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CN100343673C - 脂质成分的测定方法和肾病检查用试剂 - Google Patents

脂质成分的测定方法和肾病检查用试剂 Download PDF

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Abstract

本发明的课题是提供简便的肾病检查手段，提供在该检查手段中利用的尿中脂质成分的测定方法。本发明的课题的解决手段是，提供了测定尿中含有的脂质成分的方法，是特征在于包括使用使尿中不溶性脂肪可溶化的充分的表面活性剂，和使用在脂肪成分作用的酶的脂质成分的测定方法和测定用试剂。另外，通过测定尿中含有的脂质成分，进一步除了该测定，通过组合进行尿中脂蛋白类和/或尿中脱辅基蛋白类的测定、或尿中含有的白血球表面抗原的测定，提供了简便的肾病检查手段。

Description

脂质成分的测定方法和肾病检查用试剂
技术领域
本发明涉及尿中脂质成分的测定方法和测定用试剂。本发明还涉及利用该测定方法的肾病检查手段。
背景技术
尿沉渣中含有的成分有来自肾的成分，从尿路混入的成分，以及在尿中析出的结晶成分等多种。检查沉渣的种类、量，在鉴别肾·尿路疾病和得知其程度上非常重要。这些通过常规染色法的镜检进行。另外，通过检查尿中巨噬细胞的表面抗原可诊断IgA肾病的病态(临床检查、42卷、588～590、1998)，通过尿沉渣脂肪染色进行尿中脂肪球和卵圆形脂肪体(以下，简称为脂肪体)的鉴别，可进行肾病的检查(检查和技术，26卷，441-446，1998)。
另外，在尿中出现的大型巨噬细胞是白血球的表面抗原CD14为阴性、25F9为阳性，与通常的巨噬细胞CD14阳性、25F9阴性有很大差异，而且，已知脂肪球、卵圆形脂肪体属于大型巨噬细胞，测定其作为肾病的检查是有用的(临床病理、47卷、总会号73、1999)。
但是，这些测定中的任一种都是利用染色的镜检、使用单克隆抗体的荧光标识免疫染色的镜检或流式细胞测量法等进行的。这些方法，由于通过对每个检体进行镜检或流式细胞测量法等进行检查，因此操作烦杂，且对多个检体的测定是困难的。
发明的公开
本发明的目的是提供简便的肾病的检查手段。为解决上述课题，本发明者们进行了深入研究，结果发现，测定的尿中脂质成分的量明显暗示与肾病的关联性。
另外，由于尿中的脂质成分与血清中含有的脂质成分的量相比是微量的，因此需要敏感度好的脂质成分的测定方法。本发明者们进一步进行研究的结果是，着眼于与肾病相关的尿中脂肪球和卵圆形脂肪含有的脂肪颗粒，发现通过使用表面活性剂对其进行可溶化，可对其中含有的脂质成分进行测定，并完成了本发明的测定尿中含有的脂质成分的方法。另外，关于本发明中的“可溶化”的意思如后所述。
即，本发明是
1.肾病的检查手段，其特征在于测定尿中含有的脂质成分。
2.前述1中记载的肾病的检查手段，其特征在于，通过使用与脂质成分作用的酶测定前述尿中含有的脂质成分。
3.前述2中记载的肾病的检查手段，其特征在于，前述与脂质成分作用的酶是1种或2种以上选自催化分解反应、脱氢反应、或氧化反应的酶。
4.前述1～3任一项中记载的肾病的检查手段，其特征在于，前述脂质成分是尿中的脂肪滴、脂肪体或脂肪球的至少任意之1或2以上中含有的脂质成分。
5.前述1～4任一项中记载的肾病的检查手段，其特征在于，前述脂质成分是1种或2种以上选自中性脂肪及其衍生物、磷脂及其衍生物、过氧化脂质、固醇类、脂肪酸、脂肪酸盐、脂肪酸酯、脂肪醇、脂肪醛、糖脂、鞘脂、前列腺素、类胡萝卜素的脂质成分。
6.尿中含有的脂质成分的测定方法，其特征在于使用使尿中的不溶性脂肪可溶化或分散达到均质的手段。
7.前述6中记载的测定方法，其特征在于，使前述尿中的不溶性脂肪可溶化或分散达到均质的手段是使用表面活性剂。
8.前述6或7中记载的测定方法，其特征在于，前述尿中含有的脂质成分是脂肪滴、脂肪体或脂肪球的至少任意之1或2以上中含有的脂质成分。
9.前述6～8任一项中记载的测定方法，其特征在于，前述脂质成分是1种或2种以上选自中性脂肪及其衍生物、磷脂及其衍生物、过氧化脂质、固醇类、脂肪酸、脂肪酸盐、脂肪酸酯、脂肪醇、脂肪醛、糖脂、鞘脂、前列腺素、类胡萝卜素的脂质成分。
10.前述6～9任一项中记载的测定方法，其特征在于，前述脂质成分至少是固醇类或磷脂中的任一种。
11.前述6～10任一项中记载的测定方法，其特征在于，前述表面活性剂是具有可溶化脂肪滴、脂肪体或脂肪球中至少任意之1或2以上作用的，可使脂肪滴、脂肪体或脂肪球任一中含有的脂质成分可溶化·分散·游离成为均质的物质。
12.前述6～11任一项中记载的测定方法，其特征在于，前述表面活性剂是非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、两性离子表面活性剂、或配糖体。
13.前述6～12任一项中记载的测定方法，其特征在于，前述表面活性剂是2种以上并用。
14.前述1中记载的肾病的检查手段，其特征在于是利用前述6～13任一项中记载的方法。
15.权利要求1中记载的肾病的检查手段，其特征在于，是在前述2或3记载的检查手段中，进一步利用前述6～13任一项中记载的方法。
16.前述1～3、14或15任一项中记载的肾病的检查手段，其特征在于，至少与尿中脂蛋白类或尿中脱辅基蛋白类中的任意之1或2以上的测定组合进行。
17.前述1～3、14～16任一项中记载的肾病的检查手段，其特征在于，与尿中含有的白血球的表面抗原的测定或检出组合进行。
18.尿中脂质成分测定用试剂，是将前述6～13任一项中记载的测定方法中必须的试剂试剂盒化或以单独产品构成的。
本发明是肾病的检查手段，其特征在于测定尿中含有的脂质成分。这里，手段是指为达到目的的方法和/或介质。
另外，作为测定尿中微量的脂质成分的方法，本发明者们发现，通过使用足够的表面活性剂，使尿中的不溶性脂肪可溶化或分散达到均质化，可进行尿中脂质成分的测定。
通过本发明的尿中含有的脂质成分的测定方法测定的尿中的脂质成分，主要是脂肪滴、脂肪体和/或脂肪球中含有的脂质成分，而且是1种或2种以上选自中性脂肪及其衍生物、磷脂及其衍生物、过氧化脂质、固醇类、脂肪酸、脂肪酸盐、脂肪酸酯、脂肪醇、脂肪醛、糖脂、鞘脂、前列腺素、类胡萝卜素的脂质成分。
在本发明的尿中含有的脂质成分的测定方法中使用的酶，可以是1种或2种以上选自催化分解反应、脱氢反应、或氧化反应的酶。
在本发明的尿中含有的脂质成分的测定方法中使用的表面活性剂，可以是具有可溶化或分散脂肪滴、脂肪体或脂肪球进行均质化作用的，可使脂肪滴、脂肪体或脂肪球任一中含有的脂质成分可溶化·分散·游离成为均质的物质。表面活性剂可以2种以上组合使用，且可以是非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、两性离子表面活性剂或配糖体。
本发明的肾病检查手段的特征在于利用前述本发明的尿中含有的脂质成分的测定方法，测定的脂质成分可以是尿中的脂肪滴、脂肪体和/或脂肪球中含有的脂质成分，而且可以是1种或2种以上选自中性脂肪及其衍生物、磷脂及其衍生物、过氧化脂质、固醇类、脂肪酸、脂肪酸盐、脂肪酸酯、脂肪醇、脂肪醛、糖脂、鞘脂、前列腺素、类胡萝卜素的脂质成分。
本发明的肾病的检查手段，可以是前述本发明的尿中含有的脂质成分的测定方法与尿中脂蛋白和/或尿中脱辅基蛋白的测定或尿中含有的白血球的表面抗原的测定或检出组合进行。
另外，本发明提供将前述尿中含有的脂质成分的测定方法中必须的试剂试剂盒化或以单品构成的尿中脂质成分测定用试剂。
附图的简要说明
对于122例尿检体，测定磷脂、游离胆固醇、胆固醇、脱辅基A1(apo A1)，研究与疾病的关系。图1表示的是尿中脂质关联标记物(油红阳性粒子)和疾病的关系，图2表示的是尿中脂质关联标记物(游离胆固醇)与疾病的关系，图3表示的是尿中关联标记物(脱辅基A1)与疾病的关系，图4表示的是尿中脂质关联标记物(磷脂)与疾病的关系，且图5表示的是尿中脂质关联标记物(总胆固醇)与疾病的关系。图中，符号1表示IgA肾病，符号2表示糖尿病性肾病，符号3表示肾小球硬化症，符号4表示膜性肾病、符号5表示膜性增殖性肾小球肾炎，符号6表示膜性增殖性肾小球肾炎，符号7表示微小变化型肾变病综合征，符号8表示单状肾小球硬化症，符号9表示慢性肾衰竭，且符号10表示正常。
实施发明的最佳方式
本发明解决课题的方法是测定尿中含有的脂质成分。
另外，作为新的测定方法，可列举特征在于使尿中不溶性脂肪可溶化或分散达到均质中，包含使用充分的表面活性剂，和使用与脂质成分作用的酶的尿中脂质成分的测定方法。
这里，使之可溶化，或使之可溶化或分散达到均质化是指，使在尿中不溶的脂质成分在尿中稳定且均质地存在。即，使用使脂质成分可溶化，或使之可溶化或分散达到均质化的尿，即使采用尿的任一部分进行脂质的测定，脂质成分以几乎相同的浓度存在。另外，作为其它意思，使脂质成分可溶化或，使之可溶化或分散达到均质化是指，通过表面活性剂的作用，脂质通过与酶反应达到可定量的状态，可以是任一种意思，或者是两方面的意思。脂质成分的测定，可使用后述公知的方法。
作为尿中的脂质成分，是以脂肪滴、脂肪体和/或脂肪球中含有的物质为主要测定对象。在血清中，脂质虽然以可溶化的状态存在，但在尿中，多数为用显微镜可看到的程度的粒子。对于这些形成不溶性脂肪块的物质，用本发明可通过酶反应定量其脂质成分量。
(作为对象的脂质成分)
作为本发明测定对象的尿中的脂质成分，是1种或2种以上选自例如，中性脂肪及其衍生物、磷脂及其衍生物、过氧化脂质、固醇类、脂肪酸、脂肪酸盐、脂肪酸酯、脂肪族醇、脂肪族醛、糖脂、鞘脂、前列腺素、类胡萝卜素等的脂质成分，其浓度或含量通过使用与脂质成分作用的酶测定。脂质成分中特别重要的对象是固醇类和/或磷脂。
(测定试样的处理)
尿试样可以是尿本身，也可以是将尿离心分离得到的尿沉渣部分或上清部分。本发明的脂质成分的测定方法不仅可以不对尿试样做任何处理直接测定，也可以离心分离尿，分离尿沉渣部分，测定该部分的脂质成分。
(表面活性剂的添加)
本发明是使尿试样中含有的脂质成分，在表面活性剂的存在下，与脂质成分作用的酶作用进行测定的。表面活性剂只要是具有可使尿中不溶性脂肪可溶化或分散达到均质作用的物质都可以，对此没有特别的限制，但是优选具有使脂肪滴、脂肪体或脂肪球可溶化作用，使这些中含有的脂质成分可溶化·分散·游离达到均质的物质。另外，也可单独通过超声波处理或与表面活性剂组合处理，使脂质成分可溶化·分散·游离达到均质。
在本发明的具体例中，作为非离子表面活性剂可列举屈立通X-100，但并不特别限于这些物质。本领域技术人员，按照本发明公开的结果，通过反复进行单纯的试验进行效果比较，可得到在尿中含有的脂质成分的测定中有效的，可使不溶性脂肪可溶化或分散达到均质的表面活性剂。除了非离子表面活性剂以外，当然也可适当使用阳离子、阴离子表面活性剂、两性离子表面活性剂或配糖体。另外，也可通过并用2种以上的表面活性剂，达到更确实地使之可溶化或分散的均质化效果。
表面活性剂的添加量，一般为0.1～5w/v％，但是考虑到脂质成分的可溶化或分散的均质化程度，可通过适当增量·减量进行选择。由于作为处理条件的温度·时间等，依存于脂质成分与酶的反应条件，优选选择作为测定对象的脂质成分和酶的更合适的条件，这可通过单纯的反复试验来决定。另外，优选作为预处理添加预表面活性剂，进行脂质成分的可溶化或分散均质化处理。此时，在10～40℃的温度，进行数秒至数分钟左右的处理是充分的。当然，该表面活性剂处理，也可与酶反应处理同时进行。处理可进行适当的阶段处理，更优选自动化条件或一次处理。
(使用酶的脂质成分的定量)
如上所述通过添加表面活性剂可溶化或分散均质化的尿中脂质成分的测定，可进行使用酶的脂质成分的定量方法，该方法只要是公知的方法就可以，对此没有特别的限制。可列举例如，HPLC法、气相色谱法、电泳法、化学方法、使用酶的方法。其中，使用酶的方法，从操作性、敏感度等方面优选使用。本发明的脂质成分的测定方法，如下述具体例所示，利用1种或2种以上选自催化分解反应、脱氢反应、或氧化反应的酶，可进行脂质成分的测定。尿中的脂质成分，与血清中的脂质成分相比仅以微量存在，通过使用酶可进行高敏感度的测定。
具体地说，作为测定中性脂肪的例子，使用脂肪酶将中性脂肪分解为甘油和脂肪酸，通过酶反应测定生成的甘油。通过酶反应对甘油的测定，可使用使甘油激酶与甘油-3-磷酸脱氢酶作用，测定从辅酶NAD向NADH的转化速度的方法，测定使甘油激酶和甘油磷酸氧化酶作用生成的过氧化氢的方法，使甘油激酶和甘油-3-磷酸脱氢酶和甘油磷酸氧化酶作用通过循环反应测定甘油的高敏感度测定法，使甘油脱氢酶作用的测定方法等。
测定磷脂时，可使用使磷脂酶和甘油磷酸胆碱二酯酶作用，生成甘油-3-磷酸，该甘油-3-磷酸可使用与中性脂肪同样的测定方法，其他的用酶测定磷脂可使用公知的方法。
在测定作为生物体中代表性固醇的胆固醇时，已知使胆固醇氧化酶作用，生成过氧化氢，通过过氧化物酶测定该过氧化氢的测定方法，或使胆固醇脱氢酶作用，测定从辅酶NAD向NADH的转化速度或转化量的方法，另外，使用同样的胆固醇脱氢酶，通过使用辅酶NADH和硫NAD两种辅酶的在平衡增幅反应中更高敏感度地测定胆固醇的方法(特开平08-70894号公报)。另外，还报告了在将通过胆固醇氧化酶等转换的氧化型辅酶再生为还原型辅酶的第二脱氢酶的还原型基质存在下，以胆固醇为基质进行循环反应的测定方法(特开平11-18797号公报)。
在胆固醇的脂肪酸酯的情况下，通过使胆固醇酯酶等分解酶作用，转化为游离胆固醇，可用上述方法测定。
对于脂肪酸，可使用测定酰基辅酶A合成酶和酰基辅酶A氧化酶作用生成的过氧化氢的方法。
对于前列腺素，可使前列腺素脱氢酶作用测定。
对于糖脂质，使糖脂质分解脂肪酶和其他脂肪酶作用，可测定生成的甘油。
在鞘脂质的情况下，可使鞘脂质分解脂肪酶作用进行测定。
在脂蛋白的情况下，对于脂蛋白中含有的脂质成分可适当使用上述方法进行测定。
另一方面，关于脱辅基蛋白的测定，可使用抗原抗体反应进行测定，例如，在脱辅基B蛋白中，使用抗脱辅基B蛋白抗体，免疫比浊法、粒子凝集免疫测定法，酶免疫测定法等公知的测定法是适用的。作为其他的脱辅基蛋白的例子，有脱辅基A-I、脱辅基A-II、脱辅基C、脱辅基E、脱辅基LP(a)等。另外，根据脱辅基蛋白的种类的脂质成分也可使用公知的方法进行测定。
脂质成分的测定法，并不限于上述列举的方法，根据已知的脂质成分的测定方法可进行适当的变更·追加。
在本发明中提供，将上述本发明的尿中脂质成分测定方法中必要的试剂试剂盒化或以单独产品构成的尿中脂质成分测定用试剂。本发明的尿中脂质成分测定用试剂中含有使尿中不溶性脂肪可溶化或分散均质化的表面活性剂、和定量脂肪成分的试剂。另外，也可以是使载体中含有测定中必要的试剂的简单型测定用设备。
(肾病检查手段)
本发明课题解决手段的另一方面是以测定尿中含有的脂质成分为特征的肾病的检查手段。以前，为检出肾病的尿中脂肪粒等的检查是通过显微镜观察等烦杂的手段进行的。在本发明，发现使用上述本发明的简便的尿中脂质成分的测定方法得到的尿中含有的脂质、和尿中脂蛋白和/或尿中脱辅基蛋白类的测定结果，显示与肾疾病有明显关联性，因此完成了本发明的使用尿中脂质成分的测定方法的简便的肾病检查手段。另外，将尿中脂质成分的量记分化，通过分数可判定被检者的肾病程度。
在本发明的肾病检查手段中，可利用上述尿中脂质成分的测定方法。作为测定对象的尿中含有的脂质成分，主要含在尿中的脂肪滴、脂肪体和/或脂肪球中。因此，将尿中脂肪滴、脂肪体和/或脂肪球中含有的脂质成分中的至少1种或2种以上选自中性脂肪及其衍生物、磷脂及其衍生物、过氧化脂质、固醇类、脂肪酸、脂肪酸盐、脂肪酸酯、脂肪族醇、脂肪族醛、糖脂、鞘脂、前列腺素、类胡萝卜素的脂质成分作为对象。
在实验例中，虽然测定了肾病患者的胆固醇值和磷脂值，这些与正常人相比是具有明显差的高值，从该结果可判定，定量尿中含有的脂质成分、至少是胆固醇和/或磷脂，在肾病的发现中是有用的。
另外，在本发明，除了尿中脂质的测定，与尿中脂蛋白和/或尿中脱辅基蛋白类的测定组合是本发明的优选方案，可获得更优选的判断。
这样本发明提供，测定尿中的1种或2种以上的脂质、以及尿中脂蛋白和/或脱辅基蛋白类等脂质成分，通过解析其结果，可进行肾病的检出和判断其程度的肾病检查手段。
本发明公开了，为判定肾病的检出和障碍程度，除了该尿中脂质成分的测定，组合进行尿中含有的白血球的表面抗原的测定或检出的方法。特别是只对于尿中脂质成分显示高值(将脂质，和脂蛋白类和/或脱辅基蛋白类的测定结果记分化)的试样，可导入进行尿中含有的白血球的表面抗原的测定或检出的方法。通过该组合，可更好地进行肾病的检查。即，通过与尿中的脂质成分的测定合并，组合尿中含有的白血球表面抗原的测定或检出，可更好地进行肾病的检出和其程度的判定。
在组合尿中脂质成分的测定和尿中含有的白血球表面抗原的测定或检出进行肾病的检查时，在使用尿的一部分测定上述脂质、和脂蛋白类和/或脱辅基蛋白类，同时，将一部分通过离心分出尿沉渣成分，通过公知的镜检或流式细胞测量法等可测定检出白血球的表面抗原，例如，CD14、CD16、25F9等。另外，可使用尿沉渣组分的一部分，测定脂质、和脂蛋白和/或脱辅基蛋白类，用剩余的一部分可用镜检或流式细胞测量法等可测定检出白血球的表面抗原。另外，可将尿的一部分通过离心分离分出尿沉渣，测定检出白血球表面抗原，另一方面，将尿的一部分单独或组合使用冻结溶解和/或表面活性剂处理等，经由使尿中细胞破坏的步骤进行尿检体的脂质、和脂蛋白和/或脱辅基蛋白类的测定。
随时组合解析本发明的肾病检查手段中包括的，从尿中脂质的测定，和尿中脂蛋白和/或尿中脱辅基蛋白类的测定，或这些与尿中含有的白血球的表面抗原的测定或检出中得到的结果，可更好地进行肾病判断。可以适宜地选定用作解析的测定结果。例如，可将胆固醇和磷脂的比作为指标，其比可与CD14的测定检出结果组合。尿中含有的白血球表面抗原的测定检出结果也可以是组合多个结果。
(实施例)
下面列举实施例对本发明进行进一步说明，但本发明并不限于这些实施例。
(实施例1)
分别对正常人的尿和肾病患者的尿测定胆固醇浓度。尿预先与10％屈立通X-100以9∶1的比例混合，作为尿检体。
胆固醇的测定是，调制下述组成的2种测定试剂，对于尿检体10μL，加入250μL的试剂-1，在37℃反应5分钟后，加入100μL的试剂-2，添加后，求出从第1分钟到第3分钟在波长415nm的1分钟左右的吸收光度变化量，求出胆固醇的浓度。其结果如表1所示。
试剂-1
PIPES                         20mmol/L
KCL                           150mmol/L
屈立通X-100                   0.3w/v％
胆酸钠                        0.3w/v％
硫NAD                         1.25mmol/L
牛血清白蛋白                  0.1w/v％
胆固醇脱氢酶                  3U/ml
胆固醇酯酶                    5U/ml
pH                            7.0
试剂-2
CHES                          175mmol/L
屈立通X-100                   0.3w/v％
胆酸钠                        0.3w/v％
β-NADH                       3.5mmol/L
pH                            9.1
(实施例2)
对于实施例1调制的尿检体，测定磷脂浓度。磷脂的测定是，调制下述组成的2种测定试剂，对于尿检体10μL，加入250μL的试剂-1，在37℃反应5分钟后，加入100μL的试剂-2，添加后，求出从第1分钟到第3分钟在波长546nm的1分钟左右的吸收光度变化量，求出磷脂的浓度。其结果如表1所示。
试剂-1
HEPES                         50mmol/L
CaCl2                        1.0mmol/L
屈立通X-100                   0.2w/v％
甘油-3-磷酸脱氢酶             1.5U/ml
磷脂酶A1                      2.0U/ml
磷脂酶A2                      2.0U/ml
甘油磷酸胆碱磷酸二酯酶        0.6U/ml
NADH                          0.5mM
苯酚                          0.05％
抗坏血酸氧化酶                3U/L
pH                            8.0
试剂-2
磷酸缓冲液                    20mmol/L
甘油-3-磷酸氧化酶             200U/ml
POD                           10U/ml
4-氨基安替比林                2.0mM
pH                            7.5
从该结果可判定，肾病患者尿中胆固醇和磷脂的浓度是比正常人明显高的值，至少通过测定尿中胆固醇和/或磷脂，可检查肾病。
(表1)正常人和肾病患者尿中胆固醇和磷脂
    尿检体     胆固醇(mg/dL)     磷脂(mg/dL)
    正常人尿     0.07     0.6
    肾病患者尿1     1.74     8.7
    肾病患者尿2     0.24     12.8
    肾病患者尿3     0.19     1.5
    肾病患者尿4     0.16     8.7
(实施例3)
测定122例尿检体(IgA肾病[IgAN]51例，糖尿病性肾病[DMN]10例，肾小球硬化症[Nephroscrelosis]9例，膜性肾病[MN]6例，膜性增殖性肾小球肾炎[MPGN]7例，急性进行性肾病[RPGN]12例，微小变化型肾变病综合征[MCN]3例，巢状肾小球硬化症[FGS]12例，慢性肾衰竭[CFR]5例，正常7例)中的磷脂、游离胆固醇、胆固醇、脱辅基A的浓度。
其结果如图1～5所示。这些任一个脂质关联标记物在上述任意的疾病组与正常尿相比都显示明显的高值，由此可知，通过测定尿中脂质成分，可进行肾病的检查、诊断。另外，其它的用途是测定崛田等报告的油红O阳性颗粒(尿中的脂肪球)的个数(5mL)中(Takashi Oda，Osamu Hotta et al.kidney International，Vol.53，1190-1200，(1998))。
尿中的脂肪球，在IgAN、RPGN、FGS显示特别高的值，但是相反，在MCN等与正常尿没有变化。与其相比，可判定用本发明的方法，不仅对IgAN、RPGN、FGS，对其它肾病也可敏感度良好地检出，确认本发明是有用的。
另外，胆固醇的测定是实施例1所示的方法，磷脂的测定是实施例2所示的测定方法，游离胆固醇的测定可用实施例1所示试剂-1中除去胆固醇酯酶外与实施例1同样的操作进行。
脱辅基A1的测定，可使脱辅基A-I免疫试剂·ND[コクサイ]进行测定。
将尿预先与10％屈立通X-100以9∶1的比例混合，作为尿检体。对于尿检体10μL，以160μL的第1试剂，40μL的第2试剂的比例测定以外，按照说明书进行操作。
(实施例4)
使用从定期接受健康检查者采取的尿检体175例，按照实施例1中记载的方法测定尿中胆固醇，求出正常人尿中的胆固醇参照值。健康正常人血清中的胆固醇值通常为130～250mg/dL，与此相对，尿中胆固醇值为血清胆固醇值的1000分之1以下，为0.01～0.25mg/dL。
作为对照，使用市售的血清胆固醇测定试剂盒进行测定，但是对于任何检体也不能测定胆固醇。由此可知，尿中胆固醇的测定，必须使用本发明实施例1中记载的方法等的高敏感度测定方法。
产业上的可利用性
本发明提供了可更简便确实地测定尿中含有的脂质成分的方法，利用该方法，发现了肾病与尿中含有的脂质成分量的相关性，为检出肾病，发现尿中脂质、和尿中脂蛋白类和/或尿中脱辅基蛋白类等的测定是极其有效的。另外，提供了在该尿中脂质成分的测定中，通过解析多个脂质成分、和脂蛋白类和/或脱辅基蛋白类的测定结果，或通过与尿中含有的白血球的表面抗原的测定组合，更确实地检查肾病程度的手段。

Claims (16)

1.尿中脂质成分的测定方法，其特征在于包括将表面活性剂添加到尿试样中，将尿试样中的脂肪成分均质的步骤，以及通过使用与脂质成分作用的酶测定脂质成分的步骤。
2.权利要求1中记载的测定方法，其特征在于，前述酶是选自催化分解反应的酶、催化脱氢反应的酶和催化氧化反应的酶中的至少1种酶。
3.权利要求1中记载的测定方法，其特征在于，前述脂质成分是选自脂肪滴、脂肪体和脂肪球中的至少1种。
4.权利要求1中记载的测定方法，其特征在于，前述脂质成分是1种或2种以上选自中性脂肪及其衍生物、磷脂及其衍生物、过氧化脂质、固醇类、脂肪酸、脂肪酸盐、脂肪酸酯、脂肪族醇、脂肪族醛、糖脂、鞘脂、前列腺素和类胡萝素的脂质成分。
5.权利要求4中记载的测定方法，其特征在于，前述脂质成分是固醇类或磷脂。
6.权利要求1中记载的测定方法，其特征在于，前述表面活性剂是至少1种选自非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂和配糖体的表面活性剂。
7.肾病检查用试剂，其特征在于含有表面活性剂和与脂质成分作用的酶。
8.权利要求7中记载的肾病检查用试剂，其特征在于，前述酶是选自催化分解反应的酶、催化脱氢反应的酶和催化氧化反应的酶中的至少1种酶。
9.权利要求7中记载的肾病检查用试剂，其特征在于，前述表面活性剂是至少一种选自非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂和配糖体的表面活性剂。
10.权利要求9中记载的肾病检查用试剂，其特征在于，前述表面活性剂是非离子表面活性剂。
11.权利要求7中记载的肾病检查用试剂，其中所述脂质成分为胆固醇，所述酶为胆固醇脱氢酶。
12.权利要求11中记载的肾病检查用试剂，其进一步含有胆固醇酯酶、硫NAD和NADH。
13.权利要求7中记载的肾病检查用试剂，其中上述脂质成分为胆固醇，上述酶为胆固醇氧化酶。
14.权利要求7中记载的肾病检查用试剂，其中上述脂质成分为磷脂，上述酶为磷脂酶和甘油磷酸胆碱二酯酶。
15.权利要求14中记载的肾病检查用试剂，其包含甘油-3-磷酸脱氢酶。
16.权利要求15中记载的肾病检查用试剂，其包含甘油磷酸氧化酶。
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