CN100348633C - Dna印迹热敏高分子材料及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明以鲑鱼睾DNA印迹热敏性高分子聚N-异丙基丙烯酰胺，合成可对鲑鱼睾DNA分子进行识别的聚合物。首先将模板DNA包埋聚N-异丙基丙烯酰胺中，再利用聚N-异丙基丙烯酰胺的亲疏水性质随温度变化的特征，在交替变化的温度环境下是聚合物在水中膨胀和收缩，促使模板大分子从聚合物母体中洗出，从而得到含DNA印迹空洞的聚合物。该聚合物在液相色谱中显示出了对鲑鱼睾DNA的识别特性。
Description
(一)所属技术领域：
本发明属于生物大分子印迹技术中DNA印迹聚合物的合成领域，特别是一种DNA印迹热敏高分子材料及其制备方法，该技术是在小分子印迹技术基础上发展起来的，用于制备识别特定DNA分子的新材料，并为解决大分子印迹中模板分子脱出问题提供了一种途径。
(二)背景技术：
DNA印迹聚合物是一种可识别特定DNA大分子的材料。它作为生物大分子印迹技术的发展来源于小分子印迹技术(MIT)(参见Wulff，G.Molecular imprinting in cross-linked materials with the aid of moleculartemplate a way towards artificial antibodies.Angew.Chem.Int.Ed.，1995，34：1821-1832.)。MIT已经广泛应用在手性分离的HPLC固定相、传感器设计、高分子催化剂及人工受体/抗体等领域。其方法是将模板分子溶于或分散于单体溶液中，聚合后的聚合物网络会包埋住模板分子。在强烈的洗涤下，模板分子从聚合物中脱除，聚合物内部便形成了大量与模板分子在形状上互补的空穴，而这些空洞可特异性地结合模板分子。
对于小分子化合物模板，它们易于从聚合物中脱出，形成空洞。聚合物表面印迹蛋白质虽然可使蛋白质从聚合物表面顺利洗脱(参见Shi，H.；Tsai，W.B.；Garrison，M.D.；Ferrari，S.；&Ratner，B.D.Template-imprinted nanostructured surfaces for protein recognition.Nature，1999，398：593-597)，但由于聚合物表面积太小以致不能对大分子进行有效地识别和分离。要获得大的比表面，就必须对聚合物本体内部进行印迹。而大分子印迹的难点就在于如何将生物大分子模板从聚合物内部洗涤出来。因为DNA是生物大分子，其尺寸远大于聚合物的网格，故一旦被包埋就难以从聚合物中脱出。
(三)发明内容：
本发明的目的在于提供一种DNA印迹热敏高分子材料及其制备方法，该方案拟以热敏高分子化合物作为包埋DNA的聚合物，利用交替变化的温度使聚合物的结构经历膨胀和收缩的往复变化，从而促使大分子模板从聚合物内部脱出，这样，就可在一定程度上得到DNA印迹空洞的聚合物，并可在色谱固定相上对DNA分子进行识别。
本发明的技术方案：一种DNA印迹热敏高分子材料，其特征在于：该高分子材料具有N-异丙基丙烯酰胺的单体单元结构；该高分子材料是交联型聚合物；该高分子材料结构中含有DNA所印迹的空洞。
上述所说的DNA印迹热敏高分子材料，随着温度的变化聚合物在水溶液中的体积会发生变化。
上述所说的DNA印迹热敏高分子材料，其聚合物不溶于任何溶剂。
一种DNA印迹热敏高分子材料的制备方法，其特征在于它是由以下步骤构成：
(1)聚合物的制备：在10～20mL 50μg/mL的鲑鱼睾DNA的水溶液中加入5～10g的N-异丙基丙烯酰胺和2～4g的N，N′-亚甲基双丙烯酰胺；溶液在5℃下孵化1～3h，以便在聚合前用DNA分子对单体进行定向；在氮气保护下，以0.35～0.5g的过硫酸钾-亚硫酸氢钠引发自由基聚合反应，在5℃下强烈搅拌，直至体系交联固化；挤压碎胶冻体通过200目的筛网；
(2)模板的脱出：以50℃和10℃的蒸馏水交替洗涤聚合物各3～5次，在用索氏提取器萃取1～3h，尽可能将DNA从聚合物中除去；
(3)模板脱出量的检测：每间隔20min，用紫外-可见分光光度计测定280nm处的吸收值，直至吸收值不再增长为止；依照标准曲线，计算最终的DNA浓度；以原始浓度减去终态浓度就可推算出聚合物中印迹洞的数量，以推算DNA分子的脱出量；
(4)高性能液相色谱：DNA印迹聚合物在氯仿-丙酮(15∶3体积比)中匀浆，利用气动流体泵，在300巴的压强下，以丙酮为溶剂装载到不锈钢柱内；采用甲醇-醋酸(8∶1体积比)洗提的方法从聚合物中吸附和萃取DNA；在室温下洗提，并用分光光度计在280nm处进行跟踪。
本发明的工作原理在于：鲑鱼睾动物DNA是一种脱氧核糖核酸大分子，它作为模板溶于单体N-异丙基丙烯酰胺(NIPAAm)中。NIPAAm与N，N′-亚甲基双丙烯酰胺(EBA)共聚交联，形成聚合物网络，同时DNA大分子包埋其中。
由于DNA分子三维尺度很大，难以从交联聚合物的分子网络中溢出，不能形成DNA所印迹的聚合物纳米洞。这是大分子印迹聚合物技术上的难题之一。选择热敏高分子化合物聚PNIPAAm来包埋大分子DNA，目的是利用这种聚合物的体积随温度的可变性来促使DNA分子的脱出。PNIPAAm的亲疏水性能在30～35℃有一个转变。把包埋DNA的PNIPAAm反复置于10℃和50℃的水介质环境中，在每种温度下放置1h。使聚合物进行多次亲水和疏水的变换。交联的PNIPAAm在水中具有低温下吸水膨胀，在较高温度下收缩的特点。在吸水膨胀时，聚合物分子网络伸展开来，网格撑大，有利于DNA大分子从网格中扩散。在收缩时，聚合物网络收紧折叠，但网络间的缝隙和缺陷反而被撑大，形成聚合物的空穴和孔道，有利于DNA大分子从孔道中扩散。此外，聚合物网络的反复折叠和伸展，也有利于将DNA大分子从聚合物中挤压出去。
基于上述原理，一些DNA大分子会沿着孔道和网格脱离聚合物母体，母体所遗留下的痕迹就可作为识别这一生物大分子的空洞。这些空洞与DNA分子的3D结构在形状上互补。所以，这些印迹的空洞能够识别与模板相同的DNA。
被碾碎、过筛和萃取的聚合物用于高效液相色谱的固定相。装载在分析柱上的DNA印迹的和非印迹PNIPAAm分别来分辨DNA。后者在8.6min时DNA从聚合物中被洗提出来，而前者在相同的保留时间下并没有峰出现，这说明RAN倾向于结合那些在DNA印迹的聚合物。
本发明的优越性在于：利用热敏高分子材料体积随温度转换这一特征，迫使DNA大分子从高分子材料中的脱出，在一定程度上解决了生物大分子难以从包埋的母体中脱出的问题。
(四)具体实施方式：
实施例1：一种DNA印迹热敏高分子材料，其特征在于：该高分子材料具有N-异丙基丙烯酰胺的单体单元结构；该高分子材料是交联型聚合物；该高分子材料结构中含有DNA所印迹的空洞。
上述所说的DNA印迹热敏高分子材料，随着温度的变化聚合物在水溶液中的体积会发生变化。
上述所说的DNA印迹热敏高分子材料，其聚合物不溶于任何溶剂。
一种DNA印迹热敏高分子材料的制备方法，其特征在于它是由以下步骤构成：
1.聚合物的制备：
在10mL 50μg/mL的鲑鱼睾DNA的水溶液中加入5g的N-异丙基丙烯酰胺和2g的N，N′-亚甲基双丙烯酰胺；溶液在5℃下孵化1h，以便在聚合前用DNA分子对单体进行定向；在氮气保护下，以0.35g的过硫酸钾-亚硫酸氢钠引发自由基聚合反应，在5℃下强烈搅拌，直至体系交联固化；挤压碎胶冻体通过200目的筛网；
2.模板的脱出：
以50℃和10℃的蒸馏水交替洗涤聚合物各3次，每次1h，尽可能将DNA从聚合物中除去；
3.模板脱出量的检测：
每间隔20min，用紫外-可见分光光度计测定280nm处的吸收值，直至吸收值不再增长为止；依照标准曲线，计算最终的DNA浓度；以原始浓度减去终态浓度就可推算出聚合物中印迹洞的数量，以推算DNA分子的脱出量；
4.高性能液相色谱：
DNA印迹聚合物在氯仿-丙酮(15∶3体积比)中匀浆，利用气动流体泵，在300巴的压强下，以丙酮为溶剂装载到不锈钢柱内；采用甲醇-醋酸(8∶1体积比)洗提的方法从聚合物中吸附和萃取DNA；在室温下洗提，并用分光光度计在280nm处进行跟踪。
实施例2：一种DNA印迹热敏高分子材料，其特征在于：该高分子材料具有N-异丙基丙烯酰胺的单体单元结构；该高分子材料是交联型聚合物；该高分子材料结构中含有DNA所印迹的空洞。
上述所说的DNA印迹热敏高分子材料，随着温度的变化聚合物在水溶液中的体积会发生变化。
上述所说的DNA印迹热敏高分子材料，其聚合物不溶于任何溶剂。
一种DNA印迹热敏高分子材料的制备方法，其特征在于它是由以下步骤构成：
1.聚合物的制备：
在20mL 50μg/mL的鲑鱼睾DNA的水溶液中加入10g的N-异丙基丙烯酰胺和4g的N，N′-亚甲基双丙烯酰胺；溶液在5℃下孵化2h，以便在聚合前用DNA分子对单体进行定向；在氮气保护下，以0.5g的过硫酸钾-亚硫酸氢钠引发自由基聚合反应，在5℃下强烈搅拌，直至体系交联固化；挤压碎胶冻体通过200目的筛网；
2.模板的脱出：
以50℃和10℃的蒸馏水交替洗涤聚合物各5次，在用索氏提取器萃取3h，尽可能将DNA从聚合物中除去；
3.模板脱出量的检测：
每间隔20min，用紫外-可见分光光度计测定280nm处的吸收值，直至吸收值不再增长为止；依照标准曲线，计算最终的DNA浓度；以原始浓度减去终态浓度就可推算出聚合物中印迹洞的数量，以推算DNA分子的脱出量；
4.高性能液相色谱：
DNA印迹聚合物在氯仿-丙酮(15∶3体积比)中匀浆，利用气动流体泵，在300巴的压强下，以丙酮为溶剂装载到不锈钢柱内；采用甲醇-醋酸(8∶1体积比)洗提的方法从聚合物中吸附和萃取DNA；在室温下洗提，并用分光光度计在280nm处进行跟踪。
Claims (4)
1、一种DNA印迹热敏高分子材料，其特征在于：该高分子材料具有N-异丙基丙烯酰胺的单体单元结构；该高分子材料是交联型聚合物；该高分子材料结构中含有鲑鱼睾DNA所印迹的空洞。
2、根据权利要求1所述的DNA印迹热敏高分子材料，其特征在于其聚合物不溶于任何溶剂。
3、根据权利要求1所述的DNA印迹热敏高分子材料，其特征在于高分子材料随着温度的变化在水溶液中的体积会发生变化。
4、一种如权利要求1所述的DNA印迹热敏高分子材料的制备方法，其特征在于它是由以下步骤所构成：
(1)聚合物的制备：在10～20mL 50μg/mL的鲑鱼睾DNA的水溶液中加入5～10g的N-异丙基丙烯酰胺和2～4g的N，N＇-亚甲基双丙烯酰胺；溶液在5℃下孵化1～3h，以便在聚合前用DNA分子对单体进行定向；在氮气保护下，以0.35～0.5g的过硫酸钾-亚硫酸氢钠引发自由基聚合反应，在5℃下强烈搅拌，直至体系交联固化；挤压碎胶冻体通过200目的筛网；
(2)模板的脱出：以50℃和10℃的蒸馏水交替洗涤聚合物各3～5次，再用索氏提取器萃取1～3h，尽可能将DNA从聚合物中除去；
(3)模板脱出量的检测：每间隔20min，用紫外-可见分光光度计测定280nm处的吸收值，直至吸收值不再增长为止；依照标准曲线，计算最终的DNA浓度；以原始浓度减去终态浓度就可推算出聚合物中印迹洞的数量，以推算DNA分子的脱出量；
(4)高性能液相色谱：DNA印迹聚合物在氯仿-丙酮(15∶3体积比)中匀浆，利用气动流体泵，在300巴的压强下，以丙酮为溶剂装载到不锈钢柱内；采用甲醇-醋酸(8∶1体积比)洗提的方法从聚合物中吸附和萃取DNA；在室温下洗提，并用分光光度计在280nm处进行跟踪。
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