CN100355775C

CN100355775C - 一种海鞘多肽及其制备方法

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Publication number: CN100355775C
Application number: CNB2006100330613A
Authority: CN
Inventors: 万新祥; 胡文军; 曾凡林; 王瑞
Original assignee: Southern Medical University
Current assignee: Southern Medical University
Priority date: 2006-01-20
Filing date: 2006-01-20
Publication date: 2007-12-19
Anticipated expiration: 2026-01-20
Also published as: CN1817899A

Abstract

本发明海鞘多肽及其制备方法属于生化与生物医药领域。本发明海鞘多肽具有式(I)所示序列，分子量是711.4。其制备方法首先用乙醇常温浸泡减压回收乙醇得浸膏；将浸膏用有机溶剂萃取，浓缩；依次使用大孔树脂色谱法、硅胶色谱法、Sephadex LH20色谱法分离提纯得到，其中硅胶色谱法用CHCl₃∶MeOH∶H₂O比为7∶3∶0.5洗脱剂梯度洗脱，收集薄层色谱紫外光检识R_f为0.5～0.6的洗脱液浓缩。本发明海鞘多肽具有抗HBV作用，本发明海鞘多肽制备方法具有提取方法工艺简单，设备投资少，生产过程便于控制，原料来源广泛等优点。Lys-Gly-Lys-Ile-Glu-His (I)。

Description

一种海鞘多肽及其制备方法

发明领域

本发明属于生化与生物医药领域，具体涉及海鞘多肽及其制备方法。

背景技术

海鞘(Ascidia)是尾索动物亚门(Uronordata)纲的尾索动物，从海鞘中提取的抗癌成分已有少数进入临床或临床前阶段。研究发现海鞘类生物含有生物碱类、肽类、吲哚类、重金属螯合剂、多硫化物、大环内酯、萜类等数十种化合物，具有较强的抗肿瘤、抗病毒、抗菌、诱导肌浆网释钙、抑制钙调蛋白活性等多种生理活性，尤其以对抗肿瘤的研究报道较多(李志军，薛长湖，王长海.海鞘中的抗肿瘤生物活性物质.海洋通报，2004，23(5)：82-86；季宇彬，池文杰.海鞘中抗肿瘤活性物质的研究.哈尔滨商业大学学报(自然科学版)，2005，21(1)：6-10.)。中国专利CN03111710.4提及从海鞘中提取具有抑制血小板聚集和抗凝血作用的海鞘脂肪酸，中国专利CN01812043.1提及从海鞘中提取具有抗肿瘤和抗病毒活性作用的海鞘素，中国专利CN03807576.8提及海鞘素及其制备方法。目前海鞘类的专利申请在海鞘素和脂肪酸等方面有报道，而从海鞘中提取海鞘多肽及其在治疗乙肝中的应用尚未见报道。

发明内容

本发明目的是提供一种具有抗HBV作用的海鞘多肽。

本发明另一目的是提供一种具有抗HBV作用的海鞘多肽的制备方法。

本发明所述的海鞘多肽用下序列式表示：

Lys-Gly-Lys-Ile-Glu-His(1)。

式中Lys是赖氨酸，Gly是甘氨酸，Ile是异亮氨酸，Glu是谷氨酸，His是组氨酸。

本发明所述的式(1)表示的海鞘多肽，是浅黄色针状结晶，茚三酮反应阳性，分子量为711.4。

本发明所述的海鞘多肽制备方法，含有以下步骤：首先用乙醇浸泡海鞘，回收乙醇得到浸膏；将浸膏用水溶解，然后用有机溶剂萃取得到海鞘粗提物；最后使用色谱法分离提纯。

本发明海鞘多肽制备方法中海鞘粗提物制备方法是，用海鞘等重量的70-90％(体积浓度v/v)乙醇常温浸泡2周，减压回收乙醇得浸膏；将浸膏用水溶解，然后用有机溶剂萃取，浓缩水溶液得到海鞘粗提物。

本发明所述水的用量为浸膏2～3倍。其中所述倍数是指水的体积(ml)是浸膏质量(g)的倍数。

本发明所述有机溶剂是乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、正丁醇、乙醚、石油醚、正己烷、环己烷其中一种或两种以上。本发明所述的有机溶剂较好是二氯甲烷或氯仿其中一种，最好是氯仿。本发明所述的萃取次数为2～4次。本发明每次萃取所用有机溶剂用量和水的用量比为体积比1∶1。

本发明所述色谱法可以是大孔树脂色谱法、硅胶色谱法、Sephadex LH20色谱法其中一种或两种以上。本发明所述色谱法最好是依次使用大孔树脂色谱法、硅胶色谱法、SephadexLH20色谱法。

本发明所述的大孔树脂色谱法是本领域常用的大孔树脂色谱方法。其具体步骤为：海鞘粗提物上大孔树脂色谱柱后，用50％乙醇洗脱至柱无色，浓缩干燥。本发明所述的大孔树脂最好是非极性大孔树脂。本发明所述的大孔树脂是非极性或弱极性聚苯乙烯大孔树脂，例如HPD-100、D-101、AB-8、HP-20、HPD-300。本发明所述的大孔树脂最好是D-101大孔吸附树脂。

本发明所述的硅胶柱色谱方法，是本领域常用的硅胶色谱方法。本领域技术人员可以依据本领域知识得到最佳的参数。本发明硅胶色谱方法具体步骤为：将海鞘多肽粗提物上硅胶色谱柱后，用CHCl₃：MeOH∶H₂O比为7∶3∶0.5的洗脱剂梯度洗脱，流速为2～3ml/分钟，收集薄层色谱紫外光检识R_f为0.5～0.6的洗脱液，浓缩。其中薄层色谱条件：展开剂是正丁醇∶水∶醋酸为4∶ 5∶1；显色剂是5％硫酸乙醇液。

本发明所述的Sephadex LH20色谱法，具体步骤为：将海鞘多肽粗提物上Sephadex LH20凝胶色谱柱，用CH₃OH∶H₂O以1∶1的洗脱剂洗脱，流速为1～2ml/分钟，收集薄层色谱紫外光检识R_f约为0.55的洗脱液，浓缩。其中薄层色谱条件：展开剂是正丁醇∶水∶醋酸为4∶5∶l；显色剂是5％硫酸乙醇液。

本发明所述的Sephadex LH20为羟丙基葡聚糖凝胶。

本发明所述的海鞘(Ascidian)可以是尾索动物亚门(Uronordata)海鞘纲的尾索动物皱瘤海鞘[Styela plicata(lesueur)]。

本发明所述的海鞘多肽制备方法，还可以对海鞘进行预处理，具体步骤是将新鲜海鞘清洗、沥干、干燥、粉碎；干燥温度低于80度；干燥包括风干、烘干、真空干燥等。

本发明所述的海鞘多肽的制备方法最好是，首先将海鞘用等重量的70～90％(体积浓度)乙醇常温浸泡2周，减压回收乙醇得浸膏；将浸膏用2～3倍的水溶解，然后用和水体积相同的氯仿萃取2～4次，浓缩得到海鞘粗提物；将海鞘粗提物上大孔树脂色谱柱后，用50％乙醇洗脱至柱无色，浓缩干燥得到海鞘多肽粗提取物；将上述海鞘多肽粗提物上硅胶色谱柱后，用CHCl₃∶MeOH∶H₂O比为7∶3∶0.5的洗脱剂梯度洗脱，流速为2～3ml/分钟，收集薄层色谱紫外光检识R_f为0.5～0.6的洗脱液，浓缩得到海鞘多肽粗提取物；将上述海鞘多肽粗提物上Sephadex LH20凝胶色谱柱后，用CH₃OH∶H₂O以1∶1的洗脱剂洗脱，流速为1～2ml/分钟，收集薄层色谱紫外光检识R_f约为0.55的洗脱液，浓缩得到海鞘多肽。

本发明海鞘多肽有抗HBV作用。为了更好的理解本发明，下面用本发明的相关药理试验及结果来说明其用途。

本发明所述的抗HBV细胞实验的方法：用0.25％胰蛋白酶将2.2.15细胞分散成单个细胞悬液，按3×10⁴细胞/孔分种于96孔板，2天后换用含药培养液，每个浓度加4孔。样品用细胞培养液分别稀释成16、8、4mg/ml 3个浓度，与细胞作用12天后，吸取细胞上清液，用ELISA法测定HBsAg、HBeAg滴度。余下细胞用MTT法测定药物的细胞毒性。实验以拉米呋定作为阳性对照药物，以未加任何药物的细胞作为细胞对照组。

1.1 ELISA法测HBsAg、HBeAg滴度。

1.1.1每孔加入待测标本50μl，设阴性、阳性对照各2孔，并设空白对照1孔。

1.1.2每孔加入酶结合物50μl(除空白对照外)，充分混匀后封板，置37℃孵育8小时。

1.1.3手工洗板：弃去孔内液体，洗涤液储满各孔，静置5秒后甩干，重复5次后拍干。

1.1.4每孔加入显色剂A液、B液各50μl，充分混匀，封板，置37℃孵育15分钟；

1.1.5每孔加入终止液50μl，混匀；

1.1.6用酶标仪测定。取波长450nm，先用空白孔校零，然后读取各孔OD值，阴性对照OD值低于0.05作为0.05计算，高于0.05按照实际OD计算。

1.2 MTT法测定药物对细胞生长的半数毒性浓度。

向细胞中加入400μg/ml MTT液0.1ml/孔，37℃ 5％CO₂孵育4h，可见黄黑色甲瓒颗粒，弃去MTT液，加入100％ DMSO 0.1ml/孔，待甲瓒颗粒完全溶解(约10min)后，用紫外分光光度计于波长570nm处测定吸光度A值，以4孔未加细胞的100％ DMSO为空白对照。

1.3实验结果的计算。

半数抑制浓度(IC₅₀)是HBsAg或HBeAg抑制率为50％时的药物浓度，半数毒性浓度(TC₅₀)是实验孔存活细胞为细胞对照孔50％时的浓度。

海鞘多肽的抗HBV效果如表1所示，海鞘多肽对细胞的毒性作用如表2所示。根据计算，本发明所述的海鞘多肽抑制HBsAg的半数有效浓度分别3.65mg/ml，抑制HBeAg的半数有效浓度分别为4.40mg/ml。该多肽在高浓度时均表现出一定的毒性，但在所测浓度中，细胞破坏率均未达到50％，故其半数毒性浓度TC₅₀大于64mg/ml，其抑制HBsAg治疗指数TI大于17.53，抑制HBeAg治疗指数TI大于14.54。

表1海鞘多肽的抗HBV效果

样品	剂量mg.mL¹	HBsAg		HBeAg
		HBsAg		HBeAg		OD±S	抑制率％	OD±S	抑制率％
		海鞘多肽拉米呋定	64321684421	0.071±0.0010.085±0.0040.120±0.0020.301±0.0370.487±0.0870.110±0.0040.275±0.0080.541±0.010	92.82^91.28^87.42^67.44^46.91^88.52^70.31^40.94^	OD±S	抑制率％	OD±S	抑制率％	0.103±0.0140.164±0.0120.309±0.0970.492±0.0350.676±0.0740.299±0.0670.464±0.0410.793±0.123	92.42^87.76^76.66^62.66^48.58^77.43^64.80^39.63^
细胞对照空白对照		海鞘多肽拉米呋定	64321684421		92.82^91.28^87.42^67.44^46.91^88.52^70.31^40.94^	0.912±0.0070.006		1.311±0.0070.004			92.42^87.76^76.66^62.66^48.58^77.43^64.80^39.63^

*与细胞对照相比，p＜0.05。

表2 海鞘多肽对细胞的毒性作用

样品	剂量	OD±S	破坏率(％)
样品	剂量	OD±S	破坏率(％)	海鞘多肽拉米呋定	mg.mL¹64321684421	0.712±0.035^0.875±0.074^0.981±0.0991.121±0.1001.103±0.1031.090±0.1141.241±0.2011.115±0.123	35.8321.1211.55--1.71--
	空白对照细胞对照	0.0011.109±0.095		海鞘多肽拉米呋定	mg.mL¹64321684421		35.8321.1211.55--1.71--

*与细胞对照相比，p＜0.05 。

本发明所述的海鞘多肽及其制备方法中，海鞘广泛分布于南海海域，产量丰富，便于采集，提取方法工艺简单，设备投资少，生产过程便于控制。

具体实施方式

以下实施例使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1

新鲜皱瘤海鞘50Kg，去内脏，洗净，在室温下用75％乙醇50kg浸泡2周，用旋转蒸发器回收酒精，得提取物1000g。取提取物200g用500ml蒸馏水溶解，用500ml的二氯甲烷萃取，收干溶剂取得水溶性部分825g；再用500ml蒸馏水尽量溶解，以相同体积的正丁醇萃取，收干溶剂得水溶性部分712g；接着取水溶性部分100g，上D-101大孔树脂柱色谱，用50％乙醇500ml洗脱，流速为3ml/分钟，收干溶剂得产物14g；以此进行硅胶柱色谱，用CHCl₃：MeOH∶H₂O比为7∶3∶0.5的洗脱剂梯度洗脱，流速为3ml/分钟，收集薄层色谱紫外光检识R_r为0.5～0.6的洗脱液，收干溶剂得海鞘多肽粗提物，最后以此上Sephadex LH20凝胶柱色谱，用CH₃OH∶H₂O以1∶1的洗脱剂洗脱，流速为1ml/分钟，收集薄层色谱紫外光检识R_f约为0.55的洗脱液，收干溶剂得到海鞘多肽146mg。上述薄层层洗条件：展开剂是正丁醇∶水∶醋酸为4∶5∶1；显色剂用5％硫酸乙醇液。

实施例2

新鲜皱瘤海鞘50Kg，去内脏，洗净，在室温下用75％乙醇50kg浸泡2周，用旋转蒸发器60℃回收酒精至无味，得提取物1000g。取提取物200g用500ml蒸馏水尽量溶解，以相同体积的氯仿萃取，收干溶剂取得水溶性部分805g；再用500ml蒸馏水尽量溶解，以相同体积的正丁醇萃取，收干溶剂得水溶性部分683g：接着取水溶性部分100g，上D-101大孔树脂柱色谱，用50％乙醇500ml洗脱，流速为2.5ml/分钟，收干溶剂得产物10g；以此进行硅胶柱色谱，用CHCl₃∶MeOH∶H₂O比为7∶3∶0.5的洗脱剂梯度洗脱，流速为2.5ml/分钟，收集薄层色谱紫外光检识R_f为0.5～0.6的洗脱液，收干溶剂得粗产物，最后以此分别上Sephadex LH20凝胶柱色谱，用CH₃OH∶H₂O以1∶1的洗脱剂洗脱，流速为1.5ml/分钟，收集薄层色谱紫外光检识R_f约为0.55的洗脱液，收干溶剂得到海鞘多肽102mg。上述薄层色谱条件：展开剂是正丁醇∶水∶醋酸为4∶5∶1；显色剂用5％硫酸乙醇液。

实施例3

新鲜皱瘤海鞘50Kg，去内脏，洗净，在室温下用90％乙醇50kg浸泡2周，用旋转蒸发器60℃回收酒精至无味，得提取物1300g。取提取物200g用600ml蒸馏水溶解，用相同体积的氯仿萃取，收干溶剂取得水溶性部分830g；上述萃取方法重复3次，收干溶剂得水溶性部分730g；接着取水溶性部分100g，上AB-8大孔树脂柱色谱，用50％乙醇500ml洗脱，流速为2ml/分钟，收干溶剂得产物15g；以此进行硅胶柱色谱，用CHCl₃∶MeOH∶H₂O比为7∶3∶0.5的洗脱剂梯度洗脱，流速为3ml/分钟，收集薄层色谱紫外光检识R_f为0.5～0.6的洗脱液，收干溶剂得海鞘多肽粗提物，最后以此上Sephadex LH20凝胶柱色谱，用CH3OH∶H2O以1∶1的洗脱剂洗脱，流速为2ml/分钟，收集薄层色谱紫外光检识R_f约为0.55的洗脱液，收干溶剂得到海鞘多肽126mg。上述薄层色谱条件：展开剂是正丁醇∶水∶醋酸为4∶5∶1；显色剂用5％硫酸乙醇液。

实施例4

新鲜皱瘤海鞘50Kg，去内脏，洗净，在室温下用80％乙醇50kg浸泡2周，用旋转蒸发器60℃回收酒精至无味，得提取物1300g。取提取物200g用400ml蒸馏水溶解，用相同体积的氯仿萃取，收干溶剂取得水溶性部分825g；用600ml蒸馏水溶解，用相同体积的乙酸乙酯萃取，收干溶剂取得水溶性部分725g；用600ml蒸馏水溶解，用相同体积的正己烷萃取，收干溶剂取得水溶性部分605g，收干溶剂得水溶性部分512g；接着取水溶性部分100g，上D-101大孔树脂柱色谱，用50％乙醇500ml洗脱，流速为2ml/分钟，收干溶剂得产物13g；以此进行硅胶柱色谱，用CHCl₃∶MeOH∶H₂O比为7∶3∶0.5的洗脱剂梯度洗脱，流速为3ml/分钟，收集薄层色谱紫外光检识R_f为0.5-0.6的洗脱液，收干溶剂得海鞘多肽粗提物，最后以此上Sephadex LH20凝胶柱色谱，用CH3OH∶H2O以1∶1的洗脱剂洗脱，流速为2ml/分钟，收集薄层色谱紫外光检识R_f约为0.55的洗脱液，收干溶剂得到海鞘多肽146mg。薄层色谱条件：展开剂是正丁醇∶水∶醋酸为4∶5∶1；显色剂用5％硫酸乙醇液。

实施例5

新鲜皱瘤海鞘50Kg，去内脏，洗净，在室温下用75％乙醇50kg浸泡2周，用旋转蒸发器60℃回收酒精至无味，得提取物1000g。取提取物200g用500ml蒸馏水溶解，用相同体积的二氯甲烷萃取，再用相同体积的乙酸乙酯萃取，收干溶剂得水溶性部分712g；接着取水溶性部分100g，上HDP-100大孔树脂柱色谱，用50％乙醇500ml洗脱，流速为3ml/分钟，收干溶剂得产物14g；以此进行硅胶柱色谱，用CHCl₃∶MeOH∶H₂O比为7∶3∶0.5的洗脱剂梯度洗脱，流速为3ml/分钟，收集薄层色谱紫外光检识R_f为0.5-0.6的洗脱液，收干溶剂得海鞘多肽粗提物，最后以此上Sephadex LH20凝胶柱色谱，用CH3OH∶H2O以1∶1的洗脱剂洗脱，流速为2ml/分钟，收集薄层色谱紫外光检识R_f约为0.55的洗脱液，收干溶剂得到海鞘多肽146mg。薄层色谱条件：展开剂是正丁醇∶水∶醋酸为4∶5∶1；显色剂用5％硫酸乙醇液。

Claims

1.一种海鞘多肽，其氨基酸序列为：

Lys-Gly-Lys-Ile-Glu-His，

2.权利要求1所述的海鞘多肽，其特征是分子量为711.4。

3.一种权利要求1或2所述的海鞘多肽的制备方法，首先用海鞘等重量的70～90％体积浓度的乙醇常温浸泡2周，减压回收乙醇得浸膏；将浸膏用2～3倍水溶解，然后用和水同体积的有机溶剂萃取2～4次，浓缩水溶液得到海鞘粗提物；最后依次用大孔树脂色谱法、硅胶色谱法、Sephadex LH20色谱法分离提纯得到，其中硅胶色谱法是将海鞘多肽粗提物上硅胶色谱柱后，用CHCl₃∶MeOH∶H₂O比为7∶3∶0.5的洗脱剂梯度洗脱，流速为2～3ml/分钟，收集薄层色谱紫外光检识R_f为0.5～0.6的洗脱液，浓缩，其中薄层色谱条件：展开剂是正丁醇∶水∶醋酸为4∶5∶1；显色剂是5％硫酸乙醇液。

4.权利要求3所述的海鞘多肽制备方法，其特征在于有机溶剂是乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、正丁醇、乙醚、石油醚、正己烷、环己烷其中一种以上。

5.权利要求4所述的海鞘多肽制备方法，其特征在于有机溶剂是氯仿。

6.权利要求3所述的海鞘多肽制备方法，其特征在于大孔树脂色谱法具体步骤为：海鞘粗提物上D-101大孔树脂色谱柱后，用50％乙醇洗脱至柱无色，浓缩干燥。

7.权利要求3所述的海鞘多肽制备方法，其特征在于所述的Sephadex LH20色谱法，具体步骤为：将海鞘多肽粗提物上Sephadex LH20凝胶色谱柱，用CH₃OH∶H₂O以1∶1的洗脱剂洗脱，流速为1～2ml/分钟，收集薄层色谱紫外光检识R_f为0.55的洗脱液，浓缩，其中薄层色谱条件：展开剂是正丁醇∶水∶醋酸为4∶5∶1；显色剂是5％硫酸乙醇液。