CN100364544C - 一种携带二氯亚甲基二膦酸的明胶微粒及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种以肝、脾单核-吞噬细胞系统内巨噬细胞为靶点，携带药物二氯亚甲基二膦酸的明胶微粒及其制备方法。本发明首先对明胶进行处理，使其成为粒径在200～700nm的微粒，微粒表面带有正电荷，然后连接上药物二氯亚甲基二膦酸。该载药明胶可用治疗免疫性血小板减性紫癜(ITP)、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)和伤寒。具有疗效好，生物降解性好，降解物毒性低，生物相容性好等特点。

Description

一种携带二氯亚甲基二膦酸的明胶微粒及制备方法

技术领域

本发明是一种以肝、脾内巨噬细胞为靶点的药物及其制备方法。具体地说是一种以肝、脾单核-吞噬细胞系统内巨噬细胞为靶点，用于治疗ITP、AIDS和伤寒的以明胶为载体携带二氯亚甲基二膦酸(Cl₂MDP)药物的明胶微粒及其制备方法。

背景技术

免疫性(原发性)血小板减少性紫癜(ITP)、获得性免疫缺陷综合症(AIDS)是一种较多见的病。就免疫性(原发性)血小板减少性紫癜(ITP)而言，它是一种患者体内血小板相关免疫球蛋白或抗血小板抗体增高的自身免疫性疾病，其主要临床特征为患者自身抗血小板抗体导致的血小板减少以及由于血小板减少而可能引起的出血。大量研究表明，ITP患者血小板的破坏发生在单核-吞噬细胞系统，尤其是肝脾的巨噬细胞中。

目前ITP的临床治疗方案如糖皮质激素、脾切除、大剂量γ球蛋白、抗D免疫球蛋白、达那唑和免疫抑制剂等基本上都是通过降低或抑制单核-吞噬细胞系统活性的方式来减少血小板的破坏，增加血小板数量及其存活时间，即基于以下机制：(1)降低巨噬细胞的免疫功能；(2)减少巨噬细胞数量。然而，现有的常规治疗方案的缓解率约50％不足，且存在复发率较高或药物毒副作用较大的缺点。在治疗无效和缓解后复发的病人中不少(约16％)存在发生致命出血的危险。对美国血液病学会制订的ITP诊断与治疗指南，不少研究人员和临床医师存有异议。这表明对ITP的治疗仍未完全解决，探索对治疗无效和缓解后反复发作的病例的有效治疗手段有着重要的意义。

治疗ITP的靶向药物输送方法早在1978年已有报道，Ahn YS和他的研究小组将血小板载有长春碱，长春碱可随血小板进入巨噬细胞后再释放出来杀死巨噬细胞，不过他们的研究最终没有达到预期目的。以后不断有人利用脂质体研究被称为巨噬细胞“自杀”技术的方法，使之成为治疗一些以巨噬细胞为药物作用靶点的疾病(如ITP、AIDS等)。

脂质体作为研究最为深入的药物载体已经受到人们重视，它为单层或多层磷脂双分子层构成的封闭囊状结构，由磷脂、类脂和胆固醇等成分组成，其在结构上类似于细胞膜，具有生物膜的特性和功能，可以用来包覆水溶性和脂溶性药物。但在许多研究和使用过程中发现，脂质体作为药物载体存在靶向分布不太理想、体外储存稳定性欠佳、对水溶性药物的包覆效率偏低(仅为1％左右)、重复使用仍有可能引起免疫反应等缺陷。

发明内容

本发明的目的在于，针对现有技术不足，采用纳米技术与现代药物相结合，制备一种携带二氯亚甲基二膦酸的明胶微粒，以肝、脾单核-吞噬细胞系统内巨噬细胞为作用靶点，用于治疗免疫性血小板减少性紫癜(ITP)和获得性免疫缺陷综合症(AIDS)等疾病。

本发明是通过下列方法来实施的：

本发明选用明胶为载体，经处理使明胶微粒粒径为200nm～700nm范围，利用明胶表面带有一定的正电荷的特性，将药物二氯亚甲基二膦酸(Cl₂MDP)吸附在明胶微粒的表面，然后再用明胶进行包覆、烘干，则成一种携带二氯亚甲基二膦酸的固体明胶微粒。

本发明选用明胶作为药物载体：

明胶是由动物体内胶原部分水解所得的降解产物，因生产方法不同分为酸法水解的明胶(A型明胶)和碱法水解的明胶(B型明胶)，其分子量大小不等，范围一般在1.5万～15万，其中A型明胶带正电荷。明胶来源丰富，可以生物降解，具有蛋白质的理化性状，分子结构为18种氨基酸与肽交联形成的直链聚合物，具有独特的由溶胶到凝胶转变的性质等其它材料不可替代的优点，是最早用来作为载体包被药物的材料之一，在生物医学上具有广泛的应用。明胶作为药物载体具有以下优点：(1)良好的生物降解性，其在生物体内降解后形成无毒产物(氨基酸或多肽)参与代谢或排出体外；(2)良好的生物相容性和极低的免疫原性，进入生物体内不会引起血象变化及过敏反应等；(3)具有较好的靶向性和一定的药物缓释能力，使药物在靶区的滞留，增加对组织和细胞的渗透性和亲和力；(4)具有较高的药物包覆效率和载药量等。

A型明胶微粒大小为200～700nm，表面带正电荷；明胶微粒对携带二氯亚甲基二膦酸的包覆率＞15％，载药量＞5mg二氯亚甲基二膦酸/mg明胶(12mg二氯亚甲基二膦酸/ml明胶)，体外稳定性、载药量及明胶微粒大小等特性保持一年以上。

由纳米技术与现代药物学相结合而形成的载药纳米微粒(drug-loadednanoparticles)是一种新型的药物输送体系。纳米载药系统有其独特优势：(1)靶向输送可提高病变局部的有效药物浓度，在保证疗效的前提下，减少给药剂量，从一定程度上减轻了药物的毒副作用；(2)药物缓释可以延长药物作用时间减少给药次数，并提高药物的生物利用度；(3)提高一些药物在体内外的稳定性，在体内可保护药物，避免在血液和组织液中被灭活；(4)可改变一些药物的给药方式，方便患者用药等。由于纳米载药系统具有其他输送体系难以比拟的优势，现已成为现代药物制剂发展的趋势之一。纳米载药系统的应用有了很大发展。

试验表明载药微粒大小对杀灭巨噬细胞效果影响很大，各种大小的微粒进入体内后的去向各不相同，直径＞200nm的多被巨噬细胞吞噬、直径＜200nm且表面覆有亲水基团的可以逃避巨噬细胞对其识别、而＜10nm易被肾脏排泄或聚集到骨髓，其中微粒直径＞800nm则在肺部聚集(肺内巨噬细胞)增多。在粒径大致相同的情况下，微粒的肝脾摄取由大到小依次为负电荷、正电荷和电中性。本发明的明胶微粒粒径分布控制在200-700nm范围，本发明采用二氯亚甲基二膦酸钠作为药物。

二氯亚甲基二膦酸钠的分子式为：

二氯亚甲基二膦酸(dichloromethylene diphosphonate，Cl₂MDP)药物是一种用于治疗骨质疏松和破骨性肿瘤骨转移性病灶的临床常用药物，为水溶性，难以通过细胞膜，其进入靶细胞主要通过细胞吞噬或细胞膜受体介导的途径，杀伤细胞或抑制细胞活性的机制尚未完全清楚，但它的毒副作用非常小，大多为口服时出现的轻微胃肠道症状，机体耐受性很好。在以脂质体为载体进行的研究中，多数研究者认为它产生治疗作用的可能机理是：(1)在细胞内螯合铁离子，抑制细胞代谢直至引起细胞死亡，并减少H+的产生和蛋白合成；(2)通过破坏细胞、抑制其恢复和再生，从而减少细胞数量；(3)影响单核吞噬细胞系分泌细胞因子的种类和量，从而抑制干细胞的分化和成熟细胞的功能；(4)引起细胞形态的改变，由此抑制其功能与活性；(5)抑制前列腺素合成及溶酶体酶、焦磷酸酶、鲨烯合成酶和胆固醇等的生物合成；(6)形成不能水解的ATP类似物取代细胞内的ATP，干扰细胞的能量代谢；(7)在体外可以诱导肿瘤细胞(骨髓瘤、乳腺癌、前列腺癌等)和巨噬细胞凋亡等。因此，进入巨噬细胞后，二氯亚甲基二膦酸药物可能能够通过这些机制杀伤巨噬细胞或降低巨噬细胞的免疫活性而产生治疗作用。

本发明的优点：

和携带二氯亚甲基二膦酸的脂质体相比，携带二氯亚甲基二膦酸的明胶微粒具有以下优点(1)良好的生物降解性，其在生物体内降解后形成无毒产物(氨基酸或多肽)参与代谢或排出体外；(2)良好的生物相容性和极低的免疫原性，进入生物体内不会引起血象变化及过敏反应等；(3)具有较高的药物包覆效率和载药量等。文献报道，脂质体的二氯亚甲基二膦酸包覆率为1％；本发明的明胶微粒的二氯亚甲基二膦酸包覆率可达15％以上。脂质体的二氯亚甲基二膦酸携带量可达5mg/ml，而本发明的明胶微粒的二氯亚甲基二膦酸携带量大于12mg/ml。

附图说明

图1为^99mTc-Cl₂MDP-明胶微粒的放射性核素显像(左为1h图像，右为24h图像)。

图2为SD大鼠^99mTc-Cl₂MDP全身显像(左为4h图像，右为24h图像)。

图3a为Cl₂MDP-明胶微粒在SD大鼠体内按每克组织平均计数的分布图。

图3b为Cl₂MDP-明胶微粒在SD大鼠体内按脏器总计数的分布图。

图4为免抗鼠血小板血清多次同一剂量静脉注射后SD大鼠血小板计数的变化图。

图5为不同剂量Cl₂MDP-明胶微粒治疗后ITP SD大鼠模型的血小板变化图。

具体实施方式

本发明的实施方法：

1)明胶微粒：明胶微粒采用二次单凝聚法制备。

2)明胶微粒携带二氯亚甲基二膦酸：通过明胶表面电荷的静电吸附将治疗药物Cl₂MDP连接到明胶微粒表面上。

3)载药明胶再外封明胶，完成药物包覆。

4)保持体外稳定性：将携带二氯亚甲基二膦酸的明胶微粒进行干燥。

5)可进一步制备携带二氯亚甲基二膦酸的明胶微粒的靶向性核素标记物。

实施举例

一、明胶微粒制备

1，取0.5g明胶溶于10ml水中，溶胀30min，放在55℃的水浴中加热溶解，配制成溶液；

2，快速倾倒入8～9ml丙酮，静置分层，去掉上层的白色浊液和固体，余下的部分重新在水浴中溶解；

3，用醋酸调节pH值在3.2-3.8之间，滴加丙酮溶液至液体呈乳白色为止；

4，快速转移到圆底烧瓶，在冰浴中用磁力搅拌器搅拌10min后，加入200ml8％重量比的戊二醛固化30min；

5，停止搅拌，从冰浴中取出，进行后处理。如透析去除未成球的明胶、制备过程中

加入的丙酮和戊二醛，通过超滤选择所需明胶微粒的粒径等。

6，经过超滤选择，控制明胶粒径控制在200～700nm范围内。

7，通过Zeta电位仪测定，制得的明胶微粒表面带有正电荷，其Zeta电位在7～9.5mV。

二、明胶携带二氯亚甲基二膦酸

1，在浓度为1mg/ml的明胶微粒中加入12～20mg的二氯亚甲基二膦酸混匀，室温下置于振荡器上轻微振荡1h；

2，以6000r/min离心10min，弃上清液，沉淀物用双蒸水洗涤两次；

3，离心，得沉淀物，即为携带二氯亚甲基二膦酸的明胶微粒。

4，本发明的明胶微粒的二氯亚甲基二膦酸包覆率可达15-20％，二氯亚甲基二膦酸携带量可大于12mg/ml。

5，载药明胶的外层包覆：将30mg携带二氯亚甲基二膦酸的明胶微球再加入到50ml浓度为1％重量比的明胶溶液中搅拌20min，离心，得沉淀产物，经烘干为最终产品。

三、携带二氯亚甲基二膦酸的明胶微粒的靶向性核素标记的制备

1，准确称取Cl₂MDP5mg，溶于500μl去离子水，其浓度为10mg/ml；

2，新鲜淋洗的⁹⁹Tc^mO₄ ^-溶液，取5mCi，加入Na₂S₂O₄溶液，使其中Na₂的s₂O₄的终浓度为2mg/ml，混匀，加盖室温放置1～2min，然后加入Cl₂MDP溶液，混匀，加盖室温放置5～10min，其间轻轻振荡2～3次；产物为核素标记的二氯亚甲基二膦酸(⁹⁹Tc^m-Cl₂MDP)。

3，重复“二、明胶携带二氯亚甲基二膦酸”的过程，制备出携带^99mTc-Cl₂MDP的明胶微粒。

本发明的应用买验：

1.二氯亚甲基二膦酸明胶微粒的巨噬细胞靶向性核素显像。静脉注入^99mTc-Cl₂MDP-明胶微粒到SD大鼠其体内，1h、24h进行SD大鼠全身放射性核素γ显像。结果显示^99mTc-Cl₂MDP-明胶微粒在肝、脾有高度聚集；^99mTc-Cl₂MDP主要分布在肾、骨。见图1及2。

2.二氯亚甲基二膦酸明胶微粒对SD大鼠体内生物学分布实验

分别取出SD大鼠血液、心、肺、肝、脾、肾、股骨、甲状腺等组织器官，称重。用γ计数器测量这些组织器官的放射性计数。结果显示Cl₂MDP-明胶微粒在肝、脾有高度聚集。

以每克组织平均计数几个脏器中技术分别和血，心，肝，脾，肾，肺，甲状腺，骨组织作图。图3a和3b说明其每克组织平均计数量最大集中在肝脾之中，各脏器总计数的总量在肝脏中最高。

3.二氯亚甲基二膦酸明胶微粒对体外培养巨噬细胞的摄取实验：

3.1体外培养巨噬细胞的摄取。巨噬细胞株RAW264.7分别和^99mTc-Cl₂MDP-明胶微粒和Cl₂MDP进行37℃，5％CO₂孵育1～2h，测定巨噬细胞摄取^99mTc-Cl₂MDP-明胶微粒和Cl₂MDP的量。结果显示体外培养的巨噬细胞株RAW264.7对^99mTc-Cl₂MDP-明胶微粒和Cl₂MDP的摄取率分别为70.6％、1.2％，二者间差异明显(p＜0.05)。

3.2二氯亚甲基二膦酸明胶微粒MTT试验。在24孔培养板中培养贴壁巨噬细胞，加入不同Cl₂MDP剂量的Cl₂MDP-明胶微粒、Cl₂MDP和单纯明胶微粒，37℃，5％CO₂孵育24h，对照组只加入含10％FCS的DMEM。将MTT以PBS液配制成2mg/ml溶液。将培养皿中的培养液(包括空白)吸净后，每孔加入250ul上述新鲜配制的MTT溶液。37℃、5％CO₂继续孵育4h。显色、测值。用酶标仪以570nm测每孔溶液的OD值，按公式计算细胞抑制率。细胞抑制率＝(对照组O.D.-干预因素组O.D.)/对照组O.D.×100％。

结果显示，单纯明胶微粒和游离的Cl₂MDP不能抑制培养细胞生长，而不同剂结果显示，单纯明胶微粒和游离的Cl₂MDP不能抑制培养细胞生长，而不同剂量的Cl₂MDP-明胶微粒可以产生不同程度的抑制作用，其抑制率与其它三组比较有显著差异(p＜0.01)。在Cl₂MDP-明胶微粒组内，不同剂量Cl₂MDP-明胶微粒组的抑制率随剂量增加而增大，各剂量间比较差异明显(p＜0.05)，显示Cl₂MDP-明胶微粒以剂量依赖的关系抑制巨噬细胞。见表1

表1不同干预因素对巨噬细胞生长的抑制率

组别	剂量(mg，以所含Cl2MDP计算)
						0	0.2	0.4	0.6	0.8
	空白对照组明胶微粒组Cl2MDP组Cl2MDP-明胶微粒组	01.5％//	//0.9％35.4％	//1.7％59.6％	//2.1％79.2％						//1.2％94.8％

4.二氯亚甲基二膦酸明胶微粒对大鼠ITP模型的实验性治疗

4.1ITP模型的建立

采用未经任何处理的兔抗SD大鼠血小板血清制备动物ITP模型。每隔24h重复静脉注射兔抗鼠血小板血清150μl(用SD大鼠血浆稀释至500μl)，于注射前(0h)、注射后4h、24h、48h、72h、96h取血进行血小板计数和出血时间测定。以每24h静脉注射未经鼠血小板免疫过的正常兔血清500μl为对照。ITP模型的SD大鼠外周血小板计数维持在一个小于50,000/μl的低水平(与对照组比较，p＜0.01)。对照组SD大鼠的出血时间均＜2min，而实验组(ITP模型)的出血时间均＞4min(p＜0.01)。

4.2Cl₂MDP-明胶微粒对鼠ITP模型的实验性治疗

明胶微粒和Cl₂MDP-明胶微粒对正常SD大鼠血象的影响。分别于24h、48h、72h、96h取血进行。

明胶微粒和Cl₂MDP-明胶微粒注射后对正常SD大鼠影响见表2。兔抗大鼠血小板血清多次同一剂量静脉注射后SD大鼠血小板计数的变化见图4。

表2明胶微粒和Cl₂MDP-明胶微粒注射后正常SD大鼠的血象变化

时间(h)		0	24	48	72
						明胶微粒	血小板(×10<sup>4</sup>/μl)	25.8±3.1	24.1±3.2	25.4±2.8	24.9±3.1
红细胞(×10<sup>4</sup>/μl)	819±77	788±80	801±85	813±82
					白细胞(×10<sup>3</sup>/μl)		8.7±3.6	10.4±4.0	9.7±3.5	9.2±3.9
Cl2MDP-明胶微粒	血小板(×10<sup>4</sup>/μl)	24.5±3.9	25.4±3.6	24.9±3.2							26.0±4.2
					红细胞(×10<sup>4</sup>/μl)	799±76	787±81	805±67	812±71
	白细胞(×10<sup>3</sup>/μl)	9.6±3.3	8.9±3.6	8.4±3.8						9.3±4.1

不同剂量二氯亚甲基二膦酸明胶微粒对大鼠模型的血小板变化实验见图5。说明Cl₂MDP-明胶剂量为8mg左右效果好。

Claims (3)

1.一种携带二氯亚甲基二膦酸的明胶微粒，其特征在于它是以经过处理的明胶微粒为载体，明胶微粒粒径为200nm～700nm，微粒表面携带正电荷，Zeta电位为5～30mV，通过电荷间的静电吸附，将二氯亚甲基二膦酸连接到明胶微粒的表面，再用明胶包覆后得到携带二氯亚甲基二膦酸的明胶微粒。

2.如权利要求1所述的携带二氯亚甲基二膦酸的明胶微粒的制备方法，其特征在于其制备方法为：

a)在浓度为1mG/ml的明胶微粒溶液中加入12～20mg的二氯亚甲基二膦酸混匀，室温下置于振荡器上轻微振荡1h；

b)以6000r/min离心10min，弃上清液，沉淀用双蒸水洗涤两次；离心，得沉淀，即为携带二氯亚甲基二膦酸的明胶微粒；

c)明胶包覆：将30mg携带二氯亚甲基二膦酸的明胶微粒再加入到50ml浓度为1％重量比的明胶溶液中搅拌10～30min，离心，得沉淀产物，经干燥后为最终产品；

其中明胶微粒采用二次单凝聚法制备，具体做法为：

1)取0.5g的明胶溶于10ml水中，溶胀30min，放在55℃的水浴中加热溶解，配制成溶液；

2)快速倾倒入8～9ml丙酮，静置分层，去掉上层的白色浊液和固体，余下的部分重新在水浴中溶解；

3)用醋酸调节pH值在3.2-3.8之间，滴加丙酮溶液至液体呈乳白色为止；

4)快速转移到圆底烧瓶，在冰浴中用磁力搅拌器搅拌10min后，加入200ml 8％重量比的戊二醛固化30min；

5)停止搅拌，从冰浴中取出，进行后处理，所述后处理为透析去除未成球的明胶、制备过程中加入的丙酮和戊二醛。

3.如权利要求1所述的携带二氯亚甲基二膦酸的明胶微粒在制造治疗免疫性血小板减性紫癜、获得性免疫缺陷综合症和伤寒疾病药物中的应用。

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