CN100393744C

CN100393744C - 水稻茎杆伸长基因及其编码蛋白和用途

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Publication number: CN100393744C
Application number: CNB031293298A
Authority: CN
Inventors: 何祖华; 李群; 许永汉; 朱永友; 林鸿宣; 周海臣; 毛碧增
Original assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Current assignee: Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Priority date: 2003-06-18
Filing date: 2003-06-18
Publication date: 2008-06-11
Anticipated expiration: 2023-06-18
Also published as: CN1566146A

Abstract

本发明提供了一种新的植物基因-水稻茎杆伸长基因，及其编码蛋白和启动子。本发明还公开了编码这种茎杆伸长基因的的用途，尤其是在植物生长改良和杂交育种中用于改变植物的茎杆伸长性和抗衰老性。

Description

水稻茎杆伸长基因及其编码蛋白和用途

技术领域

本发明属于植物学领域，具体地说，本发明涉及新的水稻(Oryza sativa)茎杆伸长基因，及其编码蛋白和启动子。本发明还公开了编码这种茎杆伸长基因的的用途，尤其是在植物生长改良和杂交育种中用于改变植物的茎杆伸长性和抗衰老性。

背景技术

植物的快速生长对于作物、林业生产和抵抗不良气候条件包括干旱缺水、洪涝、低温等有着十分重要的作用，同时也是研究植物细胞分化、激素调控、分子生理的良好模式。

然而，目前尚没有公开过与植物快速生长有关基因。因此，为了有效地、针对性地改变植物品种的快速生长性，本领域迫切需要开发与快速生长性有关的蛋白及其编码基因。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种新的茎杆伸长蛋白(即水稻茎杆伸长蛋白)及其片段、类似物和衍生物。

本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。

本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用途，尤其是在改变植物快速生长性(如花期延长或果实成熟延缓)方面的用途。

在本发明的第一方面，提供新颖的分离出的水稻茎杆伸长蛋白，该多肽源自水稻，它包含：具有SEQ ID NO：3氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。较佳地，该多肽选自下组：(a)具有SEQ ID NO：3氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO：3氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有促进植物茎杆伸长功能的由(a)衍生的多肽。

在本发明的第二方面，提供编码分离的这些多肽的多核苷酸，该多核苷酸包含一核苷酸序列，该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少70％相同性：(a)编码上述水稻茎杆伸长蛋白的多核苷酸；和(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。较佳地，该多核苷酸编码具有SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的多肽。更佳地，该多核苷酸的序列是选自下组的一种：

(a)具有SEQ ID NO：1中1-5900位的序列；

(b)SEQ ID NO：1缺失了第2927-3169位或3153-3157位所形成的序列；；

(c)具有SEQ ID NO：2中1-2172位的序列。

在本发明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的载体，以及被该载体转化或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。

在本发明的第四方面，提供了制备水稻茎杆伸长蛋白的方法，该方法包含：(a)在适合表达的条件下，培养上述被转化或转导的宿主细胞；(b)从培养物中分离出水稻茎杆伸长蛋白。

在本发明的第五方面，提供了与上述的水稻茎杆伸长蛋白特异性结合的抗体。还提供了可用于检测的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中连续的10-2226个核苷酸。

在本发明的第六方面，提供了抗本发明蛋白的抗体以及一种检测样品中是否存在水稻茎杆伸长蛋白的方法，它包括：将样品与水稻茎杆伸长蛋白的特异性抗体接触，观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在水稻茎杆伸长蛋白。

在本发明的第七方面，提供了一种改变植物快速生长性和或抗衰老性的方法，它包括步骤：

(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有水稻茎杆伸长蛋白DNA编码序列，所述的水稻茎杆伸长蛋白选自下组：

(a)具有SEQ ID NO：3氨基酸序列的多肽；

(b)将SEQ ID NO：3氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有促进植物茎杆伸长功能的由(a)衍生的多肽；

(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使水稻茎杆伸长蛋白DNA编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；

(3)选择出转入水稻茎杆伸长蛋白DNA编码序列的植物细胞或组织或器官；

(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织或器官再生成植株。

本发明的其它方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1显示了Eui及其突变体(eui)控制植物茎杆的生长和发育。

图2显示了eui可消除水稻不育系的包颈。

图3显示了Eui基因控制节间分生组织的细胞分裂。

图4显示了eui基因可产生或积累更多的赤霉素(简写为GA或GA3)。

图5显示了在不同GA3浓度处理下幼苗高度，上方曲线是带突变基因eui植株的高度，下方曲线是野生型Eui基因植株的高度。

图6显示了在不同GA3浓度处理下抽穗期植株高度，上方曲线是带突变基因eui植株的高度，下方曲线是野生型Eui基因植株的高度。图5和6表明Eui控制了植株对GA3的敏感性。

图7显示了eui植株有抗衰老功能。

图8显示了Eui转基因eui突变植物回复正常伸长。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次从水稻(Oryza sativa.L)中获得了一个第一节间快速发育和高度伸长的突变体eui(Elongated upper mostinternode)，该突变体表现为单基因隐性遗传，在抽穗期第一节间能快速伸长，并对GA3高度敏感，在逆境情况下的伸长更为迅速，该基因前期已被初步定位于水稻第五染色体的长臂端。并被认为是水稻杂交育种的第四因子。本发明人利用图位克隆的方法精细定位和克隆了该功能基因，结果表明Eui编码一个调节植物激素和细胞生长的关键酶蛋白。将该eui基因导入籼稻，可改良各类杂交稻不育系包颈性状。这表明，本发明基因可应用于植物的快速生长、抗衰老、新型植物类型的转基因创造和杂交稻品种的分子育种。

在本发明中，术语“水稻茎杆伸长蛋白”、“水稻茎杆伸长多肽”、“Eui蛋白”、“Eui多肽”等可互换使用，都指具有水稻茎杆伸长蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO：3)的蛋白或多肽。

在本发明中，术语“突变型水稻茎杆伸长蛋白”、“水稻长节间蛋白”、“突变型水稻茎杆伸长多肽”、“eui蛋白”、“eui多肽”等可互换使用，都指具有突变型水稻茎杆伸长蛋白氨基酸序列。eui蛋白不具有Eui蛋白相应活性或者活性丧失。在本发明中，“本发明蛋白或多肽”包括“Eui蛋白”和“eui蛋白”；“本发明基因”指编码“Eui蛋白”和“eui蛋白”的多核苷酸。

在未特别指出时，术语“茎杆伸长蛋白”包括突变型和野生型茎杆伸长蛋白。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的水稻茎杆伸长蛋白或多肽”是指水稻茎杆伸长蛋白基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化水稻茎杆伸长蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

本发明还包括水稻茎杆伸长蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然水稻茎杆伸长蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，术语“水稻茎杆伸长蛋白”指具有水稻茎杆伸长蛋白活性的SEQ ID NO.3序列的多肽。该术语还包括具有与水稻茎杆伸长蛋白相同功能的、SEQ ID NO.3序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括水稻茎杆伸长蛋白的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与水稻茎杆伸长蛋白DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗水稻茎杆伸长蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含水稻茎杆伸长蛋白或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了水稻茎杆伸长蛋白的可溶性片段。通常，该片段具有水稻茎杆伸长蛋白序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

发明还提供水稻茎杆伸长蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然水稻茎杆伸长蛋白的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。

修饰(通常不改变一级结构)形式包括：体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。

在本发明中，“水稻茎杆伸长蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID NO：3的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO：3的蛋白质，但与SEQ ID NO：1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO：3的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO：3所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码水稻茎杆伸长蛋白的多聚核苷酸。

本发明的水稻茎杆伸长蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或水稻茎杆伸长蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。

通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的水稻茎杆伸长蛋白。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码水稻茎杆伸长蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，水稻茎杆伸长蛋白多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含水稻茎杆伸长蛋白编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得快速生长性/抗衰老性改变的植物。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

重组的水稻茎杆伸长蛋白或多肽有多方面的用途。例如用于筛选促进或对抗水稻茎杆伸长蛋白功能的抗体、多肽或其它配体。用表达的重组水稻茎杆伸长蛋白筛选多肽库可用于寻找有价值的能抑制或刺激水稻茎杆伸长蛋白功能的多肽分子。

另一方面，本发明还包括对水稻茎杆伸长蛋白DNA或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段、或嵌合抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的水稻茎杆伸长蛋白基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达水稻茎杆伸长蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备。本发明的各类抗体可以利用水稻茎杆伸长蛋白基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与水稻茎杆伸长蛋白基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。抗水稻茎杆伸长蛋白的抗体可用于检测样品中的水稻茎杆伸长蛋白。

本发明还涉及定量和定位检测水稻茎杆伸长蛋白水平的测试方法。这些试验是本领域所熟知的，且包括FISH测定和放射免疫测定。试验中所检测的水稻茎杆伸长蛋白水平，可用于解释水稻茎杆伸长蛋白在快速生长性和抑制伸长方面重要性。

一种检测检测样品中是否存在水稻茎杆伸长蛋白的方法是利用水稻茎杆伸长蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与水稻茎杆伸长蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在水稻茎杆伸长蛋白。

本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列(microarray)或DNA芯片(又称为“基因芯片”)上，用于分析组织中基因的差异表达分析。用水稻茎杆伸长蛋白特异的引物进行RNA-聚合酶链反应(RT-PCR)体外扩增也可检测水稻茎杆伸长蛋白的转录产物。

在本发明的一个实例中，提供了一种分离的多核苷酸，它编码具有SEQ IDNO：3所示氨基酸序列的多肽。本发明的多核苷酸是从水稻基因组和cDNA文库中分离出的，其序列如SEQ ID NO：2所示，它包含的多核苷酸序列全长为2172个碱基，其开放读框位于1-2172位，编码全长为723个氨基酸的水稻茎杆伸长蛋白(SEQ ID NO：3)。在另一实施例中还分离了茎杆伸长基因的基因组序列，如SEQ ID NO：1所示(包含内含子)。

水稻茎杆伸长蛋白具有明确的控制植物茎杆伸长的功能，是一个能用于构建正义和反义的转基因农作物、花卉、果蔬等转基因植物的新基因。

水稻茎杆伸长蛋白为改变植物的快速生长性包括抑制伸长、抗衰老性提供了新的途径，因而具有巨大的应用前景。可以导入正义和反义茎杆伸长基因，可改变现有优良农作物品种的快速生长性，获得茎杆快速伸长或抑制伸长的小麦、水稻等农作物或其他品种如林草、果树、花木等，解决农林业生产中存在的实际问题。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)或植物分子生物学-实验手册(PlantMolecular Biology-A Laboratory Mannual，Melody S.Clark编，Springer-verlag Berlin Heidelberg，1997)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

水稻茎杆伸长蛋白基因的克隆

利用发明人构建的包含茎杆伸长蛋白基因Eui及其突变基因eui组成的、本领域内技术人员清楚的水稻基因定位克隆(map-based cloning或positioncloning)群体，按分子标记定位Eui/eui于一个小的基因组片段内，比如30kb内。在此基础上，用常规方法分离包含该片段的基因组DNA克隆。经酶切和进一步的杂交鉴定确定其中一个含完整水稻的茎杆伸长蛋白Eui基因。

经全核苷酸序列分析结果表明：水稻茎杆伸长基因全长为5900bp(SEQ ID NO：1，包含调控区和内含子)。经软件分析和cDNA克隆，其ORF如SEQ ID NO：2所示，编码全长为723个氨基酸的水稻茎杆伸长蛋白，其序列如SEQID NO：3所示。

经序列分析，水稻茎杆伸长蛋白，如SEQ ID NO：3所示，可能为一个激素代谢过程的P450单加氧酶蛋白(P450monooxganase)。

进一步实验表明，该蛋白要么降解激素GA或Auxin或brassinosteroids，要么抑制合成GA或Auxin或brassinosteroids。而突变基因eui不能形成有上述功能的蛋白，而使植株体内积累高含量的激素，并增加外源GA的功能(敏感性)(图4-6)，促使植物细胞快速分裂、伸长(图3)，使植物茎杆尤其是上部节间快速高度伸长，株高增加，并使eui的不育系因快速高度伸长，不再包颈(见图1，2)。由于eui植株含有高量的激素，因此植株的生命力加强，抗衰老(图7)。

为验证克隆的Eui基因的功能，本发明人把水稻茎杆伸长基因Eui(含本身的启动子)按上述的本领域内技术人员熟悉的水稻转基因方法，转到含突变基因eui的植株中，验证了Eui可以互补eui的功能，转基因植株恢复正常生长(图8)。

实施例2

RT-PCR法获得水稻茎杆伸长蛋白的编码序列

为了验证序列的正确性，根据SEQ ID NO：1的序列，设计和合成了如下引物：

正向引物5’-3’ACGGAGGCCCATGAGCAAATTTCAA(SEQ ID NO：4)

反向引物5’-3’ACGTATCAGAGCCAGTCACAGCTTGG(SEQ ID NO：5)。

相应地，为获得茎杆伸长蛋白基因的cDNA探针，设计和合成了如下引物：

正向引物5’-3’ACCAGCGTCATCTTCAGCA (SEQ ID NO：6)

反向引物5’-3’AACGTCTCCCGCACCAC(SEQ ID NO：7)

RT-PCR扩增500bp的cDNA探针。

以用常规方法抽提的水稻Poly A⁺RNA为模板，进行RT-PCR扩增，扩增条件为94℃5分钟，随后94℃30秒、60℃30秒、72℃1分钟进行35个循环，最后以72℃延伸5分钟。电泳检测PCR扩增产物，回收，连接到T-Easy载体上采用终止物荧光标记(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377测序仪(Perkin-Elmer，USA)上进行测序。测序结果结果验证了水稻茎杆伸长蛋白的全长编码序列(SEQ ID NO：2)的正确性。

实施例3

水稻茎杆伸长蛋白的结构分析

根据cDNA(SEQ ID NO：2)的核苷酸的序列，获得编码的茎杆伸长蛋白的序列(SEQ ID NO：3)。经蛋白数据库联网查询，茎杆伸长蛋白含有高度保守的细胞色素P450结构域。故此断定茎杆伸长蛋白为一个P450单加氧酶。

实施例4

水稻茎杆伸长蛋白的点突变

经几个Eui突变基因eui的序列比较，茎杆伸长蛋白的缺失、移码和P450保守区的点突变均可以消除野生茎杆伸长蛋白的功能。本实施例表示在编码区的2个缺失(即缺失SEQ ID NO：1中2927-3169位和3153-3157位)分别引起水稻茎杆伸长蛋白功能丧失。

实施例5

野生型和突变型水稻茎杆伸长蛋白的功能实验

为验证野生型茎杆伸长蛋白的功能，把野生型水稻茎杆伸长基因Eui用其本身的启动子，按本领域内技术人员熟悉的水稻转基因方法，转到含突变基因eui的植株中，验证了野生型茎杆伸长蛋白可以互补突变型水稻茎杆伸长蛋白的功能，转基因植株恢复正常生长，突变型水稻茎杆伸长蛋白不能产生本发明中所说的功能(图8)。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>中国科学院上海植物生理研究所

<120>水稻茎杆伸长基因及其编码蛋白和用途

<130>027344

<160>7

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>5900

<212>DNA

<213>水稻(Oryza sativa)

<400>1

taatcaagta tgtgagttat tcaatccttg gcaatttcca atacaaatac agacacacta 60

tgtatggaac ttttttatat atagtctatt aaacaatata tctttgagcc gtctgaaacc 120

aaattatatg atattttttt agttaatcat accaagatca ttaattgagt aggaatataa 180

gacttcaagg gggaatcaac aatattaatt gtttctgaga acaattattc aaagcaattc 240

ataataaaag catatttatt ttaggagtgg gtacacacac tatctagctt gtaccatata 300

taagtcaatg accacgatat atggctagcc acctccctcc atcatgaaat aaattaacct 360

catacgaatt tagatataga atatgtccag atttattgat taaatcctag attgatttat 420

tttaggacga agagattacc tgcctgcctg cactaaccat ctgcgacgcc gacgtgtcat 480

ccatcggtcg acaaaacgta cgcaggccaa cacatgcata cgtacacaca attgcccatt 540

tgcaccccgc tccccatgtc cacgtcagac ggcgacacgt acacattaac acatgtacac 600

gtcgttttca cgtacgagct aagcaaatcc aacgtacaga aaatagttaa tttacccggt 660

tgccaactgg gacacgtacg ccggccacgt cacaggtcta cgtggcgcgg tgtgggccgg 720

gctaggaggg ttaaaagccc acgcttgtgt gctttggtca actcgtgcac ttattactct 780

gaagagttat tagccggttc gatgtgtcgc gattactgtt gtaattaagt ctgtctctgt 840

ggcgatatgt acgttgacga tgattaaggt ggtgtttgga tctagagact taactttagt 900

ctctgtattt agacactaat ttaaagtatt aaatatagac taattacaaa actaattaca 960

taaataaaaa cttatttgcg agataatttt ttttaagcct aattaatcca taattagaaa 1020

atatttaatg tagcatcaca taggataatc atgggttaat taggctcaat agaatcgtct 1080

cgcgaattag tctaagatta tggatagttt ttattaatag tctacgttta atatatataa 1140

ttagtgtcca aacatccgat aagatagaga cttaaaagtt ttaggtggtg tttagatcta 1200

gggacttaac tttagtccct atatttagac actaatttag agtattaaat atagactact 1260

tacaaaacta attacataaa taaaagctaa ttcgcgagat aattttttta agcctaatta 1320

atatataatt agagaatgtt tactgtagca tcacatatgc taatcatgga ttaattaggc 1380

tcaatagatt cgtctcgcga attagttcaa gattatggat gggttttatt aataatctac 1440

gtttaatatt tataattagt gtccaaacat ccgatatgat agggacttaa aagttttaat 1500

ctcatctaaa tatggtttta gtctcatcta aacagggtct aatagcagaa agttacgtga 1560

gattcgtata ctcgtacgta cgtatttgca tcggaatttt caaaatccta gactctttct 1620

agtactggtg gtacagtttg gcaaatctgg ttttttggat ggtttcagca tgtttaattt 1680

gcagtgtgga attgttgaga tgctagagat tttttgcaga acttatgtga aatttaatta 1740

ggcgtttcaa ctgtggctaa acgtgaagat atagcgcgct agagacgtgt gtgttggcag 1800

tgttgctttg caatttgcat aggctcgtgg tgtttggttc agaaatttat ttaaggatcc 1860

ggttgttttt tttttcattt tccttggtca atgttgtaaa gaatccgtag aatcttggca 1920

agaagattct cccaaacctc caggaaagag gagaagattc tccggaatca gtggaagtag 1980

tgcagtagct attgactggg atttttgtaa gcccggtcaa taggttcccc tgtacccttg 2040

gagagaccct gcaagtgcac acagatcacg tatatatcca catgcctata tgtgcataga 2100

tcacataggc acgcatcaaa agctttttaa tcctagctag cttactttaa tctttgatta 2160

ttttcaatag aaatttaatg acgtttaact tgattcatca ttcggcgacg tctcttgaac 2220

atgttaaagg ctgggccgag gcccaccaaa aacggaggcc catgagcaaa tttcaaattc 2280

tgactcgcgc gcggtggcgg caaaattttg caggcgagac gtacctgtac tggctgcggc 2340

ggcggccggc gctgtacgtg acggacccgg agctcatcgg cgagatcggg cggtgcgtgt 2400

cgctcgacat gggcaagccc aagtacctcc agaaaggcca ggagccactc ttcggcggcg 2460

gcgtcctcaa ggccaacggc gcgtgctggg cgcgccagcg caaggtcatc gcgccggagt 2520

tctacatggc ccgtgtcagg gccatggtcc agctcatggt cgacgccgcg cagccgctga 2580

tcgcctcctg ggaatccagg atcgacgccg ctggaggcgc ggcggcggcg gaggtcgtcg 2640

tcgacggcga cctccggagc ttctccttcg atgtgatatc gcgggcttgc tttgggagtg 2700

attactcgag ggggagggag atcttcctcc gcctccgtga gctgtccggg ctcatgtcgg 2760

agaccagcgt catcttcagc atcccttcgc tgaggcacct gccgacgggg aagaaccgga 2820

ggatctggag gctcacgggg gagatccggt cgctgatcat ggagctcgtc agggagcgga 2880

ggtgcgcggc gagggcggcg agggagcacg gcgggaaggc ggcgccgccg tcgccgccgg 2940

agcgcgactt cctcggctcc atcatcgaga acagcggcgg gcagccgcgg ccggacgact 3000

tcgtggtgga caactgcaag aacatctact tcgccgggca cgagacgagc gcggtcaccg 3060

cgacgtggtg cctcatgctg ctcgccgcgc acccggagtg gcaggaccgc gcccgcgccg 3120

aggtgctcga ggtctgcggc ggcgacggcg ccgccgcccc cgccgcgccg gacttcgaca 3180

tggtgtcccg gatgcggacg gtggggatgg tggtgcagga aacgctgcgg ctgttcccgc 3240

cgtcgtcgtt cgtggtgcgg gagacgttcc gggacatgca gttgggtagg ctgctggcgc 3300

ccaagggcac ctacctgttc gtcccggtgt ccaccatgca ccacgacgtc gccgcctggg 3360

gcccgacggc gaggctgttc gacccgtccc gcttccgcga cggcgtggcg gcggcgtgca 3420

agcacccgca ggcgtcgttc atgccgttcg gcctcggcgc ccgcacctgc ctcggccaga 3480

acctcgcgct cgtcgaggtc aagacgctcg tcgccgtcgt cctcgcccgg ttcgagttca 3540

cgctctcgcc ggagtacagg cactcgccgg cgttccggct catcatcgag ccggagttcg 3600

gcctccgcct ccgcatccgc cgcgccggcg gtcaggacgc cacgtcacaa gttgacacat 3660

ctactgcacc cgtgcatagt tctcataatt aattggcttc tgtaaacagc tagtaagtcg 3720

tgaactgaaa aaaatacatc acacatacag agacaacaga ggattaccat tttaccagca 3780

tacatccatg gcataccaaa acaatttact atacattata attaacatga tgctatacac 3840

agtataaaag gacatgcatt tttctgcgat taatggatta agccgattaa ctgtttgtca 3900

agtgattaca gtgtttaatt cagaatctag taattaattt gttgaattta gatagtctgt 3960

agcctgttcc tctctgaaag caacagagca gagcaaaagg caaaatcaag tttcagaagc 4020

acatggaaaa gtatgatttc tttggcaaaa ttgttgtgcc attctcttat gctataggcc 4080

tgtggttgag tgagcggccg tttgattggg acgccgacga acaggtgtct tttcgtttct 4140

gctttctaat ttctggcact aataaaaaca tgttggttgc tgagttaaaa tcaccaaagt 4200

ggagtggaga tcgcgatgtt atcctgtaga cttgttgtat ctggtctaat ggtctctgta 4260

agcaaaacga tcagaagtac tgaattagtt caattttttg atagacctgg tatggtcttt 4320

taaattcaac ttttgaaagt acagtgaaat acaaatctag tgatgccata ttgtgggctt 4380

gtgtagtata aattgtgaat caagcctacg gaattttttg ctgaaataca gtacgtgcct 4440

gtcttataag aaaaacctga accgagaagc cattagcgtt gtcacatacg acgccacgct 4500

cggtgactcg gtgagccagc gtgtgcacca tcagctcgcc agcagcgcgc gccaagaaag 4560

accagcagcc atgtcggggt ccggcgacgc cgcgccggcg cggcacaacg cgggtcacgg 4620

tcggcgacga cggcgcgtcc tcgtctgggc cagcttcgcc gcgctggtcc tgctgctcgt 4680

cgccgcggcg gccgccatcg ccgcgctcgc cgtgctccgg ccgcgggacc cgaccacgga 4740

gctcctgtcc gtgaacgcca cgggcgccac cccgcgcgtc gccgcgctgc cggccgtctc 4800

cgtccagctc aacgtcacct tcctcctcgt cgtccgcgtg cgcaacccga accgggcgga 4860

gttccgccac ggcgccgcca cgacggcgct cctgtaccgc ggcgccgagg tgggcgccgc 4920

cggcgtgccc gcggggacgg tgccgagccg cggcgcggcg acgctgaggc tgaacatgac 4980

ggtgcgggcg gacagggtgg tggcggcggc cggggtgggc ggcctcctcg cggacgtgct 5040

cgccggcgag atggagttcg aggcgaggac ggaggtgcgc gggcgggtga agctgctcgg 5100

gctcgtccgg cggagcgccg tggcgaggtc gctgtgccgc gtcgtgatcg gcgtcgccga 5160

cgtgaaggtc cggcgccagg agtgccacaa cgagtccaag ctgtgactgg ctctgatacg 5220

tattatacgt atgtacgctg tctttgtatt tgtacatgta tacgtgtgct gaagacagtc 5280

gatttgtacg tactctgata tatgtgcacg aatttgtcgt ggcaataaat gtttaggcta 5340

ttcataagct gtttctttgg tagactgtat atgtatattg ttaaaagtta ctgcagcctc 5400

attgtcattg ttgtgtttcc aaaattttgg agaaatcaac aatatggtta ttcaatttac 5460

atttgcaacc cctaaatata ttattcaagt agataaagtg gtcgcactgt gtgtttttct 5520

tccatttttt caaagagata attaaacttg gtctgtggtg cacattgcag aaagctactg 5580

tgaaacggat ggactattga actactctcg ttgtcattgg ttggcctaat gttagattac 5640

atttttctac ctgaatatat gttttgagta attcatgtgt gttttatttc ccgtggcatt 5700

acatatatgc tgtaacattc cgagttgtat ttttcttttt ttatttttat aatattccta 5760

cgtttcaaag gagagtctgt gaaacaaaaa ggtagattag aacaacatat agctctcaaa 5820

ctagtgagaa atttttgctc ttaatgcaac agaggcacaa caaggagaaa atattcaaca 5880

aacacgtcta ggttgctcct 5900

<210>2

<211>2172

<212>DNA

<213>水稻(Oryza sativa)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(2172)

<223>

<400>2

atg agc aaa ttt caa att ctg act cgc gcg cgg tgg cgg caa aat ttt 48

Met Ser Lys Phe Gln Ile Leu Thr Arg Ala Arg Trp Arg Gln Asn Phe

1 5 10 15

gca ggc gag acg tac ctg tac tgg ctg cgg cgg cgg ccg gcg ctg tac 96

Ala Gly Glu Thr Tyr Leu Tyr Trp Leu Arg Arg Arg Pro Ala Leu Tyr

20 25 30

gtg acg gac ccg gag ctc atc ggc gag atc ggg cgg tgc gtg tcg ctc 144

Val Thr Asp Pro Glu Leu Ile Gly Glu Ile Gly Arg Cys Val Ser Leu

35 40 45

gac atg ggc aag ccc aag tac ctc cag aaa ggc cag gag cca ctc ttc 192

Asp Met Gly Lys Pro Lys Tyr Leu Gln Lys Gly Gln Glu Pro Leu Phe

50 55 60

ggc ggc ggc gtc ctc aag gcc aac ggc gcg tgc tgg gcg cgc cag cgc 240

Gly Gly Gly Val Leu Lys Ala Asn Gly Ala Cys Trp Ala Arg Gln Arg

65 70 75 80

aag gtc atc gcg ccg gag ttc tac atg gcc cgt gtc agg gcc atg gtc 288

Lys Val Ile Ala Pro Glu Phe Tyr Met Ala Arg Val Arg Ala Met Val

85 90 95

cag ctc atg gtc gac gcc gcg cag ccg ctg atc gcc tcc tgg gaa tcc 336

Gln Leu Met Val Asp Ala Ala Gln Pro Leu Ile Ala Ser Trp Glu Ser

100 105 110

agg atc gac gcc gct gga ggc gcg gcg gcg gcg gag gtc gtc gtc gac 384

Arg Ile Asp Ala Ala Gly Gly Ala Ala Ala Ala Glu Val Val Val Asp

115 120 125

ggc gac ctc cgg agc ttc tcc ttc gat gtg ata tcg cgg gct tgc ttt 432

Gly Asp Leu Arg Ser Phe Ser Phe Asp Val Ile Ser Arg Ala Cys Phe

130 135 140

ggg agt gat tac tcg agg ggg agg gag atc ttc ctc cgc ctc cgt gag 480

Gly Ser Asp Tyr Ser Arg Gly Arg Glu Ile Phe Leu Arg Leu Arg Glu

145 150 155 160

ctg tcc ggg ctc atg tcg gag acc agc gtc atc ttc agc atc cct tcg 528

Leu Ser Gly Leu Met Ser Glu Thr Ser Val Ile Phe Ser Ile Pro Ser

165 170 175

ctg agg cac ctg ccg acg ggg aag aac cgg agg atc tgg agg ctc acg 576

Leu Arg His Leu Pro Thr Gly Lys Asn Arg Arg Ile Trp Arg Leu Thr

180 185 190

ggg gag atc cgg tcg ctg atc atg gag ctc gtc agg gag cgg agg tgc 624

Gly Glu Ile Arg Ser Leu Ile Met Glu Leu Val Arg Glu Arg Arg Cys

195 200 205

gcg gcg agg gcg gcg agg gag cac ggc ggg aag gcg gcg ccg ccg tcg 672

Ala Ala Arg Ala Ala Arg Glu His Gly Gly Lys Ala Ala Pro Pro Ser

210 215 220

ccg ccg gag cgc gac ttc ctc ggc tcc atc atc gag aac agc ggc ggg 720

Pro Pro Glu Arg Asp Phe Leu Gly Ser Ile Ile Glu Asn Ser Gly Gly

225 230 235 240

cag ccg cgg ccg gac gac ttc gtg gtg gac aac tgc aag aac atc tac 768

Gln Pro Arg Pro Asp Asp Phe Val Val Asp Asn Cys Lys Asn Ile Tyr

245 250 255

ttc gcc ggg cac gag acg agc gcg gtc acc gcg acg tgg tgc ctc atg 816

Phe Ala Gly His Glu Thr Ser Ala Val Thr Ala Thr Trp Cys Leu Met

260 265 270

ctg ctc gcc gcg cac ccg gag tgg cag gac cgc gcc cgc gcc gag gtg 864

Leu Leu Ala Ala His Pro Glu Trp Gln Asp Arg Ala Arg Ala Glu Val

275 280 285

ctc gag gtc tgc ggc ggc gac ggc gcc gcc gcc ccc gcc gcg ccg gac 912

Leu Glu Val Cys Gly Gly Asp Gly Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Asp

290 295 300

ttc gac atg gtg tcc cgg atg cgg acg gtg ggg atg gtg gtg cag gaa 960

Phe Asp Met Val Ser Arg Met Arg Thr Val Gly Met Val Val Gln Glu

305 310 315 320

acg ctg cgg ctg ttc ccg ccg tcg tcg ttc gtg gtg cgg gag acg ttc 1008

Thr Leu Arg Leu Phe Pro Pro Ser Ser Phe Val Val Arg Glu Thr Phe

325 330 335

cgg gac atg cag ttg ggt agg ctg ctg gcg ccc aag ggc acc tac ctg 1056

Arg Asp Met Gln Leu Gly Arg Leu Leu Ala Pro Lys Gly Thr Tyr Leu

340 345 350

ttc gtc ccg gtg tcc acc atg cac cac gac gtc gcc gcc tgg ggc ccg 1104

Phe Val Pro Val Ser Thr Met His His Asp Val Ala Ala Trp Gly Pro

355 360 365

acg gcg agg ctg ttc gac ccg tcc cgc ttc cgc gac ggc gtg gcg gcg 1152

Thr Ala Arg Leu Phe Asp Pro Ser Arg Phe Arg Asp Gly Val Ala Ala

370 375 380

gcg tgc aag cac ccg cag gcg tcg ttc atg ccg ttc ggc ctc ggc gcc 1200

Ala Cys Lys His Pro Gln Ala Ser Phe Met Pro Phe Gly Leu Gly Ala

385 390 395 400

cgc acc tgc ctc ggc cag aac ctc gcg ctc gtc gag gtc aag acg ctc 1248

Arg Thr Cys Leu Gly Gln Asn Leu Ala Leu Val Glu Val Lys Thr Leu

405 410 415

gtc gcc gtc gtc ctc gcc cgg ttc gag ttc acg ctc tcg ccg gag tac 1296

Val Ala Val Val Leu Ala Arg Phe Glu Phe Thr Leu Ser Pro Glu Tyr

420 425 430

agg cac tcg ccg gcg ttc cgg ctc atc atc gag ccg gag ttc ggc ctc 1344

Arg His Ser Pro Ala Phe Arg Leu Ile Ile Glu Pro Glu Phe Gly Leu

435 440 445

cgc ctc cgc atc cgc cgc gcc ggc ggc ctg tgg ttg agt gag cgg ccg 1392

Arg Leu Arg Ile Arg Arg Ala Gly Gly Leu Trp Leu Ser Glu Arg Pro

450 455 460

ttt gat tgg gac gcc gac gaa cag aaa aac ctg aac cga gaa gcc att 1440

Phe Asp Trp Asp Ala Asp Glu Gln Lys Asn Leu Asn Arg Glu Ala Ile

465 470 475 480

agc gtt gtc aca tac gac gcc acg ctc ggt gac tcg gtg agc cag cgt 1488

Ser Val Val Thr Tyr Asp Ala Thr Leu Gly Asp Ser Val Ser Gln Arg

485 490 495

gtg cac cat cag ctc gcc agc agc gcg cgc caa gaa aga cca gca gcc 1536

Val His His Gln Leu Ala Ser Ser Ala Arg Gln Glu Arg Pro Ala Ala

500 505 510

atg tcg ggg tcc ggc gac gcc gcg ccg gcg cgg cac aac gcg ggt cac 1584

Met Ser Gly Ser Gly Asp Ala Ala Pro Ala Arg His Asn Ala Gly His

515 520 525

ggt cgg cga cga cgg cgc gtc ctc gtc tgg gcc agc ttc gcc gcg ctg 1632

Gly Arg Arg Arg Arg Arg Val Leu Val Trp Ala Ser Phe Ala Ala Leu

530 535 540

gtc ctg ctg ctc gtc gcc gcg gcg gcc gcc atc gcc gcg ctc gcc gtg 1680

Val Leu Leu Leu Val Ala Ala Ala Ala Ala Ile Ala Ala Leu Ala Val

545 550 555 560

ctc cgg ccg cgg gac ccg acc acg gag ctc ctg tcc gtg aac gcc acg 1728

Leu Arg Pro Arg Asp Pro Thr Thr Glu Leu Leu Ser Val Asn Ala Thr

565 570 575

ggc gcc acc ccg cgc gtc gcc gcg ctg ccg gcc gtc tcc gtc cag ctc 1776

Gly Ala Thr Pro Arg Val Ala Ala Leu Pro Ala Val Ser Val Gln Leu

580 585 590

aac gtc acc ttc ctc ctc gtc gtc cgc gtg cgc aac ccg aac cgg gcg 1824

Asn Val Thr Phe Leu Leu Val Val Arg Val Arg Asn Pro Asn Arg Ala

595 600 605

gag ttc cgc cac ggc gcc gcc acg acg gcg ctc ctg tac cgc ggc gcc 1872

Glu Phe Arg His Gly Ala Ala Thr Thr Ala Leu Leu Tyr Arg Gly Ala

610 615 620

gag gtg ggc gcc gcc ggc gtg ccc gcg ggg acg gtg ccg agc cgc ggc 1920

Glu Val Gly Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Thr Val Pro Ser Arg Gly

625 630 635 640

gcg gcg acg ctg agg ctg aac atg acg gtg cgg gcg gac agg gtg gtg 1968

Ala Ala Thr Leu Arg Leu Asn Met Thr Val Arg Ala Asp Arg Val Val

645 650 655

gcg gcg gcc ggg gtg ggc ggc ctc ctc gcg gac gtg ctc gcc ggc gag 2016

Ala Ala Ala Gly Val Gly Gly Leu Leu Ala Asp Val Leu Ala Gly Glu

660 665 670

atg gag ttc gag gcg agg acg gag gtg cgc ggg cgg gtg aag ctg ctc 2064

Met Glu Phe Glu Ala Arg Thr Glu Val Arg Gly Arg Val Lys Leu Leu

675 680 685

ggg ctc gtc cgg cgg agc gcc gtg gcg agg tcg ctg tgc cgc gtc gtg 2112

Gly Leu Val Arg Arg Ser Ala Val Ala Arg Ser Leu Cys Arg Val Val

690 695 700

atc ggc gtc gcc gac gtg aag gtc cgg cgc cag gag tgc cac aac gag 2160

Ile Gly Val Ala Asp Val Lys Val Arg Arg Gln Glu Cys His Asn Glu

705 710 715 720

tcc aag ctg tga 2172

Ser Lys Leu

<210>3

<211>723

<212>PRT

<213>水稻(Oryza sativa)

<400>3

Met Ser Lys Phe Gln Ile Leu Thr Arg Ala Arg Trp Arg Gln Asn Phe

1 5 10 15

Ala Gly Glu Thr Tyr Leu Tyr Trp Leu Arg ArgArg Pro Ala Leu Tyr

20 25 30

Val Thr Asp Pro Glu Leu Ile Gly Glu Ile Gly Arg Cys Val Ser Leu

35 40 45

Asp Met Gly Lys Pro Lys Tyr Leu Gln Lys Gly Gln Glu Pro Leu Phe

50 55 60

Gly Gly Gly Val Leu Lys Ala Asn Gly Ala Cys Trp Ala Arg Gln Arg

65 70 75 80

Lys Val Ile Ala Pro Glu Phe Tyr Met Ala Arg Val Arg Ala Met Val

85 90 95

Gln Leu Met Val Asp Ala Ala Gln Pro Leu Ile Ala Ser Trp Glu Ser

100 105 110

Arg Ile Asp Ala Ala Gly Gly Ala Ala Ala Ala Glu Val Val Val Asp

115 120 125

Gly Asp Leu Arg Ser Phe Ser Phe Asp Val Ile Ser Arg Ala Cys Phe

130 135 140

Gly Ser Asp Tyr Ser Arg Gly Arg Glu Ile Phe Leu Arg Leu Arg Glu

145 150 155 160

Leu Ser Gly Leu Met Ser Glu Thr Ser Val Ile Phe Ser Ile Pro Ser

165 170 175

Leu Arg His Leu Pro Thr Gly Lys Asn Arg Arg Ile Trp Arg Leu Thr

180 185 190

Gly Glu Ile Arg Ser Leu Ile Met Glu Leu Val Arg Glu Arg Arg Cys

195 200 205

Ala Ala Arg Ala Ala Arg Glu His Gly Gly Lys Ala Ala Pro Pro Ser

210 215 220

Pro Pro Glu Arg Asp Phe Leu Gly Ser Ile Ile Glu Asn Ser Gly Gly

225 230 235 240

Gln Pro Arg Pro Asp Asp Phe Val Val Asp Asn Cys Lys Asn Ile Tyr

245 250 255

Phe Ala Gly His Glu Thr Ser Ala Val Thr Ala Thr Trp Cys Leu Met

260 265 270

Leu Leu Ala Ala Hi s Pro Glu Trp Gln Asp Arg Ala Arg Ala Glu Val

275 280 285

Leu Glu Val Cys Gly Gly Asp Gly Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Asp

290 295 300

Phe Asp Met Val Ser Arg Met Arg Thr Val Gly Met Val Val Gln Glu

305 310 315 320

Thr Leu Arg Leu Phe Pro Pro Ser Ser Phe Val Val Arg Glu Thr Phe

325 330 335

Arg Asp Met Gln Leu Gly Arg Leu Leu Ala Pro Lys Gly Thr Tyr Leu

340 345 350

Phe Val Pro Val Ser Thr Met His His Asp Val Ala Ala Trp Gly Pro

355 360 365

Thr Ala Arg Leu Phe Asp Pro Ser Arg Phe Arg Asp Gly Val Ala Ala

370 375 380

Ala Cys Lys His Pro Gln Ala Ser Phe Met Pro Phe Gly Leu Gly Ala

385 390 395 400

Arg Thr Cys Leu Gly Gln Asn Leu Ala Leu Val Glu Val Lys Thr Leu

405 410 415

Val Ala Val Val Leu Ala Arg Phe Glu Phe Thr Leu Ser Pro Glu Tyr

420 425 430

Arg His Ser Pro Ala Phe Arg Leu Ile Ile Glu Pro Glu Phe Gly Leu

435 440 445

Arg Leu Arg Ile Arg Arg Ala Gly Gly Leu Trp Leu Ser Glu Arg Pro

450 455 460

Phe Asp Trp Asp Ala Asp Glu Gln Lys Asn Leu Asn Arg Glu Ala Ile

465 470 475 480

Ser Val Val Thr Tyr Asp Ala Thr Leu Gly Asp Ser Val Ser Gln Arg

485 490 495

Val His His Gln Leu Ala Ser Ser Ala Arg Gln Glu Arg Pro Ala Ala

500 505 510

Met Ser Gly Ser Gly Asp Ala Ala Pro Ala Arg His Asn Ala Gly His

515 520 525

Gly Arg Arg Arg Arg Arg Val Leu Val Trp Ala Ser Phe Ala Ala Leu

530 535 540

Val Leu Leu Leu Val Ala Ala Ala Ala Ala Ile Ala Ala Leu Ala Val

545 550 555 560

Leu Arg Pro Arg Asp Pro Thr Thr Glu Leu Leu Ser Val Asn Ala Thr

565 570 575

Gly Ala Thr Pro Arg Val Ala Ala Leu Pro Ala Val Ser Val Gln Leu

580 585 590

Asn Val Thr Phe Leu Leu Val Val Arg Val Arg Asn Pro Asn Arg Ala

595 600 605

Glu Phe Arg His Gly Ala Ala Thr Thr Ala Leu Leu Tyr Arg Gly Ala

610 615 620

Glu Val Gly Ala Ala Gly Val Pro Ala Gly Thr Val Pro Ser Arg Gly

625 630 635 640

Ala Ala Thr Leu Arg Leu Asn Met Thr Val Arg Ala Asp Arg Val Val

645 650 655

Ala Ala Ala Gly Val Gly Gly Leu Leu Ala Asp Val Leu Ala Gly Glu

660 665 670

Met Glu Phe Glu Ala Arg Thr Glu Val Arg Gly Arg Val Lys Leu Leu

675 680 685

Gly Leu Val Arg Arg Ser Ala Val Ala Arg Ser Leu Cys Arg Val Val

690 695 700

Ile Gly Val Ala Asp Val Lys Val Arg Arg Gln Glu Cys His Asn Glu

705 710 715 720

Ser Lys Leu

<210>4

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(25)

<223>引物

<400>4

acggaggccc atgagcaaat ttcaa 25

<210>5

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(26)

<223>引物

<400>5

acgtatcaga gccagtcaca gcttgg 26

<210>6

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(19)

<223>引物

<400>6

accagcgtca tcttcagca 19

<210>7

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(17)

<223>引物

<400>7

aacgtctccc gcaccac 17

Claims

1.一种分离的多肽，所述的多肽是水稻茎杆伸长蛋白，其特征在于，该多肽选自下组：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的多肽；

(b)将SEQ ID NO：3氨基酸序列经过1-10个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抑制植物茎杆伸长功能的由(a)衍生的多肽。

2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，该多肽是SEQ ID NO：3氨基酸序列的多肽。

3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸序列编码权利要求1所述的多肽。

4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的多肽。

5.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的序列选自下组的一种：

(a)SEQ ID NO：1中1-5900位的序列；

(b)SEQ ID NO：2中1-2172位的序列。

6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。

7.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的载体或基因组中整合有权利要求3所述的多核苷酸。

8.一种水稻茎杆伸长蛋白的制备方法，其特征在于，该方法包含：

(a)在适合表达的条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞；

(b)从培养物中分离出水稻茎杆伸长蛋白。

9.一种改良植物的方法，其特征在于，它包括步骤：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示的多肽；

(b)将SEQ ID NO：3氨基酸序列经过1-10个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有抑制植物茎杆伸长功能的由SEQ ID NO：3所示序列所衍生的多肽；

(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织或器官再生成植株。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法改良了植物的茎杆伸长性或抗衰老性。