现金银花、蒲公英、空心草等几十种植物具有体外抑制疱疹病毒作用，但迄今为止国内尚无一种治疗疱疹病毒引发的疱疹性疾病的中药新药问世。所以，目前有疗效确切使用方便的抗疱疹的中草药新药的需求。
本发明的目的就是提供一种治疗疱疹的中药药物组合物。
本发明的另一目的是提供该中药药物组合物的制备方法。
本发明的又一个目的是提供该中药药物组合物的质量控制方法。
本发明治疗疱疹的中药药物组合物是由繁缕、金银花和冰片作为制备活性成分的原料。它们的重量配比为5-30∶10-60∶1-4，优选重量配比为5∶25∶1。该中药药物组合物的药物剂型为喷雾剂、凝胶剂、软膏剂、乳膏剂，搽剂、糊剂、膜剂、栓剂或滴眼液。
本发明的中药药物组合物是根据民间验方，参考现代实验研究，选择繁缕、金银花、冰片等进行体外细胞病毒试验和对多种疱疹病毒抑制试验，经过一系列试验研究并遵循“外科之证，最重外治”的原则，遂确定组方及用法。繁缕为民间草药，历代本草及书籍多处记载有治疗恶疮、皮肤病的。经体外试验，证明其细胞毒性低，有明显抑制疱疹病毒作用，且资源丰富，价格低廉，故选繁缕为君药。金银花性甘，味寒，有“入内逐热”之功效，长于清热，故消火之毒，用之。现代医学研究也证明金银花水煎剂对带状疱疹病毒有抑制作用，金银花中的绿原酸有治疗皮肤病的报道，故选金银花为臣药。冰片为常用外用药，有散郁止痛，止痒生肌的作用，文献也有用于缠腰火丹，热疮的记载，故以冰片为佐使药。三药配伍，共奏清热解毒、消炎止痛之功效。
该中药药物组合物的制备方法可以采用制剂学上的常规提取方法如水煮醇沉法或醇提水沉法等，优选采用下列方法：取繁缕与金银花适量，加10倍量稀乙醇，回流提取3次，每次1小时，合并醇提取液，滤过，滤液回收乙醇，浓缩至适量冷藏备用；另取羧甲基纤维素30克与琼脂，加适量水和甘油，室温溶胀，加热至50℃，搅拌30分钟，然后与上述提取液混合均匀；再取冰片、羟苯乙酯，溶于适量乙醇中，加入上述药物与基质混合物，加水适量搅拌均匀，即得。
本发明所述的中药药物组合物的质量控制方法包括下列三种方法，它们的步骤分别是：
取本品0.5g，以甲醇15ml，超声提取30分钟，滤过，滤液作为供试品溶液，另取对照药材繁缕0.2g，同法制备对照药材溶液，并且将新西兰牡荆甙-1对照品配成0.1mg/ml对照薄层分析试液，分别吸取上述三种溶液2μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以甲醇-水(2∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2％三氯化铝乙醇液，热风吹干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱在与对照药材色谱相应的位置上，应显相同颜色的荧光斑点。
取本品0.5g，加石油醚(60～90℃)25ml，超声处理30分钟，滤过，滤液挥干溶剂，残渣加醋酸乙酯2ml使溶解，作为供试品溶液。另取冰片对照品以乙酸乙酯使溶解，制成每1ml含0.4mg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述两种溶液5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(5∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2％香草醛浓硫酸溶液，加热至斑点清晰。供试品色谱在与对照品色谱相应的位置上，应显相同颜色的斑点。
所述的的中药药物组合物质量方法，它包括下列步骤：采用乙氰-0.3％冰醋酸为流动相，以ODS柱分离测定氯原酸的含量。含量应不低于0.21％。
本发明中药药物组合物对豚鼠的皮肤感染单纯疱疹病毒I型治疗试验与病毒对照组比较，治疗组第2天，豚鼠的皮肤疱疹已有所减轻；第3天皮肤疱疹的病变程度已由3.6cm2缩小到2.2cm2左右；第4天疱疹病灶开始干瘪，出现结痂；第6天疱疹病灶部位已全部结痂，病变程度(面积)已缩小到0.6cm2；第8天缩小到0.2cm2(其对疱疹的抑制率为90％)。而病毒对照组试验第5～7天，已发展到4.0cm2，第8天虽有缩小，但病程时间延长。本品阳性对照药物阿昔洛韦药膏的对比试验，两者结果相似。
本发明中药药物组合物的体外抗水痘-带状疱疹和体内抗单纯疱疹I型，II型病毒药效试验，证明本品具有抗单纯疱疹病毒I型，II型和水痘-带状疱疹病毒作用。本品尚有显著地抑制二甲苯致小鼠耳肿胀和减轻大鼠足跖，注入甲醛致炎所发生的肿胀，显示其有一定的抗炎作用。本发明药品对0.7％醋酸所致小鼠痛反应有一定的止痛作用，和用热板法试验，显示本品有明显的镇痛作用。
本发明中药药物组合物的安全性研究：
本中药药物组合物经毒理学研究，用生药材含量大于临床制剂5、10、20倍的剂量做急性毒性试验，未发现任何急性毒性反应和死亡。1次或多次给药豚鼠，对正常和破损皮肤均不发生任何刺激反应。动物皮肤重复接触受试药，也未发生任何全身反应和皮肤过敏反应。以每只4ml/次给药，1日1次给兔子涂抹给药1个月，在给药前、给药1个月或停药后两周三个时间点，以血液学、血清生化10项，心电图及脏器病理学变化为指标，观察经皮渗透对局部和全身产生的毒性反应和反应恢复的程度。结果显示整个给药过程中，涂抹给药的局部皮肤，未出现任何异常反应，动物行为、运动、精神状态无异常表现。摄食，二便正常，无死亡，血液学各项指标，血清10项生化指标、心率及心电图均属正常范围；各组动物各脏器外观均未发现肉眼可见的病理变化，主要脏器系数各组间无显著差异，病理组织学检查，结果表示各组动物心、肝、脾、肺、肾等脏器未见由药物积蓄性及迟缓性中毒所引起的病理变化。根据以上结果显示：本发明药品的使用是安全的。
实施例1：银冰疱疹宁凝胶的制备
a)称取金银花250g、繁缕50g和冰片10g；
b)将金银花与繁缕，加40％的乙醇1000ml，回流提取3次，每次1小时，合并醇提取液，滤过，滤液回收乙醇，浓缩至40℃测定相对密度为1.17-1.19，高速离心，上清液冷藏备用；另取羧甲基纤维素30克与琼脂适量，加适量水和100g甘油，室温溶胀4小时，加热至50℃，搅拌30分钟，然后与上述提取液混合均匀；再取冰片10g、羟苯乙酯1g，溶于适量乙醇中，加入上述药物与基质混合物，加水适量搅拌均匀，即得银冰疱疹宁凝胶。
以下通过银冰疱疹宁凝胶在细胞培养内对HSV-I、HSV-II和VZV病毒的抑制试验对本发明中药药物组合物的功效加以说明。
在非洲绿猴肾细胞(VERO)和人胚肺二倍体细胞(2BS)培养内，检测银冰疱疹宁凝胶抗水痘-带状疱疹病毒(VZV)和单纯疱疹病毒I型、II型(HSV-I、HSV-II)的作用。证明该药具有体外抗上述三种病毒的作用。
采用病毒细胞病变(CPE)法和噻唑蓝(MTT)染色法进行试验，计算半数抑制浓度(IC50)及治疗指数(TI)。试验分一次给药组和三次给药组，并重复三次。
1.1试验
1.1.1一次给药组
①病毒CPE法：
VERO细胞和2BS细胞以40万/ml浓度接种96孔培养板，37℃培养24小时，分别加入HSV-I、HSV-II和VZV病毒的10-100TCID50的病毒液，每孔100μl，37℃吸附1小时，弃掉病毒液。加入药液，均以药物的最大无毒浓度二倍稀释10个浓度，每浓度4孔，每孔100μl。即繁缕总黄酮为5000μg/ml、2500μg/ml、1250μg/ml、625μg/ml、312.5μg/ml、156.2μg/ml、78.1μg/ml、39.1μg/ml、19.5μg/ml、9.8μg/ml。无环鸟苷为2500μg/ml、1250μg/ml、625μg/ml、312.5μg/ml、156.3μg/ml、78.1μg/ml、39.1μg/ml、19.5μg/ml、9.8μg/ml、4.9μg/ml。同时设病毒对照和正常细胞对照，37℃、5％CO2培养5-7天，每24小时倒置显微镜下观察病毒CPE，至病毒对照细胞病变(CPE)出现“+++-++++”，计算IC50。
②病毒MTT染色法：
观察细胞病变CPE结果后，加入MTT染色液每孔10μl，置37℃培养4小时，然后加入10％SDS 100μl使细胞裂解，裂解后用酶标仪波长570nm测定，记录OD值，计算IC50。
1.1.2三次给药组
三次给药组方法同一次给药组。三次给药组每24小时将旧药液弃掉，重新加入同浓度药液，病毒对照和细胞对照换维持液，连续三天。
1.2实验结果
1.2.1预备试验结果
药物细胞的毒性作用：
银冰疱疹宁凝胶和阳性对照药物无环鸟苷，在VERO细胞和2BS细胞培养内比较其对细胞的毒性结果见附表2.及附照1～14。银冰疱疹宁凝胶对VERO细胞的毒性结果
验证药物：银冰疱疹宁凝胶CPE法：最大无毒浓度(TD0)为＞3850μg/ml，半数中毒浓度(TD50)为＞3850μg/ml。MTT法最大无毒浓度(TD0)为＞3850μg/ml，半数中毒浓度(TD50)为＞3850μg/ml。
阳性对照药物：无环鸟苷CPE法最大无毒浓度(TD0)为2500μg/ml，半数中毒浓度(TD50)为3963μg/ml。MTT法最大无毒浓度(TD0)为2500μg/ml，半数中毒浓度(TD50)为4220μg/ml。
银冰疱疹宁凝胶对2BS细胞的毒性结果
验证药物：银冰疱疹宁凝胶CPE法最大无毒浓度(TD0)为1925μg/ml，半数中毒浓度(TD50)为2716μg/ml。MTT法最大无毒浓度(TD0)为1925μg/ml，半数中毒浓度(TD50)为3188μg/ml。
阳性对照药物：无环鸟苷CPE法最大无毒浓度(TD0)为2500μg/ml，半数中毒浓度(TD50)为3963μg/ml。MTT法最大无毒浓度(TD0)为2500μg/ml，半数中毒浓度(TD50)为4278μg/ml。
在VERO和2BS细胞培养内测定HSV-I、HSV-II和VZV病毒半数感染量(TCID50)，采用病毒细胞病变CPE法
①HSV-I病毒：半数感染量(TCID50)为10-7
②HSV-II病毒：半数感染量(TCID50)为10-7
③VZV病毒：半数感染量(TCID50)为10-3
1.2.2正式试验结果(见附表3)
本发明所述的银冰疱疹宁凝胶和无环鸟苷在VERO和2BS细胞培养内对HSV-I、HSV-II型和VZV病毒的抑制作用。
1.2.2.1银冰疱疹宁凝胶对HSV-I型病毒的抑制作用
①一次给药组：
验证药物：银冰疱疹宁凝胶CPE法，药物半数有效浓度(IC50)为9.4μg/ml，最小有效浓度(MIC)为15.1μg/ml，治疗指数(TI)为＞409.6μg/ml。MTT法药物半数有效浓度(IC50)为9.8μg/ml，最小有效浓度(MIC)为15.1μg/ml，治疗指数(TI)为＞392.91μg/ml。
阳性对照药物：无环鸟苷CPE法，药物半数有效浓度(IC50)为＜4.9μg/ml，最小有效浓度(MIC)为4.9μg/ml，治疗指数(TI)为＞808.8。MTT法药物半数有效浓度(IC50)为＜4.9μg/ml，最小有效浓度(MIC)为＜4.9μg/ml，治疗指数(TI)为＞861.2。
②三次给药组：
验证药物：银冰疱疹宁凝胶CPE法：药物半数有效浓度(IC50)为9.4μg/ml，最小有效浓度(MIC)为15.1μg/ml，治疗指数(TI)为＞409.6。MTT法药物半数有效浓度(IC50)为9.5μg/ml，最小有效浓度(MIC)为15.1μg/ml，治疗指数(TI)为＞406.7。
阳性对照药物：无环鸟苷CPE法，药物半数有效浓度(IC50)为＜4.9μg/ml，最小有效浓度(MIC)为4.9μg/ml，治疗指数(TI)为＞808.8。MTT法药物半数有效浓度(IC50为＜4.9μg/ml，最小有效浓度(MIC)为4.9μg/ml，治疗指数(TI)为＞861.2。
1.2.2.2银冰疱疹宁凝胶对HSV-II型病毒的抑制作用
①一次给药组：
验证药物：银冰疱疹宁凝胶CPE法，药物半数有效浓度(IC50)为19.0μg/ml，最小有效浓度(MIC)为30.1μg/ml，治疗指数(TI)为＞202.6。MTT法药物半数有效浓度(IC50)为20.7μg/ml，最小有效浓度(MIC)为30.1μg/ml，治疗指数(TI)为＞186.5。
阳性对照药物：无环鸟苷CPE法，药物半数有效浓度(IC50)为6.2μg/ml，最小有效浓度(MIC)为9.8μg/ml，治疗指数(TI)为639.2。MTT法药物半数有效浓度(IC50)为7.1μg/ml，最小有效浓度(MIC)为9.8μg/ml，治疗指数(TI)为594.4。
②三次给药组：
验证药物：银冰疱疹宁凝胶CPE法，药物半数有效浓度(IC50)为19.0μg/ml，最小有效浓度(MIC)为30.1μg/ml，治疗指数(TI)为＞202.6。MTT法药物半数有效浓度(IC50)为21.3μg/ml，最小有效浓度(MIC)为30.1g/ml，治疗指数(TI)为＞180.6。
阳性对照药物：无环鸟苷CPE法，药物半数有效浓度(IC50)为＜6.2μg/ml，最小有效浓度(MIC)为9.8μg/ml，治疗指数(TI)为639.2。MTT法药物半数有效浓度(IC50)为＜6.9g/ml，最小有效浓度(MIC)为9.8μg/ml，治疗指数(TI)为614.6。
1.2.2.3银冰疱疹宁凝胶对VZV病毒的抑制作用
①一次给药组：
验证药物：银冰疱疹宁凝胶CPE法，药物半数有效浓度(IC50)为＜15.1μg/ml，最小有效浓度(MIC)为15.1μg/ml，治疗指数(TI)为＞181.1。MTT法药物半数有效浓度(IC50)为＜15.1g/ml，最小有效浓度(MIC)为15.1μg/ml，治疗指数(TI)为＞212.6。
阳性对照药物：无环鸟苷CPE法，药物半数有效浓度(IC50)为＜4.9μg/ml，最小有效浓度(MIC)为4.9μg/ml，治疗指数(TI)为＞808.8。MTT法药物半数有效浓度(IC50)为＜4.9g/ml，最小有效浓度(MIC)为4.9μg/ml，治疗指数(TI)为＞873.1。
②三次给药组：
验证药物：银冰疱疹宁凝胶CPE法，药物半数有效浓度(IC50)为＜15.1μg/ml，最小有效浓度(MIC)为15.1μg/ml，治疗指数(TI)为＞181.1。MTT法药物半数有效浓度(IC50)为＜15.1μg/ml，最小有效浓度(MIC)为15.1μg/ml，治疗指数(TI)为＞212.6。
阳性对照药物：无环鸟苷CPE法，药物半数有效浓度(IC50)为＜4.9g/ml，最小有效浓度(MIC)为4.9g/ml，治疗指数(TI)为＞808.8。MTT法药物半数有效浓度(IC50)为＜4.9μg/ml，最小有效浓度(MIC)为4.9μg/ml，治疗指数(TI)为＞873.1。
1.3小结：以上试验结果表明银冰疱疹宁凝胶在体外抗病毒药效试验(细胞培养内)中，采用病毒细胞病变CPE法和MTT法，证明银冰疱疹宁凝胶具有抗单纯疱疹病毒I、II型和水痘-带状疱疹病毒的作用。
Claims (6)
1.治疗疱疹的中药药物组合物，其特征在于活性成分是由下列重量配比用量的原料制成：繁缕5、金银花25和冰片1。
2.一种如权利要求1所述的治疗疱疹的中药药物组合物的制备方法，其特征在于：将金银花、繁缕合并或二者分别加10倍量15～70％乙醇回流提取2～3次，提取液滤过，合并滤液回收乙醇、浓缩至适量，加入羧甲基纤维素、乙醇、甘油、羟苯乙酯、冰片，混匀调制。
3.如权利要求1所述的治疗疱疹的中药药物组合物，药物剂型为喷雾剂、凝胶剂、软膏剂、乳膏剂，搽剂、糊剂、膜剂、栓剂或滴眼液。
4.一种如权利要求1所述的中药药物组合物的质量控制方法，它包括下列步骤：
取凝胶剂样品适量，以甲醇超声提取，滤过，滤液作为供试品溶液，另取对照药材繁缕0.2g，同法制备对照药材溶液，将新西兰牡荆甙-1对照品配成0.1mg/ml对照薄层分析试液，分别吸取上述三种溶液，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以2∶1的甲醇-水为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％三氯化铝乙醇液，热风吹干，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱在与对照药材色谱相应的位置上，应显相同颜色的荧光斑点。
5.一种如权利要求1所述的中药药物组合物的质量控制方法，它包括下列步骤：取凝胶剂0.5g，加60～90℃的石油醚25ml，超声处理30分钟，滤过，滤液挥干溶剂，残渣加醋酸乙酯2ml使溶解，作为供试品溶液；另取冰片对照品以乙酸乙酯使溶解，制成每1ml含0.4mg的溶液，作为对照品溶液；吸取上述两种溶液5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以5∶1的60～90℃的石油醚-乙酸乙酯为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2％香草醛浓硫酸溶液，加热至斑点清晰；供试品色谱在与对照品色谱相应的位置上，应显相同颜色的斑点。
6.一种如权利要求1所述的中药药物组合物的质量控制方法，它包括下列步骤：采用乙氰-0.3％冰醋酸为流动相，以ODS柱分离测定氯原酸的含量；含量应不低于0.21％。
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| PB01 | Publication | ||
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Owner name: HAINAN ASIAPHARM CO., LTD. Free format text: FORMER NAME: ASIA PHARMACY CO LTD, HAINAN |
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Address after: 570102 commercial building, Haikou, Hainan Province, 12 Patentee after: HAINAN ASIA PHARMACEUTICAL Co.,Ltd. Address before: 570102 commercial building, Haikou, Hainan Province, 12 Patentee before: Asia Pharmaceutical Group (Hainan) |
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Granted publication date: 20080716 Termination date: 20220130 |
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