CH676467A5

CH676467A5 -

Info

Publication number: CH676467A5
Application number: CH1336/87A
Authority: CH
Inventors: Brunetto Brunetti; Marco Prada
Original assignee: Ellem Ind Farmaceutica
Priority date: 1986-04-09
Filing date: 1987-04-07
Publication date: 1991-01-31
Also published as: JPH0645637B2; NL8700827A; AU597048B2; IE59806B1; ES2003043A6; KR870010080A; FR2597107B1; GB2189491B; CA1322715C; AR242799A1; AU7118287A; GB8708492D0; JPS62267296A; IT8620027A1; IT1188646B; BE1000263A4; DE3712050A1; DE3712050C2; ATA88387A; SE8701457D0

Description

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CH676 467A5 CH676 467A5

Descrizione Description

Dai dati di letteratura è noto che la L-alanina è importante per la funzione dei T linfociti, perchè è essenziale per la risposta in vitro di queste cellule agli stimoli mitogenici (Rotter V. et al.: J. Immunol. 123, 1726,1979), La L-alanina inoltre è anche essenziale alla crescita in vitro di linfociti (Nordlind K. et al.: Int. Archs Allergy Appi. Immunol. 59, 215, 1979). Dati dai nostri laboratori, comunque, documentano che questo amminoacido ha solamente una attività immunostimolante molto debole, come è mostrato nel test in vitro di induzione di Thy 1.2 in cellule T immature di topi normali. From literature data it is known that L-alanine is important for the function of T lymphocytes, because it is essential for the in vitro response of these cells to mitogenic stimuli (Rotter V. et al .: J. Immunol. 123, 1726, 1979), L-alanine is also essential for the in vitro growth of lymphocytes (Nordlind K. et al .: Int. Archs Allergy Appi. Immunol. 59, 215, 1979). Data from our laboratories, however, document that this amino acid has only a very weak immunostimulating activity, as shown in the in vitro induction test of Thy 1.2 in immature T cells of normal mice.

Da dati di letteratura risulta che anche la L-arginina è dotata di attività immunostimolante sia in vitro che in vivo, in particolare in animali stressati o nei quali siano state provocate lesioni (Barbul A. et ài, J. Surg. Res. 29, 228,1980; J. Parenteral Enterai Nutr. 4, 446,1980; ibid. 5,492,1981) ed in tumori indotti sperimentalmente (Rettura G.: J. Parenteral Enterai Nutrition 3,409,1979). From literature data it appears that L-arginine also has immunostimulating activity both in vitro and in vivo, in particular in stressed animals or in which injuries have been caused (Barbul A. et ài, J. Surg. Res. 29, 228,1980; J. Parenteral Enterai Nutr. 4, 446,1980; ibid. 5,492,1981) and in experimentally induced tumors (Rettura G .: J. Parenteral Enterai Nutrition 3,409.1979).

Nel nostro test di induzione di Thy 1.2, anche la L-arginina mostra una attività scarsa, benché statisticamente significativa. In our Thy 1.2 induction test, L-arginine also exhibits poor, though statistically significant activity.

Abbiamo sintetizzato un tripeptide avente la sequenza Arg-Ala-Arg ed abbiamo confrontato la sua attività nel nostro test con quella della miscela dei due singoli amminoacidi nel rapporto molare 2Arg:1 Ala. II tripeptide risulta essere di gran lunga più attivo della miscela dei due amminoacidi, infatti esso induce il 13% di cellule (P<0.01), mentre la miscela solo il 5% (statisticamente non significativo). We synthesized a tripeptide having the Arg-Ala-Arg sequence and we compared its activity in our test with that of the mixture of the two single amino acids in the molar ratio 2Arg: 1 Ala. The tripeptide is far more active than the mixture of the two amino acids, in fact it induces 13% of cells (P <0.01), while the mixture only 5% (statistically not significant).

La scelta di mettere la L-arginina in entrambe le posizioni terminali del tripeptide è basata sul fatto che, in molti peptidi immunostimolanti noti, questo amminoacido occupa o la posizione N-terminaie (come nel caso della timopentina) o la C-terminale (per es. in tuftsina, ubiquitina, timopoietina). The choice of putting L-arginine in both terminal positions of the tripeptide is based on the fact that, in many known immunostimulating peptides, this amino acid occupies either the N-terminal position (as in the case of thymopentin) or the C-terminal (for e.g. in tuftsina, ubiquitin, thymopoietin).

CARATTERISTICHE CHIMICHE CHEMICAL CHARACTERISTICS

PESO MOLECOLARE: 401.29 MOLECULAR WEIGHT: 401.29

ROTAZIONE OTTICA: [a]20 = 3.69 (c = 1, acido acetico) OPTICAL ROTATION: [a] 20 = 3.69 (c = 1, acetic acid)

ANALISI HPLC HPLC ANALYSIS

Il tripeptide è stato analizzato mediante HPLC a coppia ionica, secondo le condizioni di separazione qui descritte: The tripeptide was analyzed by ion pair HPLC, according to the separation conditions described here:

Eluente: NaH2P04 0.05M pH 4.3 + sds 5x10-4 m, MeOH; 50 :50. Eluent: NaH2P04 0.05M pH 4.3 + sds 5x10-4 m, MeOH; 50: 50.

Flusso: 1 ml/min. Flow: 1 ml / min.

Lunghezza d'onda: 225 nm. Wavelength: 225 nm.

Volume iniettato: 20 mei. Injected volume: 20 mei.

Campione: 20 mcg. Sample: 20 mcg.

Colonna: u Bondapack C18 (WATERS), 300 x 3.9 mm. Column: u Bondapack C18 (WATERS), 300 x 3.9 mm.

La strumentazione usata è stata la seguente: The instrumentation used was the following:

Cromatografo liquido: SERIES 4 (PERKIN ELMER). Liquid chromatograph: SERIES 4 (PERKIN ELMER).

Valvola di iniezione: Reodyne mod. 7125-075 con loop da 20 ul. Injection valve: Reodyne mod. 7125-075 with 20 ul loop.

Rivelatore: Spettrofotometro LC 95 (PERKIN ELMER). Detector: LC 95 spectrophotometer (PERKIN ELMER).

Integratore computerizzato: Data Station 3600 (PERKIN ELMER). Computerized integrator: Data Station 3600 (PERKIN ELMER).

Il profilo del tripeptide in HPLC è riportato nella figura. The profile of the tripeptide in HPLC is shown in the figure.

RESISTENZA ALL'AMBIENTE GASTRICO SIMULATO IN VITRO. RESISTANCE TO THE SIMULATED IN VITRO GASTRIC ENVIRONMENT.

Il tripeptide è risultato resistente all'ambiente gastrico simulato in vitro, in cui si è utilizzata la soluzione di fluido gastrico simulato USP XXI (HCl + pepsina) a T 37 per 5 ore. The tripeptide was resistant to the simulated gastric environment in vitro, in which the simulated gastric fluid solution USP XXI (HCl + pepsin) was used at T 37 for 5 hours.

METODO DI SINTESI SUMMARY METHOD

N02 N02

Boc-Ala-Arg-OBe (1) Boc-Ala-Arg-OBe (1)

Alla Boc-AIa (0.1 mole) disciolta in cloruro di metilene e raffreddata a 0°C +/-1 è stato aggiunto isobutil-cloroformiato (0.1 mole) sotto agitazione ed abbassando la temperatura a -15°C. Dopo aver mantenuto la miscela di reazione in agitazione a -15°C per 15 minuti, è stata aggiunta lentamente una soluzione preraffreddata di NG-Nitro-Arginina-benzil estere di-p-tosilato (0.1 mole) e N-metil-morfolina (NMM) (0.2 mole) in dimetiiformamide. La miscela di reazione è stata lasciata sotto agitazione per una notte. To the Boc-AIa (0.1 mole) dissolved in methylene chloride and cooled to 0 ° C +/- 1, isobutyl chloroformate (0.1 mole) was added under stirring and lowering the temperature to -15 ° C. After keeping the reaction mixture under stirring at -15 ° C for 15 minutes, a pre-cooled solution of NG-Nitro-Arginine-benzyl ester di-p-tosylate (0.1 mole) and N-methyl-morpholine was slowly added NMM) (0.2 mole) in dimetiiformamide. The reaction mixture was left under stirring overnight.

[ solventi sono stati rimossi per evaporazione a pressione ridotta ed il residuo ottenuto ripreso in acetato di etile. The solvents were removed by evaporation under reduced pressure and the residue obtained taken up in ethyl acetate.

L'acetato di etile è stato lavato, in fasi successive, con acqua, con acido cloridrico 1N, con una soluzione acquosa di sodio bicarbonato al 5%, e ancora con acqua, quindi anidrificato su sodio solfato. Il solvente è stato rimosso per evaporazione a pressione ridotta ed il prodotto ottenuto, un liquido molto den2 The ethyl acetate was washed, in successive stages, with water, with 1N hydrochloric acid, with a 5% sodium bicarbonate aqueous solution, and again with water, then dried over sodium sulphate. The solvent was removed by evaporation under reduced pressure and the product obtained, a very den2 liquid

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CH676467A5 CH676467A5

so, è stato cromâtografato mediante TLC con il sistema CHC13:MeOH:AcOH (90:8:2). La purezza era del 95% e le rese deli'80%. I know, it has been chromatographed by TLC with the system CHC13: MeOH: AcOH (90: 8: 2). The purity was 95% and the yields were 80%.

Il gruppo Boc è stato rimosso mediante trattamento con la miscela acido trifluoroacetico 50%: cloruro di metilene 1:1,10 mi per g, per 30 min. La miscela di reazione è stata evaporata a pressione ridotta, ed il residuo ottenuto è stato triturato in etere etilico, filtrato, lavato con etere ed essicato sotto vuoto. Le rese sono state del 98%. The Boc group was removed by treatment with the 50% trifluoroacetic acid mixture: 1: 1.10 ml methylene chloride per g, for 30 min. The reaction mixture was evaporated under reduced pressure, and the residue obtained was triturated in ethyl ether, filtered, washed with ether and dried under vacuum. Yields were 98%.

Il prodotto ottenuto TFA-Ala-Arg-OBe è stato neutralizzato con NMM e fatto reagire con Z3-Arg disciolta in dimetilformamide-tetraidrofurano, usando NMM e isobutilcloroformiato e operando nelle stesse condizioni descritte per (1). Rese 60%. The product obtained TFA-Ala-Arg-OBe was neutralized with NMM and reacted with Z3-Arg dissolved in dimethylformamide-tetrahydrofuran, using NMM and isobutylchloroformate and operating under the same conditions described for (1). Yield 60%.

Da un controllo fatto con cromatografia su strato sottile con il sistema cloroformio:metanolo (92:8) è risultata una sola macchia principale. From a check made with thin layer chromatography with the chloroform: methanol (92: 8) system, only one main stain was found.

Il tripeptide è stato idrogenato con Pd/C in acido acetico-acqua-metanolo. A fine reazione, la sospensione è stata filtrata per rimuovere il catalizzatore ed il filtrato è stato evaporato sotto vuoto. The tripeptide was hydrogenated with Pd / C in acetic acid-water-methanol. At the end of the reaction, the suspension was filtered to remove the catalyst and the filtrate was evaporated under vacuum.

Il prodotto ottenuto, il tripeptide, è stato purificato mediante distribuzione in contro corrente nel sistema n-butanolo: acido acetico: acqua (4:1:5) con rese del 50%. The product obtained, the tripeptide, was purified by countercurrent distribution in the n-butanol: acetic acid: water (4: 1: 5) system with 50% yields.

Dalla cromatografia su strato sottile con sistema butanolo:acido acetico:acqua:piridina (32:6:22:20) è risultato una macchia principale e dal controllo HPLC una purezza del 97%. Thin layer chromatography with butanol system: acetic acid: water: pyridine (32: 6: 22: 20) resulted in a main stain and by HPLC control a purity of 97%.

ATTIVITÀ' BIOLOGICHE BIOLOGICAL ACTIVITIES

1. a induzione in vitro dell'antigene thy 1.2 1. by in vitro induction of thy antigen 1.2

La capacità di Arg-Ala-Arg di indurre in vitro il differenziamento dei precursori delle cellule T del topo in linfociti esprimenti markers T cellulari è stata provata evidenziando l'induzione dell'antigene di membrana Thy 1.2. The ability of Arg-Ala-Arg to induce in vitro the differentiation of mouse T cell precursors into lymphocytes expressing cell T markers has been proven by highlighting the induction of Thy 1.2 membrane antigen.

MATERIALI E METODI MATERIALS AND METHODS

TOPI: topi nudi (nu/nu) SPF dell'età di 8 settimane. MICE: naked mice (nu / nu) SPF aged 8 weeks.

PREPARAZIONE DELLE CELLULE: le milze sono state rimosse in condizioni asettiche, sminuzzate e passate attraverso un setaccio in acciaio inossidabile a maglie fini in una soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS). CELL PREPARATION: the spleens were removed under aseptic conditions, shredded and passed through a fine-meshed stainless steel sieve in a balanced Hank saline solution (HBSS).

Gli splenociti, lavati e risospesi in mezzo di coltura 199 (Gibco Ltd) supplementato con l'1% di BSA (Boehringer Mannheim) e con gentamicina (100 mcg/ml), sono stati incubati per 45 min. in colonne di lana di nylon equilibrate secondo il metodo di Julius et al. (Eur. J. Immunol: 3,645,1973). The splenocytes, washed and resuspended in culture medium 199 (Gibco Ltd) supplemented with 1% BSA (Boehringer Mannheim) and with gentamicin (100 mcg / ml), were incubated for 45 min. in nylon wool columns balanced according to the method of Julius et al. (Eur. J. Immunol: 3,645.1973).

Sono state usate le popolazioni cellulari effluenti arricchite in precursori delle cellule T. Effluent cell populations enriched in T cell precursors were used

INDUZIONE: 0,5x106 cellule effluenti in 0,1 mi di mezzo di coltura, sono state incubate a 37°C per 18 ore, con o senza il tripeptide. Le colture sono state eseguite in duplicato. INDUCTION: 0.5x106 effluent cells in 0.1 ml of culture medium, were incubated at 37 ° C for 18 hours, with or without the tripeptide. The crops were run in duplicate.

Al termine dell'incubazione, le cellule sono state lavate con Io 0,87% di ammonio cloruro per lisare gli eritrociti, poi con HBSS. At the end of the incubation, the cells were washed with 0.87% ammonium chloride to lyse the erythrocytes, then with HBSS.

L'induzione dell'antigene di membrana Thy 1.2 è stata determinata mediante immunofluorescenza diretta. The induction of Thy 1.2 membrane antigen was determined by direct immunofluorescence.

IMMUNOFLUORESCENZA DIRETTA: le cellule sono state incubate a 4°C per 20 min. con anticorpo monoclonale anti Thy 1.2 coniugato con fluoresceina (Bio-Yeda) alla diluizione di 1:200. La miscela è stata centrifugata a 300 g per 5 min., lavata 2 volte in HBSS e poi sospesa per il conteggio al microscopio a fluorescenza (Leitz Orthoplan). DIRECT IMMUNOFLUORESCENCE: cells were incubated at 4 ° C for 20 min. with anti-Thy 1.2 monoclonal antibody conjugated with fluorescein (Bio-Yeda) at a dilution of 1: 200. The mixture was centrifuged at 300 g for 5 min., Washed twice in HBSS and then suspended for counting under a fluorescence microscope (Leitz Orthoplan).

La differenza in percentuale di cellule fluorescenti tra colture con e senza tripeptide, ha dato l'attività inducente del prodotto, The difference in percentage of fluorescent cells between crops with and without tripeptide, gave the inducing activity of the product,

RISULTATI: come mostrato nella tabella, il tripeptide induce la comparsa del marker Thy 1.2 in cellule T immature con una risposta ottimale a 10 mcg/ml. La curva dose-risposta è a forma di campana, poiché concentrazioni maggiori e minori di 10 mcg/ml provocano una Induzione inferiore. RESULTS: as shown in the table, tripeptide induces the appearance of the Thy 1.2 marker in immature T cells with an optimal response at 10 mcg / ml. The dose-response curve is bell-shaped, since concentrations higher and lower than 10 mcg / ml cause a lower induction.

3 3

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10 10

15 15

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65 65

CH 676 467 A5 CH 676 467 A5

Concentrazione del tripeptide (mcg/ml) Tripeptide concentration (mcg / ml)

% Cellule Thy 1.2 + Media +/— E.S. % Cells Thy 1.2 + Media +/— E.S.

Variazione change

0 0

11 +/-1.6 11 +/- 1.6

— -

0.0001 0.0001

13+/-3.9 13 +/- 3.9

+ 2 + 2

0.001 0001

25+/-5 25 +/- 5

+ 14 + 14

0.01 00:01

36+/-3.7 36 +/- 3.7

+ 25 + 25

0.1 0.1

36+/-5.4 36 +/- 5.4

+ 25 + 25

1 1

41 +/-1.6 41 +/- 1.6

+ 30 + 30

10 10

48+/-2.2 48 +/- 2.2

+ 37 + 37

20 20

33+/-3.3 33 +/- 3.3

+ 22 + 22

50 50

29+/- 3.3 29 +/- 3.3

+ 18 + 18

100 100

19+/-1.7 19 +/- 1.7

+ 8 + 8

200 200

19+/—4.5 19 +/- 4.5

+ 8 + 8

1.B INDUZIONE DELL'ANTIGENE THY 1.2 IN VIVO 1.B INDUCTION OF THY 1.2 ANTIGEN IN VIVO

Il tripeptide è stato somministrato per 4 giorni consecutivi e i topi sono poi stati sacrificati 24 ore dopo l'ultima somministrazione. Le milze sono state rimosse e le cellule esaminate per l'espressione dell'antigene Thy 1.2 mediante fluorescenza. I topi di controllo hanno ricevuto il Medium 199 (M199), il mezzo in cui il farmaco è stato dissolto. The tripeptide was administered for 4 consecutive days and the mice were then sacrificed 24 hours after the last administration. The spleens were removed and cells examined for expression of Thy 1.2 antigen by fluorescence. Control mice received Medium 199 (M199), the medium in which the drug was dissolved.

I topi avevano un peso medio di circa 24 g. The mice had an average weight of around 24 g.

Risultati Results

% Cellule Thy 1.2 + orale i.p. % Cells Thy 1.2 + oral i.p.

Controllo Control

2% 2%

4% 4%

ELS2 42 ug/kg ELS2 42 ug / kg

3% 3%

4% 4%

ELS2 420 ug/kg ELS2 420 ug / kg

6% 6%

7% 7%

ELS21055 ug/kg ELS21055 ug / kg

17% 17%

19% 19%

ELS2 2110 ug/kg ELS2 2110 ug / kg

16% 16%

17% 17%

ELS2 4220 (ig/kg ELS2 4220 (ig / kg

18% 18%

17% 17%

ELS2 8440 ug/kg ELS2 8440 ug / kg

17% 17%

20% 20%

(ELS2 = Tripeptide Arg-Ala-Arg) (ELS2 = Tripeptide Arg-Ala-Arg)

I dati mostrano che il tripeptide ELS2 è in grado di indurre la maturazione degli splenociti sia dopo somministrazione orale che intraperitoneale. The data show that the ELS2 tripeptide is capable of inducing the maturation of splenocytes both after oral and intraperitoneal administration.

II dosaggio ottimale è di 1055 ug/kg mentre con dosaggi più aiti si osserva un andamento a plateau della curva dose-risposta. The optimal dosage is 1055 ug / kg while with higher dosages a plateau trend of the dose-response curve is observed.

2. STIMOLAZIONE IN VITRO DELLA PRODUZIONE DI LINFOCHINE MATERIALI E METODI 2. IN VITRO STIMULATION OF THE PRODUCTION OF MATERIALS AND METHODS

PREPARAZIONE DELLE CELLULE MONONUCLEATE DI SANGUE UMANO PERIFERICO (PBMC). Il sangue venoso periferico viene ottenuto da volontari sani. PREPARATION OF MONONUCLEED HUMAN PERIPHERAL BLOOD CELLS (PBMC). Peripheral venous blood is obtained from healthy volunteers.

Gli eritrociti sono separati dalle cellule bianche mediante gradienti Ficoll-Hipaque. Il «buffy eoat» (PBMC) viene rimosso e lavato, e le cellule sono risospese ad una concentrazione di 1x106 celtule/ml in RPMI, addizionato con I'1% di penicillina/streptomicina, 1*1% di glutamina e l'1% di siero di feto di vitello inattivato riscaldato (FCS, 56 C, 30 min.). Erythrocytes are separated from white cells by Ficoll-Hipaque gradients. The buffy eoat (PBMC) is removed and washed, and the cells are resuspended at a concentration of 1x106 celtule / ml in RPMI, added with 1% penicillin / streptomycin, 1 * 1% glutamine and 1% Heated inactivated calf fetus serum% (FCS, 56 C, 30 min.).

PREPARAZIONE DEL FATTORE Di CRESCITA. PREPARATION OF THE GROWTH FACTOR.

Le PBMC, alla concentrazione di 1x106 cellule /mi in FCS 1% inattivato riscaldato, vengono incubate con o senza fitoemaggiutinina (PHA) alla concentrazione di 0.75% (v/v). PBMCs, at the concentration of 1x106 cells / ml in heated inactivated FCS 1%, are incubated with or without phytohemaggiutinin (PHA) at the concentration of 0.75% (v / v).

4 4

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CH676 467 A5 CH676 467 A5

II tripeptide viene aggiunto alla concentrazione di 1 ug/ml alle colture. Il periodo di incubazione è di 18— 24 ore a 37°C in atmosfera umidificata. Le colture vengono poi filtrate attraverso filtri con porosità 0.22 nM e i supernatanti vengono esaminati per la presenza dei fattori di crescita. Tripeptide is added to the concentration of 1 ug / ml to the cultures. The incubation period is 18-24 hours at 37 ° C in a humidified atmosphere. The cultures are then filtered through filters with 0.22 nM porosity and the supernatants are examined for the presence of growth factors.

MISURAZIONE DEI FATTORI DI CRESCITA NEI SUPERNATANTI. MEASUREMENT OF GROWTH FACTORS IN SUPERNATANTS.

A. Cellule usate nei test. A. Cells used in tests.

Le cellule B usate per esaminare la presenza del fattore di crescita delle cellule B (BCGF) appartengono a culture di linee cellulari a lungo termine, mantenute con BCGF e sono EBV-negatìve. Queste cellule sono cresciute in mezzo privo dì siero usando Nutridoma (Boehringer Mannheim Biochemicals), e non rispondono alla IL—2. The B cells used to test for the presence of B cell growth factor (BCGF) belong to long-term cell line cultures maintained with BCGF and are EBV-negative. These cells grew in serum-free medium using Nutridoma (Boehringer Mannheim Biochemicals), and do not respond to IL — 2.

Le cellule T usate per esaminare la presenza di IL—2 sono isolate di fresco. Esse vengono inizialmente stimolate con PHA (0.75%) e vengono mantenute in cultura almeno per 10 giorni prima dell'uso (per ridurre il «background» e stabilire la loro dipendenza alla IL—2). T cells used to test for IL — 2 are freshly isolated. They are initially stimulated with PHA (0.75%) and are kept in culture for at least 10 days before use (to reduce the "background" and establish their dependence on IL — 2).

B. Preparazione delle cellule per l'utilizzazione nel saggio. B. Preparation of cells for use in the assay.

1. Le cellule B sono di solito utilizzate 4 giorni dopo l'ultimo trattamento con BCGF. Vengono lavate 4 volte con RPM11640 per rimuovere ogni traccia di BCGF e sospese alla concentrazione di 15x104 cellule/m! in RPM11640 e Nutridoma (alla concentrazione finale dell'1%,) 1. B cells are usually used 4 days after the last BCGF treatment. They are washed 4 times with RPM11640 to remove all traces of BCGF and suspended at a concentration of 15x104 cells / m! in RPM11640 and Nutridoma (at the final concentration of 1%,)

2. Le cellule T vengono utilizzate 4 giorni dopo l'ultimo trattamento con IL—2. Vengono lavate 4 volte e sospese alla concentrazione di 50x104 cellule/ml in RPMI coi 5% di FCS. 2. T cells are used 4 days after the last IL-2 treatment. They are washed 4 times and suspended at the concentration of 50x104 cells / ml in RPMI with 5% FCS.

C. Procedura del saggio. C. Test procedure.

1. Le cellule B coltivate a lungo termine vengono incubate con varie concentrazioni di supernatante proveniente dalle colture di PBMC in piastre a 96 pozzetti a fondo piatto. 1. Long-term cultured B cells are incubated with various concentrations of supernatant from PBMC cultures in 96-well flat-bottom plates.

Ciascun pozzetto ha un volume totale di 200 ul, costituito da 100 ul di cellule B (15x103 cellule) e 100 ui di supernatante. Si esamina l'efficacia delle cellule B incubandole con varie concentrazioni di BCGF purificato (Cellular Products, Inc. Buffalo, N.Y.). Each well has a total volume of 200 ul, consisting of 100 ul of B cells (15x103 cells) and 100 ui of supernatant. The effectiveness of B cells is examined by incubating them with various concentrations of purified BCGF (Cellular Products, Inc. Buffalo, N.Y.).

Le colture vengono incubate per 24 ore, dopo di che 1 uCi di [3 H-Tdr] viene aggiunto e si incuba nuovamente per 12 ore. The cultures are incubated for 24 hours, after which 1 uCi of [3 H-Tdr] is added and incubated again for 12 hours.

Le colture sono poi raccolte e contate in uno scintilloscopio. The cultures are then collected and counted in a scintilloscope.

2. Le cellulte T vengono incubate in pozzetti a fondo piatto. Il volume totale in ciascun pozzetto è di 200 ul contenente 50x103 cellule, li periodo di incubazione è di 72 ore, comprese 12 ore di marcature con [3 H-Tdr]. 2. T cells are incubated in flat-bottomed wells. The total volume in each well is 200 ul containing 50x103 cells, the incubation period is 72 hours, including 12 hours of markings with [3 H-Tdr].

RISULTATI RESULTS

1) PRODUZIONE DEL FATTORE DI CRESCITA 1) PRODUCTION OF THE GROWTH FACTOR

Esperimento 1 Experiment 1

Attività del BCGF (C.P.M.) BCGF activities (C.P.M.)

Provenienza supernat. Supernat origin.

% Sup. % Sup.

3.05 3:05

6.25 6:25

12.5 12.5

25 25

50 50

PBL+PHA PBL + PHA

424 424

1026 1026

1674 1674

3172 3172

8392 8392

PBL+ PHA+ ELS2 PBL + PHA + ELS2

2772 2772

4616 4616

6336 6336

8186 8186

9818 9818

Attività del TCGF(aP.M.) TCGF activities (aP.M.)

Provenienza supernat. Supernat origin.

%Sup. % Sup.

3.05 3:05

6.25 6:25

12.5 12.5

25 25

50 50

PBL + PHA PBL + PHA

542 542

192 192

224 224

564 564

1144 1144

PBL+PHA + ELS2 PBL + PHA + ELS2

384 384

718 718

1832 1832

4028 4028

8338 8338

5 5

10 10

15 15

20 20

25 25

30 30

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

CH 676 467 A5 CH 676 467 A5

Esperimento 2 Experiment 2

Attività del BCGF (C.P.M.) BCGF activities (C.P.M.)

Provenìenzasupernat. Provenìenzasupernat.

% Sup. % Sup.

3.125 3,125

6.25 6:25

12.5 12.5

25 25

50 50

PBL+ PHA PBL + PHA

1369 1369

2187 2187

2894 2894

4876 4876

8104 8104

PBL+ PHA+ ELS2 PBL + PHA + ELS2

2690 2690

4214 4214

7442 7442

8730 8730

11 754 11 754

Attività del TCGF (C.P.M.) TCGF activities (C.P.M.)

Provenienza supernat. Supernat origin.

% Sup. % Sup.

3.125 3,125

6.25 6:25

12.5 12.5

25 25

50 50

PBL+PHA PBL + PHA

1482 1482

3146 3146

4322 4322

7184 7184

9012 9012

PBL+ PHA+ ELS2 PBL + PHA + ELS2

2968 2968

6220 6220

9354 9354

12014 12014

12984 12984

3. EFFETTO SULLA SINTESI DI RNA 3. EFFECT ON THE SYNTHESIS OF RNA

EFFETTO DI ELS2 SULLA SINTESI DI RNA IN CELLULE T UMANE, COME OSSERVATO DALLA INCORPORAZIONE DI 3H-URIDINA. NUMERO DI PARTICELLE EMESSE AL MINUTO (C.P.M.). EFFECT OF ELS2 ON THE SYNTHESIS OF RNA IN HUMAN CELLS, AS OBSERVED BY THE INCORPORATION OF 3H-URIDINE. NUMBER OF PARTICLES EMITTED PER MINUTE (C.P.M.).

Risultati ottenuti dopo 24 ore di incubazione. Results obtained after 24 hours of incubation.

T T

3732 3732

T+PHA T + PHA

20 752 20 752

Concentrazione ELS2 ug/ml ELS2 concentration ug / ml

0.1 1 10 0.1 1 10

20 20

T+ELS2 T + ELS2

4741 4834 5086 4741 4834 5086

5130 5130

T + ELS2 + PHA T + ELS2 + PHA

31 000 31413 32706 31 000 31413 32706

31 494 31 494

4. EFFETTO SULLA SINTESI DI DNA 4. EFFECT ON DNA SYNTHESIS

EFFETTO Dl ELS2 SULLA SINTESI DI DNA IN CELLULE T UMANE, COME OSSERVATO DALLA INCORPORAZIONE Dl 3H-TIMIDINA. NUMERO DI PARTICELLE EMESSE PER MINUTO (C.P.M.). EFFECT OF ELS2 ON THE SYNTHESIS OF DNA IN HUMAN CELLS, AS OBSERVED BY THE INCORPORATION OF 3H-THYDIDINE. NUMBER OF PARTICLES EMITTED PER MINUTE (C.P.M.).

Risultati ottenuti dopo 3 giorni di incubazione. Results obtained after 3 days of incubation.

T T

154 154

T+PHA T + PHA

6076 6076

Concentrazione ELS2 ug/ml ELS2 concentration ug / ml

0.01 0.1 1 0.01 0.1 1

10 10

T+ELS2 T + ELS2

152 166 190 152 166 190

234 234

T + ELS2 + PHA T + ELS2 + PHA

5758 6477 7548 5758 6477 7548

12317 12317

5. AUMENTO IN VITRO DEL NUMERO DI CELLULE 5. INCREASE IN VITRO OF THE NUMBER OF CELLS

Il tripeptide, aggiunto sia a culture di linfociti T che di miscele di linfociti B e T ogni quattro giorni alla concentrazione di 5 ug/ml per un periodo di 30 giorni, è in grado di aumentare il numero di cellule con un massimo di + 50% rispetto alle culture di controllo osservato tra il decimo e il quindicesimo giorno dell'esperimento. The tripeptide, added to both T lymphocyte cultures and mixtures of B and T lymphocytes every four days at a concentration of 5 ug / ml for a period of 30 days, is able to increase the number of cells with a maximum of + 50 % compared to control cultures observed between the tenth and fifteenth days of the experiment.

TOSSICOLOGIA TOXICOLOGY

TOSSICITÀ' ACUTA ACUTE TOXICITY

Gli studi di tossicità acuta condotti sul topo e sul ratto hanno mostrato che fino alla dose di 10Q0 mg/kg i.m. il tripeptide è totalmente privo di effetti collaterali. Acute toxicity studies conducted in the mouse and rat have shown that up to the dose of 10Q0 mg / kg i.m. the tripeptide is totally free of side effects.

6 6

5 5

10 10

15 15

20 20

25 25

30 30

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

CH 676 467 A5 CH 676 467 A5

TÖLLERABILITA' tolerability '

Studi su conigli e topi hanno mostrato che il prodotto, alla dose di 100 mg/kg rispettivamente i.v. e ì.p., non provoca alcuna modificazione emodinamica ne effetti comportamentali. Studies in rabbits and mice have shown that the product, at a dose of 100 mg / kg respectively i.v. and ì.p., does not cause any hemodynamic modification or behavioral effects.

In particolare, il tempo di sonno indotto da pentobarbital mostra solo un lieve aumento. In particular, pentobarbital-induced sleep time shows only a slight increase.

ATTIVITÀ' ALLERGIZZANTE ALLERGIZING ACTIVITY

Il prodotto, alla dose di 100 mg/kg i.m., non induce alcun fenomeno di sensibilizzazione nella cavia. The product, at a dose of 100 mg / kg i.m., does not induce any sensitization phenomenon in the guinea pig.

SALI DEL TRIPEPTIDE TRIPEPTID SALTS

Le ricerche sopra menzionate sono state condotte con l'acetato del tripeptide; comunque è ben noto allo stato dell'arte che risultati simili possono essere ottenuti usando altri sali per esempio il trìfluoroace-tato, il cloridrato, il solfato. The research mentioned above was conducted with tripeptide acetate; however, it is well known in the state of the art that similar results can be obtained by using other salts, for example the trifluoroacetate, hydrochloride, sulphate.

Claims

claims

1. A tripeptide consisting of L-Ala (alanine), and 2 L-Arg (arginine) and having the following structure: Arg-Ala-Arg

2. A tripeptide according to claim 1 as an immunistimulant.

3. Pharmaceutical composition for the therapeutic treatment of pathologies characterized by primary and secondary deficiencies of the immune system, containing the tripeptide according to claim 1.

Pharmaceutical composition with immunostimulating activity for parenteral and oral administration, containing the tripeptide according to claim 1.

Pharmaceutical composition according to claim 3, wherein the tripeptide is a salt thereof selected from the salts: acetate, trifluoroacetate, hydrochloride and sulphate.

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