Die vorliegende Erfindung betrifft Polyaminosäuren bzw. Polypeptide und biologisch aktive Fragmente davon. Die Verbindungen dienen der Modulierung des Zellwachstums, wie z.B. der Hemmung des Wachstums von Tumorzellen und der Stimulierung des Wachstums von normalen Fibroblasten und können Immunfunktionen modulieren. Die Aminosäure-Sequenzen der erfindungsgemässen Verbindungen sind ausgeprägt anders als Sequenzen anderer Verbindungen, welchen analoge Eigenschaften zugeschrieben wurden.
Leukocyten, sowohl Lymphocyten und Monocyten wurden in die Hemmung des Tumorwachstums von verschiedenen Tiertumor-Modellen einbezogen. Das zunehmende Vorkommen von bösartigen Tumoren bei immunschwachen Menschen, stützt das Argument, dass die weissen Blutkörperchen eine Rolle bei der Regulierung des neoplastischen Wachstums spielen. Protein-Faktoren, die durch diese weissen Zellen produziert werden, welche das Tumorwachstum hemmen oder Immunfunktionen modulieren und schon isoliert und charakterisiert worden sind, umfassen die alpha - und gamma -Interferone, den Tumor-Necrose-Faktor, das Lymphotoxin, das Interleukin-2 und andere Lymphokine.
Da jeder der isolierten Faktoren ein anderes Aktivitätsspektrum aufweist und verschieden in Wechselwirkung mit anderen Faktoren reagieren kann, besteht ein fortgesetztes und starkes Interesse an der Isolierung und Charakterisierung sämtlicher Faktoren, welche durch weisse Blutkörperchen zur Modulierung des Zellwachstums oder der Immunfunktionen produziert werden. Diese Verbindungen finden individuell oder zusammen Verwendung bei der Behandlung oder Diagnose von Krebs, als Promotoren der Wundheilung oder als Immuno-Modulator für die Behandlung von Patienten mit Immunschwäche, bei der Auto-Immunität, bei Organ-Transplantationen und dergleichen.
Es bestehen verschiedene Schwierigkeiten, welche bei der Entdeckung, der Isolierung, der Reinigung oder Charakterisierung von natürlich vorkommenden Faktoren in Betracht gezogen werden müssen. Die Methodik muss für die Trennung und Reinigung eines interessierenden Faktors von anderen Faktoren im rohen Ausgangsmaterial entwickelt werden, wobei die Aktivität des gewünschten Faktors nicht denaturiert werden darf; es müssen Bio-Assays entwickelt werden, welche die Identifizierung der Fraktionen während den Trennungsschritten, welche einen bestimmten Faktor konzentrieren, identifizieren; ein neuer Faktor muss von bekannten oder anderen, unbekannten Faktoren unterschieden werden können, welche vorhanden sein können und die Aktivität des gewünschten Faktors entweder negativ oder positiv beeinflussen können; der gereinigte Faktor muss charakterisiert werden;
und der gereinigte Faktor muss in genügender Weise konzentriert werden, um eine Identifikation und Charakterisierung des Faktors zu ermöglichen. Demzufolge wird mit der zunehmenden Zahl der isolierten Faktoren jeder neue Faktor schwieriger zu identifizieren, da seine Rolle und Funktion durch zahlreiche andere vorhandene Faktoren erschwert wird.
Beal et al., Cancer Biochem. Biophys. (1979) 3: 93-96 schildern, dass in humanem Urin Peptide vorhanden sind, welche das Wachstum und die DNA-Synthese in transformierten Zellen mehr als in normalen Zellen hemmen. Holley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1980) 77: 5989-5992 beschreiben die Reinigung von epithelialen Zellwachstums-Inhibitoren. Letansky, Biosci. Rep. (1982) 2: 39-45 schildern, dass Peptide, welche aus boviner Placenta isoliert wurden, das Tumorwachstums und den Thymidin-Einbau in DNA in einem grösseren Ausmass in Neoplasmen hemmen, als in normalen Zellen. Chen, Trends Biochem. Sci . ( 1982 ) 7: 364-365 schildert die Isolierung eines Peptides aus einer Ascites-Flüssigkeit mit einer krebshemmenden Eigenschaft. Redding und Schally, Proc. Natl. Acad.
Sci. ( 1982 ) 79: 7014-7018 schildern die Isolierung und Reinigung von Peptid aus Schweine-Hypothalmi, welches eine anti-mytogene Aktivität gegen verschiedene normale Zellinien und Tumorzellinien aufweist . Sone et al ., Gann ( 1984 ) 75 : 920-928 schildern die Herstellung eines Faktors, der durch humane Macrophagen produziert wird, welcher das Wachstum von verschiedenen Zellinien in vitro hemmt. Ransom et al., Cancer Res. (1985) 45: 851-862 schildern die Isolierung eines Faktors, welcher Leukoregulin genannt wird, der die Replikation von verschiedenen Tumorzellinien hemmt und unterscheidbar von Lymphotoxin, Interferon und Interleukin 1 und 2 auftritt. Die meisten dieser Faktoren sind weder vollständig charakterisiert, noch ist ihre Primär-Struktur bekannt.
Aggarwal et al ., J. Biol . Chem. ( 1984 ) 259 : 686-691 reinigten und charakterisierten humanes Lymphotoxin (LT), welches durch eine Lymphoblastoid-Zellinie produziert wurde und welches LT anschliessend sequeniert wurde (Aggarwal et al, J. Biol. Chem. (1985) 260: 2334). Gamma-Interferon ( gamma -IF), welches durch die Lymphoid-Zellen produziert wird und eine Immuno-Modulations- und Tumor-Inhibitor-Aktivität aufweist, wurde geklont und exprimiert (Gray et al., Nature (1982) 295: 503-508 ). Tumor-Necrose-Faktor ( TNF ), welcher das Wachstum von einigen Tumoren hemmt und durch Macrophagen und gewisse Leukämie-Zellinien produziert wird, ist charakterisiert worden und die TNF-cDNA wurde geklont und in E. coli exprimiert (Pennica et al., Nature (1984) 312: 724).
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, einen Faktor zur Verfügung zu stellen, welcher das Zellwachstum moduliert, insbesondere das Tumor-Zellwachstum hemmt und das Wachstum von normalen Fibroblasten stimuliert und die Immunfunktionen moduliert.
Die Aufgabe wurde durch die Gegenstände der vorliegenden Erfindung gelöst.
Die Gegenstände der vorliegenden Erfindung sind in den unabhängigen Patentansprüchen definiert.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen:
Figur 1 zeigt eine Serie von Mikrophotographien von Zellen, welche mit Oncostatin M behandelt wurden, wobei A bis C A375-Melanom-Zellen darstellen, die mit 0,5, bzw. 100 GIA-Einheiten behandelt wurden und D bis F WI38 Fibroblasten darstellen, die mit 0,5, bzw. 100 GIA-Einheiten behandelt wurden; und
Figur 2 eine Photographie einer SDS-PAGE-Analyse von Oncostatin M darstellt.
Es werden neue Polyaminosäuren, Polypeptide, Polypeptid-Zusammensetzungen und Fragmente davon sowie ihre Herstellung und Verwendung beschrieben. Die Zusammensetzungen zeigen eine Aktivität bei der Modulierung des Zellwachstums, insbesondere bei der Hemmung des Tumorzellwachstums und der Stimulierung des Wachstums von normalen Fibroblasten. Ein bevorzug tes Polypeptid wird als Oncostatin M bezeichnet und wird aus Leukocyten erhalten, z.B. aus konditionierten Medien von stimulierten U-937-Zellen oder konditionierten Medien von stimulierten, normalen, peripheralen Blut-Lymphocyten (PBL). Fragmente und Mutanten des Polypeptides, welche die biologische Aktivität des intakten Oncostatin M, wie die Zellwachstums-Modulations-Aktivität oder die immunologische Aktivität aufweisen, werden ebenfalls beschrieben.
Die neuen erfindungsgemässen Polypeptid-Fragmente weisen mindestens 8 Aminosäuren auf und besitzen mindestens eine solche biologische Aktivität, dass sie immunologisch kreuzreaktiv sind mit natürlich vorkommendem Oncostatin M. Unter immunologischer Kreuzreaktivität wird verstanden, dass ein Antikörper, welcher durch ein erfindungsgemässes Polypeptid induziert wird, mit intaktem Oncostatin M eine Kreuzreaktion eingeht, zumindest, wenn das Oncostatin M in einem denaturierten Zustand vorliegt. Die Polypeptide sind demzufolge zur Induktion von Antikörpern gegen Oncostatin M nützlich und können demzufolge zur Bestimmung der Konzentration von Oncostatin M in Körperflüssigkeiten, zur Bindung von Oncostatin M und demzufolge zur Modulation seiner Aktivität und zur Reinigung von Oncostatin M, beispielsweise in einer Affinitäts-Säule, verwendet werden.
Ein Teil dieser Polypeptide kann ebenfalls die Zellmodulations-Aktivität des intakten Oncostatins aufweisen, obschon die Aktivität moduliert sein kann, normalerweise im Vergleich zu intaktem Oncostatin M reduziert ist.
Nachstehend sind die Aminosäure-Sequenzen von Poylaminosäuren dargestellt, welche mit Oncostatin M kreuzreaktiv sind, wobei die erste Sequenz (I) den N-Terminus M darstellt.
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Die erfindungsgemässen Polyaminosäuren enthalten in der Regel eine Aminosäure-Sequenz, die mindestens 8 aufeinanderfolgende Aminosäuren einer der obigen Aminosäure-Sequenzen umfasst und sich von dieser Sequenz durch nicht mehr als drei normalerweise durch nicht mehr als eine Aminosäure unterscheidet. Der Unterschied kann entweder eine Insertion einer Aminosäure, einer Deletion einer Aminosäure oder einer Substitution einer Aminosäure durch eine andere, insbesondere eine konservative Substitution sein. Normalerweise enthält eine erfindungsgemässe Polyaminosäure mindestens 10, in der Regel mindestens 12 aufeinanderfolgende Aminosäuren, welche den oben dargestellten Sequenzen entsprechen und sich durch nicht mehr als eine Aminosäure unterscheiden.
Eine bevorzugte Gruppe von erfindungsgemässen Verbindungen besitzt folgende N-terminale Aminosäuresequenz:
X-X-I-G-S-X-S-K-E-Y-R-V-L-L-G-Q-L-X-K-X
worin X irgend eine Aminosäure darstellt.
Die Aminosäuren, welche die Bausteine der vorliegenden Polyaminosäuren bilden, können in eine Anzahl von Unterklassen aufgeteilt werden. Die folgende Tabelle stellt diese Unterklassen dar:
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Unter konservativer Substitution wird verstanden, dass die Aminosäuren der gleichen Unterklasse (d.h. entweder der neutralen, aliphatischen, der sauren, aliphatischen, der basischen aliphatischen oder der aromatischen) und insbesondere der gleichen Polarität subsituiert werden. Vorzugsweise bilden Aminosäuren von 2 bis 5 C-Atomen oder mit 5-6 C-Atomen Monomer-Gruppierungen in der aliphatischen Unterklasse.
Die Polyaminosäuren überschreiten in der Regel die Länge von 1000 Aminosäuren nicht. Normalerweise haben sie weniger als 100 Aminosäuren, insbesondere weniger als 50 Aminosäuren. Demzufolge können die Polyaminosäuren leicht synthetisch hergestellt werden. Wenn eine Polyaminosäure mehr als 100 Aminosäuren in der Länge aufweist, können diese Polyaminosäuren Polymere von Fragmenten von Oncostatin M sein, mit weniger als 100 Aminosäuren oder Fusionsproteine sein, wo das Fragment mit einem Antigen, einem Enzym, mit Enzym-Fragmenten usw. fusioniert ist. Insbesondere können die Polyaminosäuren von höherem Molekulargewicht mindestens ein Polypeptid-Fragment von weniger als etwa 100 Aminosäuren darstellen, das kovalent an einen grossen immunogenen Polypeptid-Träger gebunden ist, welcher die Immunität verleiht.
Exemplarisch für solche Proteinträger sind bovines Serumalbumin, Schlüssellochschnecken-He mocyanin (Keyhole limpet hemocyanine, KLH) und dergleichen. Diese konjugierten Polypeptide sind nützlich für die Induzierung von Antikörpern in einem zweckmässigen Wirtorganismus.
U937-Zellen sind eine Zellinie, die aus einer histiocytischen Lymphom-Zellinie abgeleitet ist (Sundstrom und Nilsson Int. J. Cancer (1976) 17: 565-577), die zur Differenzierung in Zellen induziert werden kann, die macrophage Charakteristiken aufweisen, nachdem sie mit einer Vielzahl von Mitteln behandelt wurde (Harris et al., Cancer Res. (1985) 45: 9-13). Für die Herstellung von Oncostatin M können die U937-Zellen in einer üblichen Nährlösung mit Serum gezüchtet werden und mit einem zweckmässigen Initiator behandelt werden. Der Bequemlichkeit halber können Phorbole oder Ingenole, insbesondere 12-O-Tetradecanoylphorbol-13-acetat (TPA) verwendet werden. Normalerweise wird etwa 5 bis 20 ng/ml Initiator verwendet. Die ursprüngliche Zellzahl liegt im Bereich von 10<5>-10<6> Zellen/ml.
Nachdem die Zellen genügend lange mit dem Initiator behandelt waren, im allgemeinen 3 bis 6 Tage, wird der Überstand entfernt, die Zellen mit serumfreiem Nährmedium gewaschen, die gebundenen Zellen wiederum mit serumfreiem Medium gewaschen und schliesslich werden die Zellen mindestens 12 Std. inkubiert, normalerweise nicht mehr als etwa 48 Std. in serumfreiem Nährmedium, z.B. RPMI-1640-Medium. Die Überstände werden dann gesammelt und die Zellen werden durch Zentrifugation entfernt. Die zellfreien Überstände werden auf zellwachstumshemmende Aktivität (GIA) geprüft, wie dies im experimentellen Teil beschrieben ist. Der Überstand enthält 50 bis 500 Einheiten GIA/ml (die GIA-Einheiten sind im experimentellen Teil definiert).
Oncostatin M kann ebenfalls aus stickstoff-stimulierten, normalen, humanen, peripheren Blutlymphocyten (PBL) erhalten werden. Die PBL können aus Leuko-Fraktionen isoliert werden, indem die Fraktionen verdünnt werden und über Ficoll-Gradienten zentrifugiert werden. Die Zellen, welche von der Gradientenoberfläche gewonnen wurden, werden gewaschen und schock-lysiert, um die roten Blutkörperchen zu entfernen. Die zurückbleibenden Zellen werden aus dieser Lösung durch Zentrifugation gewonnen, wiederum in Pufferlösung, die Serum und Thrombin enthält, aufgelöst, gerührt und das Blättchenaggregat wird während kurzer Zeit zur Absetzung stehengelassen. Die wiedersuspendierten Zellen werden transferiert, durch Zentrifugation wiedergewonnen, wiederum in Serum suspendiert und auf eine Säule gegeben, die Nylon-Wolle enthält.
Die Säule wird zur Bindung der Monocyten und B-Lymphocyten inkubiert und dann gewaschen. Die meisten peripheren Blut-T-Lymphocyten werden nicht gebunden und aus der Säule eluiert. Diese Zellen wurden bei 37 DEG C in Kulturmedium (d.h. RPMI-1640-Medium) kultiviert und mit einem zweckmässigen Initiator behandelt, z.B. Phytohemagglutinin (1 bis 5 mg/l) während etwa 100 Std. und dann wurden die Überstände gesammelt. Die Überstände wurden zur Entfernung der Zellen zentrifugiert und beispielsweise durch Ultra-Filtration oder Dialyse konzentriert.
Nach der Isolierung des zellfreien Überstandes von U937-Zellen oder normalen PBL wird das konditionierte Medium konzentriert, bequemlichkeitshalber unter Verwendung eines "Hollow-Fiber"-Systems oder einer Ultra-Filtrations-Membrane, anschliessend durch Verdünnung mit Essigsäure (auf eine Konzentration von 0,1N Essigsäure) gefolgt durch etwa 10-fache Konzentration und unter Wiederholung der Verdünnung und Konzentration. Das Konzentrat kann gefriergetrocknet werden und di rekt verwendet werden oder das gefriergetrocknete Produkt kann einem weiteren Reinigungsschritt unterworfen werden.
Das Oncostatin M kann durch Gel-Permeation-Chromatographie unter Verwendung von 40% Acetonitril/0,1% Trifluoressigsäure als isokratische, mobile Phase auf einer Bio-Sil TSK250-Säule gereinigt werden, wobei die Aktivität für jede Fraktion gemessen wird. Die Reinigung ergibt eine Zusammensetzung mit einer Aktivität von mindestens 0,5 bis 5 x 10<4> GIA-Einheiten/ml in den aktiven Fraktionen.
Das mittels Gel-Permeations-Chromatographie partiell gereinigte Produkt kann unter Verwendung einer Umkehrphasen-Hochdruck-Flüssig-Chromatographie weiter gereinigt werden, wobei ein linearer Gradient eingesetzt wird und das primäre Lösungsmittel 0,1% Trifluoressigsäure in Wasser und das sekundäre Acetonitril mit 0,1% Trifluoressigsäure ist. Das Verfahren kann variiert werden, im allgemeinen erfordert die Chromatographie etwa 3 bis 4 Std., wobei die Hauptzeitdauer grösser als etwa 50% und nicht mehr als etwa 80% der Zeit im Bereich von 30 bis 45% des sekundären Lösungsmittels beträgt. Unter diesen Bedingungen werden die aktiven Fraktionen bei etwa 41 bis 42% Acetonitrol eluiert.
Die gepoolten aktiven Fraktionen können weiter gereinigt werden, indem die Umkehrphasen-HPLC wiederholt wird, wobei ein schnellerer Wechsel der Gradientenbedingungen und eine langsamere Fliessgeschwindigkeit verwendet wird. Unter diesen Bedingungen tritt die Aktivität bei etwa 40,5 bis 41,5% Acetonitril auf.
Die Umkehrphasen-HPLC kann dann wiederholt werden, wobei das Lösungsmittelsystem geändert wird, indem als zweites Lösungsmittel n-Propanol/0,1% Trifluoressigsäure eingesetzt wird. Es wird ein linearer Gradient verwendet, wobei der Gradient langsam im Bereich von 23 bis 35% n-Propanol geändert wird. Die Hauptaktivität wird im Bereich von 25,5 bis 27,5% Propanol beobachtet, wobei ein im wesentlichen homogenes Produkt erhalten wird, mit einer spezifischen Aktivität, die höher als 10 GIA-Einheiten/ng Protein ist. Üblicherweise wird das Produkt solange gereinigt, bis eine spezifische Aktivität von 100 GIA-Einheiten/ng Protein und insbesondere 150 GIA-Einheiten/ng erhalten wird.
Die Hauptverbindungen sind durch ein Molekulargewicht von etwa 17 bis 19 ku (kD), insbesondere etwa 18 ku (kD) charakterisiert, bestimmt durch Grössen-Ausschluss-Chromatographie. Die Hauptverbindungen werden weiter charakterisiert, dass sie ein scheinbares Molekulargewicht von etwa 28 ku (kD) aufweisen, bestimmt durch Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese unter reduzierenden oder nicht reduzierenden Bedingungen.
Es wurde die Aminosäure-Sequenz von Fragmenten des gereinigten Oncostatin M analysiert. Oncostatin besitzt im wesentlichen die folgenden Aminosäure-Sequenzen:
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Die erste Sequenz (I) erläutert den N-Terminus von Oncostatin M, während die übrigen Sequenzen (II, III) interne Fragmente des Polypeptides darstellen.
Aktive Präparate von isoliertem Oncostatin M enthielten eine Mischung von hohen Mannose- und Komplex-N-Oligosaccharid. Die nicht-glykosilierten Präparate von Oncostatin M enthielten jedoch die zellwachstums-modulierende Aktivität.
Oncostatin M wird weiter durch seine Aktivität gegen gewisse Zellstämme charakterisiert. Dem Hauptpolypeptid fehlt die cytotoxische Aktivität gegen die humanen Fibroblasten WI26 und WI38 und gegen die Mäuse-Zellen L929, welche auf den Tumor-Necrose-Faktor empfindlich sind und gegen eine gamma -Interferon empfindliche humane Tumor-Zellinie. Es wurde ebenfalls gefunden, dass es die Proliferation von normalen, humanen T-Lymphocyten oder die granulocytische/myelocytische Kolonienbildung aus Knochenmarkzellen bei einer Konzentration bis zu 100 GIA-Einheiten/ml nicht hemmt. Weiter stimuliert Oncostatin M die Proliferation von normalen, humanen Fibroblasten wie dies durch WI38 und WI26-Zellen gezeigt wurde und hemmt die Proliferation von Tumor-Zellen, wie A375, HBT10, A549 und SKMEL28 und kann das Wachstum von kolonienbildenden Zellen aus normalem Knochenmark erhöhen.
Oncostatin M unterdrückt die humanen, proliferativen oder cytotoxischen T-Zell-Antworten nicht in gemischten Leukocyten-Kultur-Reaktionen (MLC) bei Konzentrationen von 500 GIA-Einheiten/ml.
Das Polypeptid ist gegen schwache Säuren und Basen sowie gegen Hitzebehandlung bei 56 DEG C stabil.
Die Aminosäure-Sequenz des Polypeptid kann unter Verwen dung von kommerziell erhältlichen Sequenatoren vollständig bestimmt werden. Das Polypeptid kann dann gemäss bekannten Techniken synthetisiert werden, unter Verwendung eines automatischen Synthesizers, welche ebenfalls kommerziell erhältlich sind.
Alternativ kann das Polypeptid ebenfalls durch rekombinante DNA-Techniken produziert werden. Von einer partiellen Aminosäure-Sequenz können Proben abgeleitet werden, welche dann für das Screening einer humanen Genbank verwendet werden können. Die Genbank kann eine cDNA-Genbank oder eine chromosomale Genbank sein. Wenn das KIon oder die Klone einmal identifiziert sind, wie durch Verschmelzen mit der Probe, können die Fragmente der interessierenden Gene auf zahlreiche Arten identifiziert und auf zahlreiche Arten manipuliert werden. Die Fragmente können in der Grösse durch Endonuklease-Restriktion reduziert werden, wobei die resultierten Fragmente geklont und auf die Gegenwart des gewünschten Gens getestet werden können. Zellen, welche das gewünschte Peptid produzieren oder erhöhte Anteile des gewünschten Peptides produzieren, können für die Produktion der mRNA verwendet werden.
Aus der mRNA kann eine einsträngige cDNA hergestellt werden. Die cDNA kann dann mit einer gesamten mRNA aus einer Zelle, welche wenig, wenn überhaupt, Polypeptid produziert, verschmolzen werden. Die nicht verschmolzene cDNA kann dann isoliert und zur Herstellung von ds cDNA verwendet werden, welche dann mit den Proben einem Screening unterworfen werden kann.
Alternativ können die DNA-Fragmente in lambda gtll insertiert werden, so dass die codierenden Fragmente stromabwärts und im Rahmen des beta -Galactosidase-Gen vorliegen. Es können dann Antikörper zum Oncostatin M Polypeptid hergestellt und für das Screening des resultierenden, verschmolzenen Proteins für die Kreuzreaktivität verwendet werden. Auf diese Weise können Fragmente, welche das Polypeptid oder Fragmente davon codieren, identifiziert und für die Identifikation des gewünschten Gens verwendet werden.
Wenn einmal ein vollständiges Gen identifiziert worden ist, entweder als cDNA oder als chromosomale DNA, kann es dann auf verschiedene Arten manipuliert werden, um eine Expression zu erhalten. Wenn das Gen in einem Wirt exprimiert wird, welcher die transkriptions- und translations-regulierenden Gebiete des Wild-Typs von Oncostatin M erkennt, kann das gesamte Gen, mit seinen 5 min -3 min -Regulierungsgebieten des Wild-Typs in einem zweckmässigen Expressions-Vektor eingeführt werden. Verschiedene existierende Expressions-Vektoren verwenden Replikationssysteme aus Säugetier-Viren, wie aus dem Simian-Virus 40, dem Adenovirus, dem bovinen Papilloma-Virus, dem Vaccinia-Virus, dem Insekten-Baculovirus usw.
Diese Replikationssysteme sind entwickelt worden, um Markierungsmittel zur Verfügung zu stellen, welche die Selektion von Transfektionsmittel erlauben, ebenso um zweckmässige Restriktionsstellen zur Verfügung zu stellen, in welche das Gen eingeführt werden kann.
Wenn das Gen in einem Wort exprimiert werden muss, welcher die natürlich vorkommenden Wild-Typ-transkriptions- und translations-regulierenden Gebiete nicht erkennt, sind weitere Manipulationen erforderlich. Es ist eine Anzahl von zweckmässigen 3 min -transkriptionalen Steuerregionen bekannt, die stromabwärts vom Stop-Codon eingesetzt werden können. Die nicht codierende 5 min -Region, die stromaufwärts vom Struk turgen liegt, kann durch Endonuklease-Restriktion, Bal31-Resektion oder dergleichen entfernt werden. Wenn alternativ eine zweckmässige Restriktionsstelle in der Nähe des 5 min -Terminus des Strukturgens vorhanden ist, kann das Strukturgen einer Restriktion unterworfen werden und ein Adaptor kann für die Verbindung des Strukturgens mit der Promotorregion verwendet werden, wobei der Adaptor als Ersatz für die verlorenen Nukleotide des Strukturgens dient.
Es können verschiedene Strategien eingeschlagen werden, um eine Expressions-Kassette zu erhalten, welche in 5 min -, 3 min -Richtung der Transkription eine Transkriptions- und Translations-Einleitungsregion, die ebenfalls Steuerungs-Sequenzen für die Einleitung der Steuerung aufweist, das Strukturgen mit der Transkriptions- und Translationssteuerung der Einleitungsregion und ein terminales Transkriptions- und Translationsgebiet aufweist.
Beispiele für Transkriptions-Einleitungsgebiete oder -Promotoren sind für Bakterien der beta -Gal-Promotor, der TAC-Promotor, der Lambda-links- und rechts-Promotor usw; für Hefe die glykolytischen Enzym-Promotoren, wie ADH-I und -II-Promotoren, der GPK-Promotor und der PGI-Promotor, der TRP-Promotor usw; für Säugetierzellen SV40-früh- und -spät-Promotoren, Adenovirus Major-spät-Promotoren usw. Wie bereits angegeben kann die Expressions-Kassette in ein Replikationssystem für die episomale Aufrechterhaltung in einem zweckmässigen, cellulären Wirt eingeschlossen werden oder kann ohne Replikationssystem zur Verfügung gestellt werden, wo es in das Genom des Wirts integriert werden kann.
Die DNA kann in bekannter Weise in den Wirt eingeführt werden, wie durch Transformation, unter Verwendung von Kalziumphosphat gefällter DNA, Transfektion durch In-Kontakt-Bringen der Zellen mit dem Virus oder durch Mikro-Injektion der DNA in die Zellen.
Ist einmal das Strukturgen in einen zweckmässigen Wirt eingeführt worden, kann der Wirt gezüchtet werden und dieser wird das Strukturgen exprimieren. In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, eine Signal-Sequenz (secretory leader) stromaufwärts von und im Leseraster des Strukturgens vorzusehen, was die Sekretion des Strukturgens und die Spaltung des secretory leaders bewirkt, was zur Reifung des reifen Polypeptids im Überstand führt. Wenn keine Sekretion stattfindet, dann können die Wirtszellen geändert werden, gemäss den üblichen Bedingungen lysiert werden und das gewünschte Produkt isoliert und gemäss den bekannten Techniken gereinigt werden, beispielsweise durch Chromatographie, Elektrophorese, Lösungsmittelextraktion oder dergleichen.
Die erfindungsgemässen Polyaminosäuren oder Polypeptide können für viele Zwecke sowohl in vivo wie auch in vitro verwendet werden. Diese erfindungsgemässen Verbindungen können für die Herstellung von Antikörpern gegen die erfindungsgemässen Verbindungen verwendet werden, welche in vivo oder in vitro Anwendung finden können. Die Antikörper können in üblicher Weise hergestellt werden, beispielsweise durch Verwendung eines erfindungsgemässen Polypeptids als Immunogen und Injektion des Polypeptides in einen Säugetierwirt, z.B. in eine Maus, eine Kuh, eine Geiss, ein Schaf, ein Kaninchen usw., insbesondere mit einem Adjuvant, z.B. dem vollständigen Freund-Adjuvant oder Aluminiumhydroxidgel.
Dem Wirt kann das Blut entnommen werden und das Blut kann für die Isolierung von polyclonalen Antikörpern verwendet werden oder bei der Maus können die peripheren Blut-Lymphocyten oder die Milz-Lymphocyten (B-Zellen) für die Fusion mit einer zweckmässigen Myelom-Zelle verwendet werden, um die Chromosome für die monoclonale Expression von Antikörpern, die spezifisch gegen die erfindungsgemässen Verbindungen sind, zu immortalisieren.
Es können sowohl polyclonale als auch monoclonale Antikörper hergestellt werden, welche dann für die Diagnose oder den Nachweis der Gegenwart eines erfindungsgemässen Polypeptides in einer Probe, wie in Form Zellen oder einer physiologischen Flüssigkeit, wie Blut, eingesetzt werden können. Die Antikörper können ebenfalls bei der Affinitäts-Chromatographie für die Reinigung der erfindungsgemässen Polypeptide und ihre Isolierung aus natürlichen und synthetischen Quellen verwendet werden. Die Antikörper können ebenfalls bei der Kontrolle des Gehaltes an erfindungsgemässen Polypeptiden in Zellkulturen oder in vivo Verwendung finden, wobei das Wachstum der Zellen verändert werden kann. Die erfindungsgemässen Verbindungen können dann als Liganden für den Nachweis der Gegenwart von Rezeptoren für die erfindungsgemässen Verbindungen verwendet werden.
Auf diese Weise können Zellen im Zusammenhang mit der Gegenwart und der Dichte von Rezeptoren für die erfindungsgemässen Verbindungen unterschieden werden, wobei die Wirkung von verschiedenen Verbindungen auf die Gegenwart von solchen Rezeptoren nachgewiesen wird.
Die erfindungsgemässen Polyaminosäuren oder Polypeptide können in vitro-Kulturen verwendet werden, um das Wachstum von Zellen oder Zellinien zu hemmen, welche empfindlich auf die erfindungsgemässen Polypeptide sind und demzufolge von Zellen, welche nicht empfindlich sind, unterschieden werden können. Demzufolge können heterogene Zellmischungen oder Zellinien von unerwünschten Zellen befreit werden, wenn die unerwünschten Zellen auf die erfindungsgemässen Polypeptide empfindlich sind. Die erfin dungsgemässen Polypeptide können in vivo bei neoplastischen Bedingungen verabreicht werden, beispielsweise durch Injektion, intralesional, peritoneal, subcutan.
Die erfindungsgemässen Verbindungen können in vitro verwendet werden, um bösartige Zellen vom Knochenmark für autologe Marktransplantationen zu entfernen oder die Proliferation zu hemmen oder bösartige Zellen in anderen Geweben, beispielsweise im Blut, vor der Reinfusion zu entfernen.
Die erfindungsgemässen Polypeptide können ebenfalls in einem Wundbehandlungs-Verfahren verwendet werden, beispielsweise bei Schnittwunden, Hornhautwunden und zahlreichen anderen Störungen des Epithels und des Stromas, wie bei chronischen Ulcern, Verbrennungen, chirurgischen Eingriffen, traumatischen Wunden und Verletzungen in den hohlen, durch epithel begrenzten Organen, wie in der Speiseröhre, im Magen, im Dick- und Dünndarm, im Mund und im Uro-Genitalen-Trakt. Das Verfahren beruht auf der topischen Anwendung mit einer Behandlungszusammensetzung, die Oncostatin M in einem physiologisch annehmbaren Träger enthält.
Die erfindungsgemässe Zusammensetzung kann für die Behandlung einer grossen Anzahl von Wunden, einschliesslich im wesentlichen aller cutaner Wunden, Hornhautwunden und Verletzungen bei den durch epithel begrenzten, hohlen Organen des Körpers verwendet werden. Wunden, welche zweckmässig mit der genannten Zusammensetzung behandelt werden, umfassen denjenigen, welcher von einem Trauma herrühren, wie Verbrennungen, Schürfungen, Schnitte und dergleichen, ebenso wie solche von chirurgischen Verfahren, wie chirurgischen Schnitten und Hauttransplantationen. Andere Bedingungen, welche zweckmässig sind für die Behandlung mit den erfindungsgemässen Zusammensetzun gen umfassen chronische Bedingungen, wie chronischer Ulcer, diabetischer Ulcer und andere nicht heilende (trophische) Bedingungen.
Oncostatin M kann in physiologisch annehmbaren Trägern für die Anwendung in angegriffenen Gebieten formuliert werden. Die Natur der Träger kann in einem weiten Bereich variiert werden und hängt von der Lage der beabsichtigten Anwendung ab. Für die Anwendung auf der Haut wird normalerweise eine Creme oder eine Salbenbasis bevorzugt, zweckmässige Basen umfassen Lanolin, Silvaden (Marion) (insbesondere für die Behandlung von Verbrennungen), Aquaphor (Duke Laboratories, South Norwalk, Connecticut) und dergleichen. Gewünschtenfalls ist es möglich, Oncostatin M enthaltende Zusammensetzungen in Verbände und andere Wundbedeckungen einzufügen, damit die Wunde kontinuierlich dem Peptid ausgesetzt ist. Aerosol-Anwendungen können ebenfalls eingesetzt werden.
Die Konzentration des Polypeptids in der Behandlungszusammensetzung ist nicht kritisch. Das Polypeptid muss in einem Anteil vorhanden sein, welcher die Epithel-Zell-Proliferation induziert. Die Zusammensetzungen werden topisch beim affektierten Bereich angewendet, typischerweise als Augentropfen für die Augen oder als Cremen, Salben oder Lotionen für die Haut. Im Falle der Augen ist eine häufige Behandlung wünschenswert, normalerweise in Intervallen von 4 Std. oder weniger. Auf der Haut ist eine kontinuierliche Aufrechterhaltung der Behandlungslösung an der angegriffenen Stelle während des Heilungsprozesses wünschenswert, wobei die Anwendung der Behandlungszusammensetzung 2 bis 4 mal täglich oder häufiger erfolgen kann.
Die eingesetzte Menge des erfindungsgemässen Polypeptides variiert, je nach Art der Verabreichung, der Verwendung von anderen aktiven Verbindungen und dergleichen, und liegt im allgemeinen im Bereich von 1 mu g bis 100 mu g. Die erfindungsgemässen Polypeptide können mit physiologisch annehmbaren Trägern, wie Kochsalzlösung oder phosphat-gepufferter Kochsalzlösung verwendet werden. Der Anteil der verwendeten Verbindungen wird empirisch festgelegt, wobei die Antwort der Zellen in vitro und die Antwort bei Versuchstieren auf die erfindungsgemässen Polypeptide oder Formulierungen, die sie enthalten, Bezug genommen wird. Die erfindungsgemässen Verbindungen finden als solche oder in Kombination mit anderen Wachstums-Faktoren oder -Inhibitoren oder Immuno-Modulatoren, wie TNF, IL-2, gamma -Interferin oder monoclonale Antikörper Verwendung.
Die Menge dieser Verbindung beträgt im allgemeinen 1 mu g bis 100 mu g. Die Konjugate der erfindungsgemässen Verbindungen durch zentrums-gerichtete Reste, beispielsweise Antikörper, können hergestellt werden, wenn die Antikörper spezifisch für besondere bösartige Zellen oder Organe sind.
Die nachstehenden Beispiele dienen der Erläuterung der vorliegenden Erfindung.
EXPERIMENTELLES
Material und Methoden
Oncostatin M isoliert aus U937-Zellen Herstellung eines Inhibitors für das Tumorzellwachstum aus einer hystiocytischen Lymphom-Zellinie
U937-Zellen, eine hystiocytische Lymphom-Zellinie (Sundstrom und Nilsson, Int. J. Cancer (1976) 17: 565-577) wurden in 850 cm<2>-Rollflaschen (Corning C2540) mit einer Konzentration von 4 x 10<5> Zellen/ml in einem Gesamtvolumen von 300 ml RPMI 1640 Medium, das mit 10% fötalem Kälberserum (FCS), Penicillin/Streptomycin (PS), L-Glutamin und 10 ng/ml 12-O-Tetradecanoylphorbol 13-acetat (TPA) ergänzt wurde, kultiviert. 4 Tage später wurden die Überstände, die FCS und TPA enthielten, entfernt, die Rollflaschen wurden fünfmal mit serumfreiem RPMI-1640 gewaschen und die Zellen, welche gelöst wurden (1 x 10<5> Zellen/ml) wurden dreimal mit serumfreiem Medium gewaschen und in die Flaschen zurückgegeben, wobei ein Endvolumen von 125 ml serumfreies RPMI-1640-Medium pro Rollflasche resultierte.
1 Tag später wurden die Überstände gesammelt, zur Entfernung der Zellen zentrifugiert und durch ein 0,45 mu m Nalgen-Filter filtriert und unter Verwendung eines Hollow-Fiber-Systems (Amicon-Patrone HIP10-20) auf ein Volumen von 150 ml konzentriert (ursprüngliches Volumen 1500 ml). Das Oncostatin M wurde ebenfalls aus den Überständen von mit serumfreiem TPA behandelten U937-Zellen in 150 cm<2> Kulturflaschen erhalten. Der Überstand wurde mit einer Amicon Diaflo-Membrane PM-10, mit einem Ausschluss 10 kD konzentriert und dialysiert. Nach der Dialyse wurde das Konzentrat mit Essigsäure verdünnt, wobei eine Endkonzentration von 0,1 N Essigsäure in 500 ml erhalten wurde und auf 50 ml konzentriert wurde, wobei ein Amicon PM-10-Filter verwendet wurde. Die 50 ml Konzentrat wurden auf 400 ml mit 0,1 N Essigsäure verdünnt und auf 40 ml mit dem selben Filter konzentriert.
Das Konzentrat wurde mit 1 N Essigsäure verdünnt und das resultierende Präcipitat wurde durch Zentrifugation entfernt. Das resultierende Konzentrat wurde gefroren und gefriergetrocknet. Das lyophilisierte Material wurde für den Reinigungsschritt verwendet.
Gel-Permeations-Chromatographie
Eine Bio-Sil TSK-250-Säule (600 x 21,5 mm) (Bio-Rad) wurde an ein Hochdruck-Flüssig-Chromatographiesystem angeschlossen. Die rohe Fraktion (10 mg/ml) wurde in 40% Acetonitril in 0,1% wässriger Trifluoressigsäure (0,1% TFA) aufgelöst. Eine 2 ml Aliquot der Mischung wurde injiziert und die Elution wurde isokratisch mit einer mobilen Phase von 40% Acetonitril in 0,1% TFA durchgeführt. Die Fliessgeschwindigkeit betrug 2,5 ml/Min. und die Papiergeschwindigkeit wurde auf 0,25 cm/Min. festgesetzt. Es wurden 5 ml-Fraktionen gesammelt. Die Chromatographie wurde bei Zimmertemperatur durchgeführt. Ein Aliquot von jeder Fraktion wurde abgedampft und dreifach auf wachstumshemmende Aktivität (GIA) von A375-Zellen getestet.
Die aktiven Fraktionen (Fraktionen 21 und 22) wurden 6 Läufen gepoolt. Das gepoolte Material hatte ein Total von ungefähr 4,8 x 10<5> GIA-Einheiten. Es wurde gefunden, dass der Faktor ein scheinbares Molekulargewicht von 18 kD aufwies, durch Bestimmung durch Grössen-Ausschluss-Chromatographie (Bio-Sil TSK-250-Säule).
Umkehrphasen-Hochdruck-Flüssig-Chromatographie (HPLC) von TSK-250-Fraktionen
Gepoolte TSK-250-Fraktionen 21 und 22, wie oben beschrieben, wurden zweimal mit 0,1% TFA verdünnt. Diese Mischung wurde isokratisch auf eine mu -Bondapak-C18-Säule (7,8 x 300 mm) (bezogen auf C18<1> ) bei Zimmertemperatur eingespritzt. Die Fliessgeschwindigkeit wurde auf 2,0 ml/Min. festgesetzt und die Papiergeschwindigkeit betrug 0,25 cm/Min. Der lineare Gradient wurde zwischen dem primären Lösungsmittel 0,1% TFA und dem sekundären Lösungsmittel Acetonltril/TFA 0,1% gewählt. Die Gradientenbedingungen waren 0,30% in 20 Min., dann 30-45% in 150 Min., 45-55% in 20 Min. und 55-100% in 10 Min. Sämtliche Lösungsmittel waren in der HPLC-Reinheit. Es wurden 4 ml-Fraktionen gesammelt und Aliquote von jeder Fraktion wurden auf wachstumshemmende Aktivität getestet. Es wurde gefunden, dass die Fraktionen 72-75 die Mehrheit an Aktivität aufwiesen.
Die aktiven Fraktionen wurden zwischen 41 und 42% Acetonitril eluiert.
Die Fraktionen 72-75 wurden gepoolt. 16 ml 0,1% TFA wurde zu den gepoolten Fraktionen gegeben. Die Mischung wurde in eine mu -Bondapak-C18-Säule (3,9 x 300 mm) (als C18<2> bezeichnet) bei Zimmertemperatur eingespritzt. Die Fliessgeschwindigkeit wurde auf 1 ml/Min. festgesetzt und die Papiergeschwincigkeit betrug 0,25 cm/Min. Die Gradientenbedingungen waren 0,35% in 10 Min., 35-45% in 100 Min. und 45-100% in 10 Min. Die Fraktionen wurden gesammelt und aliquote Anteile wurden genommen und auf GIA getestet. Der grösste Teil der Aktivität trat aus der Kolonne zwischen 40,7 bis 41,3% Acetonitril-Konzentration auf (Retentionszeit 83-86 Min.).
Die aktiven Fraktionen wurden gepoolt und zweimal mit 0,1% TFA verdünnt und isokratisch auf eine mu -Bondapack-C18-Säule (3,9 x 300 mm) (bezeichnet als C18<3>) bei Zimmertemperatur eingespritzt. Die Fliessgeschwindigkeit betrug 1 ml/Min. und die Papiergeschwindigkeit war 0,25 cm/Min. Es wurde ein linearer Gradient verwendet, zwischen dem primären Lösungsmittel 0,1% TFA und dem sekundären Lösungsmittel n-Propanol-TFA (0,1%).
Die Gradientenbedingungen waren 0-23% in 20 Min. und 23-35% in 120 Min. Die Fraktionen wurden gesammelt und alitquote Anteile jeder Fraktion wurden auf GIA getestet. Der grösste Teil der Aktivität erschien zwischen 25-26,5% Propanolkonzentration (Retentionszeit 59 Min.). Diese scheinbar homogene Fraktion enthielt 300 ng Protein und etwa 40 000 GIA-Einheiten.
Zellwachstumsmodulations-Versuch unter Verwendung einer <3>H-Thymidin-Einverleibung in die DNA (GIA)
Die Tests wurden in Platten 96 flachen Vertiefungen (Costar 3596) durchgeführt. Humane Melanom-Zellen (A375) wurden als empfindliche Indikator-Zellinie verwendet. Die Zellen (3 x 10<3>) in 0,1 ml Eagles-Medium, modifiziert nach Dulbecco (DMEM) wurden mit 10% FCS ergänzt und PS wurden in jede Vertiefung gegeben. 3 Std. später wurden 0,1 ml Testproben in jedes Loch gegeben. Die Platten wurden bei 37 DEG C während 3 Tagen inkubiert. Dann wurde 0,025 ml (0,5 mu Ci) einer Lösung <3>H-Thymidin (spezifische Aktivität 27 mu Ci/ mu g) für die letzten 6 Std. der Inkubation in jedes Loch gegeben. Die Zellen wurden dann auf Glasfilter-Streifen übergeführt, indem ein Multiwell-Harvester verwendet wurde (PHD-Zell-Harvester, Cambridge Technology, Inc.).
Die Filter wurden in Scintillations-Ampullen übergeführt, zu welchen 2 ml Scintillations-Flüssigkeit (Scienti Verse II, Fisher Scientific Co.) gegeben wurde, bevor auf einem Scintillations-Zähler die <3>H-Thymidin-Einverleibung bestimmt wurde.
Softagar-Kolonie-Inhibitions-Test (TGI)
Eine 0,5 ml Basisschicht von 0,5% Agar (Agar Noble; Difco Laboratories, Detroit, Michigan) in DMEM enthaltenden 10%igen fötalem Kälberserum (FCS) wurde auf 24-Loch-Costar-Gewebekultur-Platten gegeben. 0,5 ml 0,3% Agar, welche die gleiche Medium/FCS-Mischung enthielt, 1-2,5 x 10<3> A375-Zellen und der zu testende Faktor in verschiedenen Konzentrationen wurden auf die Basisschicht von Agar unter Überschichten gegeben. Die Platten wurden bei 37 DEG C in feuchter Atmosphäre mit 5% CO2 in Luft inkubiert und nach 7 Tagen durch Zugabe von 0,5 ml 0,3% Agar, welches das gleiche Medium und die gleichen Faktorkonzentrationen enthielt, genährt. Die Kolonien wurden numeriert, abgelöst und entfernt und Kolonien mit mehr als 6 Zellen wurden zwischen 7-14 Tagen ausgewertet.
Resultate
Sequenzen von Oncostatin M, welches aus U937-Zellen gewonnen wurde
Die N-terminale Sequenz und die internen Fragmente von Oncostatin M wurden durch Mikrosequenz-Analyse bestimmt unter Verwendung des reduzierten und S-pyridinethylierten Polypeptides und von Peptiden, die aus enzymatischer Verdauung des reduzierten und S-pyridinethylierten Oncostatin M mit Endoproteinase Lys-C und Staphylococcus aureus V8-Protease erhalten wurden. Die Peptid-Fragmente wurden durch Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung von flüchtigen Lösungsmitteln gereinigt. Die Peptide wurden einem automatisierten, wiederholten Edman-Abbau in einem Sequenator Modell 470 A (Applied Biosystem, Inc. unterworfen. Die Phenylthiohydantoin-Aminosäuren wurden durch Umkehrphasen-HPLC (Applies Biosystems, Inc.) analysiert, wobei eine PTH-C18-Säule (2,1 x 220 mm, ABI) verwendet wurde und zur Elution ein Natriumacetat-Puffer/Tetrahydrofuran/Acetonitril-Gradient eingesetzt wurde.
Die resultierenden Aminosäure-Sequenzen entsprechen im wesentlichen den nachstehenden Sequenzen:
EMI26.1
Ein Vergleich dieser Sequenzen mit denjenigen, welche in der geläufigen Protein-Datenbank gespeichert sind (PIR Release 9,0, Mai 1986) zeigte keine signifikante Sequenz-Homologien mit irgend einer anderen bekannten Sequenz. Zusätzlich besteht keine Homologie zwischen dem Tumor-Necrose-Faktor, dem Lymphotoxin, dem kolonien-stimulierenden Faktor, Interleukin 1 oder 2 oder dem beta -transformierenden Wachstumsfaktor.
Hemmung der Proliferation von Tumorzellen und Verbesserung der Proliferation von normalen humanen Fibroblasten
Unter Verwendung des Softagar-Kolonien-Hemm-Tests, wie er oben beschrieben ist, wurden folgende Resultate erhalten:
<tb><TABLE> Columns=3
<tb>Title: Tabelle 1
Hemmung der Melanom-A375-Zellkolonie-Bildung in Softagar durch gereinigtes Oncostatin M, das aus U937-Zellen* isoliert wurde
<tb>Head Col 01 AL=L: GIA-Einheiten/Loch
<tb>Head Col 02 AL=L: % Hemmung der Kolonien
<tb>Head Col 03 AL=L: Kolonienbildung
<tb> <SEP>250 <SEP>4 <SEP>96
<tb> <SEP>83 <SEP>6 <SEP>94
<tb> <SEP>27 <SEP>11 <SEP>89
<tb> <SEP>45 <SEP>32 <SEP>69
<tb> <SEP>0 <SEP>106 <SEP>-
* Die A375-Zellen wurden in Softagar aufgetragen, mit oder ohne Faktor in einem Endvolumen von 2 ml, wie oben beschrieben. Der verwendete Faktor wurde durch eine C18-Propanol-Säulen-Fraktion mit der Spitzenaktivität für die Hemmung des Tumorwachstums erhalten (GIA). 11 Tage später wurde die Anzahl der Kolonien gezählt.
Eine Kolonie wurde als Anhäufung von mindestens 6 Zellen definiert. Eine GIA-Einheit wurde als derjenige Betrag definiert, welcher 50% Hemmung der <3>H-Thymidin-Einverleibung in A375-Zellen in Mikro-Löchern bewirkte, wie oben im einzelnen angegeben.
<tb></TABLE>
In der nächsten Studie wurden verschiedene Behandlungen verwendet, um die Wirkung der chemischen oder physikalischen Behandlung auf die Aktivität des erfindungsgemässen Polypeptides zu bestimmen. Die nachstehende Tabelle zeigt die Resultate:
<tb><TABLE> Columns=6
<tb>Title: Tabelle 2
Wirkung von verschiedenen Behandlungen der Überstände von TPA-induzierten U937-Zellen auf die Tumorwachstums-Hemmungs-Aktivität*
<tb>Head Col 02 to 04 AL=L:
Endverdünnung des Überstandes
<tb>SubHead Col 02 AL=L>1:4:
<tb>SubHead Col 03 AL=L>1:8:
<tb>SubHead Col 04 AL=L>1:16:
<tb> <SEP>Mediumkontrolle <SEP>- <SEP>- <SEP>- <SEP>39 780
<tb> <SEP>Unbehandelter Überstand <SEP>7206** <SEP>13 896 <SEP>16 000
<tb> <SEP>1N essigsäure <SEP>6670 <SEP>17 073 <SEP>18 783
<tb> <SEP>1N NH4OH <SEP>6956 <SEP>15 016 <SEP>13 923
* Die U937-Zellen wurden während 3 Tagen mit TPA (10 ng/ml) behandelt, und dann wurden die Zellen mit Medium gewaschen und während 24 Std. in serumfreiem Medium inkubiert, bevor die Überstände gesammelt wurden. Die Überstände wurden mit 1N Essigsäure oder 1N Ammoniumhydroxid (NH4OH) behandelt. Sie wurden dann gegen das Medium dialysiert und auf ihre Fähigkeit, die <3>H-Thymidin-
Einverleibung in A375-Zellen zu hemmen, getestet.
Die A375-Zellen wurden mit <3>H-Thymidin (<3>H-TdR) für die letzten 6 Std. der dreitägigen Inkubation markiert.
** Die angegebenen Daten betreffen die <3>H-TdR-Einverleibungs-Zählrate pro Minute.
<tb></TABLE>
Die obigen Resultate zeigen, dass Oncostatin im dialysierten Überstand im wesentlichen gegen lnaktivierung durch 1N Essigsäure und 1N Ammoniumhydroxid resistent ist. Demzufolge sind die erfindungsgemässen Verbindungen im wesentlichen unempfindlich sowohl gegen mittelstarke Säuren wie auch mittelstarke Basen. Die erfindungsgemässen Verbindungen sind gegen Hitzebehandlung bei 26 Std. während 1 Std. stabil, jedoch nicht gegen eine Behandlung bei 90 DEG C während 30 Min.
Die erfindungsgemässen Verbindungen wurden ebenfalls auf Hitzestabilität geprüft und es wurde gefunden, dass ihre Aktivität nach der Aussetzung einer Temperatur von 56 DEG C während 1 Std. erhalten bleibt, während sie im wesentlichen die gesamte Aktivität verlieren, wenn sie einer Temperatur von 95 DEG C während 30 Min. ausgesetzt sind.
In einer weiteren Studie wurde die Fähigkeit der erfindungsgemässen Polypeptide ermittelt, die Tumorzell-Replikation einer Anzahl von neoplastischen Zellen zu hemmen. Die nachstehende Tabelle zeigt die Resultate:
<tb><TABLE> Columns=2
<tb>Title: Tabelle 3
Hemmung der Replikation von Tumorzellen durch gereinigtes Oncostatin M aus U937-Zellen
<tb>Head Col 01 to 02 AL=L: Einheiten GIA zur Verursachung von 30% Hemmung
<tb>SubHead Col 01 AL=L>Tumorzellen:
<tb>SubHead Col 02 AL=L><3>H-TdR-Einverleibung:
<tb> <SEP>A549 (Lungenkrebs) <SEP>21
<tb> <SEP>HTB10 (Neuroblastom) <SEP>81
<tb> <SEP>A375 (Melanom) <SEP>0,3
<tb></TABLE>
Die Tumorzellen wurden 3 Std. vor der Zugabe von verschiedenen Verdünnungen von Oncostatin M, welches durch Umkehrphasen-HPLC wie oben aufgeführt gereinigt wurde, in Mikro-Löcher gegeben. Während den letzten 6 Std. einer dreitätigen Inkubation, wurden die Zellen in 0,2 ml Medium mit <3>H-Thymidin (<3>H-TdR) (0,5 Ci/Loch) markiert. Eine Einheit Tumorwachstums-Inhibitor-Aktivität (GIA) ist in der Fussnote zu Tabelle 1 als diejenige Menge definiert, welche 50% Hemmung der <3>H-TdR-Einverleibung in A375-Melanomzellen bewirkt. Die Einheit wurde aus etwa 10 pg gereinigtem Protein definiert und demzufolge betrug die Konzentrag (ng/ml), welche eine 30% Hemmung <3>H-TdR-Einverleibung in A549, HTB10 und A375-Zellen ungefähr 1,4, 4,0 bzw. 0,15 ng/ml. Die <3>H-TdR-Einverleibung in normale, humane WI26-Fibroblasten wurde in jedem Experiment durch den Faktor U937 nicht unterdrückt.
Die obigen Resultate zeigen, dass Oncostatin M in seiner Fähigkeit, die Replikation zu hemmen, selektiv ist und stark variierende Wirkungen, je nach der Natur der Zelle, aufweist. Die erfindungsgemässen Verbindungen sind gegen Melanom-Zellen wie die A375-Melanomzellen, die schuppenartigen Lungenkrebszellen, wie A549 und die Neuroblastomzellen, wie HTB10, wirksam.
Die Tumorzellen wurden mit einer Dichte von 3 x 10<3> Zellen/Loch und die normalen Fibroblasten mit einer Dichte von 1, 5 x 10<3> Zellen/Loch in 96-Loch-Platten während 3 Std. angesetzt. Verschiedene Konzentrationen von gereinigtem Oncostatin M, welches aus den Fraktionen mit der höchsten antiproliferativen Aktivität gegen A375-Zellen aus der C18<3>-Säule erhalten wurde, wurden zugegeben und 3 Tage später wurde die <3>H-Thymidin-Einverleibung in die Zellen in 3 Löchern für jede Konzentration gemessen.
Die Resultate sind in Tabelle 4 dargestellt:
<tb><TABLE> Columns=5
<tb>Title: Tabelle 4
Hemmung der Proliferation von Tumorzellen und Verbesserung der Proliferation von normalen Fibroblasten durch Oncostatin M
<tb>Head Col 02 AL=L: GIA
Einheiten/Loch
<tb>Head Col 03 AL=L: % Hemmung
<tb>Head Col 05 AL=L: % Stimulation
<tb> <SEP>A375 <SEP>WI38
<tb> <SEP>Exp. 1 <SEP>16 <SEP>83 <SEP>25
<tb> <SEP>4 <SEP>62 <SEP>30
<tb> <SEP>1 <SEP>46 <SEP>46
<tb>Head Col 03 AL=L: A375
<tb>Head Col 04 AL=L: HTB10
<tb>Head Col 05 AL=L: WI26
<tb> <SEP>Exp. 2 <SEP>27 <SEP>NT <SEP>28 <SEP>46
<tb> <SEP>9 <SEP>87 <SEP>22 <SEP>36
<tb> <SEP>3 <SEP>76 <SEP>11 <SEP>52
<tb>Head Col 03 AL=L: A375
<tb>Head Col 04 AL=L: A549
<tb> <SEP>Exp. 3 <SEP>75 <SEP>89 <SEP>30
<tb> <SEP>25 <SEP>85 <SEP>22
<tb> <SEP>8 <SEP>71 <SEP>16
<tb>Head Col 03 AL=L: A375
<tb>Head Col 04 AL=L:
SK-MEL28
<tb> <SEP>Exp. 4 <SEP>20 <SEP>87 <SEP>44
<tb> <SEP>5 <SEP>75 <SEP>25
<tb> <SEP>1 <SEP>59 <SEP>11
<tb></TABLE>
Die Resultate sind angegeben in %-Hemmung oder %-Stimulation der <3>H-Thymidin-Einverleibung in Tumorzellen (A375, HTB10, A549 und SK-MEL28) bzw. normale Fibroblasten (WI26 und WI38). Eine GIA-Einheit ist in der Fussnote zu Tabelle 1 als derjenige Anteil von Oncostatin M definiert, welcher eine 50% Hemmung der <3>H-Thymidin-Einverleibung in A375-Zellen bewirkt.
Zusätzlich zum beobachteten Unterscheidungseffekt bei der <3>H-Thymidin-Einverleibung in Tumorzellen und normale humane Fibroblasten besteht ebenfalls ein beobachteter Unterscheidungseffekt bezüglich Morphologie und Zellanzahl in den der Oncostatin M-Behandlung der beiden Zelltypen folgenden 3 Tagen, wie in Figur 1 dargestellt.
Das verwendete Oncostatin M stammte von einer HPLC-C18<3>-Säulenfraktion mit der Spitzenaktivität für die Hemmung der Proliferation von A375-Zellen. Figur 1 stellt eine Serie von Mikro-Photographien von A375-Melanomzellen dar, welche unbehandelt sind (A), mit 5 Wachstums-Hemm-Aktivitäts-Einheiten (GIA-Einheiten) Oncostatin M behandelt (B) und mit 100 GIA-Einheiten Oncostatin M behandelt (C). Die Mikro-Photographien der WI38-Fibroblasten, die unbehandelt waren, sind in der Abbildung (D) diejenigen, die mit 5 GIA-Einheiten behandelt waren, sind in der Abbildung (E) und diejenigen, welche mit 100 GlA-Einheiten behandelt waren, sind in (F) abgebildet. Die Zellen wurden mit Kristallviolett in 0,5% Methanol gefärbt. Vergrösserung: 63 x.
NaDodSO<4>/PAGE von Oncostatin M
Gereinigtes Oncostatin M wurde einer Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) unter reduzierenden Bedingungen unterworfen. Es wurde gefunden, dass es ein scheinbares Molekulargewicht von etwa 28 kD, wie in Fig. 2 dargestellt, aufweist. Die folgenden Proteine wurden als Standards verwendet (Gel A): Ovalbumin, Mr = 43 kD; alpha -Chymotryposinogen, Mr = 25,7 kD; beta -Lactoglobulin, Mr = 18,4 kD; Lysozym, Mr = 14,2 kD; boviner Trypsin-Inhibitor, Mr = 6,2 kD; Insulin A- und B-Kette, Mr = 2,3 dK bzw. 3,4 kD. Oncostatin M wurde auf das Gel B appliziert.
Oncostatin M, das eine PAGE unter nicht reduzierenden Bedingungen unterworfen wurde, hatte ebenfalls ein scheinbares Molekulargewicht von 28 kD und das Protein, welches aus der Bande elektro-eluiert wurde, bewirkte die Hemmung der Proliferation von A375-Zellen.
Antikörper gegen ein synthetisches Peptid von Oncostatin M reagieren mit <1><2><5>I-markiertem Oncostatin M als Readioimmuno-Präcipitate
a) Peptid-Synthese
Das Peptid entspricht den Resten 6-9 des Oncostatin M-Proteins und wurde durch Festphasen-Techniken auf einem automatischen Beckmann-Gerät durchgeführt, wie beschrieben durch Gentry et al., J. Biol. Chem. (1983) 258: 11 219). Das Peptide wurde vom Harz unter Verwendung des "low-high"-HF-Verfahrens gelöst (Tam et al., J. Amer. Chem. Soc. (1983) 105: 6442-6445). Die Reinigung wurde durch präparative HPLC durchgeführt.
b) Herstellung von Antikörpern
Das Peptid wurde an bovines gamma -Globulin, wie beschrieben durch Gentry und Lawton gekoppelt (Virology (1986) 152: 421-431). Weisse Neuseeland-Kaninchen wurden subcutan behandelt und nachbehandelt (fünfmal) an vier Stellen, wie beschrieben durch Gentry und Lawton (Virology (1986) 152: 421-431). Die Antiseren wurden 2 Wochen nach der fünften Nachbehandlung erhalten.
c) Iodierung von Oncostatin M
Eine Probe von partiell gereinigtem Oncostatin M wurde mit Iod-125 markiert, wobei publizierte Verfahren verwendet wurden (Linsley et al., PNAS (1985) 82: 356-360). Ein Aliquot der markierten Zubereitung, welcher 100 000 cpm enthielt, wurde mit Kaninchen-Antiserum, welches gegen die N-terminalen 17 Aminosäuren von Oncostatin M (Endverdünngung von 1:20) gerichtet war, in Abwesenheit oder Gegenwart des N-terminalen Peptides (die N-terminalen 17 Aminosäuren von Oncostatin M) (2 mu g) gemischt und einer Immuno-Präcipitations-Analyse wie durch Linsley et al., Biochemistry (1986), 25: 2978-2986, beschrieben.
Ein Röhrchen, das 5 l enthielt wurde mit 2 mu g des N-terminalen Peptides in 10 ml TNEN (20 mM Tris pH 7,5, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,05% Nonidet P-40), das 0,1% BSA enthielt, während 30 Min. bei 4 DEG C vorinkubiert, bevor I<1><2><5> Oncostatin M in 85 lambda TNEN, welcher 0,1% BSA und 40 mM Dithioerithrit (DTT) enthielt, zugegeben wurde. 7 Röhrchen, die 5 mu l Antiserum enthielten wurden mit I125 Oncostatin M in 85 lambda l TNEN, welches 0,1% BSA und 40 mM DTT enthielt, während 30 Min. bei 4 DEG C inkubiert, bevor 50 mu l von Formalin-fixiertem Staphylococcus aureus (Pansorbin, Calbiochem) zugegeben wurde.
Im Anschluss an eine zusätzliche Inkubation während 30 Min. bei 4 DEG C wurden die Röhrchen mittels einer Mikrozentrifuge zentrifugiert und die Kügelchen wurden 4 x mit 1 ml TNEN gewaschen, bevor sie einer PAGE-Analyse unterworfen wurden. Ein diffuses Band beim Mr = 32 kD wurde nach der SDS/PAGE-Analyse des Immuno-Präcipitates beobachtet. Die Ausfällung dieser Spezies wurde gehemmt durch Einschluss eines Überschusses an unmarkiertem Peptid, welches den N-terminalen 17 Aminosäuren von Oncostatin M entsprach, was anzeigt, dass die Präcipitation für dieses Peptid spezifisch war.
Die Kohlehydrat-Zusammensetzung von Oncostatin M wurde geprüft, indem sie auf Glykosidase-Empfindlichkeit getestet wurde. Die Immuno-Präcipitate, wie sie gemäss dem obigen Absatz c) hergestellt wurden, wurden mit Pufferlösung, Endoglykosidase H oder Neuraminidase behandelt, wie durch Linsley et al., (1986) beschrieben. Die Behandlung mit Endoglykosidase H, einem Enzym mit einer Spezifität für N-gebundene, hohe Mannose-Oligosaccharide, resultierte in der Erscheinung einer Sorte mit niederem Molekulargewicht von Mr = 24 kD. Nur ein Teil des radio-markierten Materials war gegenüber diesem Enzym empfindlich, was zeigte, dass nicht alle Moleküle hohe Mannose-Oligosaccharide enthielten.
Die Behandlung mit Neuraminidase resultierte in der Erscheinung einer einzelnen Bande von Mr = 27 kD, anzeigte, dass die Grössen-Heterogenität von unbehandeltem <1><2><5>I-markiertem Oncostatin M seine Ursache in der molekularen Heterogenität der Sialysierung des Glykoproteinkerns hatte. Die Resultate zeigten, dass die aktiven Präparate von Oncostatin M eine Mischung von hoher Mannose und Komplex-N-gebundenen Oligosaccharid-Seitenketten war.
Oncostatin M, welches aus normalen, humanen, peripheren Blutlymphocyten (PBL) isoliert ist
Herstellung eines Tumor-Zellwachstums-Inhibitors aus PBL
Leukofraktionen, welche PBL enthielten, welche von einer Blutbank erhalten wurden, wurden 1:1 mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (pH 7,4) (PBS) verdünnt. 35 ml verdünntes Blut wurde mit 10 ml einer Lösung unterschichtet, welche aus 9 & Ficoll bestand, welches 20 Vol.-% 50% Natriumdiatrizoat enthielt (finales, spezifisches Gewicht 1,080). Die Gradienten wurden bei Zimmertemperatur während 20 Min. mit 850 x g zentrifugiert. Die Zellen wurden aus der Gradienten-Zwischenschicht gewonnen und mit PBS gewaschen. Die roten Blutkörperchen wurden während 3 bis 4 Min. mit 10 bis 20 ml einer Lösung, die 0,8% Ammoniumchlorid und 0,1% Na4-EDTA enthielt, schock-lysiert.
Die Zellen wurden aus der lysierten Lösung der roten Blutkörperchen durch Zentrifugation bei 600 x g während 10 Min. gewonnen und 10 ml RPMI-1640-Medium (GIBCO), die 5% fötales, bovines Serum enthielt, resuspendiert. Es wurde Thrombin bis zu einer finalen Konzentration von 0,5 U/ml zugegeben. Die Zellsuspension wurde während 5 Min. bei 37 DEG C gerührt und anschliessend wurde sie 5 Min. stehengelassen, damit sich das Plättchen-Aggregat absetzen konnte. Die suspendierten Zellen wurden in neue Röhrchen transferiert, wiederum durch Zentrifugation isoliert und in 1 ml fötalem, bovinem Serum resuspendiert und in eine Säule transferiert, die 0,5 g gebürstete, vorgenetzte Nylon-Wolle des Typs 200 (Fenwal) enthielt.
Die Nylon-Woll-Kolonne wurde bei 37 DEG C während 60 Min. in kubiert, um die Bindung der Monocyten und B-Lymphocyten zu ermöglichen. Die Säule wurde dann mit 3 x Volumen RPMI-1640-Medium (37 DEG C), welches 5% fötales, bovines Serum enthielt, gewaschen und dann wurden die nicht gebundenen Zellen (PBL) gesammelt.
Die PBL (2 x 10<6> Zellen/ml) wurden bei 37 DEG C mit 5% CO2-95% Luft während 96 Std. in RPMI-1640-Medium (10,4 g/l), welches FeSO4 . 7H2O ( 1 mg/l ), ZnSO4 . 7H2O ( 2 mg/l ) Na2SeO3 . 5H2O (0,017 mg/l), 1-Aminoethanol (1 mg/l) humanes Transferrin (5 mg/l), bovines Serumalbumin-Linolsäurekonjugat (Sigma) (200 mg/l), L-Glutamin (300 mg/l), Penicillin/Streptomycin (100 000 Einheiten/l) und Phytohämagglutinin-P (Wellcome) (2 mg/l) enthielt, kultiviert. Die Überstände wurden gesammelt und zur Entfernung der Zellen zentrifugiert, durch Ultrafiltration (Amicon Diaflo-Membrane YM-10, 10 Kd cut-off) konzentriert und gegen 0,1 M Essigsäure (Spectrapore 3-Dialyseschlauch) dialysiert. Die geklärte, zurückgehaltene Lösung wurde gefriergetrocknet.
Gel-Permeations-Chromatographie
Die rohe Fraktion wurde in 20 ml 1 M Essigsäure (50 mg/ml) rekonstituiert und auf eine BioGel-P-100-Säule (2,6 x 88 cm) appliziert, welche mit 1 M Essigsäure mit einer Fliessgeschwindigkeit von 0,5 ml/Min. equilibriert war. Es wurden 12 ml-Fraktionen gesammelt. Ein Aliquot von jeder Fraktion wurde eingedampft und dreifach auf Wachstums-Hemmungs-Aktivität (GIA) gegen A375-Zellen getestet. Die aktiven Fraktionen wurden gepoolt, lyophilisiert und auf einer Bio-Sil TSK-250-Säule (600 x 21,5 mm), wie beschrieben, rechromatographiert.
Umkehrphasen-Hochdruckchromatographie von TSK-250-Fraktionen
Die Endreinigung der gepoolten TSK-250-Fraktionen wurde durch Umkehrphasen-HPLC erzielt, im wesentlichen wie beschrieben. Der PBL-derivierte Tumorzellen-Inhibitor wurde aus mu -Bondapak-C18-Trägern bei Konzentrationen von 40 bis 41% Acetonitril bzw. 26,5% n-Propanol eluiert.
Zellwachstums-Modulations-Test unter Verwendung von <1><2><5>I-Ioddesoxyuridin-Einverleibung in DNA (GIA)
Diese Tests wurden in 96-Loch-Kulturschalen mit flachem Boden (Costar 3596) durchgeführt. Humane Melanomzellen, A375 (4 x 10<3> ) in 50 l Testprobe wurden in jedes Loch gegeben und während 3 Tagen bei 37 DEG C inkubiert. Die Zellen wurden 24 Std. mit <1><2><5>I-IdU (0,05 Ci/Loch) markiert und zusätzliche 24 Std. inkubiert. Die Zellen wurden dreimal gewaschen und mit einem Mehrfach-Proben-Ernter geerntet und die Radioaktivität wurde in einem gamma -Zähler gezählt.
Resultate
Ein Präparat von PBL-deriviertem Tumorzellen-Inhibitor wurde einem automatischen repititiven Edman-Abbau unterworfen. Die Amino-terminale Aminosäure-Sequenz ist die folgende:
EMI38.1
X bedeutet eine Aminosäure, dle noch nicht identifiziert wurde.
Ein Verqleich dieser Sequenz mit derjenigen des U937-Faktors zeigt klar die Identität mlt dem N-Terminus des PBL-derlvierten Faktors.
EMI39.1
In der nächsten Studie wurde die Fähigkeit von PBL-deriviertem Oncostatin M erforscht, die Replikation einer Zellsorte zu bewirken. Es wurde gefunden, dass die L929-Mäusezellen unempfindlich gegen PBL-deriviertes Oncostatin M waren, wenn bis zu 1000 GIA-Einheiten/ml verwendet wurden. Humane Fibroblasten WI26 wurden zum Wachstum stimuliert, wenn mit 1000 GIA-Einheiten/ml behandelt wurde. 72 Std. nach der Mitogenese wurde die Proliferation von normalen, humanen T-Lymphocyten nicht bewirkt bei bis zu 500 GIA-Einheiten/ml.
Es ist naheliegend aus den obigen Resultaten, dass ein neues Polypeptid und Polypeptid-Fragmente vorliegen, welche für die Modulation des Zellwachstums verwendet werden können. Es wurde gefunden, dass die Verbindungen eine variierende Aktivität, je nach der Natur der involvierten Zellinie, besitzen, so dass sie als solche oder in Konjugation mit anderen Komponenten bei der Modulierung des Zellwachstums verwendet werden können. Die erfindungsgemässen Polypeptide stellen demzufolge zusätzliche Polypeptide dar, welche mit Zellmischungen sowohl in vivo wie auch in vitro verwendet werden können, um cellulare Proliferation eines besonderen Zelltypes zu reduzieren oder zu erhöhen.
Insbesondere kann der Faktor verwendet werden, um Zellen für autologe Knochenmarktransplantationen zu behandeln. Die Verwendung des Faktors hemmt das Wachstum von Tumorzellen im Knochenmark und kann die Bildung von Zellkolonien stimulieren. Oncostatin M kann ebenfalls verwendet werden, um das Wachstum von epithelialen Zellen zu stimulieren, wobei die Wundheilung gefördert wird. Zusätzlich können die intakten Polypeptide oder Fragmente davon als Immunogene verwendet werden, um die Antikörperbildung einzuleiten. Die eingeleiteten Antikörper finden Verwendung, um Oncostatin M, welches in einer Körperflüssigkeit vorhanden ist, zu titrieren oder die Aktivität des Faktors zu modulieren, indem er gebunden wird.
Weiter können diese Antikörper zusammen mit gereinigtem Oncostatin M oder von Fragmenten davon als Komponenten von diagnostischen Ausrüstungen verwendet werden, in Konjugation mit anderen Reagenzien, insbesondere Antikörper zum qualitativen und quantitativen Nachweis von Oncostatin M.
Obschon die vorliegende Erfindung zum besseren Verständnis und zwecks Klarheit durch Erläuterungen und Beispiele im einzelnen beschrieben ist, ist es naheliegend, dass gewisse Änderungen und Modifikationen innerhalb des Definitionsbereichs der beiliegenden Ansprüche liegen.
The present invention relates to polyamino acids or polypeptides and biologically active fragments thereof. The compounds serve to modulate cell growth, e.g. inhibiting the growth of tumor cells and stimulating the growth of normal fibroblasts and can modulate immune functions. The amino acid sequences of the compounds according to the invention are markedly different from sequences of other compounds to which analog properties have been ascribed.
Leukocytes, both lymphocytes and monocytes, have been implicated in the inhibition of tumor growth by various animal tumor models. The increasing incidence of malignant tumors in immunodeficient people supports the argument that white blood cells play a role in regulating neoplastic growth. Protein factors that are produced by these white cells, which inhibit tumor growth or modulate immune functions and have already been isolated and characterized, include the alpha and gamma interferons, the tumor necrosis factor, the lymphotoxin, the interleukin-2 and other lymphokines.
Since each of the isolated factors has a different spectrum of activity and can react differently in interaction with other factors, there is a continuing and strong interest in the isolation and characterization of all factors which are produced by white blood cells to modulate cell growth or immune functions. These compounds find use individually or together in the treatment or diagnosis of cancer, as promoters of wound healing or as immuno-modulators for the treatment of patients with immunodeficiency, auto-immunity, organ transplants and the like.
There are various difficulties that must be considered in the discovery, isolation, purification, or characterization of naturally occurring factors. The methodology must be developed for the separation and purification of a factor of interest from other factors in the raw starting material, whereby the activity of the desired factor must not be denatured; bioassays have to be developed which identify the identification of the fractions during the separation steps which concentrate a certain factor; a new factor must be able to be distinguished from known or other, unknown factors which may be present and which may have a negative or positive effect on the activity of the desired factor; the purified factor must be characterized;
and the purified factor must be concentrated enough to enable the factor to be identified and characterized. As a result, as the number of factors isolated increases, each new factor becomes more difficult to identify because its role and function are hampered by numerous other existing factors.
Beal et al., Cancer Biochem. Biophys. (1979) 3: 93-96 describe that peptides are present in human urine which inhibit growth and DNA synthesis in transformed cells more than in normal cells. Holley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1980) 77: 5989-5992 describe the purification of epithelial cell growth inhibitors. Letansky, Biosci. Rep. (1982) 2: 39-45 describe that peptides isolated from bovine placenta inhibit tumor growth and thymidine incorporation in DNA to a greater extent in neoplasms than in normal cells. Chen, Trends Biochem. Sci. (1982) 7: 364-365 describes the isolation of a peptide from an ascites fluid with an anti-cancer property. Redding and Schally, Proc. Natl. Acad.
Sci. (1982) 79: 7014-7018 describe the isolation and purification of peptide from porcine hypothalm, which has anti-mytogenic activity against various normal cell lines and tumor cell lines. Sone et al., Gann (1984) 75: 920-928 describe the production of a factor produced by human macrophages that inhibits the growth of various cell lines in vitro. Ransom et al., Cancer Res. (1985) 45: 851-862 describe the isolation of a factor called leukoregulin that inhibits the replication of different tumor cell lines and is distinguishable from lymphotoxin, interferon and interleukin 1 and 2. Most of these factors are not fully characterized, nor is their primary structure known.
Aggarwal et al., J. Biol. Chem. (1984) 259: 686-691 purified and characterized human lymphotoxin (LT) which was produced by a lymphoblastoid cell line and which was subsequently sequenced (Aggarwal et al, J. Biol. Chem. (1985) 260: 2334 ). Gamma interferon (gamma -IF), which is produced by the lymphoid cells and has immuno-modulation and tumor inhibitory activity, has been cloned and expressed (Gray et al., Nature (1982) 295: 503-508 ). Tumor necrosis factor (TNF), which inhibits the growth of some tumors and is produced by macrophages and certain leukemia cell lines, has been characterized and the TNF cDNA has been cloned and expressed in E. coli (Pennica et al., Nature (1984) 312: 724).
The object of the present invention was to provide a factor which modulates cell growth, in particular inhibits tumor cell growth and stimulates the growth of normal fibroblasts and modulates the immune functions.
The object was achieved by the objects of the present invention.
The subjects of the present invention are defined in the independent claims.
Brief description of the drawings:
FIG. 1 shows a series of microphotographs of cells which have been treated with Oncostatin M, where A to C represent A375 melanoma cells which have been treated with 0.5 or 100 GIA units and D to F represent WI38 fibroblasts, treated with 0.5 or 100 GIA units; and
Figure 2 is a photograph of SDS-PAGE analysis of Oncostatin M.
New polyamino acids, polypeptides, polypeptide compositions and fragments thereof as well as their production and use are described. The compositions show activity in modulating cell growth, particularly inhibiting tumor cell growth and stimulating growth of normal fibroblasts. A preferred polypeptide is called Oncostatin M and is obtained from leukocytes, e.g. from conditioned media from stimulated U-937 cells or conditioned media from stimulated normal peripheral blood lymphocytes (PBL). Fragments and mutants of the polypeptide which have the biological activity of the intact Oncostatin M, such as the cell growth modulation activity or the immunological activity, are also described.
The new polypeptide fragments according to the invention have at least 8 amino acids and have at least such a biological activity that they are immunologically cross-reactive with naturally occurring oncostatin M. Immunological cross-reactivity is understood to mean that an antibody which is induced by a polypeptide according to the invention has an intact Oncostatin M cross-reacts, at least when Oncostatin M is in a denatured state. The polypeptides are therefore useful for inducing antibodies against Oncostatin M and can therefore be used to determine the concentration of Oncostatin M in body fluids, to bind Oncostatin M and consequently to modulate its activity and to purify Oncostatin M, for example in an affinity column. be used.
Some of these polypeptides may also have the cell modulation activity of the intact oncostatin, although the activity may be modulated, usually reduced compared to intact Oncostatin M.
The amino acid sequences of polyamino acids which are cross-reactive with Oncostatin M are shown below, the first sequence (I) representing the N-terminus M.
EMI6.1
The polyamino acids according to the invention generally contain an amino acid sequence which comprises at least 8 consecutive amino acids of one of the above amino acid sequences and which differs from this sequence by no more than three, normally by no more than one amino acid. The difference can either be an insertion of an amino acid, a deletion of an amino acid or a substitution of an amino acid by another, in particular a conservative substitution. Normally, a polyamino acid according to the invention contains at least 10, generally at least 12 consecutive amino acids which correspond to the sequences shown above and differ by no more than one amino acid.
A preferred group of compounds according to the invention has the following N-terminal amino acid sequence:
X-X-I-G-S-X-S-K-E-Y-R-V-L-L-G-Q-L-X-K-X
where X represents any amino acid.
The amino acids that form the building blocks of the present polyamino acids can be divided into a number of subclasses. The following table shows these subclasses:
EMI7.1
Conservative substitution means that the amino acids of the same subclass (i.e. either neutral, aliphatic, acidic, aliphatic, basic aliphatic or aromatic) are substituted, and in particular the same polarity. Amino acids of 2 to 5 carbon atoms or with 5-6 carbon atoms preferably form monomer groups in the aliphatic subclass.
The polyamino acids usually do not exceed 1000 amino acids in length. Usually they have less than 100 amino acids, especially less than 50 amino acids. As a result, the polyamino acids can be easily synthesized. If a polyamino acid is more than 100 amino acids in length, these polyamino acids can be polymers of fragments of Oncostatin M, with less than 100 amino acids or fusion proteins where the fragment is fused with an antigen, an enzyme, with enzyme fragments, etc. . In particular, the higher molecular weight polyamino acids can be at least one polypeptide fragment of less than about 100 amino acids covalently linked to a large immunogenic polypeptide carrier that imparts immunity.
Examples of such protein carriers are bovine serum albumin, keyhole limpet hemocyanin (Keyhole limpet hemocyanine, KLH) and the like. These conjugated polypeptides are useful for inducing antibodies in a convenient host organism.
U937 cells are a cell line derived from a histiocytic lymphoma cell line (Sundstrom and Nilsson Int. J. Cancer (1976) 17: 565-577) that can be induced to differentiate into cells that have macrophage characteristics after it has been treated with a variety of agents (Harris et al., Cancer Res. (1985) 45: 9-13). For the production of Oncostatin M, the U937 cells can be grown in a conventional nutrient solution with serum and treated with a suitable initiator. For convenience, phorbols or ingenols, especially 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) can be used. Usually about 5 to 20 ng / ml initiator is used. The original cell count is in the range of 10 <5> -10 <6> cells / ml.
After the cells have been treated with the initiator for a sufficient time, generally 3 to 6 days, the supernatant is removed, the cells are washed with serum-free nutrient medium, the bound cells are again washed with serum-free medium and finally the cells are incubated for at least 12 hours, normally no more than about 48 hours in serum-free culture medium, e.g. RPMI 1640 medium. The supernatants are then collected and the cells are removed by centrifugation. The cell-free supernatants are tested for cell growth inhibitory activity (GIA), as described in the experimental part. The supernatant contains 50 to 500 units GIA / ml (the GIA units are defined in the experimental part).
Oncostatin M can also be obtained from nitrogen-stimulated normal human peripheral blood lymphocytes (PBL). The PBL can be isolated from leuco fractions by diluting the fractions and centrifuging over Ficoll gradients. The cells obtained from the gradient surface are washed and shock-lysed to remove the red blood cells. The remaining cells are obtained from this solution by centrifugation, again dissolved in buffer solution containing serum and thrombin, stirred and the leaflet aggregate is left to stand for a short time. The resuspended cells are transferred, recovered by centrifugation, resuspended in serum and placed on a column containing nylon wool.
The column is incubated to bind the monocytes and B-lymphocytes and then washed. Most peripheral blood T lymphocytes are not bound and eluted from the column. These cells were cultured at 37 ° C in culture medium (i.e. RPMI-1640 medium) and treated with a suitable initiator, e.g. Phytohemagglutinin (1 to 5 mg / l) for about 100 hours and then the supernatants were collected. The supernatants were centrifuged to remove the cells and concentrated, for example by ultra-filtration or dialysis.
After isolation of the cell-free supernatant from U937 cells or normal PBL, the conditioned medium is concentrated, for convenience, using a "holofiber" system or an ultra-filtration membrane, then by dilution with acetic acid (to a concentration of 0, 1N acetic acid) followed by about 10 times the concentration and repeating the dilution and concentration. The concentrate can be freeze-dried and used directly or the freeze-dried product can be subjected to a further purification step.
The Oncostatin M can be purified by gel permeation chromatography using 40% acetonitrile / 0.1% trifluoroacetic acid as an isocratic mobile phase on a Bio-Sil TSK250 column, measuring the activity for each fraction. The cleaning gives a composition with an activity of at least 0.5 to 5 x 10 <4> GIA units / ml in the active fractions.
The product partially purified by gel permeation chromatography can be further purified using reverse phase high pressure liquid chromatography using a linear gradient and the primary solvent 0.1% trifluoroacetic acid in water and the secondary acetonitrile 0.1 % Is trifluoroacetic acid. The process can be varied, generally chromatography requires about 3 to 4 hours with the major time being greater than about 50% and no more than about 80% of the time in the range of 30 to 45% of the secondary solvent. Under these conditions, the active fractions are eluted at about 41 to 42% acetonitrole.
The pooled active fractions can be further purified by repeating the reverse phase HPLC using a faster change in gradient conditions and a slower flow rate. Under these conditions, the activity occurs at about 40.5 to 41.5% acetonitrile.
The reverse phase HPLC can then be repeated, changing the solvent system using n-propanol / 0.1% trifluoroacetic acid as the second solvent. A linear gradient is used, the gradient slowly changing in the range of 23 to 35% n-propanol. The main activity is observed in the range of 25.5 to 27.5% propanol, giving an essentially homogeneous product with a specific activity higher than 10 GIA units / ng protein. The product is usually purified until a specific activity of 100 GIA units / ng protein and in particular 150 GIA units / ng is obtained.
The main compounds are characterized by a molecular weight of approximately 17 to 19 ku (kD), in particular approximately 18 ku (kD), determined by size exclusion chromatography. The main compounds are further characterized to have an apparent molecular weight of about 28 ku (kD) as determined by polyacrylamide gel electrophoresis under reducing or non-reducing conditions.
The amino acid sequence of fragments of the purified Oncostatin M was analyzed. Oncostatin essentially has the following amino acid sequences:
EMI11.1
The first sequence (I) explains the N-terminus of Oncostatin M, while the remaining sequences (II, III) represent internal fragments of the polypeptide.
Active preparations of isolated Oncostatin M contained a mixture of high mannose and complex N-oligosaccharide. However, the non-glycosylated preparations of Oncostatin M contained the cell growth modulating activity.
Oncostatin M is further characterized by its activity against certain cell strains. The main polypeptide lacks the cytotoxic activity against the human fibroblasts WI26 and WI38 and against the mouse cells L929, which are sensitive to the tumor necrosis factor and against a gamma-interferon sensitive human tumor cell line. It has also been found that it does not inhibit the proliferation of normal human T lymphocytes or granulocytic / myelocytic colonization from bone marrow cells at a concentration up to 100 GIA units / ml. Oncostatin M further stimulates the proliferation of normal human fibroblasts as shown by WI38 and WI26 cells and inhibits the proliferation of tumor cells such as A375, HBT10, A549 and SKMEL28 and can increase the growth of colonizing cells from normal bone marrow.
Oncostatin M does not suppress human, proliferative or cytotoxic T cell responses in mixed leukocyte culture reactions (MLC) at concentrations of 500 GIA units / ml.
The polypeptide is stable against weak acids and bases as well as against heat treatment at 56 ° C.
The amino acid sequence of the polypeptide can be fully determined using commercially available sequencers. The polypeptide can then be synthesized according to known techniques, using an automatic synthesizer, which are also commercially available.
Alternatively, the polypeptide can also be produced by recombinant DNA techniques. Samples can be derived from a partial amino acid sequence, which can then be used for the screening of a human gene bank. The library can be a cDNA library or a chromosomal library. Once the clone or clones are identified, such as by fusing with the sample, the fragments of the genes of interest can be identified and manipulated in a variety of ways. The fragments can be reduced in size by endonuclease restriction, and the resulting fragments can be cloned and tested for the presence of the desired gene. Cells that produce the desired peptide or produce elevated portions of the desired peptide can be used to produce the mRNA.
A single-stranded cDNA can be produced from the mRNA. The cDNA can then be fused with an entire mRNA from a cell that produces little, if any, polypeptide. The unmelted cDNA can then be isolated and used to produce ds cDNA, which can then be screened with the samples.
Alternatively, the DNA fragments can be inserted into lambda gtll so that the coding fragments are present downstream and within the framework of the beta-galactosidase gene. Antibodies to the Oncostatin M polypeptide can then be made and used to screen the resulting fused protein for cross-reactivity. In this way, fragments encoding the polypeptide or fragments thereof can be identified and used for the identification of the desired gene.
Once a complete gene has been identified, either as cDNA or as chromosomal DNA, it can be manipulated in a number of ways to obtain expression. If the gene is expressed in a host that recognizes the wild-type transcription and translation-regulating regions of Oncostatin M, the entire gene, with its 5 min -3 min -regulation regions of the wild-type, can be expressed in a convenient expression- Vector are introduced. Various existing expression vectors use replication systems from mammalian viruses such as Simian 40, adenovirus, bovine papilloma virus, vaccinia virus, insect baculovirus, etc.
These replication systems have been developed to provide labeling agents that allow the selection of transfection agents, as well as to provide convenient restriction sites into which the gene can be introduced.
If the gene needs to be expressed in a word that does not recognize the naturally occurring wild-type transcription and translation regulating areas, further manipulations are required. A number of useful 3 min transcriptional control regions are known which can be used downstream of the stop codon. The non-coding 5 min region upstream of the structure can be removed by endonuclease restriction, Bal31 resection or the like. Alternatively, if there is a convenient restriction site near the 5 min terminus of the structural gene, the structural gene can be restricted and an adapter can be used to connect the structural gene to the promoter region, the adapter replacing the lost nucleotides of the Structural gene serves.
Various strategies can be adopted in order to obtain an expression cassette which has a transcription and translation initiation region in the 5 min, 3 min direction of transcription, which also has control sequences for the initiation of control, the structural gene the transcription and translation control of the initiation region and a terminal transcription and translation area.
Examples of transcription initiation areas or promoters for bacteria are the beta gal promoter, the TAC promoter, the lambda left and right promoter, etc; for yeast, the glycolytic enzyme promoters such as ADH-I and II promoters, the GPK promoter and the PGI promoter, the TRP promoter, etc .; for mammalian cells SV40 early and late promoters, adenovirus major late promoters, etc. As previously indicated, the expression cassette can be included in a replication system for episomal maintenance in a convenient cellular host or can be provided without a replication system where it can be integrated into the host's genome.
The DNA can be introduced into the host in a known manner, such as by transformation, using DNA precipitated with calcium phosphate, transfection by bringing the cells into contact with the virus or by micro-injecting the DNA into the cells.
Once the structural gene has been introduced into an appropriate host, the host can be grown and it will express the structural gene. In some cases it may be desirable to provide a signal sequence (secretory leader) upstream and in the reading frame of the structural gene, which causes the secretion of the structural gene and the cleavage of the secretory leader, which leads to the maturation of the mature polypeptide in the supernatant. If no secretion takes place, the host cells can be changed, lysed according to the usual conditions and the desired product isolated and purified according to known techniques, for example by chromatography, electrophoresis, solvent extraction or the like.
The polyamino acids or polypeptides according to the invention can be used for many purposes both in vivo and in vitro. These compounds according to the invention can be used for the production of antibodies against the compounds according to the invention, which can be used in vivo or in vitro. The antibodies can be prepared in a conventional manner, for example by using a polypeptide according to the invention as an immunogen and injecting the polypeptide into a mammalian host, e.g. into a mouse, a cow, a goat, a sheep, a rabbit, etc., especially with an adjuvant, e.g. Freund's complete adjuvant or aluminum hydroxide gel.
Blood can be drawn from the host and the blood can be used for the isolation of polyclonal antibodies, or in the mouse the peripheral blood lymphocytes or the spleen lymphocytes (B cells) can be used for the fusion with a suitable myeloma cell to immortalize the chromosomes for the monoclonal expression of antibodies which are specific against the compounds according to the invention.
Both polyclonal and monoclonal antibodies can be produced, which can then be used for the diagnosis or detection of the presence of a polypeptide according to the invention in a sample, such as in the form of cells or a physiological fluid, such as blood. The antibodies can also be used in affinity chromatography for the purification of the polypeptides according to the invention and their isolation from natural and synthetic sources. The antibodies can also be used to control the content of polypeptides according to the invention in cell cultures or in vivo, it being possible to change the growth of the cells. The compounds according to the invention can then be used as ligands for the detection of the presence of receptors for the compounds according to the invention.
In this way, cells can be distinguished in connection with the presence and density of receptors for the compounds according to the invention, the effect of various compounds on the presence of such receptors being demonstrated.
The polyamino acids or polypeptides according to the invention can be used in vitro cultures to inhibit the growth of cells or cell lines which are sensitive to the polypeptides according to the invention and consequently can be distinguished from cells which are not sensitive. Accordingly, heterogeneous cell mixtures or cell lines can be freed of unwanted cells if the unwanted cells are sensitive to the polypeptides according to the invention. The polypeptides according to the invention can be administered in vivo under neoplastic conditions, for example by injection, intralesional, peritoneal, subcutaneous.
The compounds according to the invention can be used in vitro to remove malignant cells from the bone marrow for autologous marrow transplants or to inhibit proliferation or to remove malignant cells in other tissues, for example in the blood, before reinfusion.
The polypeptides according to the invention can also be used in a wound treatment method, for example for cuts, corneal wounds and numerous other disorders of the epithelium and stroma, such as chronic ulcers, burns, surgical interventions, traumatic wounds and injuries in the hollow organs delimited by epithelium , such as in the esophagus, stomach, large and small intestine, mouth and urogenital tract. The method is based on topical application with a treatment composition containing Oncostatin M in a physiologically acceptable carrier.
The composition according to the invention can be used for the treatment of a large number of wounds, including essentially all cutan wounds, corneal wounds and injuries in the hollow organs of the body delimited by epithelium. Wounds that are conveniently treated with the composition mentioned include those resulting from trauma such as burns, abrasions, cuts and the like, as well as those from surgical procedures such as surgical cuts and skin grafts. Other conditions which are expedient for treatment with the compositions according to the invention include chronic conditions such as chronic ulcers, diabetic ulcers and other non-healing (trophic) conditions.
Oncostatin M can be formulated in physiologically acceptable carriers for use in attacked areas. The nature of the carriers can be varied widely and depends on the location of the intended application. A cream or ointment base is usually preferred for use on the skin, convenient bases include lanolin, Silvaden (Marion) (especially for the treatment of burns), aquaphor (Duke Laboratories, South Norwalk, Connecticut) and the like. If desired, it is possible to insert compositions containing Oncostatin M into bandages and other wound coverings so that the wound is continuously exposed to the peptide. Aerosol applications can also be used.
The concentration of the polypeptide in the treatment composition is not critical. The polypeptide must be present in an amount that induces epithelial cell proliferation. The compositions are applied topically to the affected area, typically as eye drops for the eyes or as creams, ointments or lotions for the skin. In the case of the eyes, frequent treatment is desirable, usually at intervals of 4 hours or less. On the skin, it is desirable to maintain the treatment solution continuously at the affected area during the healing process, and the treatment composition can be used 2 to 4 times a day or more frequently.
The amount of the polypeptide according to the invention used varies depending on the type of administration, the use of other active compounds and the like, and is generally in the range from 1 μg to 100 μg. The polypeptides according to the invention can be used with physiologically acceptable carriers, such as saline or phosphate-buffered saline. The proportion of the compounds used is determined empirically, reference being made to the response of the cells in vitro and the response in experimental animals to the polypeptides or formulations according to the invention which contain them. The compounds according to the invention are used as such or in combination with other growth factors or inhibitors or immunomodulators, such as TNF, IL-2, gamma interferin or monoclonal antibodies.
The amount of this compound is generally 1 µg to 100 µg. The conjugates of the compounds according to the invention by center-directed residues, for example antibodies, can be prepared if the antibodies are specific for particular malignant cells or organs.
The following examples serve to illustrate the present invention.
EXPERIMENTAL
material and methods
Oncostatin M isolated from U937 cells. Production of an inhibitor for tumor cell growth from a hystiocytic lymphoma cell line
U937 cells, a hystiocytic lymphoma cell line (Sundstrom and Nilsson, Int. J. Cancer (1976) 17: 565-577) were in 850 cm <2> -rolling bottles (Corning C2540) with a concentration of 4 x 10 <5> cells / ml in a total volume of 300 ml RPMI 1640 medium containing 10% fetal calf serum (FCS), penicillin / streptomycin (PS), L-glutamine and 10 ng / ml 12-O-tetradecanoylphorbol 13-acetate ( TPA) was cultivated. Four days later, the supernatants containing FCS and TPA were removed, the roller bottles were washed five times with serum-free RPMI-1640 and the cells which were dissolved (1 x 10 <5> cells / ml) were washed three times with serum-free medium and returned to the bottles, resulting in a final volume of 125 ml of serum-free RPMI-1640 medium per roller bottle.
One day later, the supernatants were collected, centrifuged to remove the cells and filtered through a 0.45 µm Nalgen filter and concentrated to a volume of 150 ml using a hollow fiber system (Amicon cartridge HIP10-20) ( original volume 1500 ml). The Oncostatin M was also obtained from the supernatants from U937 cells treated with serum-free TPA in 150 cm <2> Preserved culture bottles. The supernatant was concentrated with an Amicon Diaflo membrane PM-10, with a 10 kD exclusion, and dialyzed. After dialysis, the concentrate was diluted with acetic acid to give a final concentration of 0.1 N acetic acid in 500 ml and concentrated to 50 ml using an Amicon PM-10 filter. The 50 ml concentrate was diluted to 400 ml with 0.1 N acetic acid and concentrated to 40 ml with the same filter.
The concentrate was diluted with 1N acetic acid and the resulting precipitate was removed by centrifugation. The resulting concentrate was frozen and freeze-dried. The lyophilized material was used for the cleaning step.
Gel permeation chromatography
A Bio-Sil TSK-250 column (600 x 21.5 mm) (Bio-Rad) was connected to a high pressure liquid chromatography system. The crude fraction (10 mg / ml) was dissolved in 40% acetonitrile in 0.1% aqueous trifluoroacetic acid (0.1% TFA). A 2 ml aliquot of the mixture was injected and elution was carried out isocratically with a mobile phase of 40% acetonitrile in 0.1% TFA. The flow rate was 2.5 ml / min. and the paper speed was set to 0.25 cm / min. fixed. 5 ml fractions were collected. Chromatography was carried out at room temperature. An aliquot of each fraction was evaporated and tested in triplicate for growth inhibitory activity (GIA) from A375 cells.
The active fractions (fractions 21 and 22) were pooled in 6 runs. The pooled material had a total of approximately 4.8 x 10 <5> GIA units. The factor was found to have an apparent molecular weight of 18 kD as determined by size exclusion chromatography (Bio-Sil TSK-250 column).
Reverse phase high pressure liquid chromatography (HPLC) of TSK-250 fractions
Pooled TSK-250 fractions 21 and 22, as described above, were diluted twice with 0.1% TFA. This mixture was isocratic on a mu -Bondapak-C18 column (7.8 x 300 mm) (based on C18 <1>) injected at room temperature. The flow rate was reduced to 2.0 ml / min. and the paper speed was 0.25 cm / min. The linear gradient was chosen between the primary solvent 0.1% TFA and the secondary solvent acetonitrile / TFA 0.1%. The gradient conditions were 0.30% in 20 minutes, then 30-45% in 150 minutes, 45-55% in 20 minutes and 55-100% in 10 minutes. All solvents were HPLC grade. 4 ml fractions were collected and aliquots from each fraction were tested for growth inhibitory activity. Fractions 72-75 were found to have the majority of activity.
The active fractions were eluted between 41 and 42% acetonitrile.
Fractions 72-75 were pooled. 16 ml 0.1% TFA was added to the pooled fractions. The mixture was poured into a mu -Bondapak C18 column (3.9 x 300 mm) (as C18 <2>) injected at room temperature. The flow rate was reduced to 1 ml / min. and the paper speed was 0.25 cm / min. The gradient conditions were 0.35% in 10 minutes, 35-45% in 100 minutes and 45-100% in 10 minutes. The fractions were collected and aliquots were taken and tested for GIA. Most of the activity occurred from the column between 40.7 to 41.3% acetonitrile concentration (retention time 83-86 min.).
The active fractions were pooled and diluted twice with 0.1% TFA and isocratically on a mu -Bondapack C18 column (3.9 x 300 mm) (designated C18 <3>) injected at room temperature. The flow rate was 1 ml / min. and the paper speed was 0.25 cm / min. A linear gradient was used, between the primary solvent 0.1% TFA and the secondary solvent n-propanol-TFA (0.1%).
The gradient conditions were 0-23% in 20 minutes and 23-35% in 120 minutes. The fractions were collected and alitquote portions of each fraction were tested for GIA. Most of the activity appeared between 25-26.5% propanol concentration (retention time 59 min.). This apparently homogeneous fraction contained 300 ng protein and about 40,000 GIA units.
Cell growth modulation experiment using a <3> H-thymidine incorporation into DNA (GIA)
The tests were performed in 96 flat well plates (Costar 3596). Human melanoma cells (A375) have been used as a sensitive indicator cell line. The cells (3 x 10 <3>) in 0.1 ml Eagles medium, modified according to Dulbecco (DMEM), were supplemented with 10% FCS and PS were added to each well. 3 hours later, 0.1 ml test samples were placed in each well. The plates were incubated at 37 ° C. for 3 days. Then 0.025 ml (0.5 mu Ci) of a solution <3> H-thymidine (specific activity 27 mu Ci / mu g) was added to each well for the last 6 hours of incubation. The cells were then transferred to glass filter strips using a multiwell harvester (PHD cell harvester, Cambridge Technology, Inc.).
The filters were transferred to scintillation vials, to which 2 ml of scintillation fluid (Scienti Verse II, Fisher Scientific Co.) was added before the on a scintillation counter <3> H-thymidine incorporation was determined.
Soft agar colony inhibition test (TGI)
A 0.5 ml base layer of 0.5% agar (Agar Noble; Difco Laboratories, Detroit, Michigan) in DMEM-containing 10% fetal calf serum (FCS) was placed on 24-well Costar tissue culture plates. 0.5 ml 0.3% agar containing the same medium / FCS mixture, 1-2.5 x 10 <3> A375 cells and the factor to be tested in various concentrations were placed on the base layer of agar under layers. The plates were incubated at 37 ° C. in a humid atmosphere with 5% CO 2 in air and were fed after 7 days by adding 0.5 ml of 0.3% agar, which contained the same medium and the same factor concentrations. The colonies were numbered, detached and removed and colonies with more than 6 cells were evaluated between 7-14 days.
Results
Sequences of Oncostatin M, which was obtained from U937 cells
The N-terminal sequence and the internal fragments of Oncostatin M were determined by microsequence analysis using the reduced and S-pyridinethylated polypeptides and peptides resulting from enzymatic digestion of the reduced and S-pyridinethylated Oncostatin M with endoproteinase Lys-C and Staphylococcus aureus V8 protease were obtained. The peptide fragments were purified by reverse phase HPLC using volatile solvents. The peptides were subjected to automated, repeated Edman degradation in a Model 470 A sequencer (Applied Biosystem, Inc.). The phenylthiohydantoin amino acids were analyzed by reverse phase HPLC (Applies Biosystems, Inc.) using a PTH-C18 column ( 2.1 x 220 mm, ABI) was used and a sodium acetate buffer / tetrahydrofuran / acetonitrile gradient was used for the elution.
The resulting amino acid sequences essentially correspond to the following sequences:
EMI26.1
Comparison of these sequences with those stored in the current protein database (PIR Release 9.0, May 1986) showed no significant sequence homologies with any other known sequence. In addition, there is no homology between the tumor necrosis factor, the lymphotoxin, the colony-stimulating factor, interleukin 1 or 2 or the beta-transforming growth factor.
Inhibiting the proliferation of tumor cells and improving the proliferation of normal human fibroblasts
Using the soft agar colony inhibition test as described above, the following results were obtained:
<tb> <TABLE> Columns = 3
<tb> Title: Table 1
Inhibition of melanoma A375 cell colony formation in soft agar by purified Oncostatin M, which was isolated from U937 cells *
<tb> Head Col 01 AL = L: GIA units / hole
Head Col 02 AL = L:% inhibition of the colonies
<tb> Head Col 03 AL = L: Colonization
<tb> <SEP> 250 <SEP> 4 <SEP> 96
<tb> <SEP> 83 <SEP> 6 <SEP> 94
<tb> <SEP> 27 <SEP> 11 <SEP> 89
<tb> <SEP> 45 <SEP> 32 <SEP> 69
<tb> <SEP> 0 <SEP> 106 <SEP> -
* The A375 cells were applied in soft agar, with or without a factor in a final volume of 2 ml as described above. The factor used was obtained from a C18 propanol column fraction with the peak activity for inhibiting tumor growth (GIA). The number of colonies was counted 11 days later.
One colony was defined as an accumulation of at least 6 cells. A GIA unit was defined as the amount that inhibited 50% of the <3> H-thymidine incorporation into A375 cells in micro-holes caused, as detailed above.
<tb> </TABLE>
In the next study, various treatments were used to determine the effect of the chemical or physical treatment on the activity of the polypeptide according to the invention. The table below shows the results:
<tb> <TABLE> Columns = 6
<tb> Title: Table 2
Effect of Different Treatments of Supernatants from TPA-Induced U937 Cells on Tumor Growth Inhibition Activity *
<tb> Head Col 02 to 04 AL = L:
Final dilution of the supernatant
<tb> SubHead Col 02 AL = L> 1: 4:
<tb> SubHead Col 03 AL = L> 1: 8:
<tb> SubHead Col 04 AL = L> 1:16:
<tb> <SEP> medium control <SEP> - <SEP> - <SEP> - <SEP> 39 780
<tb> <SEP> untreated supernatant <SEP> 7206 ** <SEP> 13 896 <SEP> 16,000
<tb> <SEP> 1N acetic acid <SEP> 6670 <SEP> 17 073 <SEP> 18 783
<tb> <SEP> 1N NH4OH <SEP> 6956 <SEP> 15 016 <SEP> 13 923
* The U937 cells were treated with TPA (10ng / ml) for 3 days and then the cells were washed with medium and incubated in serum-free medium for 24 hours before the supernatants were collected. The supernatants were treated with 1N acetic acid or 1N ammonium hydroxide (NH4OH). They were then dialyzed against the medium and checked for their ability to <3> H-thymidine
Inhibiting incorporation into A375 cells, tested.
The A375 cells were with <3> H-thymidine ( <3> H-TdR) marked for the last 6 hours of the three-day incubation.
** The specified data concern the <3> H-TdR incorporation count rate per minute.
<tb> </TABLE>
The above results show that oncostatin in the dialyzed supernatant is essentially resistant to inactivation by 1N acetic acid and 1N ammonium hydroxide. Accordingly, the compounds according to the invention are essentially insensitive to both medium-strong acids and medium-strong bases. The compounds according to the invention are stable against heat treatment at 26 hours for 1 hour, but not against treatment at 90 ° C. for 30 minutes.
The compounds of the invention were also tested for heat stability and it was found that their activity was retained for 1 hour after exposure to a temperature of 56 ° C., whereas they lost substantially all of their activity if they were kept at a temperature of 95 ° C. during Exposed for 30 minutes.
In a further study, the ability of the polypeptides according to the invention to inhibit tumor cell replication of a number of neoplastic cells was determined. The table below shows the results:
<tb> <TABLE> Columns = 2
<tb> Title: Table 3
Inhibition of replication of tumor cells by purified Oncostatin M from U937 cells
<tb> Head Col 01 to 02 AL = L: GIA units to cause 30% inhibition
<tb> SubHead Col 01 AL = L> tumor cells:
<tb> SubHead Col 02 AL = L> <3> H-TdR incorporation:
<tb> <SEP> A549 (lung cancer) <SEP> 21
<tb> <SEP> HTB10 (neuroblastoma) <SEP> 81
<tb> <SEP> A375 (melanoma) <SEP> 0.3
<tb> </TABLE>
The tumor cells were placed in micro-holes 3 hours before the addition of various dilutions of Oncostatin M, which was purified by reverse phase HPLC as listed above. During the last 6 hours of a three day incubation, the cells were in 0.2 ml of medium <3> H-thymidine ( <3> H-TdR) (0.5 Ci / hole) marked. A unit of tumor growth inhibitor activity (GIA) is defined in the footnote to Table 1 as the amount that 50% inhibition of <3> H-TdR incorporation in A375 melanoma cells. The unit was defined from about 10 pg of purified protein and consequently the concentration (ng / ml) was 30% inhibition <3> H-TdR incorporation in A549, HTB10 and A375 cells approximately 1.4, 4.0 and 0.15 ng / ml, respectively. The <3> H-TdR incorporation into normal, human WI26 fibroblasts was not suppressed by the factor U937 in each experiment.
The above results show that Oncostatin M is selective in its ability to inhibit replication and has widely varying effects depending on the nature of the cell. The compounds according to the invention are active against melanoma cells such as the A375 melanoma cells, the scale-like lung cancer cells such as A549 and the neuroblastoma cells such as HTB10.
The tumor cells were with a density of 3 x 10 <3> cells / hole and the normal fibroblasts with a density of 1.5 x 10 <3> Cells / hole set in 96-hole plates for 3 hours. Different concentrations of purified Oncostatin M, which from the fractions with the highest antiproliferative activity against A375 cells from the C18 <3> column was added and added 3 days later <3> H-thymidine incorporation into the cells measured in 3 holes for each concentration.
The results are shown in Table 4:
<tb> <TABLE> Columns = 5
<tb> Title: Table 4
Inhibition of the proliferation of tumor cells and improvement of the proliferation of normal fibroblasts by Oncostatin M
<tb> Head Col 02 AL = L: GIA
Units / hole
<tb> Head Col 03 AL = L:% inhibition
<tb> Head Col 05 AL = L:% stimulation
<tb> <SEP> A375 <SEP> WI38
<tb> <SEP> Exp. 1 <SEP> 16 <SEP> 83 <SEP> 25
<tb> <SEP> 4 <SEP> 62 <SEP> 30
<tb> <SEP> 1 <SEP> 46 <SEP> 46
<tb> Head Col 03 AL = L: A375
<tb> Head Col 04 AL = L: HTB10
<tb> Head Col 05 AL = L: WI26
<tb> <SEP> Exp. 2nd <SEP> 27 <SEP> NT <SEP> 28 <SEP> 46
<tb> <SEP> 9 <SEP> 87 <SEP> 22 <SEP> 36
<tb> <SEP> 3 <SEP> 76 <SEP> 11 <SEP> 52
<tb> Head Col 03 AL = L: A375
<tb> Head Col 04 AL = L: A549
<tb> <SEP> Exp. 3rd <SEP> 75 <SEP> 89 <SEP> 30
<tb> <SEP> 25 <SEP> 85 <SEP> 22
<tb> <SEP> 8 <SEP> 71 <SEP> 16
<tb> Head Col 03 AL = L: A375
<tb> Head Col 04 AL = L:
SK-MEL28
<tb> <SEP> Exp. 4th <SEP> 20 <SEP> 87 <SEP> 44
<tb> <SEP> 5 <SEP> 75 <SEP> 25
<tb> <SEP> 1 <SEP> 59 <SEP> 11
<tb> </TABLE>
The results are given in% inhibition or% stimulation of the <3> H-thymidine incorporation in tumor cells (A375, HTB10, A549 and SK-MEL28) or normal fibroblasts (WI26 and WI38). A GIA unit is defined in the footnote to Table 1 as that portion of Oncostatin M which has 50% inhibition of <3> H-Thymidine incorporation into A375 cells.
In addition to the observed differentiation effect at <3> H-thymidine incorporation into tumor cells and normal human fibroblasts also has an observed differentiating effect with regard to morphology and cell number in the 3 days following the oncostatin M treatment of the two cell types, as shown in FIG. 1.
The Oncostatin M used was from an HPLC-C18 <3> column fraction with the peak activity for inhibiting the proliferation of A375 cells. Figure 1 is a series of microphotographs of A375 melanoma cells which are untreated (A), treated with 5 growth inhibitory activity units (GIA units) Oncostatin M (B) and with 100 GIA units Oncostatin M treated (C). The microphotographs of the WI38 fibroblasts that were untreated are in Figure (D) those that were treated with 5 GIA units are in Figure (E) and those that were treated with 100 GlA units are shown in (F). The cells were stained with crystal violet in 0.5% methanol. Magnification: 63 x.
NaDodSO <4> / PAGE by Oncostatin M
Purified Oncostatin M was subjected to sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) under reducing conditions. It was found to have an apparent molecular weight of about 28 kD as shown in FIG. 2. The following proteins were used as standards (Gel A): ovalbumin, Mr = 43 kD; alpha-chymotryposinogen, Mr = 25.7 kD; beta-lactoglobulin, Mr = 18.4 kD; Lysozyme, Mr = 14.2 kD; bovine trypsin inhibitor, Mr = 6.2 kD; Insulin A and B chain, Mr = 2.3 dK and 3.4 kD, respectively. Oncostatin M was applied to Gel B.
Oncostatin M, which was subjected to PAGE under non-reducing conditions, also had an apparent molecular weight of 28 kD and the protein which was electro-eluted from the band caused the inhibition of the proliferation of A375 cells.
Antibodies against a synthetic peptide from Oncostatin M react with <1> <2> <5> I-labeled Oncostatin M as Readioimmuno-Precipitate
a) Peptide synthesis
The peptide corresponds to residues 6-9 of the Oncostatin M protein and was carried out by solid phase techniques on an automatic Beckmann device as described by Gentry et al., J. Biol. Chem. (1983) 258: 11 219). The peptide was detached from the resin using the "low-high" HF method (Tam et al., J. Amer. Chem. Soc. (1983) 105: 6442-6445). The purification was carried out by preparative HPLC.
b) production of antibodies
The peptide was coupled to bovine gamma globulin as described by Gentry and Lawton (Virology (1986) 152: 421-431). New Zealand white rabbits were treated subcutaneously and post-treated (five times) at four sites as described by Gentry and Lawton (Virology (1986) 152: 421-431). The antisera were obtained 2 weeks after the fifth post-treatment.
c) Iodination of Oncostatin M
A sample of partially purified Oncostatin M was labeled with iodine-125 using published methods (Linsley et al., PNAS (1985) 82: 356-360). An aliquot of the labeled preparation containing 100,000 cpm was challenged with rabbit antiserum directed against the N-terminal 17 amino acids of Oncostatin M (1:20 final dilution) in the absence or presence of the N-terminal peptide (die N-terminal 17 amino acids of Oncostatin M) (2 µg) mixed and an immuno-precipitation analysis as described by Linsley et al., Biochemistry (1986), 25: 2978-2986.
A tube containing 5 l was washed with 2 μg of the N-terminal peptide in 10 ml TNEN (20 mM Tris pH 7.5, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 0.05% Nonidet P-40), the 0 , 1% BSA was pre-incubated at 4 ° C. for 30 min before I <1> <2> <5> Oncostatin M in 85 lambda TNEN containing 0.1% BSA and 40 mM dithioerithritol (DTT) was added. 7 tubes containing 5 μl of antiserum were incubated with I125 Oncostatin M in 85 lambda 1 TNEN, which contained 0.1% BSA and 40 mM DTT, for 30 min at 4 ° C. before 50 μl of formalin-fixed Staphylococcus aureus (Pansorbin, Calbiochem) was added.
Following an additional 30 min. Incubation at 4 ° C., the tubes were centrifuged using a microcentrifuge and the beads were washed 4 × with 1 ml TNEN before being subjected to a PAGE analysis. A diffuse band at Mr = 32 kD was observed after the SDS / PAGE analysis of the immunoprecipitate. Precipitation of this species was inhibited by the inclusion of an excess of unlabeled peptide that corresponded to the N-terminal 17 amino acids of Oncostatin M, indicating that the precipitation was specific for this peptide.
The carbohydrate composition of Oncostatin M was checked by testing for glycosidase sensitivity. The immunoprecipitates as prepared according to paragraph c) above were treated with buffer solution, endoglycosidase H or neuraminidase as described by Linsley et al., (1986). Treatment with endoglycosidase H, an enzyme specific for N-linked high mannose oligosaccharides, resulted in the appearance of a low molecular weight variety of Mr = 24 kD. Only part of the radio-labeled material was sensitive to this enzyme, which showed that not all molecules contained high mannose oligosaccharides.
Treatment with neuraminidase resulted in the appearance of a single band of Mr = 27 kD, indicating that the size heterogeneity of untreated <1> <2> <5> I-labeled Oncostatin M was caused by the molecular heterogeneity of the sialyzation of the glycoprotein nucleus. The results showed that the active preparations of Oncostatin M was a mixture of high mannose and complex N-linked oligosaccharide side chains.
Oncostatin M, which is isolated from normal, human, peripheral blood lymphocytes (PBL)
Production of a tumor cell growth inhibitor from PBL
Leuco fractions containing PBL obtained from a blood bank were diluted 1: 1 with phosphate buffered saline (pH 7.4) (PBS). 35 ml of diluted blood was underlaid with 10 ml of a solution which consisted of 9 & Ficoll, which contained 20% by volume of 50% sodium diatrizoate (final specific weight 1.080). The gradients were centrifuged at 850 x g for 20 min at room temperature. The cells were harvested from the gradient intermediate layer and washed with PBS. The red blood cells were shock-lysed for 3 to 4 minutes with 10 to 20 ml of a solution containing 0.8% ammonium chloride and 0.1% Na4-EDTA.
The cells were recovered from the lysed red blood cell solution by centrifugation at 600 x g for 10 min and 10 ml of RPMI-1640 medium (GIBCO) containing 5% fetal bovine serum was resuspended. Thrombin was added to a final concentration of 0.5 U / ml. The cell suspension was stirred at 37 ° C. for 5 minutes and then left to stand for 5 minutes so that the platelet aggregate could settle. The suspended cells were transferred to new tubes, again isolated by centrifugation, and resuspended in 1 ml of fetal bovine serum and transferred to a column containing 0.5 g of brushed, pre-wetted type 200 nylon wool (Fenwal).
The nylon-wool column was incubated at 37 ° C. for 60 minutes in order to enable the monocytes and B-lymphocytes to be bound. The column was then washed with 3 x volume of RPMI-1640 medium (37 ° C.), which contained 5% fetal bovine serum, and then the unbound cells (PBL) were collected.
The PBL (2 x 10 <6> cells / ml) were at 37 ° C. with 5% CO2-95% air for 96 hours in RPMI-1640 medium (10.4 g / l), which FeSO4. 7H2O (1 mg / l), ZnSO4. 7H2O (2 mg / l) Na2SeO3. 5H2O (0.017 mg / l), 1-aminoethanol (1 mg / l) human transferrin (5 mg / l), bovine serum albumin-linoleic acid conjugate (Sigma) (200 mg / l), L-glutamine (300 mg / l), Penicillin / streptomycin (100,000 units / l) and phytohemagglutinin-P (Wellcome) (2 mg / l). The supernatants were collected and centrifuged to remove the cells, concentrated by ultrafiltration (Amicon Diaflo membrane YM-10, 10 Kd cut-off) and dialyzed against 0.1 M acetic acid (Spectrapore 3 dialysis tube). The clarified, retained solution was freeze-dried.
Gel permeation chromatography
The crude fraction was reconstituted in 20 ml of 1 M acetic acid (50 mg / ml) and applied to a BioGel-P-100 column (2.6 x 88 cm) which was filled with 1 M acetic acid at a flow rate of 0.5 ml / Min. was equilibrated. 12 ml fractions were collected. An aliquot from each fraction was evaporated and tested in triplicate for growth inhibition activity (GIA) against A375 cells. The active fractions were pooled, lyophilized and rechromatographed on a Bio-Sil TSK-250 column (600 x 21.5 mm) as described.
Reverse phase high pressure chromatography of TSK-250 fractions
The final purification of the pooled TSK-250 fractions was accomplished by reverse phase HPLC, essentially as described. The PBL-derived tumor cell inhibitor was eluted from mu-Bondapak-C18 carriers at concentrations of 40 to 41% acetonitrile or 26.5% n-propanol.
Cell growth modulation test using <1> <2> <5> I-iododeoxyuridine incorporation in DNA (GIA)
These tests were performed in flat-bottomed 96-well culture dishes (Costar 3596). Human melanoma cells, A375 (4 x 10 <3>) in 50 l test sample were added to each well and incubated at 37 ° C. for 3 days. The cells were used for 24 hours <1> <2> <5> I-IdU (0.05 Ci / hole) marked and incubated for an additional 24 hours. The cells were washed three times and harvested with a multiple sample harvester and the radioactivity was counted in a gamma counter.
Results
A preparation of PBL-derived tumor cell inhibitor was subjected to automatic repetitive Edman degradation. The amino terminal amino acid sequence is the following:
EMI38.1
X represents an amino acid that has not yet been identified.
A comparison of this sequence with that of the U937 factor clearly shows the identity with the N-terminus of the PBL-derived fourth factor.
EMI39.1
In the next study, the ability of PBL-derived Oncostatin M to replicate a cell type was investigated. The L929 mouse cells were found to be insensitive to PBL-derived Oncostatin M when using up to 1000 GIA units / ml. WI26 human fibroblasts were stimulated to grow when treated with 1000 GIA units / ml. 72 hours after mitogenesis, normal human T lymphocyte proliferation was not effected at up to 500 GIA units / ml.
It is obvious from the above results that a new polypeptide and polypeptide fragments are present which can be used for the modulation of cell growth. The compounds have been found to have varying activity, depending on the nature of the cell line involved, so that they can be used as such or in conjugation with other components in modulating cell growth. The polypeptides according to the invention accordingly represent additional polypeptides which can be used with cell mixtures both in vivo and in vitro in order to reduce or increase cellular proliferation of a particular cell type.
In particular, the factor can be used to treat cells for autologous bone marrow transplants. The use of the factor inhibits the growth of tumor cells in the bone marrow and can stimulate the formation of cell colonies. Oncostatin M can also be used to stimulate epithelial cell growth, promoting wound healing. In addition, the intact polypeptides or fragments thereof can be used as immunogens to initiate antibody formation. The introduced antibodies are used to titrate Oncostatin M, which is present in a body fluid, or to modulate the activity of the factor by binding it.
Furthermore, these antibodies can be used together with purified Oncostatin M or fragments thereof as components of diagnostic equipment, in conjugation with other reagents, in particular antibodies for the qualitative and quantitative detection of Oncostatin M.
While the present invention has been described in detail by way of explanation and example for clarity and clarity, it is obvious that certain changes and modifications will come within the scope of the appended claims.