CN100338217C

CN100338217C - 单链重组t细胞受体

Info

Publication number: CN100338217C
Application number: CNB2003801011431A
Authority: CN
Inventors: B·K·雅各布森; M·格利克
Original assignee: Avidex Ltd
Current assignee: Immunocore Ltd; Adaptimmune Ltd
Priority date: 2002-10-09
Filing date: 2003-10-03
Publication date: 2007-09-19
Anticipated expiration: 2023-10-03
Also published as: GB0223399D0; ZA200502927B; CN1703512A

Abstract

单链T细胞受体(scTCR)包括由融合TCRα链恒定区胞外序列N末端的TCRα链可变区序列构成的α区段，由融合TCRβ链恒定区胞外序列N末端的TCRβ链可变区构成的β区段，以及连接α区段C末端与β区段N末端的接头序列，或反之亦然，由二硫键连接的α和β区段的恒定区胞外序列，接头序列长度和二硫键位置使α和β区段的可变区序列大体如在天然αβT细胞受体中一样相互定位。公开了2种或更多这类scTCRs的复合体、scTCRs在治疗和多种筛选应用中的用途。

Description

单链重组T细胞受体

本发明涉及单链T细胞受体(TCRs)。

发明的背景

天然TCRs

例如，如WO 99/60120所述，TCRs介导T细胞识别特异主要组织相容性复合体(MHC)-肽复合体，这对免疫系统的细胞臂功能是必需的。

抗体和TCRs是唯一以特异方式识别抗原的2类分子，因此TCR是MHC中呈递的特定肽抗原的唯一受体，异源肽通常是细胞内异常的仅有征兆。当T细胞和抗原呈递细胞(APC)直接物理接触时，发生T细胞识别且通过抗原特异TCRs与pMHC复合体的连接来起始。

天然TCR是免疫球蛋白超家族的异二聚体细胞表面蛋白，与参与介导信号转导的CD3复合体的不变蛋白相关联。TCRs以αβ和γδ形式存在，它们结构类似但有完全不同的解剖学位置且很可能功能不同。MHC I型和II型配基也是免疫球蛋白超家族蛋白，但对于抗原呈递特异，高度多态的肽结合位点使它们能呈递APC细胞表面的不同阵列的短肽片段。

已知另2类蛋白能作为TCR配基发挥功能。(1)CD1抗原是MHC I型-相关分子，其基因位于来自经典MHC I型和II型抗原的不同染色体上。CD1分子能呈递肽和非肽(例如脂类、糖脂)部分到T细胞，方式类似于传统的MHC I型和II型-肽复合体。参见例如(Barclay等，(1997)《白细胞抗原数据手册》(TheLeucocyte AntigenFactsbook)，第2版，Acadmeic Press)和(Bauer(1997)Eur J Immunol 27(6)1366-1373))(2)细菌超抗原是可溶毒素，能结合MHC II型分子和TCRs亚型(Fraser(1989)Nature339 221-223)。许多超抗原表现出对1或2种Vbeta区段的特异性，而其它表显出更混杂的结合。无论如何，超抗原能引起免疫反应增强，这是通过它们以多克隆方式刺激T细胞亚型的能力。

天然异二聚αβTCR的胞外部分由2种多肽组成，它们各自有近膜恒定结构域和远膜可变结构域(见图1)。恒定和可变结构域各包括链内二硫键。可变结构域包含高度多态的环，与抗体的互补性决定区(CDRs)类似。TCR的CDR3与MHC呈递的肽相互作用，CDRs1和2与肽和MHC相互作用。TCR序列的多样性通过连接的可变(V)、多样性(D)、连接(J)和恒定基因的体细胞重排产生。功能性α链多肽由重排的V-J-C区形成，而β链由V-D-J-C区组成。胞外恒定结构域有近膜区和免疫球蛋白区。有称为TRAC的单α链恒定结构域和称为TRBC1及TRBC2的2种不同β恒定结构域(IMGT命名法)。这些β恒定结构域间有4个氨基酸变化，其中3个在用于产生本发明单链TCRs的结构域内。这些变化都在TRBC1和TRBC2的外显子1内：N₄K₅-＞K₄N₅和Y₃₇-＞Y(IMGT编号，TRBC1-＞TRBC2差异)，2个TCRβ链恒定区间的最终氨基酸变化在TRBC1和TRBC2的外显子3内：V₁-＞E。各TCR胞外结构域的程度稍微可变。然而，本领域技术人员能容易确定结构域边界位置，使用参考文献如《T细胞受体数据手册》(The TCR Receptor FactsBook)，Lefanc&Lefranc，Pub 1.Academic Press 2001。

单链TCR

单链TCRs(scTCRs)是人工构建物，由单氨基酸链组成，类似天然异二聚TCRs结合MHC-肽复合体。不幸的是，通过简单连接α和β链从而使它们都在单个可读框中表达以产生功能性α/β类似物scTCRs的尝试都不成功，大概是由于α-β可溶结构域配对的天然不稳定性。

因此，产生scTCRs需要使用任一或两种α和β链的不同截短的特殊技术。这些形式似乎仅能应用于很有限范围的scTCR序列。Soo Hoo等(1992)PNAS.89(10)：4759-63报导小鼠TCR在来自2C T细胞克隆的单链形式中表达，使用截短的β和α链，链与25个氨基酸接头相连且细菌周质表达(也参见Schodin等(1996)Mol.Immunol.33(9)：819-29)。此设计也形成Holler等(2000)PNAS.97(10)：5387-92报导的m6单链TCR的基础，它来源于2C scTCR并结合相同H2-Ld-限制性同种抗原表位。Shusta等(2000)Nature Biotechnology 18：754-759报导在酵母展示实验中使用单链2C TCR构建物，产生的突变TCRs的热稳定性和溶解性增强，此报导也证明这些展示的2C TCRs能选择性结合表达其相关pMHC的细胞。Khandekar等(1997)J.Biol.Chem.272(51)：32190-7报导用于鼠D10TCR的类似设计，尽管此scTCR融合MBP且在细菌细胞质中表达(也参见Hare等(1999)Nat.Struct.Biol.6(6)：574-81)。Hilyard等(1994)PNAS.91(19)：9057-61报导特异于流感基质蛋白-HLA-A2的人scTCR，使用Vα-接头-Vβ设计并在细菌周质中表达。

Chung等(1994)PNAS.91(26)：12654-8报导人scTCR的生成，使用Vα-接头-Vβ-Cβ设计并在哺乳动物细胞系的表面上表达。此报导不包括任何有关肽-HLA特异结合scTCR。Plaksin等(1997)J.Immunol.158(5)：2218-27报导类似的Vα-接头-Vβ-Cβ设计，用于产生特异于HIV gp120-H-2D^d抗原表位的鼠scTCR。此scTCR作为细菌内含体表达且体外重折叠。

治疗用途

需要靶向部分，它们能定位到受疾病过程影响的细胞。这种靶向部分能用于直接阻断引起自身免疫疾病的免疫系统‘错定向’作用，或作为传递细胞毒性剂到癌细胞的一种方法。

适合这些应用的分子理想上需要对细胞标记的特异亲和性，细胞标记直接参与相关疾病过程。抗体用于此目的。

筛选用途

一些重要的细胞相互作用和细胞反应受细胞表面受体与其它细胞表面上呈递的配基之间的接触控制，包括TCR-介导的免疫突触。这些类型的特异分子接触对人体内的正确生化调节至关重要并因此认真地研究。在许多情况中，这些研究目的是设计调节细胞反应的方法以预防或抵抗疾病。

因此，鉴定以一定程度特异性结合人受体或配基分子的化合物的方法是重要的，它引导新疾病疗法的发现和发展。尤其是，干扰某些受体-配基相互作用的化合物具有作为治疗剂或载体的直接潜力。

组合化学的进展能使生产很大化合物库相对容易且成本效率高，极大增加了测试化合物的范围。目前，筛选程序的限制通常在于能使用的测定性质、合适受体和配基分子的生成及这些测定能如何适应高通量筛选方法。

发明的概述

此发明获得一类新的α/β类似物scTCRs，其特征是单氨基酸链的残基间存在二硫键，键有助于分子α和β区间配对的稳定性。这种TCRs用于筛选或治疗目的。

发明的详述

本发明提供的单链T细胞受体(scTCR)包含由融合TCRα链恒定区胞外序列N末端的TCRα链可变区序列构成的α区段，由融合TCRβ链恒定区胞外序列N末端的TCRβ链可变区序列构成的β区段，以及连接α区段C末端与β区段N末端的接头序列，或反之亦然。由二硫键连接的α和β区段的恒定区胞外序列，接头序列长度和二硫键位置使α和β区段的可变区序列大体如在天然αβT细胞受体中一样相互定位。

发明的scTCR需要α和β区段的可变区序列大体如在天然αβT细胞受体中一样相互定位，测试此要求是通过确定分子结合相关TCR配基(pMHC复合体、CD1-抗原复合体、超抗原或超抗原/pMHC复合体)-如果结合则满足要求。与pMHC复合体的相互作用能用BLAcore 3000^TM或BLAcore 2000^TM仪器测量。本文的实施例3或WO99/6120分别详细描述分析TCR结合MHC-肽复合体所需的方法。这些方法同样可应用于TCR/CD1和TCR/超抗原相互作用的研究。为将这些方法应用于TCR/CD1相互作用的研究，需要可溶形式的CD1，其生成描述于(Bauer(1997)EurJ Immunol 27(6)：1366-1373)。

α和β区段

α和β区段中存在的恒定区胞外序列优选对应于人TCR的恒定区胞外序列，α和β区段中存在的可变区序列也如此。然而，这些序列间的对应不需要氨基酸水平上的1∶1。可接受相对于对应人TCR序列的N-或C-截断和/或氨基酸缺失和/或取代，只要总结果是α和β区段的可变区序列如在天然αβT细胞受体中一样相互定位并保持肽-MHC结合功能。尤其是，由于α和β区段中存在的恒定区胞外序列不直接参与接触scTCR结合的肽-MHC复合体，它们可以比天然TCRs的胞外恒定结构域序列短，或可包含相对此序列的取代或缺失。

α区段中存在的恒定区胞外序列可包括对应于TCRα链胞外恒定Ig结构域的序列和/或β区段中存在的恒定区胞外序列可包括对应于TCRβ链胞外恒定Ig结构域的序列。

在发明的一个实施方案中，α区段对应于大体所有的TCRα链可变区，可变区融合大体所有的TCRα链恒定区胞外结构域的N末端；和/或β区段对应于大体所有的TCRβ链可变区，可变区融合大体所有的TCRβ链恒定区胞外结构域的N末端。

在另一个实施方案中，α和β区段中存在的恒定区胞外序列对应于天然TCR的α和β链恒定区，天然TCR的C末端截短从而排除形成TCR天然链间二硫键的半胱氨酸残基。另外，这些半胱氨酸残基可由另一氨基酸残基取代，如丝氨酸或丙氨酸，从而缺失天然二硫键。此外，天然TCRβ链包含未配对半胱氨酸残基且残基能从发明的scTCRβ序列中缺失或由β序列中的非半胱氨酸残基取代。

在发明的一个特定实施方案中，α和β区段中存在的TCRα和β链可变区序列可一起对应于第一个TCR的功能性可变结构域，α和β区段中存在的TCRα和β链恒定区胞外序列可对应于第二个TCR的功能性可变结构域，第一和第二个TCR来自相同种类。因此，α和β区段中存在的α和β链可变区序列能对应于第一个人TCR的序列，α和β链恒定区胞外序列可对应于第二个人TCR的序列。例如，A6Tax sTCR恒定区胞外序列能用作融合异源可变结构域的框架。

在发明的另一个实施方案中，α和β区段中存在的TCRα和β链可变区序列一起对应于第一个TCR的功能性可变结构域，α和β区段中存在的TCRα和β链恒定区胞外序列对应于第二个TCR的功能性可变结构域，第一和第二个TCR来自不同种类。在此实施方案中，优选α和β区段中存在的TCRα和β链可变区序列一起对应于人TCR的功能性可变结构域，α和β区段中存在的TCRα和β链恒定区胞外序列对应于小鼠TCR的序列。本发明的这种实施方案的优点是scTCRs包含可能是免疫原性的非人恒定区序列，因而当位于其靶细胞时可能增强对dTCR的总免疫反应。因此，可增强对异常细胞如癌细胞的免疫反应。

接头

在本发明中，接头序列连接α和β区段以形成单多肽链。例如，接头序列可具有结构式-P-AA-P-，其中P是脯氨酸且AA代表氨基酸序列，氨基酸是甘氨酸和丝氨酸。

对于结合MHC-肽复合体的scTCR，α和β区段必须配对，从而其可变区序列定向用于这种结合。因此，接头长度应足以横跨α区段C末段与β区段N末端间的距离，反之亦然。另一方面，应优选避免接头长度过度，以免N末端可变区序列的接头末端阻碍或减少scTCR结合靶肽-MHC复合体。

例如，当α和β区段中存在的恒定区胞外序列对应于天然TCR的α和β链恒定区且天然TCR的C末端截短从而排除形成TCR天然链间二硫键的半胱氨酸残基时，接头序列连接α区段C末段与β区段N末端，接头可由26到41个氨基酸组成，例如29、30、31或32个，特定接头具有结构式-PGGG-(SGGGG)₅-P-，其中P是脯氨酸，G是甘氨酸且S是丝氨酸。

二硫键

本发明scTCRs的主要典型特征是α和β区段的恒定区胞外序列间的二硫键。此键可对应于天然二聚体αβTCRs中存在的天然链间二硫键，或在天然TCRs中没有对应物，半胱氨酸间的键特定地掺入到α和β区段的恒定区胞外序列中。在一些情况中，现有scTCRs中需要天然和非天然二硫键。

二硫键位置受α和β区段的可变区序列需大体如在天然αβT细胞受体中一样相互定位的要求影响。

二硫键形成可通过将α和β区段上的非半胱氨酸残基突变成半胱氨酸并使键在突变残基间形成。优选残基的各β碳在天然TCR中分开约6(0.6nm)或或更少，优选在3.5(0.35nm)到5.9(0.59nm)范围内，从而二硫键能在导入取代天然残基的半胱氨酸残基间形成。二硫键优选在恒定免疫球蛋白区的残基间，尽管它可能在近膜区的残基间。能引入半胱氨酸以形成二硫键的优选位置是外显子1中的下列残基，对于TCRα链是TRAC*01的外显子1且对于TCRβ链是TRBC1*01和TRBC2*01的外显子1：

TCRα链	TCRβ链	天然β碳分离(nm)
TCRα链	TCRβ链	天然β碳分离(nm)	Thr 48	Ser 57	0.473
Thr 45	Ser 77	0.533	Thr 48	Ser 57	0.473
Thr 45	Ser 77	0.533	Tyr 10	Ser 17	0.359
Thr 45	Asp 59	0.560	Tyr 10	Ser 17	0.359
Thr 45	Asp 59	0.560	Ser 15	Glu 15	0.59

现在鉴定了人TCRs中能突变成半胱氨酸残基的残基以形成根据发明的scTCRs中的新链间二硫键，本领域技术人员能突变其它种类的TCRs，方法与产生该种类scTCR的方法相同。在人中，技术人员仅需寻找各TCR链中的下列基序以鉴定待突变残基(有阴影残基是突变成半胱氨酸的残基)。

α链Thr 48：DSDVYITDKTVLDMRSMDFK(TRAC*01基因外显子1的氨基酸39-58)

α链Thr 45：QSKDSDVYITDKTVLDMRSM(TRAC*01基因外显子1的氨基酸36-55)

α链Tyr 10：DIQNPDPAVYQLRDSKSSDK(TRAC*01基因外显子1的氨基酸1-20)

α链Ser 15：DPAVYQLRDSKSSDKSVCLF(TRAC*01基因外显子1的氨基酸6-25)

β链Ser 57：NGKEVHSGVSTDPQPLKEQP(TRBC1*01和TRBC2*01基因外显子1的氨基酸48-67)

β链Ser 77：ALNDSRYALSSRLRVSATFW(TRBC1*01和TRBC2*01基因外显子1的氨基酸68-87)

β链Ser 17：PPEVAVFEPSEAEISHTQKA(TRBC1*01和TRBC2*01基因外显子1的氨基酸8-27)

β链Asp 59：KEVHSGVSTDPQPLKEQPAL(TRBC1*01和TRBC2*01基因外显子1的氨基酸50-69)

β链Glu 15：VFPPEVAVFEPSEAEISHTQ(TRBC1*01和TRBC2*01基因外显子1的氨基酸6-25)

在其它种类中，TCR链可以没有与上面基序100％同一性的区域。然而，本领域技术人员能用上面基序鉴定TCRα或β链的等效部分并因而鉴定待突变成半胱氨酸的残基。排列技术可用于此方面。例如，可获得自欧洲生物信息学会(EuropeanBioinformatics Institute)网址( http：//www.ebi.ac.uk/index.html)的ClustalW能用于比较上面的基序与特定TCR链序列以定位用于突变的TCR序列相关部分。

本发明包括其范围内的αβ-类似物scTCRs以及其它哺乳动物的αβ-类似物scTCRs，包括但不限于小鼠、大鼠、猪、山羊和绵羊。还包括如上讨论的人/非人嵌合scTCR。如上所示，本领域技术人员能确定与上述人位点等效的位点，在这些位点能引入半胱氨酸残基以形成链间二硫键。例如，下列各项显示小鼠Cα和Cβ可溶结构域的氨基酸序列以及显示与上述人残基等效鼠残基的基序，这些残基能突变成半胱氨酸残基以形成TCR链间二硫键(其中相关残基是有阴影的)：

小鼠Cα可溶结构域：

PYIQNPEPAVYQLKDPRSQDSTLCLFTDFDSQINVPKTMESGTFITDKTVLDMKAMDSKSNGAIAWSNQTSFTCQDIFKETNATYPSSDVP

小鼠Cβ可溶结构域：

EDLRNVTPPKVSLFEPSKAEIANKQKATLVCLARGFFPDHVELSWWVNGREVHSGVSTDPQAYKESNYSYCLSSRLRVSATFWHNPRNHFRCQVQFHGLSEEDKWPEGSPKPVTQNISAEAWGRAD

人α链Thr 48的鼠等效物：ESGTFITDKTVLDMKAMDSK

人α链Thr 45的鼠等效物：KTMESGTFITDKTVLDMKAM

人α链Tyr 10的鼠等效物：YIQNPEPAVYQLKDPRSQDS

人α链Ser 15的鼠等效物：AVYQLKDPRSQDSTLCLFTD

人β链Ser 57的鼠等效物：NGREVHSGVSTDPQAYKESN

人β链Ser 77的鼠等效物：KESNYSYCLSSRLRVSATFW

人β链Ser 17的鼠等效物：PPKVSLFEPSKAEIANKQKA

人β链Asp 59的鼠等效物：REVHSGVSTDPQAYKESNYS

人β链Glu 15的鼠等效物：VTPPKVSLFEPSKAEIANKQ

如上所讨论，A6Tax sTCR胞外恒定区能用作融合异源可变结构域的框架。异源可变区序列优选连接恒定区序列，在二硫键和恒定区序列N末端间的任何点连接。在A6Tax TCRα和β恒定区序列的情况中，二硫键可在半胱氨酸残基间形成，半胱氨酸残基分别在氨基酸残基158和172上引入。因此，异源α和β链可变区序列附着点分别优选在残基159或173与α或β恒定区序列N末端之间。

另外的方面

本发明的scTCR(优选是人)可以大体纯的形式提供，或者作为纯化或分离制品提供。例如，它可以大体没有其它蛋白的形式提供。

本发明的许多scTCRs能以多价复合体提供。因此，本发明一方面提供多价T细胞受体(TCR)复合体，复合体包含本文所述的许多可溶T细胞受体。各可溶TCRs的多重性优选相同。

在本发明的多价复合体中，scTCRs可以多聚体形式，和/或可存在于脂双层上或与之相联，例如脂质体。

根据发明的多价scTCR复合体的最简单形式包括2或3或4种或更多彼此相联(例如共价或另外相连)T细胞受体分子的多聚体，优选经接头分子。合适的接头分子包括但不限于多价附着分子如抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白和外抗生物素蛋白(extravidin)，它们各有4个生物素结合位点。因此，生物素酰化TCR分子能形成T细胞受体多聚体，多聚体具有许多TCR结合位点。多聚体中的TCR分子数取决于TCR量，TCR量是相对于用于构成多聚体的接头分子的量，也取决于任何其它生物素酰化分子的存在或缺乏。优选多聚体是二聚、三聚或四聚TCR复合体。

比TCR四聚体大相当多的结构可用于追踪或靶向表达特异MHC-肽复合体的细胞。结构优选在10nm到10μm直径范围内。各结构显示多个scTCR分子，分开的距离足以使结构上的2个或更多TCR分子同时结合细胞上的2个或更多MHC-肽复合体并因而增加多聚结合部分对细胞的亲合力。

本发明使用与1个或多个scTCRs形成复合体的合适结构包括膜结构如脂质体和固体结构，固体结构优选是颗粒如珠，例如乳胶珠。其它可用T细胞受体分子外包被的结构也合适。结构优选用T细胞受体多聚体包被，而不是单个T细胞受体分子。

在脂质体的情况中，T细胞受体分子或其多聚体可附于膜或另外与膜相联。用于此方面的技术对本领域技术人员熟知。

本发明多价scTCR复合体可包括标记或另外部分如毒性或治疗部分。例如，混合分子多聚体中能包括标记或其它部分。这种多聚分子的例子是含3个scTCR分子和1个过氧化物酶分子的四聚体。获得此四聚体可通过以3∶1摩尔比混合TCR和酶以产生四聚复合体，从不含正确分子比例的任何复合体分离所需复合体。这些混合分子能包含任何分子组合，只要立体位阻不危及或不显著危及所需分子功能。链霉抗生物素蛋白上的结合位点的定位适合混合四聚体，因为立体位阻不太可能发生。

另一方面，发明提供检测MHC-肽复合体的方法，包括：

a.提供本发明的scTCR

b.scTCR接触MHC-肽复合体；检测scTCR与MHC-肽复合体的结合。

治疗用途

本发明的scTCR(或其多价复合体)可交替地或额外地与治疗剂相联(例如共价或另外连接)，治疗剂可以是例如用于细胞杀死的有毒部分或免疫刺激剂如白介素或细胞因子。与非多聚T细胞受体异二聚体相比，本发明的多价scTCR复合体结合TCR配基如pMHC复合体或CD1分子的能力增强。非多聚T细胞受体异二聚体。因此，根据发明的多价scTCR复合体特定用于体外或体内追踪或靶向呈递特定抗原的细胞，也用作产生更多有这种用途的多价TCR复合体的中间物。因此，scTCR或多价scTCR复合体可以体内使用的药学上可接受制剂形式提供。

发明也提供传递治疗剂到靶细胞的方法，方法包括使潜在靶细胞根据发明接触scTCR或多价scTCR复合体，所用条件允许scTCR或多价scTCR复合体附于靶细胞，所述scTCR或多价scTCR复合体特异于MHC-肽复合体且具有与之相关的治疗剂。

尤其是，可溶scTCR或多价scTCR复合体能用于传递治疗剂到呈递特定抗原的细胞位置。这可能用于许多情形，特别是抗肿瘤。能传递治疗剂使它局部发挥作用而不仅在其结合的细胞上。因此，一种特定策略考虑抗肿瘤分子连接特异于肿瘤抗原的T细胞受体或多价scTCR复合体。

许多治疗剂能用于此用途，例如放射性化合物、酶(如穿孔素)或化疗剂(如顺式铂氨)。为确保毒性效果在所需位置发挥作用，毒素能在连接链霉抗生物素蛋白的脂质体内，从而缓慢释放化合物。这在体内运输期间防止损害作用并确保毒素在scTCR结合相关抗原呈递细胞后有最大效果。

其它合适治疗剂包括：

·小分子细胞毒性剂，即能杀死哺乳动物细胞的化合物，分子量小于700道尔顿。这种化合物也可包含能有细胞毒性作用的有毒金属。此外，要理解这些小分子细胞毒性剂也包括前体药物，即在生理条件下衰变或转变以释放细胞毒性剂的化合物。这种试剂的例子包括顺式铂氨、美登素衍生物、雷查霉素、卡利霉素、脱乙酰紫杉醇、依托泊苷、耶西塔宾、异环磷酰胺、伊里诺坎、美法兰、米托蒽醌、卟吩姆钠(光敏素II)、替莫唑胺、拓普替康、葡糖醛酸、auristatin E、长春新碱和阿霉素；

·肽细胞毒素，即能杀死哺乳动物细胞的蛋白或其片段。例子包括篦麻毒蛋白、白喉毒素、假单胞菌属细菌外毒素A、DNA酶和RNA酶；

·放射性核，即元素的不稳定同位素，它们衰减同时发射的1个或多个α或β粒子或γ射线。例子包括碘131、铼186、铟111、钇90、铋210和213、锕225和砹213；

·前体药物，如抗体定向的酶前体药物；

·免疫刺激物，即刺激免疫反应的部分。例子包括细胞因子如IL-2、趋化因子如IL-8、血小板因子4、黑素瘤生长刺激蛋白等、抗体或其片段、补体活化剂、异种蛋白结构域、异源蛋白结构域、病毒/细菌蛋白结构域和病毒/细菌肽。

发明的可溶性scTCRs或多价scTCR复合体可连接能使前体药物转变成药物的酶。这允许前体药物仅在需要位点转变成药物(即由scTCR靶向)。

根据发明用于scTCR的合适MHC-肽靶例子包括但不限于病毒抗原表位如HTLV-1抗原表位(例如受HLA-A2限制的Tax肽；HTLV-1与白血病相关)、HIV抗原表位、EBV抗原表位、CMV抗原表位；黑素瘤抗原表位(例如MAGE-1HLA-A1限制的抗原表位)和其它癌特异性抗原表位(例如受HLA-A2限制的肾细胞癌相关抗原G250)；自身免疫病相关抗原表位，如类风湿性关节炎。适用于本发明的更多疾病相关pMHC靶列于《HLA数据手册》(Barclay(编辑)Academic Press)，并鉴定了许多其它靶。

通过scTCRs特异性定位药物传递能潜在地增强许多疾病治疗。

存在药物的病毒疾病例如HIV、SIV、EBV、CMV，受益于在感染细胞邻近释放或激活的药物。对于癌症，定位于肿瘤或转移附近会增强毒素或免疫刺激物的效果。在自身免疫疾病中，免疫抑制药物能缓慢释放，在较长时间跨度中有更局部的作用而对受试者总体免疫能力的影响最小。在防止移植排斥中，免疫抑制药物的效果能以相同方式最优化。对于疫苗传递，疫苗抗原能定位于抗原呈递细胞附近，因而增强抗原功效。方法也能应用于成像目的。

本发明的scTCRs可用于调节T细胞活化，这是通过结合特异配基如pMHC并从而抑制T细胞活化。涉及T细胞-介导的炎症和/或组织损伤的自身免疫疾病可能适合于此方法，例如I型糖尿病。此用途需要相关pMHC呈递的特异肽抗原表位的知识。

根据发明的药物常作为无菌、药物组合物部分提供，组合物通常包括药学上可接受载体。此药物组合物可以任何合适的形式(取决于施用它给病人所需的方法)。它可以单位剂型提供，一般在密封容器中提供且能作为试剂盒部分提供。这种试剂盒通常(尽管不一定)包括使用说明书。它可包括许多所述单位剂型。

药物组合物能适应任何适当途径的施用，例如通过口腔(包括含服或舌下)、直肠、鼻、局部(包括含服、舌下或经皮)、阴道或肠胃外(包括皮下、肌肉内、静脉内或皮内)途径。这种组合物可通过药学领域中已知的任何方法制备，例如在无菌条件下混合活性成分与载体或赋形剂。

筛选用途

本发明的scTCRs能用于筛选方法，筛选方法设计用于鉴定TCR-介导的细胞免疫突触的调节物，包括抑制剂。

本领域技术人员已知一些测定形式提供此类蛋白-蛋白相互作用筛选的合适基础。

放大发光邻近均匀测定系统如AlphaScreen^TM，取决于“供体”和“受体”珠的使用，珠包被受体和配基蛋白能附着的水凝胶层。这些受体和配基分子间的相互作用使珠接近。当这些珠受到激光时，“供体”珠中的光敏剂使周围的氧转变成更激发的单线态。单线态氧分子横跨扩散以与“受体”珠中的化学发光剂反应，进一步激活相同珠内所含荧光团。荧光团随后在520-620nm处发光，此信号显示受体-配基相互作用发生。受体-配基相互作用抑制剂的存在导致此信号减少。

表面等离振子共振(SPR)是界面光学测定，其中1个结合伴侣(通常是受体)在‘芯片’(传感器表面)上固定且检测另1个结合伴侣(通常是配基)的结合，后者可溶并溢出芯片。配基结合导致芯片表面附近的蛋白浓度增加，使该区域中的折射率变化。芯片表面组成使折射率变化可通过表面等离振子共振检测，表面等离振子共振是一种光学现象，其中薄金属薄膜上某一入射角的光产生强度减小的反射束，这是由于振动表面电荷密度(表面待离振子)波的共振激发。共振对金属薄膜远侧上的折射率变化很敏感，此信号用于检测固定和可溶蛋白间的结合。能方便使用SPR检测分子相互作用和数据分析的系统可商业购买。例子是Iasys^TM机器(Fisons)和Biacore^TM机器。

其它界面光学测定包括总内部反射荧光(TIRF)、共振镜(RM)和光栅耦合传感器(GCS)，它们更详细讨论于Woodbury和Venton(J.Chromatog.B.725113-137(1999))。

闪烁亲近测定(SPA)用于筛选CD28与B7间的低亲和性相互作用(该区域的K_d或许为4μM)的抑制剂的化合物库，(Van der Merwe等J.Exp.Med.185：393-403(1997)，Jenh等，Anal Biochem165(2)287-93(1998))。SPA是放射性测定，使用来自某些放射性同位素的β粒子发射，将能量转移到指示器表面上固定的闪烁体。溶液中小范围的β粒子确保闪烁仅当β粒子在闪烁体邻近发射时产生。当应用于检测蛋白-蛋白相互作用时，1个相互作用伴侣用放射性同位素标记，而另1个结合含闪烁体的珠或与闪烁体一起在表面上包被。如果测定法能最优地制定，放射性同位素可足够接近闪烁体，仅当2种蛋白间发生结合时用于激活光子发射。

发明的另一方面是鉴定scTCR与TCR配基间相互作用抑制剂的方法，TCR配基选自MHC-肽复合体、CD1-抗原复合体、超抗原和MHC-肽/超抗原复合体，方法包括使scTCR在测试化合物存在和缺乏时接触scTCR配基结合伴侣，确定测试化合物的存在是否减少scTCR与配基的结合，这种减少看作是鉴定抑制剂。

发明的最后一方面是鉴定scTCR与TCR配基间相互作用的潜在抑制剂的方法，TCR配基选自MHC-肽复合体、CD1-抗原复合体、超抗原和MHC-肽/超抗原复合体，方法包括使scTCR或scTCR配基结合伴侣接触测试化合物并确定测试化合物是否结合scTCR和/或配基，这种结合看作是鉴定潜在抑制剂。发明的此方面可特定用于界面光学测定，如用Biacore^TM系统完成的测定。

发明各方面的优选特征是对各其它方面已作必要的修改。本文所示现有技术文献以法律允许的最充分程度纳入。

实施例

发明在以下例子中进一步描述，例子不以任何方式限制发明的范围。

参考下列附图，其中：

图1a和1b分别显示可溶A6TCR的α和β链的核酸序列，突变以引入半胱氨酸密码子。阴影指示引入的半胱氨酸密码子；

图2a显示A6TCRα链胞外氨基酸序列，包括用于产生新链间二硫键的T₄₈→C突变(下划线)，图2b显示A6TCRβ链胞外氨基酸序列，包括用于产生新链间二硫键的S₅₇→C突变(下划线)。

图3显示Gly/Ser接头(30mer)的DNA和氨基酸序列。

图4概括用于产生scDiS A6 TCR的克隆策略。

图5a显示scDiS A6 TCR的DNA序列。

图5b显示scDiS A6 TCR的氨基酸序列。

图6说明从POROS 50HQ离子交换柱洗脱scDiS A6 TCR蛋白，使用0-500mMNaCl梯度，如直线所示；

图7显示来自图6所示柱运行的A15、B10、B9和B3部分的还原SDS-PAGE(考马斯染色)和非还原SDS-PAGE(考马斯染色)凝胶的结果。B9和B10部分明显包含对应于scDiS A6 TCR的预计大小的蛋白；

图8说明通过Superdex 200凝胶过滤柱从B10-B7部分洗脱scDiS A6 TCR，B10-B7部分来自图6所示的离子交换柱运行；

图9显示来自图8所示凝胶过滤柱运行的B8、B7、B3和B2部分的还原SDS-PAGE(考马斯染色)和非还原SDS-PAGE(考马斯染色)凝胶的结果。B7部分明显包含对应于scDiS A6 TCR的预计大小的蛋白；

图10是图8所示凝胶过滤运行的B9-B6浓缩组分的BIAcore缓冲液中运行入最终凝胶过滤。scDiS A6 TCR作为单个主要峰洗脱；

图11是scDiS A6 TCR结合HLA-A2 TAX的BIAcore数据。

实施例1-设计A6 Tax TCRα和β链的引物和诱变以引入形成新链间二硫键所需的半胱氨酸残基

为将TRAC*01中外显子1的A6 Tax苏氨酸48突变成半胱氨酸，设计下列引物(突变以小写字体表示)：

5’-C ACA GAC AAA tgT GTG CTA GAC AT

5’-AT GTC TAG CAC Aca TTT GTC TGT G

为将TRBC1*01和TRBC2*01中外显子1的A6 Tax丝氨酸57突变成半胱氨酸，设计下列引物(突变以小写字体表示)：

5’-C AGT GGG GTC tGC ACA GAC CC

5’-GG GTC TGT GCa GAC CCC ACT G

PCR诱变：

表达质粒含用于A6 Tax TCRα或β链的基因，质粒分别用α链引物或β链引物如下突变。100ng质粒混合5μl 10mM dNTP、25μl 10xPfu-缓冲液(Stratagene)、10单位Pfu聚合酶(Stratagene)且终体积用H₂O调至240μl。48μl的此混合物补充引物，稀释到在50μl终反应体积中的终浓度为0.2μM。在Hybaid PCR express PCR机器中，95℃30秒的初始变性步骤后，反应混合物进行15轮的变性(95℃，30秒)，退火(55℃，60秒)，延伸(73℃，8分钟)。产物然后用10单位的DpnI限制性酶(NewEngland Biolabs)37℃消化5小时。10μl的消化反应物转化到感受态XL1-Blue细菌中并37℃生长18小时。挑出单菌落且在5ml TYP+氨苄青霉素(16g/l细菌用胰蛋白胨、16g/l酵母膏、5g/l NaCl、2.5g/l K₂HPO₄、100mg/l氨苄青霉素)中生长过夜。质粒DNA在Qiagen mini-prep柱上根据厂商说明书纯化，序列通过牛津大学生化系的测序设备自动测序确认。图1a和2a分别显示α链的突变核酸和氨基酸序列且图1b和2b显示β链的突变核酸和氨基酸序列。

实施例2-设计、表达和测试掺入新链间二硫键的单链A6TCR

表达载体含突变A6 TCRα和β链的DNA序列，序列掺入形成新二硫键所需的另外半胱氨酸残基，如实施例1所制备且如图1a和1b所示，载体用作如下产生单链A6TCR的基础，除了终止密码子(TAA)从α链序列末端去除：

scDiS A6 TCR包含TCRα链C末端与β链N末端间的30个氨基酸接头序列。图3显示此接头的DNA和氨基酸序列。用于产生scDiS A6 TCR的克隆策略概括于图4。

简要地，A6 dsTCR的α和β链通过PCR扩增，所用引物含图4所示限制性位点，即：

α5’引物：ccaaggccatatgcagaaggaagtggagcagaactct

α3’引物：ttgggcccgccggatccgcccccgggggaactttctgggctgggg

β5’引物：tcccccgggggcggatccggcgggcccaacgctggtgtcactcag

β3’引物：gggaagcttagtctgctctaccccaggcctcg

因而产生的2个片段用5’α和3’β引物PCR接合以产生有短接头的单链TCR，接头含XmaI-BamHI-ApaI位点。此片段克隆到pGMT7中。全长接头然后在2个阶段中插入，首先42bp片段用XmaI和BamHI位点插入：

5’-CC GGG GGT GGC TCT GGC GGT GGC GGT TCA GGC GGT GGC G -3’

3’-C CCA CCG AGA CCG CCA CCG CCA AGT CCG CCA CCG CCT AG-5’

其次，48bp片段用BamHI和ApaI位点插入以产生α链3’末端与β链5’末端间的90bp接头。48bp片段通过PCR延伸下列寡核苷酸混合物产生：

5’-GC GGA TCC GGC GGT GGC GGT TCG GGT GGC GGT GGC TC-3’

3’-CCA AGC CCA CCG CCA CCG AGT CCG CCA CCG CCC GGG TG-5’

此延伸的产物用BamHI和ApaI消化并连接入含42bp接头片段的消化质粒中。

scDiS A6 TCR的完整DNA和氨基酸序列分别示于图5a和5b。

表达和纯化单链二硫键连接的A6 TCR：

含单链二硫键连接的A6 TCR的表达质粒转化到大肠杆菌(E.coli)菌株BL21pLysS中，单个氨苄青霉素抗性菌落在TYP(氨苄青霉素100μg/ml)培养基中37℃生长到OD₆₀₀为0.4，然后用0.5mM IPTG诱导蛋白表达。诱导后3小时在Beckman J-6B中以4000rpm离心30分钟来收集细胞。细胞沉淀重悬于缓冲液，缓冲液含500mM Tris-HCl、25％(w/v)蔗糖、1mM NaEDTA、0.1％(w/v)叠氮钠、10mMDTT，pH8.0。过夜冻融步骤后，重悬浮细胞在Milsonix XL2020超声波仪中以1分钟促发超声波降解，总共约10分钟，使用标准的12mm直径探针。通过在BeckmanJ2-21离心机中以13000rpm离心30分钟回收内含体沉淀。然后用洗涤剂洗3次以取出细胞碎片和膜成分。每次内含体在Triton缓冲液(50mM Tris-HCl、0.5％Triton-X100、200mM NaCl、10mM NaEDTA、0.1％(w/v)叠氮钠、2mMDTT，pH8.0)中匀浆，然后通过Beckman J2-21，13000rpm离心15分钟来沉淀。随后在下列缓冲液中类似洗涤去除洗涤剂和盐：50mM Tris-HCl、1mM NaEDTA、0.1％(w/v)叠氮钠、2mM DTT，pH8.0。最后，内含体分成30mg等分并在-70℃冷冻。定量内含体蛋白产量是通过用6M胍-HCl溶解和Bradford染料结合测定(PerBio)测量的。

约15mg溶解的内含体链从冻存物中解冻。内含体在6M胍溶液中稀释到5mg/ml终浓度，加入DTT(2M贮存液)至10mM终浓度。混合物在37℃孵育30分钟。制备1升下列重折叠缓冲液：100mM Tris pH8.5、400mM L-精氨酸、2mM EDTA、5mM还原谷胱甘肽、0.5mM氧化谷胱甘肽、5mM尿素、0.2mMPMSF且在5℃±3℃剧烈搅拌。在加入变性TCR链之前约5分钟加入氧化还原对(2-巯基乙胺和胱胺(分别到6.6mM和3.7mM的终浓度)。然后蛋白可重折叠约5小时±15分钟，5℃±3℃搅拌。然后重折叠物透析2次，第1次相对10升100mg尿素，第2次相对10升100mM尿素、10mM Tris pH8.0。重折叠和透析步骤在6-8℃完成。

scTCR分离自降解产物和杂质，分离是通过将透析的重折叠物上样到POROS50HQ阴离子交换柱上并用0-500mM NaCl梯度在50柱体积中洗脱结合蛋白，使用Akta净化器(Pharmacia)，如图6所示。峰部分于4℃保存，通过考马斯染色的SDS-PAGE分析(图7)，然后混合和浓缩。然后纯化sTCR并用Superdex200HR凝胶过滤柱表征(图8)，柱在HBS-EP缓冲液(10mM HEPES pH7.4、150mM NaCl、3.5mM EDTA、0.05％乙基苯基聚乙二醇p40)中预平衡。峰部分于4℃保存，通过考马斯染色的SDS-PAGE分析(图9)，然后混合和浓缩。最后，浓缩的B9-B6部分进行另一个凝胶过滤步骤以在BIAcore缓冲液中产生纯化蛋白(图10)。合并在约50kDa相对分子量洗脱的峰。浓缩，然后通过BIAcore表面等离振子共振分析鉴定。

实施例3-scTCR结合HLA-A2Tax的BIAcore表面等离振子共振鉴定

表面等离振子共振生物传感器(BIAcore 3000^TM)用于分析A6scTCR与其肽-MHC配基(HLA-A2Tax)的结合。这通过产生单一pMHC复合体(描述于下)来促进，复合体以半定向方式固定到链霉抗生物素蛋白包被的结合表面上，能有效测试可溶T细胞受体同时与多达4个不同pMHC(固定于分离流动细胞上)的结合。手工注射HLA复合体使精确水平的固定I型分子能容易操作。

这种固定复合体能结合T细胞受体和共受体CD8αa，两者都可以可溶相注射。

生物素酰化的I型HLA-A2-Tax复合体从细菌表达的内含体中体外重折叠，内含体含组成型亚基蛋白和合成肽，接着进行纯化和体外酶生物素酰化(O’Callaghan等.(1999)Anal.Biochem.266：9-15)。HLA-重链用C-末端生物素酰化标记表达，标记在适当构建物中取代蛋白的跨膜和细胞质结构域。HLA-轻链或β2-微球蛋白也在大肠杆菌中作为内含体从适当构建物中表达，水平为～500mg/升细菌培养物。

裂解大肠杆菌细胞且内含体纯化到约80％纯度。来自内含体的蛋白在6M胍-HCl、50mM Tris pH8.1、100mM NaCl、10mM DTT、10mM EDTA中变性，以30mg/升重链、30mg/升β2m的浓度在0.4M L-精氨酸-HCl、100mM Tris pH8.1、3.7mM胱胺、mM半胱胺、4mg/ml肽(例如tax11-19)中重折叠，通过于＜5℃加入单脉冲的变性蛋白到重折叠缓冲液中。重折叠于4℃达到完成至少要1小时。

缓冲液通过在10体积的10mM Tris pH8.1中透析来交换。需要2次交换的缓冲液以充分减少溶液的离子强度。蛋白溶液然后经1.5μm乙酸纤维素滤器过滤并上样到POROS 50HQ阴离子交换柱(8ml床体积)上。蛋白用0-500mM NaCl线性梯度洗脱。HLA-A2-肽复合体在约250mM NaCl洗脱，收集峰部分，加入蛋白酶抑制剂混合物(Calbiochem)且组分在冰上冷却。

生物素酰化标记的HLA复合体在10mM Tris pH8.1、5mM NaCl中缓冲液交换，用在相同缓冲液中平衡的Pharmacia快速脱盐柱。洗脱后，含蛋白的组分立即在冰上冷却并加入蛋白酶抑制剂混合物(Calbiochem)。然后加入生物素酰化试剂：1mM生物素、5mM ATP(缓冲到pH8)、7.5mM MgCl2和5μg/ml BirA酶(根据O’Callaghan等.(1999)Anal.Biochem.266：9-15纯化)。然后混合物可室温孵育过夜。

生物素酰化的HLA复合体用凝胶过滤层析纯化。Pharmacia Superdex 75HR10/30柱用滤过的PBS预平衡，上样1ml生物素酰化反应混合物且柱用PBS以0.5ml/分钟展开。生物素酰化的HLA复合体作为单峰洗脱，约15ml。合并含蛋白的组分，冰上冷却，加入蛋白酶抑制剂混合物。蛋白浓度用考马斯-结合测定(PerBio)确定，生物素酰化的HLA复合体等分在-20℃冷冻保存。链霉抗生物素蛋白通过标准胺偶联方法固定。

含新链间键的A6 Tax scTCR与其配基/MHC复合体或不相关HLA-肽组合间的相互作用在BIAcore 3000^TM表面等离振子共振(SPR)生物传感器上分析，HLA-肽组合如上所述产生。SPR测量小流动细胞内传感器附近的折射率变化，以反应单位(RU)表示，此原理能用于检测受体配基相互作用和分析其亲和性及动力学参数。制备探测流动细胞是通过在分离流动细胞中固定单独HLA-肽复合体，固定是经β2m与链霉抗生物素蛋白上交联的生物素间的结合，链霉抗生物素蛋白化学交联于流动细胞的活化表面。然后进行测定，scTCR以恒定流速穿过不同流动细胞的表面，在这情况下测量SPR反应。以恒定流速和超过肽-HLA复合体的不同浓度注射可溶sTCR，用于确定背景共振。这些对照测量值从特定肽-HLA复合体所得值中减去并用于计算结合亲和性，表示为解离常数Kd(Price&Dwek，《生物化学家的物理化学原理和问题》(Principles and Problems in Physical Chemistry forBiochemists)(第2版)1979，Clarendon Press，Oxford)。

scDiS A6 TCR的BIAcore分析证明，此分子特异结合其相关配基(HLA-A2TAX)，kd为12.4±1.62μM。

Claims

1.一种单链T细胞受体，即scTCR，其特征在于，所述scTCR包括

由融合TCRα链恒定区胞外序列N末端的TCRα链可变区序列构成的α区段，其中，TCRα链恒定区胞外序列包括对应于TCRα链胞外恒定Ig结构域的序列，

由融合TCRβ链恒定区胞外序列N末端的TCRβ链可变区构成的β区段，其中，TCRβ链恒定区胞外序列包括对应于TCRβ链胞外恒定Ig结构域的序列，和

其中，所述TCRα和TCRβ恒定区胞外序列的C末端截短，从而排除形成TCR天然链间二硫键的半胱氨酸残基，

连接α区段C末端与β区段N末端的接头序列，或反之亦然，

由二硫键连接的α和β区段的恒定区胞外序列，所述二硫键在天然αβT细胞受体中没有对应物，

接头序列长度和所述在天然αβT细胞受体中没有对应物的二硫键位置使α和β区段的可变区序列如在天然αβT细胞受体中一样相互定位。

2.如权利要求1所述的scTCR，其特征在于，二硫键连接半胱氨酸残基，半胱氨酸残基所取代氨基酸残基的β碳原子在TCRα和β胞外恒定Ig结构域的对应序列中分开小于0.6nm。

3.如权利要求1或2中任一项所述的scTCR，其特征在于，α和β区段中存在的恒定区胞外序列对应于天然TCR的α和β链恒定区，天然TCR的C末端截短从而排除形成TCR天然链间二硫键的半胱氨酸残基。

4.如权利要求1或2中任一项所述的scTCR，其特征在于，α和β区段中存在的恒定区胞外序列对应于天然TCR的α和β链恒定区，天然TCR中形成天然链间二硫键的半胱氨酸残基由另一个氨基酸残基取代。

5.如上述权利要求1或2中任一项所述的scTCR，其特征在于，不存在天然TCRβ链中存在的未配对半胱氨酸残基。

6.如上述权利要求1或2中任一项所述的scTCR，其特征在于，α区段恒定区胞外序列包括对应于TRAC*01的序列且β区段包括对应于TRBC1*01或TRBC2*01的序列，所述非天然二硫键在半胱氨酸残基之间，半胱氨酸残基取代TRAC*01外显子1的Thr48和TRBC1*01或TRBC2*01外显子1的Ser57。

7.如权利要求1或2中任一项所述的scTCR，其特征在于，共价连接治疗剂。

8.一种药物组合物，其特征在于，所述组合物包括上述权利要求中任一项所述的scTCR和药学上可接受载体。