Die Erfindung betrifft einen neuen Assay auf Antikörper für Retroviren und neue Virenextrakte bzw. Isolate für die Verwendung bei dem Verfahren und insbesondere einen Virus, der dem humanen T-lymphotropen Virus verwandt ist zur Bestimmung der Anwesenheit von Antikörpern für Retroviren, insbesondere jene, die mit dem erlangten Immunmangelsyndrom (AIDS, von dem angelsächsischen Ausdruck acquired immune deficiency syndrome) assoziiert sind.
Die Wahrscheinlichkeit, dass das erlangte Immunmangelsyndrom (AIDS) durch ein infektiöses Mittel verursacht wird, ist seit einigen Jahren ersichtlich. Die Symptome dieser Krankheit wurden auf bestimmte, gut definierte Risikogruppen in einem Muster beschränkt, welches sehr wahrscheinlich macht, dass das Mittel durch Sexual- oder Blutkontakt übertragen wird. Obgleich diese Krankheit anfangs in den Vereinigten Staaten von Amerika entdeckt wurde, tritt ein erhöhtes Vorkommen der Krankheit auch sonst, einschliesslich in Europa, auf.
Eine Methode, von der man annimmt, dass durch sie die Krankheit übertragen wird, ist die Transfusion von Blut, welches von Spendern gespendet wurde, welche selbst mit Aidsvirus infiziert sind. Das Sammeln von gespendetem Blut bedeutet, dass, wenn Blut, welches von einem Spender gespendet wird, der einen Aidsvirus beherbergt, mit Proben von Blut von anderen Spendern vereinigt wird, dann das gesamte Blut und die anderen Produkte, die von diesem Pool stammen, kontaminiert sind, unabhängig davon, wie klein oder gross die Probe ist. Viele der Blutspender, welche einen Aidsvirus beherbergen, sind sich ihrer Infektion, insbesondere in den Anfangsphasen der Infektion, nicht bewusst und andere infizierte Spender werden sich, selbst wenn sie von ihrer Infektion wissen, weigern, entweder zuzugeben, dass sie die Krankheit haben oder dass sie zu einer hohen Risikogruppe gehören.
Es besteht daher ein erhöhter Bedarf für relativ einfache, aber vollständig zuverlässige Tests, gemäss denen Proben aus Blut, welches für Transfusionszwecke bestimmt ist, auf die Anwesenheit von Aidsvirus oder Antikörpern für Aidsvirus routinemässig getestet werden können. Blutspenden, die in dem Test positiv reagieren, können für Transfusionszwecke zurückgewiesen werden, und die Kontamination anderer Blutproben durch das Zusammengeben mit der kontaminierten Probe kann vermieden werden.
Die Forschung hinsichtlich der Identifizierung und Isolierung des Mittels, welches für Aids verantwortlich ist, wird seit etwa 2 Jahren aktiv betrieben. Es gibt aber zwischen den verschiedenen Forschern auf diesem Gebiet hinsichtlich der genauen Identität und Nomenklatur keine Übereinstimmung. Über einen sogenannten Aidsvirusextrakt (Isolat) wurde zuerst 1983 von Montagnier und seinen Kollegen in Frankreich berichtet, die das Material "Lymphadenopathy Associated Virus One" (LAV-1) bezeichneten. Ungefähr ein Jahr später haben Gallo und seine Kollegen in den Vereinigten Staaten Einzelheiten hinsichtlich der Isolierung eines anderen sogenannten Aidsvirus publiziert, welchen sie dann als "Human T-lymphotropic Virus Type III" (HTLVIII) bezeichneten.
Wir waren jetzt in der Lage, aus einem Lymphknotentumor ein humanes T-lymphotropes Retrovirus, welches mit HTLV-III und LAV verwandt ist, zu isolieren und welches von uns als CBL-1 bezeichnet wurde. Das CBL-1-Material ist ein stabiler Extrakt, welcher in einer Wirtszellinie gezüchtet werden kann und in einem Assay für den Nachweis von Antikörper für Aidsvirus in Serumproben verwendet werden kann.
Die Erfindung betrifft somit einen humanen T-lymphotropen Retrovirus CBL-1, der ätiologisch zu Aids verwandt ist, zur Verwendung im neuen Assay auf Antikörper für Retroviren.
Es wurde gefunden, dass CBL-1 während langer Zeiten in einer leukämischen T-Zellinie, die als CCRF-CEM bezeichnet wird und von Foley et al, Cancer 18, 522-529 (1965) beschrieben wird, gehalten werden kann, und die Erfindung betrifft weiterhin CCRF-CEM-Zellen, welche den erfindungsgemässen CBL-1-Virus beherbergen.
Für Bestätigungszwecke haben wir Proben der CCRF-CEM-Zellen, welche das erfindungsgemässe CBL-1-Virus beherbergen, bei der National (jetzt European) Collection of Animal Cell Cultures (NCACC) bei dem Public Health Laboratory Service Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 OJG England hinterlegt. Die Hinterlegungsstelle NCACC wurde als Internationale Hinterlegungsstelle gemäss dem Budapester Vertrag von 1977 anerkannt. Die Hinterlegung erfolgte am 11. Januar 1985 und erhielt die Hinterlegungsnummer 85 011 101.
Das erfindungsgemässe CBL-1-Material wurde aus Lymphozyten isoliert, die in einer Biopsie eines Lymphknotentumors eines britischen Patienten gezüchtet wurden, der auf immunoplastische Lymphoma, die mit Aids assoziiert war, behandelt wurde. Fragmente der Biopsie wurden in einem Kulturmedium gehalten, zu dem man T-Zellenwachstumsfaktor zugab, und nach etwa 2 Tagen wurden die CCRF-CEM-Zellen zu der Kultur gegeben, welche bei solchen Bedingungen gehalten wurde, dass die primären Lymphozyten im Verlauf von etwa einem Monat verschwanden, während die CCRF-CEM-Zellen sich vermehrten und chronisch mit dem CBL-1-Virus infiziert wurden.
Es wurde gezeigt, dass der CBL-1-Virus den zuvor beschriebenen Extrakten von HTLV-III verwandt ist, da er
(a) eine Umkehrtranskriptaseaktivität mit einer Präferenz für Mg<+><+>-Kationen besitzt, und ausserdem
(b) durch die Morphologie der Viruspartikel, welche durch Elektronenmikroskopie kenntlich gemacht wurde,
(c) durch indirekte Immunofluoreszenz, die für Virenantigene in CBL-1 infizierte CCRF-CEM-Zellen mit Seren, hergestellt von Aids-Patienten, spezifisch ist,
(d) durch Vergleich in dem Festphasen-Radioimmunoassay mit HTLV-III und LAV-1,
und wird somit von der taxanomischen Gruppe der Retroviridae umfasst, welche humane T-zellenlymphotrope Viren enthalten.
Eine vorläufige DNA-Sequenzanalyse zeigt, dass die Sequenz des CBL-1-Virus, obgleich sie eng mit der der anderen humanen T-lymphotropen Retroviren, die bis jetzt be schrieben wurden, verwandt ist, nicht mit der der zuvor beschriebenen Materialien identisch ist, sondern an verschiedenen Stellen eine Sequenzvariation zeigt.
Es wurde gezeigt, dass die infizierten Zellen, die beim NCACC hinterlegt wurden, kontinuierlich Viren und virale Antigene im Verlauf von mindestens 6 Monaten synthetisieren.
Obgleich gefunden wurde, dass CCRF-CEM-Zellen ein idealer Wirt für den erfindungsgemässen CBL-1-Virus ist, wurde gefunden, dass die Zellen ebenfalls verwendet werden können, um ein ähnliches Virus zu beherbergen, welches von uns aus dem peripheren Blut des gleichen Patienten, dem die Lymphknotentumorbiopsie entnommen wurde, isoliert wurde und ähnliche Viren, die von anderen Patienten, die mit Aids verwandten Viren infiziert sind, isoliert wurden. Wir haben gezeigt, dass diese Zellinie einen wertvollen Wirt für die in-vitro-Züchtung nicht nur von dem erfindungsgemässen CBL-1-Material, sondern ebenfalls von anderen verwandten Materialien ergibt.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher ein Verfahren für die Analyse einer biologischen Probe auf Antikörper für Retroviren, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man die biologische Probe in Kontakt mit
(1) einem insolubilisierten Antigen, welches Retroviren-Antigene, gebunden an Globulin, enthält, wobei das Globulin selbst an einen inerten festen Träger gebunden ist, und
(2) einem Immunoglobulin, welches einen spezifischen Antikörper für die Retroviren-Antigene enthält, und welches mit einem nicht radioaktiven Erkennungsmarkierungsmittel markiert ist, bringt und die flüssige Phase von der festen Phase trennt und die Menge an Erkennungsmarkierung, die entweder mit der flüssigen oder festen Phase assoziiert ist, bestimmt.
Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Testkit bzw. ein Testbesteck bzw. ein Testerzeugnis zur Durchführung des obigen Verfahrens, welches
(1) eine erste Komponente, die ein insolubilisiertes Antigen ist, welches Retroviren-Antigene, gebunden an Globulin, enthält, wobei das Globulin selbst an einen inerten festen Träger gebunden ist, und
(2) eine zweite Komponente, welche ein Immunoglobulin ist, welches einen spezifischen Antikörper für die Retroviren-Antigene enthält, und welches mit einem nicht radioaktiven Erkennungsmarkierungsmittel markiert ist, umfasst.
Wie oben angegeben, ist die Hauptverwendung von CBL-1 die, dass es eine Komponente in einem Testsystem für die Routineprüfung von Transfusionsblut ist, um festzustellen, ob es von einem Subjekt, welches mit Aidsvirus infiziert ist, stammt. Wir haben ein System auf der Grundlage des gleichzeitigen Konkurrenzassays unter Verwendung von immobilisierten CBL-1-Antigenen oder anderen Retrovirus-Antigenen als feste Phase und des Testserums als flüssige Phase entwickelt.
Genauer gesagt, basiert der erfindungsgemässe gleichzeitige Konkurrenzassay auf der Immobilisierung des CBL-1-Antigens oder eines anderen Retrovirus-Antigens durch seine Bindung an eine feste Phase über einen Liganden, d.h. Globu lin , und dann unterwerfen der Bindungsstellen an diesem immobilisierten Antigen einer konkurrierenden Einwirkung eines Gemisches aus Testserum-Antikörper und bekanntem Antikörper für das Aidsvirus, welcher durch das Erkennungsmittel identifiziert werden kann. Wir haben gefunden, dass die zufriedenstellendsten Ergebnisse erreicht werden können, wenn das Erkennungsmittel eine Enzymmarkierung ist. Die Verwendung einer Enzymmarkierung anstatt einer Radiomarkierung besitzt Vorteile, da die Bestrahlungsbiogefahr nicht auftritt, und eine unerwartete Konsequenz ist, dass die Assay-Immuninkubation auf 1 Stunde oder darunter verkürzt werden kann.
Eine weitere Alternative ist die Verwendung der Immunofluoreszenz zur Kenntlichmachung der Anwesenheit eines bekannten Antikörpers, der an ein immobilisiertes Antigen gebunden ist.
Wie oben angegeben, wurde gefunden, dass die besten Ergebnisse erhalten werden, wenn das Antigen an die feste Phase über einen Liganden d.h. Globulin, der ein Antikörper ist, gebunden ist.
Eine Technik ist die Verwendung eines Humanserums mit hohem Titer, welches von irgendeinem, der asymptomatisch mit Aidsvirus infiziert ist, entnommen wurde. Das ideale Serum wird einen hohen Titer an Antikörpern für Aidsvirus enthalten, wird jedoch von einem Patienten stammen, dessen Immunoglobulinwerte im Normalbereich liegen. Eine andere Möglichkeit ist die Verwendung eines monoklonalen Antikörpers, der gegenüber dem Retrovirus gezüchtet wurde. Wird dieser in an sich bekannter Weise unter Verwendung von Mäusen gezüchtet, dann können bestimmte Vorteile sichergestellt werden, wie es im folgenden genauer erläutert wird.
Das Material für die feste Phase ist zweckdienlich Polystyrol, welches in Form von Rohren, Perlen oder bevorzugt als Plättchen mit einer Vielzahl von Oberflächenwellen oder anderen Oberflächeneindrücken bzw. -vertiefungen verwendet wird. Gamma-Globulin, das aus dem ausgewählten Serum oder einem anderen Antikörper hergestellt worden ist, wird dann auf das Polystyrol aufgetragen, und das Antigen wird an das mit Globulin beschichtete Polystyrol unter Bildung der ersten Komponente des Tests gebunden. Diese Komponente kann nass oder trocken während mehrerer Monate gelagert werden.
Die zweite Komponente des Tests umfasst die IgG-Fraktion, die aus dem Testserum isoliert worden ist, und wenn die Erkennung mittels einer Enzymmarkierung erfolgt, kann diese IgG-Fraktion beispielsweise mit Meerettich-Peroxidase (HRPO) nach an sich bekannten Verfahren konjugiert werden.
Das erfindungsgemässe Testkit kann zum Vermischen der markierten IgG-Komponente mit dem Testserum und In-Kontakt-bringen des Gemisches aus IgG und Testserum mit dem insolubilisierten Antigen, Trennen der festen und flüssigen Phasen voneinander und Bestimmung des Ausmasses, gemäss dem das IgG an das Antigen gebunden wurde, verwendet werden. Entsprechend den gleichzeitigen Konkurrenz-Assays ist, je grösser das Ausmass ist, gemäss dem die IgG-Komponente der flüssigen Phase an die feste Phase gebunden ist, um so geringer die Menge an Antikörper oder Antigen in dem Testserum. Durch Auswahl geeigneter Kontrollwerte ist es daher möglich, einen Routinetest zu haben, wo, wenn HRPO als Markierungsmittel verwendet wird, das Testserum als frei von Aids-Antikörper oder Antigen angesehen werden kann, vorausgesetzt, dass die optische Dichte (OD) der Testprobe einen vorbestimmten Minimalwert erreicht.
Irgendeine Probe des Testserums, wel che eine OD-Zählung unter dem vorbestimmten Wert, der aufgezeichnet wurde, verursacht, kann daher zurückgewiesen werden, wodurch eine Transfusion mit einer Blutspende, die möglicherweise mit Aidsvirus oder Antikörper kontaminiert ist, vermieden wird.
Als Alternative zu CBL-1 als Retrovirus-Antigen in dem Assayverfahren und dem diagnostischen Testkit gemäss der vorliegenden Erfindung kann man andere Retroviren verwenden. Diese können andere humane Retroviren sein, die ätiologisch mit dem Aidsvirus, wie dem humanen T-lymphotropen Retrovirus HTLV-III oder anderen humanen Retroviren, wie dem humanen T-Leukämiavirus, HTLV-II oder HTLV-I oder tierischen Retroviren, wie dem Maedi-Visna oder Rinder-Leukosisvirus verwandt sind.
Wie es im folgenden näher erläutert wird, ergibt die indirekte Bindung von humanen Retrovirus-Antigenen an die feste Phase über das Globulin eine bestimmte Vervielfältigung der Ergebnisse, und das Testformat erlaubt eine einfache, schnelle und genaue Bestimmung auf die Anwesenheit oder Abwesenheit der Kontamination von Blutproben durch relativ wenig ausgebildete und ungeübte Techniker.
Beschreibung der Zeichnungen
Figur 1 zeigt die Festphase ELISA für Anti-HTLV-III.
In der Figur sind die optischen Dichten, die man bei einer Reihe von Tests klinischer Seren einschliesslich solcher, die für Anti-HTLV-III reaktiv und nichtreaktiv sind, sowie Ergebnisse, die zuvor durch Radioimmunoassay bekannt waren, dargestellt.
In Figur 2 sind ähnliche Ergebnisse wie in Figur 2 dargestellt, jedoch diesmal für Anti-HTLV-I, bestimmt gemäss einer ähnlichen, einstufigen, gleichzeitig konkurrierenden ELISA.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1
Isolierung und Charakterisierung von CBL-1
Der Virus CBL-1 wurde aus Lymphozyten isoliert, die aus einer Lymphknotentumorbiopsie eines britischen Patienten, der für immunoplastische Lymphoma behandelt wurde, welcher mit erlangtem Immunmangelsyndrom (AIDS) assoziiert ist, kultiviert. Die Lymphknotenbiopsie wurde in kleine Fragmente geschnitten und in ein Kulturmedium gegeben, welches aus RPMI-1640 Grundmedium, ergänzt mit 10%igem fötalem Kalbserum und 10 mu g/ml Phytohaemagglutinin, bestand. Nach 24 Stunden wurde konditioniertes Medium, welches T-Zellenwachstumsfaktor, geerntet von gemischten Kulturen aus tonsillaren Lymphozyten, enthielt, zugegeben, und das Phytohaemagglutinin wurde entfernt. 48 Stunden nach der Initiierung der Kultur wurde Antiserum für Interferon alpha zugegeben. Nach 48 Stunden wurden CCRF-CEM-Zellen (im folgenden als CEM-Zellen bezeichnet) ebenfalls zugegeben.
Die CEM-Zellen sind eine permanent wachsende leukämische T-Zellenlinie, die von Foley et al (1965) Cancer 18: 522-9 beschrieben wird.
Unter den Züchtungsbedingungen verschwinden die primären Lymphozyten im Verlauf von 4-wöchiger Kultur, während die CEM-Zellen exponentiell wuchern. Der CBL-1-Virus, produziert durch die primären Lymphozyten, infiziert die CEM-Zellen, und nach 8-wöchiger Kultur sind die CEM-Zellen chronisch mit dem CBL-1-Virus infiziert. Die Erhaltung der CBL-1-infizierten CEM-Zellen erforderte keinen T-Zellenwachstumsfaktor oder Anti-Interferon alpha. Diese CBL-1-infizierten CEM-Zellen wurden wie oben angegeben bei NCACC unter der Hinterlegungsnummer 85 011 101 hinterlegt.
Es konnte gezeigt werden, dass der CBL-1-Virus den zuvor beschriebenen Isolaten von HTLV-III/LAV verwandt ist, da es (a) eine Umkehrtranskriptaseaktivität mit einer Bevorzugung für Mg<2><+>-Kationen aufweist, durch die Morphologie der Virusteilchen, die durch Elektromikroskopie sichtbar gemacht wurden, und (b) durch indirekte Immunofluoreszenz, die für die viralen Antigene in CBL-1-infizierten CEM-Zellen mit Seren, hergestellt von Aids-Patienten, spezifisch ist, und durch Vergleich mit anderen Aidsvirusextrakten in der Festphase RIA. Die CEM/CBL-1-Zellen haben den Virus und virale Antigene im Verlauf von 6 Monaten kontinuierlich weitersynthetisiert.
Beispiel 2
1. Antigen-Herstellung
Ein rohes, gefriergetautes Zell-Lysat wird auf folgende Weise hergestellt. HT-H9-Zellen, infiziert mit HTLV-IIIB, können zu einer maximalen Dichte in einer Suspensionskultur wachsen. Die Kulturen werden auf 4 DEG C gekühlt, und 0,25% v/v beta -Propiolacton werden während 2 Stunden zugegeben. Die Zellen werden dann aus dem Kulturfluid herausgesponnen und mit niedriger Geschwindigkeit pelletisiert. Die Zellenpel lets werden erneut in destilliertem Wasser resuspendiert und drei Gefrier/Tauzyklen unterworfen. Bei jedem Zyklus wird der Rest der Zellenpellets sorgfältig resuspendiert. Nach dem dritten Zyklus wird der Extrakt auf 0,25% vol/vol mit beta -Propiolacton eingestellt und bei 4 DEG C während 2 Stunden gehalten. Er wird dann auf 37 DEG C während einer halben Stunde erwärmt. Während dieser Zeit wird der pH-Wert im Bereich von 7,4 gehalten.
Das rohe Lysat wird geklärt und bei -20 DEG C gelagert. Vor der Verwendung wird es in TRIS-Puffer, ergänzt mit 0,1% BSA und Detergens, verdünnt. Die Wahl des Detergens und seine Konzentration ist wichtig, und es wurde gefunden, dass die Verwendung von Tween 20 bei einer Konzentration von 0,1% optimal ist, wodurch die Aktivität der Antigenpräparation dreifach oder manchmal mehr verstärkt wird. Nach Verdünnung in TRIS-BSA/Tween 20 wird das Antigen 30 Minuten bei 37 DEG C inkubiert. Es ist während dieser Stufe, dass eine Antigenverstärkung auftritt.
Die Antigen-Präparation, die auf diese Weise erhalten wurde, kann verwendet werden, um die Expression von HTLV-III-Antigen bei verschiedenen definierten Kulturbedingungen zu verfolgen. Die Antigenizität kann in Festphasen-RIA unter Verwendung von Festphasen-Anti-HTLV-III und einem zweiten Reagens, welches <1><2><5>-J Anti-HTLV-III enthält, quantitativ eingeteilt werden. Bei der letzten Analyse wird das Antigen in einer Verdünnung verwendet, welche ein P-N-Verhältnis von 10:1 mit 1 bis 2% Markierungsbindung in Anwesenheit negativer Sera (vgl. im folgenden unter Assayverfahren) erlaubt. Es gab eine variable Abstossung der viralen Antigene in das überstehende Fluid der Zellen, aber in relativen Beziehungen wurde die Hauptmasse des nachweisbaren Antigens in den Zellpellets gelassen.
Dies galt für CBL-1 und für andere Isolate (Extrakte) von HTLV-III, die in CEM-Zellen oder HT-H9-Zellen getragen wurden. Es gab keine Beschränkung der Antigenreinheit (vgl. im folgenden), und es war richtig, die Antigenexpression in den Zellen zu maximieren. Die Antigen-Präparation, die hier verwendet wurde, war leicht herzustellen, vermutlich mit höherer Ausbeute pro Volumen Zellkultur als Antigen, welches aus Überstandfluid hergestellt wurde, und sie ist bei -20 DEG C stabil. Sie kann leicht durch beta -Propiolacton inaktiviert werden. Man kann ebenfalls stark erwarten, dass durch die Verwendung von Tween 20 der Titer von irgendeinem infektiösen Virus verringert wird.
2. Antisera
Das Reagens für den Assay wird aus menschlichem Serum mit hohem Titer hergestellt, welches aus Personen stammt, die asymptomatisch mit Aids-Retrovirus infiziert sind. Die Auswahl der Sera für die Reagensherstellung war wichtig. Das Serum hatte einen hohen Titer von Anti-HTLV-III gemäss RIA und kam von einem Patienten, dessen Immunoglobulingehalte im Normalbereich lagen. In der Praxis ist es im allgemeinen erforderlich, Reagenzien von einer kleinen Zahl Seren herzustellen, die die obigen Kriterien erfüllen, und das Wirken der Reagenzien in dem Assay zu prüfen. Damit diese Reagenzien nichtinfektiös sind, werden die als Ausgangsmaterial verwendeten Sera durch Erhitzen bei 56 DEG C während 30 Minuten behandelt.
(a) Herstellung von Anti-HTLV-IIIB-Globulin
Dieses Material wird zur in-situ-Reinigung an einem Festphasen-HTLV-IIIB-Antigen verwendet. In dieser Strategie liegen beachtliche Vorteile. Globulin von wärmebehandeltem Serum wird zweimal mit 40% gesättigtem Ammoniumsulfat präzipitiert. Dies ist das einfachste Reagens für die Globulinbeschichtung, durch die es möglich ist, entweder Gesamtserum oder gereinigtes IgG zu verwenden. Das Globulin wurde mit einer optimalen Verdünnung verwendet, welche durch individuelle Titration des Reagenses bestimmt werden muss. Das Festphasenmaterial war Polystyrol in Form von Wells bzw. kleinen Schälchen und wurde mit Globulin beschichtet. Die freien Bindungsstellen wurden dann mit einem inerten Protein - in diesem Fall 0,1% Rinderserumalbumin (BSA) - abgeschreckt bzw. abgebunden. Die beschichtete und abgeschreckte feste Phase wurde nass bei 4 DEG C während Monaten gelagert.
Ein Trocknen ergab ein noch stabileres Produkt. Zum Beschichten der festen Phase wurde HT-H9/HTLV-IIIB-Lysat, wie oben beschrieben, in TRIS-BSA-Tween-Puffer bis zu einer Verdünnung, welche, in nachfolgenden Testen, die Möglichkeit ergab, dass 1 bis 2% der Markierung an negatives Serum gebunden wurde, verdünnt. Die Beschichtung wurde am wirksamsten während einer 2tägigen Inkubation des Antigens bei Raumtemperatur in fester Phase und anschliessender Nasslagerung bei 4 DEG C bis zur Verwendung erreicht. Vorversuche zeigten, dass die feste Phase in dieser Form während mehrerer Monate stabil ist. Sie kann jedoch ebenfalls ohne signifikanten Verlust der Potenz getrocknet werden und verbleibt während mehrerer Monate stabil.
(b) Markierung von Globulin
Das in 2(a) oben beschriebene IgG wird mit HRPO unter Verwendung von heterobifunktionellen Derivaten in üblicher Weise konjugiert, wobei man ein molares Substitutionsverhältnis von 1:3 erhält. Dieses Material wurde in Assoziation mit der oben in 2(a) beschriebenen festen Phase in einem Enzymimmunoassay für den Nachweis von Antikörper für Aids-Retroviren in Proben von Körperflüssigkeiten verwendet.
Für Vergleichszwecke wurde eine weitere Probe des IgG mit <1><2><5>-J bis zu einer spezifischen Aktivität von 15 mu Ci pro mu g Protein markiert.
Beispiel 3
Einstufige Konkurrenz-ELISA für Anti-CEM/CBL-1-Serumreagenzien
Ein humanes Serum, welches einen hohen Titer an Anti-HTLV-III enthielt, wurde für die Herstellung von beschichtetem Globulin, wie zuvor in Beispiel 2.2 beschrieben, verwendet. Polystyrol-Schälchen mit rundem Boden werden mit einer optimalen Verdünnung von Globulin beschichtet und dann mit einem inerten Protein, in diesem Fall 0,1% BSA, abgeschreckt bzw. abgebunden. Das gleiche Serum wird als Quelle für Immunoglobulin verwendet, welches durch Ionenaustauschchromatographie an DE 52, wie zuvor beschrieben, gereinigt wurde. IgG wurde mit Meerettich-Peroxidase bei einem ungefähren Substitutionsverhältnis von 3 Molekülen Meerettich-Peroxidase pro 1 Molekül IgG gekuppelt.
Die Wirkung des Konjugats wird bestimmt durch Inkubation über Schälchen, die zuvor mit einem indirekten Antikörper mit Virus-Antigenen, welche von HTLV-III infizierten Zellen stammen, und mit Antigenen nichtinfizierten Zellen beschichtet waren. Die optimale Verdünnung des Konjugats wurde als die genommen, bei der man eine maximale Farbbindung mit dem infizierten Zell-Antigen und eine minimale Farbbindung mit den nichtinfizierten Zellen erhält.
CEM/CBL-1-Antigen
Zellen, welche dauernd mit CEM/CBL-1-Virus infiziert sind, wurden bis zur maximalen Dichte in nichthaftenden Rührkulturen gezüchtet. Die Rührkulturen werden auf 4 DEG C abgekühlt und dann auf 0,25% Volumen mit beta -Propiolacton gebracht. Nach 2stündiger Inkubation bei 4 DEG C werden die Zellpellets geerntet und den Gefrier- und Auftauzyklen unterworfen und dann, wie zuvor beschrieben, durch Zentrifugieren geklärt. Der Gewebekulturextrakt wird dann mittels weiterer 2 Stunden Inkubation bei 4 DEG C mit 0,25% beta -Propiolacton behandelt und dann wie zuvor hydrolysiert. In diesem Fall ist das Verdünnungsmittel für die Zellaufbrechung und den Gefrier-Auftauzyklus phosphatgepuffertes Salz, welches mit 0,1% Tween 20 ergänzt ist. Die Antigen-Präparationen werden anschliessend an einer festen Phase titriert, welche mit hohem Titer Anti-HTLV-III-Globulin beschichtet ist.
Die Verdünnung, welche einen OD 450 nm zwischen 1,0 und 1,2 bei den im folgenden definierten Bedingungen ergab, wurde als Arbeitsverdünnung für den darauffolgenden Test verwendet.
Optimierung und Format bzw. Grösse der Tests
Schälchen, die mit Globulin mit hohem Titer beschichtet sind und anschliessend abgebunden bzw. abgeschreckt wurden, werden mit 100 mu l einer optimalen Verdünnung von CEM/CBL-1-Antigen inkubiert. Nach einer über-Nacht-Inkubation bei Raumtemperatur werden die Antigenextrakte von den Schälchen abgewaschen, welche dann bei solchen Bedingungen getrocknet wurden, von denen gefunden wurde, dass sie die Stabilität immobilisierter CEM/CBL-1-Virusantigene aktivieren. Zum Testen werden 25 mu l antikörperpositives- und antikörpernegatives Serum in getrennte Schälchen gegeben und 75 mu l ELISA-Konjugat in detergensergänztem destilliertem Wasser werden zu den Schälchen gegeben. Das Gemisch aus Testserum und Konjugat wird in den Schälchen während unterschiedlicher Zeiten bei unterschiedlichen Bedingungen (Immuninkubation) inkubiert.
Die Schälchen werden dann dreimal mit SalzlösungTween (0,8% Natriumchloridlösung, ergänzt mit 0,1% Tween 20) gewaschen. Nach drei Waschvorgängen werden die Schälchen mit Salz-Tween gefüllt und können während 2 Minuten bei Raumtemperatur die Feuchtigkeit aufnehmen. Danach wird der Waschvorgang mit drei Waschzyklen wiederholt. Danach werden 100 mu l Chromogensubstrat, in diesem Fall 3, 3 min , 5, 5 min -Tetramethylbenzidin (TMB) zugegeben. Nach 20minütiger Inkubation bei Raumtemperatur wird die Chromogenfreigabe durch Zugabe von 50 mu l von 4 normaler Schwefelsäure beendigt. Die Farbstofffreigabe wurde spektrophotometrisch bei 450 nm gemessen.
Die Arbeitsverdünnung von irgendeinem besonderen CEM/CBL-1-Antigen wird als die Verdünnung angenommen, bei der man zuverlässig eine optische Dichte zwischen 1 und 1,2 mit negativem Serum erhält, wenn es bei ELISA unter optimalen Bedingungen, definiert als Immuninkubation von 1 Stunde bei 45 DEG C, verwendet wurde.
Ergebnisse
Ein Vergleich zwischen den Ergebnissen, die man bei dem an sich bekannten RIA unter Verwendung einer festen Phase und <1><2><5>-J-markiertem IgG, beschrieben wie in Beispiel 2, erhält und den ELISA-Ergebnissen, die man bei diesem Beispiel erhält, werden zwei unerwartete Vorteile erkennbar, die zu Gunsten von ELISA sprechen. Erstens erhält man bei suboptimalen Antigen-Präparationen, welche in RIA schlechte Ergebnisse geben, beim gleichen Titer gute Ergebnisse bei ELISA. Zweitens ist es, wie in der Tabelle erläutert wird, mit RIA nicht möglich, die Inkubationszeiten unter 3 Stunden zu verringern.
Es besteht aber ein Bedarf für einen schnellen Assay, d.h. 1 bis 2 Stunden insgesamt, bei der Transfusionsdurchführung, und dies ist nur mit ELISA möglich.
<tb><TABLE> Columns=5
<tb>Title: Tabelle
<tb>Head Col 01 to 05 AL=L: Zeit/Temperaturversuche in RIA mit <125>-J-markiertem IgG
<tb>SubHead Col 01 AL=L>Zeit/Std.:
<tb>SubHead Col 02 AL=L>Temperatur:
<tb>SubHead Col 03 to 05 AL=L:
Kontrollsera
<tb>SubHead Col 03 AL=L>Negativ:
<tb>SubHead Col 04 AL=L>Abgekürzt
(Cutoff):
<tb>SubHead Col 05 AL=L>Positiv:
<tb> <SEP>18 <SEP>Ü <SEP>1,13* <SEP>0,28 <SEP>0,08
<tb> <SEP>3 <SEP>Ü RT <SEP>0,37 <SEP>0,19 <SEP>0,1
<tb> <SEP>2 <SEP>Ü <SEP>0,30 <SEP>0,18 <SEP>0,09
<tb> <SEP>1 <SEP>Ü <SEP>0,34 <SEP>0,15 <SEP>0,1
<tb> <SEP>3 <SEP>Ü <SEP>0,43 <SEP>0,15 <SEP>0,11
<tb> <SEP>2 <SEP>Ü 37 DEG C <SEP>0,43 <SEP>0,19 <SEP>0,09
<tb> <SEP>1 <SEP>Ü <SEP>0,28 <SEP>0,18 <SEP>0,12
<tb> <SEP>3 <SEP>Ü <SEP>0,45 <SEP>0,14 <SEP>0,06
<tb> <SEP>2 <SEP>Ü 45 DEG C <SEP>0,40 <SEP>0,14 <SEP>0,07
<tb> <SEP>1 <SEP>Ü <SEP>0,27 <SEP>0,13 <SEP>0,05
* % Bindung beim Inputwert.
<tb></TABLE>
In der Figur 2 sind die Ergebnisse des Tests mit ELISA für 56 klinische Seren dargestellt, die in diesem Fall von haemophilen Patienten stammen, und mit im Handel erhältlichen und nichterhältlichen Faktor-VIII-Konzentration behandelt wurden und von Homosexuellen stammen. Aus der Figur ist klar erkennbar, dass eine klare Trennung zwischen Seren, die für Anti-CEM/ CBL-1 reaktiv sind, und nichtreaktiven Seren vorhanden ist.
In diesem besonderen Beispiel ist die mittlere optische Dichte von 16 Seren, die reaktiv für CEM/CBL-1-Antikörper sind, 0,085 (0,037 bis 0,327), und die mittlere optische Dichte für 40 Seren, die für diesen Antikörper nicht reaktiv sind, beträgt 1,16 (0,738 bis 1,352). Das Serum a stammt vonn einem terminal kranken Aids-Patienten und ist schwach reaktiv bei IF und den direkten Bindungsassays. Die Seren b und c sind beim erneuten Testen nicht reaktiv.
Es wurde genau das gleiche Format in einem Überblick der Bluttransfusionsseren in Grossbritannien verwendet. Bis zum heutigen Zeitpunkt wurden über 12000 Seren von Spendern geprüft. 3 Seren ergaben Screen-Testreaktionen, jedoch fand man beim erneuten Testen, dass nur ein einziger Spender reaktiv war. Das Serum war wiederholt reaktiv, war titrierbar und demonstrierte eine starke Reaktivität bei der Immunofluoreszenz gegenüber infizierten, aber nicht gegenüber nichtinfizierten Zellen. Die Random-Reaktivität von Seren, welche in keiner Beziehung zu CEM/CBL-1-Infektionen standen, war dementsprechend extrem niedrig. Darauffolgende Versuche für die Titration von Seren, welche reaktiv für Anti-HTLV III waren, zeigten, dass die Titer breit die gleichen sind, wenn sie sowohl gemäss dem CEM/CBL-1-ELISA als auch gemäss den direkten Assays geprüft werden.
Dies wurde durch die darauffolgende Prüfung der Seren, die von Patienten entnommen wurden, welche eine akute Seroconversion nach der primären HTLV-III-Infektion hatten, bestätigt. Wieder war hier grob kein Unterschied im Gehalt oder zum Zeitpunkt der Anfangsreaktivität sowohl bei dem direkten Bindungsassay noch bei dem Konkurrenz-ELISA. Unter Verwendung des gleichen Assays waren Seren von Patienten mit oligo- und panreaktiven Anti-Lymphozyt-Antikörpern und Seren von Patienten mit Autoimmunkrankheiten bei dem glei chen Konkurrenz-ELISA nicht aktiv. Zusammengefasst zeigen diese Werte an, dass die Spezifizität und Empfindlichkeit dieses Konkurrenz-ELISAs für Antikörper für den Aids verwandten Retrovirus hoch sind.
Beispiel 4
Einstufige Konkurrenz-ELISA für Anti-HTLV-I
Seren und Reagenzien werden auf gleiche Weise, wie bei dem CEM/CBL-1-Immunoassay von Beispiel 3, ausgewählt und hergestellt, mit der Ausnahme, dass Zellen, die mit HTLV-I infiziert sind, für die Antigen-Präparation, und Seren von Patienten, die mit HTLV-I infiziert sind, als Quelle für die Reagenzien verwendet werden. In der Figur 3 ist die optische Dichte dargestellt, die man bei 32 klinischen Seren einschliesslich drei bekannter schwach positiver Kontrollen erhält. Es tritt ein klarer Unterschied zwischen reaktiven und nichtreaktiven Seren auf, wobei die mittlere optische Dichte von 5 reaktiven Seren für diesen Antikörper 0,099 (0,060 bis 0,129) und die mittlere optische Dichte für 24 Seren, die nicht für diesen Antikörper reaktiv sind, 1,64 (1,48 bis 1,83) betragen. Der Test war robust und die Bedingungen können in der Praxis variiert werden.
Es wurde jedoch entschieden, dass man eine Immunoinkubation von 1 Stunde bei 45 DEG C als optimal ansieht. Dies ist parallel zu den Bedingungen für den Nachweis von CEM/CBL-1-Antikörper.
Der Test wurde im gleichen Format verwendet, um über 1000 nichtausgewählte britische Blutspender zu untersuchen, und es wurden keine reaktiven Seren identifiziert. Im Gegensatz dazu gab eine selektive Prüfung von etwa 75 Spendern aus Afrika und der Karibik einen einzigen Donor, der zum ersten Mal seropositiv war.
Das obige Verfahren wurde wiederholt unter Verwendung von Seren von Patienten, die mit HTLV-II infiziert waren, als Quelle für die Beschichtung mit Globulin und als Quelle für IgG. Die mit HTLV-II infizierten Zellen wurden als Antigenquelle verwendet. Diese Reagenzien werden auf gleiche Weise, wie zuvor im Beispiel 2 für Anti-HTLV-III-RIA beschrieben, ausgewählt und hergestellt.
Beispiel 5
Herstellung und Verwendung eines Testkits (bzw. Testbesteck bzw. Testerzeugnis - im folgenden wird der Ausdruck Kit verwendet)
1. Reagenzien
Eine Polystyrolplatte mit vielen Ausbuchtungen (eine Multiwellplatte), welche 96 Ausbuchtungen enthielt, wurde mindestens auf der Innenoberfläche der Ausbuchtungen mit gereinigtem, in der Wärme behandeltem Antikörper für CBL-1 beschichtet. Der Antikörper stammt aus einem in der Wärme behandelten Serum eines Menschen, welcher mit Aids-Retrovirus infiziert war. Nach dem Beschichten des Polystyrols mit dem Antikörper werden die freien Bindungsstellen mit einem inerten Protein abgeschreckt bzw. abgebunden, in diesem Fall Rinderserumalbumin. Das für die Insolubilisierung auf den Polystyrolplatten verwendete Antigen war CBL-1. Diese wurde zuerst mit dem vericiden beta -Propiolacton behandelt, und dann wurde eine Suspension von inaktiviertem CBL-1 in TRIS-BSA-Tween-Puffer mit dem behandelten Polystyrol während etwa 2 Tagen bei Raumtemperatur inkubiert.
Auf diese Weise wurde das CBL-1 durch indirekte Bindung an den Polystyrolträger über den Antikörper insolubilisiert. Diese Komponente ist die erste Komponente des Testkits.
Die zweite Komponente des Testkits wird hergestellt, indem man den gleichen humanen Antikörper, welcher zur Beschichtung des Polystyrols, wie oben beschrieben, verwendet wurde, markierte. Der Antikörper wurde durch Konjugation mit Meerettich-Peroxidase (HRPO) unter Verwendung an sich bekannter Konjugationsverfahren markiert. Der mit HRPO markierte Antikörper wird in einem gefriergetrockneten Zustand gelagert und unmittelbar vor der Verwendung mit einer Suspension in einem wässrigen Verdünnungsmittel rekonstituiert.
Zusätzlich zu den beiden oben erwähnten Komponenten ist es bevorzugt, in dem Testkit Hilfsreagenzien vorzusehen, so dass alle notwendigen Erkennungsreagenzien und Kontrollreagenzien verfügbar sind. Für diesen Kit, bei dem HRPO als Markierung verwendet wird, ist es zweckdienlich, 3, 3 min , 5, 5 min -Tetramethylbenzidin (TMB) als Substrat für das Enzym zu verwenden, und das TMB wurde in Tablettenform zur Verfügung gestellt, wobei jede Tablette ein ausreichendes Substrat für die 96 Ausbuchtungen ergab. Unmittelbar vor der Verwendung werden die TMB-Tabletten in einer wässrigen Lösung, welche tri-Natriumcitrat und Wasserstoffperoxid enthält, gelöst. Es ist ebenfalls bevorzugt, positive und negative Kontrollseren vorzusehen. Das negative Kontrollserum ist normales humanes Serum, das für den Antikörper für CBL-1 bei diesem Test nicht reaktiv ist.
Das positive Kontrollserum ist in der Wärme behandeltes Humanserum, welches für Antikörper für CBL-1 bei dem Testverfahren reaktiv ist. Zusätzlich ist es bevorzugt, ein verkürztes Kontrollserum, ein wärmebehandeltes Humanserum (das an den verkürzten Gehalt im Test) für Antikörper CBL-1 reaktiv ist, und ebenfalls eine Waschlösung, welche Salz und Tween 20 enthält, vorzusehen.
2. Verwendung des Testkits
Unmittelbar vor der Verwendung wird der HRPO-markierte Antikörper rekonstituiert. Der Versuch wird unter Verwendung von 25 Mikroliter Proben von Serum pro Ausbuchtung durchgeführt. Zwei Ausbuchtungen werden mit negativem Kontrollserum und eine mit positivem Kontrollserum beschickt, drei mit verkürztem Kontrollserum (der Ausdruck verkürzt bezieht sich auf den angelsächsischen Ausdruck "cut-off") und die Testproben werden in die verbleibenden Ausbuchtungen gefüllt. 75 Mikroliter Teile des rekonstituierten HRPO-markierten Antikörpers werden in jede Ausbuchtung gegeben, und die Platte mit den Ausbuchtungen wird dann bedeckt und auf einem Heizblock bei 45 DEG C während 1 Stunde oder alternativ bei 20 bis 25 DEG C über Nacht während mindestens 16 Stunden Inkubation inkubiert.
Gegen Ende der Inkubationszeit wird die Platte gewaschen, und 100 Mikroliter Teile der Substratlösung werden zu jeder Ausbuchtung gegeben. Die Platte wird dann bei 20 Minuten bei 18 bis 25 DEG C inkubiert. Danach entwickelt sich eine blaue Farbe in den Ausbuchtungen, die negative Proben enthalten. 50 Mikroliter Teile von 2M Schwefelsäure werden dann zu jeder Ausbuchtung gegeben, und die blaue Farbe ändert sich zu gelb. Die Absorption jeder Ausbuchtung bei 450 nm wird innerhalb von 30 Minuten nach der Zugabe von Schwefelsäure unter Verwendung eines Ablesegeräts für eine Platte mit Mikroausbuchtungen abgelesen.
3. Ergebnisse
Die Ergebnisse werden auf folgende Weise erhalten. Die mittlere Absorption der drei verkürzten Kontrollsera wird berechnet. Irgendeine Probe, die eine Absorption zeigt, welche gleich oder grösser ist wie die des mittleren verkürzten Kontrollwerts, wird als negativer Antikörper für Aids-Retrovirus innerhalb der Grenzen des Testsystems angesehen. Irgendwelche Proben mit einer Absorption unterhalb von der der mittleren verkürzten Vergleichsprobe oder bis zu 10% über der der mittleren verkürzten Vergleichsprobe wurden erneut geprüft.
Irgendwelche Seren, die wiederholt in diesem Test positive Ergebnisse gaben, wurden dann für Bestätigungszwecke unter Verwendung des Immunofluoreszenztests oder Western-Blottingtests erneut geprüft.
Das oben beschriebene Verfahren wurde mit 1600 Routine-Blutbank-Spenderproben mit negativen Ergebnissen getestet. Wurden jedoch andere klinische Proben von Patienten mit klinischer Diagnose von Aids einem Aids verwandten Komplex oder anderen Krankheiten getestet, so erhielt man positive Ergebnisse, und in praktisch jedem Fall erfolgte eine Bestätigung durch den Immunofluoreszenztest und durch einen anderen Enzymimmunoassay.
Man erhielt die folgenden Ergebnisse.
<tb><TABLE> Columns=4
<tb>Title: Tabelle
<tb>Head Col 01 to 04 AL=L: Reaktivität für Seren von Blutspendern und Patienten mit Aids, Aids assoziierten Bedingungen und anderen Krankheiten
<tb>SubHead Col 01 AL=L>Klinische Gruppe:
<tb>SubHead Col 02 AL=L>Zahl der Proben:
<tb>SubHead Col 03 AL=L>Antikörper positiv mittels dem Testkit:
<tb>SubHead Col 04 AL=L>Es wurde bestätigt, dass der Antikörper positiv ist<a>:
<tb> <SEP>Blutspender <SEP>1600 <SEP>0 <SEP>-
<tb> <SEP>AIDS <SEP>4 <SEP>4 <SEP>4
<tb> <SEP>AIDS verwandter Komplex <SEP>39 <SEP>39 <SEP>39
<tb> <SEP>Hohe Risikogruppen <SEP>7 <SEP>7 <SEP>7
<tb> <SEP>Andere Krankheiten<b>
<tb> <SEP>Infektiöse Mononucleose <SEP>48 <SEP>0 <SEP>-
<tb> <SEP>Hepatitis B <SEP>25 <SEP>3<c> <SEP>2
<tb> <SEP>Syphilis <SEP>117 <SEP>2 <SEP>2
<tb> <SEP>Rheumatische Arthritis <SEP>9 <SEP>0 <SEP>-
<tb> <SEP>Andere Infektionen<d> <SEP>37 <SEP>0 <SEP>-
<a> Die Bestätigungstests schliessen Immunofluoreszenz und einen anderen Enzymimmunoassay ein.
<b> Es wurden nur positive Proben bestätigt.
<c> Eine Probe positiv bei 2 oder 4 Testverfahren; bestätigt negativ.
<d> Schliesst Rubella (18 Fälle), Parvovirus (9), Cytomegalovirus (5), Toxoplasmose (5) ein.
<tb></TABLE>
Das Prinzip der Verwendung eines humanen Antiserums für die Bindung von viralem Antigen an die feste Phase ergibt eine feste Phase, die selbst das Muster der viralen Antigene reflektiert. Dies wurde bei Menschen am besten erkannt. Dies kann von Vorteil sein, da hierbei ein gutes "Passen" zwischen dem Gemisch der eingefangenen bzw. erhaltenen Antigene und dem Profil der humanen Antikörper erhalten wird. Weiterhin können die milden Bedingungen, die zur Antigen-Herstellung verwendet wurden, die Konservierung delikater bzw. komplizierter, unförmiger Epitope erlauben, die in dem Gradienten der gereinigten und zerstörten Präparationen, welche bei anderen Festphasenassays verwendet werden, nicht vorhanden sind.
Es ist jetzt möglich, das Gemisch aus Festphasen-Antigenen einzustellen, indem man die feste Phase mit monoklonalem Murin-Antikörper definierter Spezifizität beschichtet, so dass die immobilisierten Antigene eine vorbestimmte Spezifizität aufweisen.
Die hier gezeigten Werte zeigen die überlegene Natur des Tests, wenn ein ausgewählter monoklonaler Antikörper, der mit p25 (einem 25 K Dalton Protein) reagiert, an der festen Phase verwendet wird. Die Vorteile liegen in der geringeren Menge des Antigens, die für einen geeigneten Assay erforderlich ist (Tabelle A) und in der erhöhten Empfindlichkeit des entstehenden Tests, vergleiche Tabelle B, wo gezeigt wird, dass die Endpunktverdünnungen (d.h. niedrige OD-Ablesungen) der individuellen Seren eine höhere Inhibierung bei den monoklonalen, verglichen mit den polyklonalen Tests ergeben. Die Erhöhung der Empfindlichkeit bewirkt, dass der Test wirksamer im Nachweis für Antikörperproduktion ist, verglichen mit vielen anderen Assays.
Zusätzlich vermeidet die Verwendung von Murin-Antikörper an der festen Phase das potentielle Problem der rheumatoidartigen Faktoren-Kreuzvernetzung zwischen festem Phasen Human-IgG und Human-IgG-Konjugat in dem homologen Assay. Praktisch wurden wenige Sera identifiziert, welche konsistent einen grösseren Grad der Inhibierung bei dem Assay auf monoklonaler Grundlage zeigen, verglichen mit dem Assay auf polyklonaler Grundlage. Dieses Phänomen beruht wahrscheinlich auf dem geringen Gehalt und der niedrigen Titerreaktivität, welche Konjugate an die feste Phase in nicht spezifischer Weise nur in dem homologen Assay bindet.
Dies oder ein ähnliches Phänomen kann ebenfalls eine weitere unerwartete Tatsache erklären, dass die Verteilung der optischen Dichtereaktivität der normalen Seren wesentlich enger in dem Assay auf monoklonaler Grundlage ist als bei dem gleichzeitig durchgeführten polyklonalen Assay.
Da es sich als einfach erwiesen hat, einen monoklonalen Antikörper für ein retrovirales gag-Genprodukt zu verwenden, erhält man im wesentlichen einen Konkurrenzassay für die humane Anti-HTLV-III-Kernantwort, und es ist wahrscheinlich, dass die Verwendung von Antikörper für definierte env-Produkte die Entwicklung analoger Assays für Antikörper für ausgewählte Envelope-Antigene erlaubt.
Dies wird eine wesentlich genauere Untersuchung der humanen Antwort auf unterschiedliche Virus-Antigene erlauben, welches von Wichtigkeit bei klinischen, prognostischen und Infektions-Kontrolluntersuchungen sein kann.
<tb><TABLE> Columns=7
<tb>Title: Tabelle A
<tb>Head Col 01 to 07 AL=L: Titration von CEM/CBL-1-Antigen an polyklonalen und monoklonalen festen Phasen.
<tb>SubHead Col 01 AL=L>Antigenverdünnung:
<tb>SubHead Col 02 to 07 AL=L: Beschichtung der festen Phase
<tb>SubHead Col 02 to 04 AL=L: Polyklonal
<tb>SubHead Col 05 to 07 AL=L:
Monoklonal
<tb>SubHead Col 02 AL=L>neg.:
<tb>SubHead Col 03 AL=L>verkürzt*:
<tb>SubHead Col 04 AL=L>pos.:
<tb>SubHead Col 05 AL=L>neg.:
<tb>SubHead Col 06 AL=L>verkürzt:
<tb>SubHead Col 07 AL=L>pos.:
<tb> <SEP>10 <SEP>1,34** <SEP>0,69 <SEP>0,05 <SEP>NT <SEP>NT <SEP>NT
<tb> <SEP>20*** <SEP>1,14 <SEP>0,45 <SEP>0,03 <SEP>1,85 <SEP>0,86 <SEP>0,11
<tb> <SEP>30 <SEP>0,82 <SEP>0,42 <SEP>0,03 <SEP>NT <SEP>NT <SEP>NT
<tb> <SEP>40 <SEP>NT <SEP>NT <SEP>NT <SEP>1,50 <SEP>0,37 <SEP>0,09
<tb> <SEP>60 <SEP>NT <SEP>NT <SEP>NT <SEP>1,36 <SEP>0,38 <SEP>0,08
<tb> <SEP>80 <SEP>NT <SEP>NT <SEP>NT <SEP>1,23 <SEP>0,28 <SEP>0,07
<tb> <SEP>100 <SEP>NT <SEP>NT <SEP>NT*** <SEP>1,18 <SEP>0,27 <SEP>0,07
* verkürzt - schwach positiv Vergleich
** OD bei 450 nm im Standardbedingungstest für Anti-CEM/CBL-1
*** "Arbeits"-Titer für die Antigen-Präparation
NT = nicht getestet
<tb></TABLE>
<tb><TABLE>
Columns=4
<tb>Title: Tabelle B
<tb>Head Col 01 to 04 AL=L: OD 450 nm Verdünnung von 19 Sera, titriert auf 50% Inhibierungs-Endpunkt, geprüft mit polyklonaler und monoklonaler fester Phase.
<tb>SubHead Col 01 to 02 AL=L: Serum
<tb>SubHead Col 03 to 04 AL=L: Beschichtung der festen Phase
<tb>SubHead Col 03 AL=L>Polyklonal:
<tb>SubHead Col 04 AL=L>Monoklonal:
<tb> <SEP>Vergleich positiv <SEP>0,08 <SEP>0,09
<tb> <SEP>Verkürzt <SEP>0,76 <SEP>0,55
<tb> <SEP>Negativ <SEP>1,39 <SEP>1,42
<tb> <SEP>Haemophil <SEP>1 <SEP>1,08 <SEP>0,86
<tb> <SEP>2 <SEP>0,95 <SEP>0,77
<tb> <SEP>3 <SEP>1,01 <SEP>0,77
<tb> <SEP>4 <SEP>1,04 <SEP>0,74
<tb> <SEP>Aids <SEP>1 <SEP>0,63 <SEP>0,48
<tb> <SEP>2 <SEP>0,93 <SEP>0,71
<tb> <SEP>3 <SEP>0,85 <SEP>0,52
<tb> <SEP>4 <SEP>0,70 <SEP>0,56
<tb> <SEP>PGL
(persistent allgemeine Lymphadenopathie) <SEP>1 <SEP>0,84 <SEP>0,62
<tb> <SEP>2 <SEP>0,84 <SEP>0,58
<tb> <SEP>3 <SEP>0,73 <SEP>0,56
<tb> <SEP>4 <SEP>0,60 <SEP>0,48
<tb> <SEP>Drogenabhängig <SEP>1 <SEP>0,50 <SEP>0,44
<tb> <SEP>2 <SEP>0,66 <SEP>0,50
<tb> <SEP>3 <SEP>0,95 <SEP>0,73
<tb> <SEP>4 <SEP>0,85 <SEP>0,63
<tb> <SEP>Gesund <SEP>1 <SEP>0,50 <SEP>0,41
<tb> <SEP>2 <SEP>0,56 <SEP>0,42
<tb> <SEP>3 <SEP>0,69 <SEP>0,49
<tb></TABLE>
In den obigen Beispielen wird der Assay durch Bestimmung der Markierung, die mit der festen Phase assoziiert ist, durchgeführt. Da jedoch auch der Markierungsgehalt, der mit dem Ausgangsserum assoziiert ist, bestimmt werden kann, ist es ebenfalls möglich, die Reduktion in der radioaktiven Zählung oder dem Enzymgehalt, der mit der flüssigen Phase assoziiert ist, nachdem ein bekanntes markiertes Serum und die Testseren in Kontakt mit dem Festphasen-Antigen gebracht wurden, und die Verringerung in dem Gehalt der Markierung der flüssigen Phase, die als Mass für den Antikörpergehalt im Testserum verwendet wird, zu bestimmen.
Die Vorteile des gleichzeitigen Konkurrenzassays können unter den folgenden Überschriften zusammengefasst werden.
Antigenherstellung
Obgleich in Beispiel 2 die Verwendung gereinigter HTLV-III-Viren beschrieben wird, erlaubt die verstärkte Bindung, die durch die Verwendung des immobilisierten Antikörpers kommt, die Verwendung einer rohen Zell-Lysatpräparation zum Beschichten, wenn sie alleine vorliegt, wobei ein solches Antigen nicht direkt auf irgendwelche nützliche Weise an eine feste Phase bindet. Diese Stufe entfernt die Beschränkung, dass hochgereinigtes Antigen für die Herstellung diagnostischer Tests verwendet werden muss, und dadurch wird ihre Herstellung leichter. Dies ist ein Vorteil, welcher für die direkten Assays nicht anwendbar ist, wo eine gesamte humane Globulinbeschichtung ein nicht vermeidbares Signal mit der fertigen Anti-Human-Globulinmarkierung ergeben würde.
Format bzw. Grösse
Die Verwendung eines Volumens an nichtverdünntem Serum bietet einen grossen Vorteil für Bluttransfusionszentren, wo, wenn eine Anfangsverdünnung erforderlich wäre, die Arbeitsbelastung grösser wäre. Das Verhältnis zwischen Serum und enzymmarkiertem Volumen kann innerhalb des Bereiches von 1:1 bis 1:10 mit nur geringer Änderung in dem Testergebnis variiert werden. Das Optimum beträgt 1:3, wobei 25 mu l Serum und 75 mu l Enzymmarkierung verwertet werden, und man erhält eine gute Differenzierung zwischen positiven und negativen Seren. Die Assayzeit kann auf 1 Stunde oder weniger unter Verwendung der ELISA-Technik verkürzt werden.
Empfindlichkeit
Ein Mass für die Empfindlichkeit irgendeines Assays für Aids-Antikörper wird durch das Verhältnis der Seren, die aus terminal kranken Patienten mit Aids entnommen werden müssen, welches positiv verbleibt, bestimmt. Bei direkten Assays scheint es so zu sein, dass eine unterschiedliche Zahl der Patienten ihre Antikörperreaktivität verlieren. Dies tritt nicht bei dem Konkurrenzassay auf, was nahelegt, dass die Empfindlichkeit des Konkurrenzassays so gut oder besser ist wie die eines der derzeit verwendeten Assays.
Spezifizität
Von einem Konkurrenzassay erwartet man nicht, dass grosse Probleme bei einer falschen positiven Reaktivität auftritt. Der Einschluss von Lymphozyt-Membran-Antigenen in den Envelope von HTLV-Virionen führt sicher zur falschen Reaktivität, wie die Anwesenheit von Aggregaten von IgG, welche nicht spezifisch an der festen Phase kleben. Ein solches Phänomen ergibt keine Erhöhung der Reaktivität bei dem Konkurrenzassay. Nichtspezifische Affekte variabler Proteinkonzentrationen können durch Auswahl geeigneter Serum/Markierungsverhältnisse (1:3, wie oben) minimal gehalten werden und durch Verwendung der Verkürzung von über 50% Inhibierung. Sera, welche eine Inhibierung von Markierungsbindung gleich oder grösser als das des inneren Kontrollserums ergeben, werden als Screen-Test positiv angesehen. Der Test sollte jedoch wiederholt werden.
Aufgrund der niedrigen Werte für falsche Reaktivität, die auf unter 1 bei 5000 angenommen wird, ist es unwahrscheinlich, dass falsche positive Reaktionen bei dem Konkurrenz-ELISA numerisch grosse Schwierigkeiten ergeben, wie dies bei anderen direkten Assays der Fall ist. Dies gilt insbesondere dort, wo die direkten Assays ohne Kontroll-Antigen durchgeführt werden. Man nimmt an, dass dies bei Transfusionszentren der Fall sein wird, da die Verwendung von Kontroll-Antigen die Erfordernisse für Reagenzien beim direkten Assay verdoppeln würden.
Zusammenfassung
Die Kombination eines einfachen Formats, hoher Empfindlichkeit und hoher Spezifizität bewirkt, dass der Konkurrenzassay ideal für die Screenung von Blutspenden und für diagnostische Verwendung geeignet ist. Zusätzlich kann er dort, wo Zentren einen direkten Assay für Anti-HTLV-III verwenden, besser sein, um die Serumreaktivität zu bestimmen für die Retestung im Konkurrenzassay, anstatt dass man die Seren den arbeitsaufwendigeren und weniger empfindlichen Western-Blotting-Tests unterwirft, die von der FDA in den Vereinigten Staaten empfohlen werden.
The invention relates to a new assay for antibodies for retroviruses and new virus extracts or isolates for use in the method and in particular to a virus which is related to the human T-lymphotropic virus for determining the presence of antibodies for retroviruses, in particular those which are associated with the acquired immune deficiency syndrome (AIDS, from the Anglo-Saxon term acquired immune deficiency syndrome).
The likelihood that the acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) is caused by an infectious agent has been evident for some years. The symptoms of this disease have been limited to certain well-defined risk groups in a pattern that makes it very likely that the drug will be transmitted through sexual or blood contact. Although this disease was initially discovered in the United States, an increased incidence of the disease is occurring elsewhere, including in Europe.
One method that is believed to transmit the disease is the transfusion of blood donated by donors who are themselves infected with the AIDS virus. Collecting donated blood means that if blood donated by a donor harboring an AIDS virus is combined with samples of blood from other donors, then all of the blood and other products derived from that pool will be contaminated regardless of how small or large the sample is. Many of the blood donors harboring an AIDS virus are not aware of their infection, especially in the early stages of the infection, and other infected donors, even if they know about their infection, will refuse to either admit that they have the disease or that they belong to a high risk group.
There is therefore an increased need for relatively simple but completely reliable tests according to which samples from blood, which is intended for transfusion purposes, can be routinely tested for the presence of AIDS virus or antibodies for AIDS virus. Blood donations that are positive in the test can be rejected for transfusion purposes, and contamination of other blood samples by combining them with the contaminated sample can be avoided.
Research into the identification and isolation of the agent responsible for AIDS has been active for about 2 years. However, there is no agreement between the various researchers in this field regarding the exact identity and nomenclature. A so-called AIDS virus extract (isolate) was first reported in 1983 by Montagnier and his colleagues in France, who called the material "Lymphadenopathy Associated Virus One" (LAV-1). About a year later, Gallo and his colleagues in the United States published details regarding the isolation of another so-called AIDS virus, which they then called "Human T-lymphotropic Virus Type III" (HTLVIII).
We were now able to isolate from a lymph node tumor a human T-lymphotropic retrovirus, which is related to HTLV-III and LAV, and which we called CBL-1. The CBL-1 material is a stable extract that can be grown in a host cell line and used in an assay for the detection of antibodies to AIDS virus in serum samples.
The invention thus relates to a human T-lymphotropic retrovirus CBL-1, which is etiologically related to AIDS, for use in the new assay for antibodies to retroviruses.
It has been found that CBL-1 can be maintained for long periods in a leukemic T cell line called CCRF-CEM and described by Foley et al, Cancer 18, 522-529 (1965) and the invention furthermore relates to CCRF-CEM cells which harbor the CBL-1 virus according to the invention.
For confirmation purposes, we have samples of the CCRF-CEM cells, which harbor the CBL-1 virus according to the invention, at the National (now European) Collection of Animal Cell Cultures (NCACC) at the Public Health Laboratory Service Center for Applied Microbiology and Research, Filed Porton Down, Salisbury, Wiltshire, SP4 OJG England. The NCACC depository was recognized as an international depositary under the 1977 Budapest Treaty. The deposit was made on January 11, 1985 and received the deposit number 85 011 101.
The CBL-1 material of the invention was isolated from lymphocytes grown in a biopsy of a British patient's lymph node tumor treated for immunoplastic lymphoma associated with AIDS. Fragments of the biopsy were kept in a culture medium to which T cell growth factor was added, and after about 2 days, the CCRF-CEM cells were added to the culture, which was maintained under conditions such that the primary lymphocytes were grown in about one Disappeared for months as the CCRF-CEM cells proliferated and became chronically infected with the CBL-1 virus.
The CBL-1 virus has been shown to be related to the HTLV-III extracts previously described because it
(a) reverse transcriptase activity with a preference for Mg <+> <+> - has cations, and also
(b) by the morphology of the virus particles, which was identified by electron microscopy,
(c) by indirect immunofluorescence, which is specific for virus antigens in CBL-1 infected CCRF-CEM cells with sera, produced by AIDS patients,
(d) by comparison in the solid phase radioimmunoassay with HTLV-III and LAV-1,
and is thus included in the taxanomic group of the Retroviridae, which contain human T cell lymphotropic viruses.
Preliminary DNA sequence analysis shows that the sequence of the CBL-1 virus, although closely related to that of the other human T-lymphotropic retroviruses described so far, is not identical to that of the materials previously described, but shows a sequence variation at different points.
The infected cells deposited with the NCACC have been shown to continuously synthesize viruses and viral antigens for at least 6 months.
Although it was found that CCRF-CEM cells are an ideal host for the CBL-1 virus according to the invention, it was found that the cells can also be used to harbor a similar virus, which we have from the peripheral blood of the same Patient from whom the lymph node tumor biopsy was taken and similar viruses isolated from other patients infected with AIDS-related viruses. We have shown that this cell line yields a valuable host for in vitro cultivation not only from the CBL-1 material according to the invention but also from other related materials.
The present invention therefore relates to a method for the analysis of a biological sample for antibodies for retroviruses, which is characterized in that the biological sample is in contact with
(1) an insolubilized antigen containing retrovirus antigens bound to globulin, the globulin itself being bound to an inert solid support, and
(2) an immunoglobulin, which contains a specific antibody for the retrovirus antigens and which is labeled with a non-radioactive recognition label, and separates the liquid phase from the solid phase and the amount of the identification label associated with either the liquid or solid Phase associated is determined.
The invention also relates to a test kit or a test kit or a test product for carrying out the above method, which
(1) a first component which is an insolubilized antigen which contains retrovirus antigens bound to globulin, the globulin itself being bound to an inert solid support, and
(2) a second component which is an immunoglobulin which contains a specific antibody for the retroviral antigens and which is labeled with a non-radioactive recognition label.
As stated above, the main use of CBL-1 is that it is a component in a test system for routine transfusion blood testing to determine if it is from a subject infected with the AIDS virus. We have developed a system based on the simultaneous competition assay using immobilized CBL-1 antigens or other retrovirus antigens as the solid phase and the test serum as the liquid phase.
More specifically, the simultaneous competition assay according to the invention is based on the immobilization of the CBL-1 antigen or another retrovirus antigen by its binding to a solid phase via a ligand, i.e. Globulin, and then the binding sites on this immobilized antigen compete with a mixture of test serum antibody and known antibody for the AIDS virus, which can be identified by the detection means. We have found that the most satisfactory results can be achieved if the recognition agent is an enzyme label. Using an enzyme label instead of a radiolabel has advantages in that there is no radiation biohazard and an unexpected consequence is that the assay immune incubation can be reduced to 1 hour or less.
Another alternative is to use immunofluorescence to indicate the presence of a known antibody bound to an immobilized antigen.
As indicated above, it has been found that the best results are obtained when the antigen is attached to the solid phase via a ligand i.e. Globulin, which is an antibody.
One technique is to use a high titer human serum taken from anyone asymptomatically infected with the AIDS virus. The ideal serum will contain a high titer of antibodies to AIDS virus, but will come from a patient whose immunoglobulin levels are in the normal range. Another option is to use a monoclonal antibody raised against the retrovirus. If this is bred in a manner known per se using mice, then certain advantages can be ensured, as will be explained in more detail below.
The material for the solid phase is expediently polystyrene, which is used in the form of tubes, beads or, preferably, as platelets with a large number of surface waves or other surface impressions or depressions. Gamma globulin made from the selected serum or other antibody is then applied to the polystyrene and the antigen is bound to the globulin coated polystyrene to form the first component of the test. This component can be stored wet or dry for several months.
The second component of the test comprises the IgG fraction which has been isolated from the test serum, and if the detection is carried out by means of enzyme labeling, this IgG fraction can be conjugated with horseradish peroxidase (HRPO), for example, according to methods known per se.
The test kit according to the invention can be used to mix the labeled IgG component with the test serum and bring the mixture of IgG and test serum into contact with the insolubilized antigen, separate the solid and liquid phases from one another and determine the extent to which the IgG is attached to the antigen was used. According to the simultaneous competition assays, the greater the extent to which the IgG component of the liquid phase is bound to the solid phase, the lower the amount of antibody or antigen in the test serum. By selecting suitable control values, it is therefore possible to have a routine test where, when HRPO is used as a labeling agent, the test serum can be considered free of AIDS antibody or antigen, provided that the optical density (OD) of the test sample is a predetermined one Minimum value reached.
Any sample of the test serum that causes an OD count below the predetermined value that was recorded can therefore be rejected, thereby avoiding transfusion with a blood donation that may be contaminated with AIDS virus or antibodies.
As an alternative to CBL-1 as a retrovirus antigen in the assay method and diagnostic test kit according to the present invention, other retroviruses can be used. These can be other human retroviruses which are etiologically linked to the AIDS virus, such as the human T-lymphotropic retrovirus HTLV-III or other human retroviruses, such as the human T-leukemia virus, HTLV-II or HTLV-I or animal retroviruses, such as the Maedi- Visna or bovine leukosis virus are related.
As will be explained in more detail below, the indirect binding of human retrovirus antigens to the solid phase via the globulin results in a certain duplication of the results, and the test format allows simple, quick and accurate determination of the presence or absence of contamination of blood samples by relatively little trained and inexperienced technicians.
Description of the drawings
Figure 1 shows the solid phase ELISA for anti-HTLV-III.
The figure shows the optical densities obtained in a series of tests on clinical sera, including those that are reactive and nonreactive for anti-HTLV-III, and results previously known from radioimmunoassay.
FIG. 2 shows results similar to FIG. 2, but this time for anti-HTLV-I, determined according to a similar, one-stage, simultaneously competing ELISA.
The following examples illustrate the invention.
example 1
Isolation and characterization of CBL-1
The CBL-1 virus was isolated from lymphocytes cultured from a British patient's lymph node tumor biopsy treated for immunoplastic lymphoma associated with acquired immunodeficiency syndrome (AIDS). The lymph node biopsy was cut into small fragments and placed in a culture medium consisting of RPMI-1640 basic medium supplemented with 10% fetal calf serum and 10 μg / ml phytohaemagglutinin. After 24 hours, conditioned medium containing T cell growth factor harvested from mixed cultures of tonsillar lymphocytes was added and the phytohaemagglutinin was removed. Antiserum for interferon alpha was added 48 hours after initiation of the culture. After 48 hours, CCRF-CEM cells (hereinafter referred to as CEM cells) were also added.
The CEM cells are a permanently growing leukemic T cell line described by Foley et al (1965) Cancer 18: 522-9.
Under the culture conditions, the primary lymphocytes disappear over the course of 4 weeks of culture, while the CEM cells grow exponentially. The CBL-1 virus, produced by the primary lymphocytes, infects the CEM cells, and after 8 weeks of culture, the CEM cells are chronically infected with the CBL-1 virus. Preservation of the CBL-1 infected CEM cells did not require a T cell growth factor or anti-interferon alpha. These CBL-1 infected CEM cells were deposited with NCACC under the accession number 85 011 101 as indicated above.
The CBL-1 virus has been shown to be related to the isolates of HTLV-III / LAV described above, since (a) it has reverse transcriptase activity with a preference for Mg <2> <+> - Cations, by the morphology of the virus particles, which were visualized by electromicroscopy, and (b) by indirect immunofluorescence, which is used for the viral antigens in CBL-1-infected CEM cells with sera, produced by AIDS patients , is specific, and by comparison with other AIDS virus extracts in the solid phase RIA. The CEM / CBL-1 cells have continuously synthesized the virus and viral antigens over the course of 6 months.
Example 2
1. Antigen production
A raw, freeze-thawed cell lysate is made in the following manner. HT-H9 cells infected with HTLV-IIIB can grow to maximum density in a suspension culture. The cultures are cooled to 4 ° C. and 0.25% v / v beta-propiolactone are added over 2 hours. The cells are then spun out of the culture fluid and pelletized at low speed. The cell pellets are resuspended in distilled water and subjected to three freeze / thaw cycles. With each cycle, the rest of the cell pellets are carefully resuspended. After the third cycle, the extract is adjusted to 0.25% vol / vol with beta-propiolactone and kept at 4 ° C. for 2 hours. It is then heated to 37 ° C. for half an hour. During this time the pH is kept in the 7.4 range.
The crude lysate is clarified and stored at -20 ° C. Before use, it is diluted in TRIS buffer supplemented with 0.1% BSA and detergent. The choice of detergent and its concentration is important and it has been found that the use of Tween 20 is optimal at a concentration of 0.1%, which increases the activity of the antigen preparation three times or sometimes more. After dilution in TRIS-BSA / Tween 20, the antigen is incubated at 37 ° C. for 30 minutes. It is during this stage that antigen enhancement occurs.
The antigen preparation obtained in this way can be used to monitor the expression of HTLV-III antigen under various defined culture conditions. Antigenicity can be determined in solid-phase RIA using solid-phase anti-HTLV-III and a second reagent, which <1> <2> <5> -J Anti-HTLV-III contains, can be classified quantitatively. In the last analysis, the antigen is used in a dilution which allows a P-N ratio of 10: 1 with 1 to 2% label binding in the presence of negative sera (see below under the assay method). There was variable rejection of the viral antigens into the supernatant fluid from the cells, but in relative relationships the bulk of the detectable antigen was left in the cell pellets.
This was true for CBL-1 and other HTLV-III isolates (extracts) carried in CEM cells or HT-H9 cells. There was no restriction on antigen purity (see below) and it was right to maximize antigen expression in the cells. The antigen preparation used here was easy to make, presumably with higher yield per volume of cell culture than antigen made from supernatant fluid, and is stable at -20 ° C. It can easily be inactivated by beta propiolactone. One can also strongly expect that using Tween 20 will reduce the titer of any infectious virus.
2. Antisera
The reagent for the assay is made from high titer human serum derived from individuals asymptomatically infected with AIDS retrovirus. The choice of sera for reagent production was important. The serum had a high titer of anti-HTLV-III according to RIA and came from a patient whose immunoglobulin levels were in the normal range. In practice, it is generally necessary to prepare reagents from a small number of sera that meet the above criteria and to test the activity of the reagents in the assay. So that these reagents are non-infectious, the sera used as starting material are treated by heating at 56 ° C. for 30 minutes.
(a) Preparation of anti-HTLV-IIIB globulin
This material is used for in-situ purification on a solid phase HTLV-IIIB antigen. There are considerable advantages in this strategy. Globulin from heat-treated serum is precipitated twice with 40% saturated ammonium sulfate. This is the simplest globulin coating reagent that makes it possible to use either whole serum or purified IgG. The globulin was used with an optimal dilution, which must be determined by individual titration of the reagent. The solid phase material was polystyrene in the form of wells or small bowls and was coated with globulin. The free binding sites were then quenched or bound with an inert protein - in this case 0.1% bovine serum albumin (BSA). The coated and quenched solid phase was stored wet at 4 ° C. for months.
Drying gave an even more stable product. To coat the solid phase, HT-H9 / HTLV-IIIB lysate was, as described above, in TRIS-BSA-Tween buffer to a dilution which, in subsequent tests, gave the possibility that 1 to 2% of the label was bound to negative serum, diluted. The coating was most effectively achieved during a 2-day incubation of the antigen at room temperature in the solid phase and subsequent wet storage at 4 ° C. until use. Preliminary tests showed that the solid phase in this form is stable for several months. However, it can also be dried without significant loss of potency and remains stable for several months.
(b) labeling of globulin
The IgG described in Figure 2 (a) above is conjugated to HRPO using heterobifunctional derivatives in a conventional manner to give a 1: 3 molar substitution ratio. This material was used in association with the solid phase described above in Figure 2 (a) in an enzyme immunoassay for the detection of antibodies to AIDS retroviruses in body fluid samples.
Another IgG sample was used for comparison <1> <2> <5> -J labeled up to a specific activity of 15 mu Ci per mu g protein.
Example 3
Single stage competitor ELISA for anti-CEM / CBL-1 serum reagents
A human serum containing a high titer of anti-HTLV-III was used to produce coated globulin as described in Example 2.2 above. Polystyrene bowls with a round bottom are coated with an optimal dilution of globulin and then quenched or set with an inert protein, in this case 0.1% BSA. The same serum is used as a source of immunoglobulin, which was purified by ion exchange chromatography on DE 52 as previously described. IgG was coupled with horseradish peroxidase at an approximate substitution ratio of 3 molecules of horseradish peroxidase per 1 molecule of IgG.
The effect of the conjugate is determined by incubation on dishes which were previously coated with an indirect antibody with virus antigens derived from HTLV-III infected cells and with antigens not infected cells. The optimal dilution of the conjugate was taken to be that at which maximum color binding with the infected cell antigen and minimal color binding with the uninfected cells were obtained.
CEM / CBL-1 antigen
Cells permanently infected with the CEM / CBL-1 virus were grown to maximum density in non-adherent stir cultures. The stirring cultures are cooled to 4 ° C. and then brought to 0.25% volume with beta-propiolactone. After 2 hours of incubation at 4 ° C., the cell pellets are harvested and subjected to the freezing and thawing cycles and then, as described above, clarified by centrifugation. The tissue culture extract is then treated by means of a further 2 hour incubation at 4 ° C. with 0.25% beta-propiolactone and then hydrolyzed as before. In this case, the diluent for cell disruption and the freeze-thaw cycle is phosphate-buffered salt, which is supplemented with 0.1% Tween 20. The antigen preparations are then titrated on a solid phase which is coated with a high titer of anti-HTLV-III globulin.
The dilution which gave an OD 450 nm between 1.0 and 1.2 under the conditions defined below was used as the working dilution for the subsequent test.
Optimization and format or size of the tests
Small dishes coated with high-titer globulin that were subsequently set or quenched are incubated with 100 μl of an optimal dilution of CEM / CBL-1 antigen. After an overnight incubation at room temperature, the antigen extracts are washed away from the dishes, which are then dried under conditions that have been found to activate the stability of immobilized CEM / CBL-1 virus antigens. For testing, 25 μl of antibody-positive and antibody-negative serum are added to separate dishes and 75 μl of ELISA conjugate in detergent-supplemented distilled water are added to the dishes. The mixture of test serum and conjugate is incubated in the dishes for different times under different conditions (immune incubation).
The dishes are then washed three times with Tween saline (0.8% sodium chloride solution supplemented with 0.1% Tween 20). After three washes, the bowls are filled with salt tween and can absorb the moisture for 2 minutes at room temperature. The washing process is then repeated with three washing cycles. Then 100 μl of chromogen substrate, in this case 3, 3 min, 5, 5 min tetramethylbenzidine (TMB) are added. After 20 minutes of incubation at room temperature, the chromogen release is stopped by adding 50 μl of 4 normal sulfuric acid. The dye release was measured spectrophotometrically at 450 nm.
The working dilution of any particular CEM / CBL-1 antigen is believed to be the dilution that reliably obtains an optical density between 1 and 1.2 with negative serum when used under ELISA under optimal conditions, defined as 1 hour immuno-incubation at 45 ° C was used.
Results
A comparison between the results obtained in the known RIA using a solid phase and <1> <2> <5> -J-labeled IgG obtained as described in Example 2, and the ELISA results obtained in this example reveal two unexpected advantages that speak in favor of ELISA. First, suboptimal antigen preparations that give poor results in RIA give good results with the same titer in ELISA. Second, as explained in the table, it is not possible with RIA to reduce the incubation times to less than 3 hours.
However, there is a need for a rapid assay, i.e. 1 to 2 hours in total when performing the transfusion, and this is only possible with ELISA.
<tb> <TABLE> Columns = 5
<tb> Title: table
<tb> Head Col 01 to 05 AL = L: Time / temperature tests in RIA with <125> -J-labeled IgG
<tb> SubHead Col 01 AL = L> time / hour:
<tb> SubHead Col 02 AL = L> Temperature:
<tb> SubHead Col 03 to 05 AL = L:
Control sera
<tb> SubHead Col 03 AL = L> Negative:
<tb> SubHead Col 04 AL = L> Abbreviated
(Cutoff):
<tb> SubHead Col 05 AL = L> Positive:
<tb> <SEP> 18 <SEP> Ü <SEP> 1.13 * <SEP> 0.28 <SEP> 0.08
<tb> <SEP> 3 <SEP> Ü RT <SEP> 0.37 <SEP> 0.19 <SEP> 0.1
<tb> <SEP> 2 <SEP> Ü <SEP> 0.30 <SEP> 0.18 <SEP> 0.09
<tb> <SEP> 1 <SEP> Ü <SEP> 0.34 <SEP> 0.15 <SEP> 0.1
<tb> <SEP> 3 <SEP> Ü <SEP> 0.43 <SEP> 0.15 <SEP> 0.11
<tb> <SEP> 2 <SEP> Ü 37 DEG C <SEP> 0.43 <SEP> 0.19 <SEP> 0.09
<tb> <SEP> 1 <SEP> Ü <SEP> 0.28 <SEP> 0.18 <SEP> 0.12
<tb> <SEP> 3 <SEP> Ü <SEP> 0.45 <SEP> 0.14 <SEP> 0.06
<tb> <SEP> 2 <SEP> Ü 45 DEG C <SEP> 0.40 <SEP> 0.14 <SEP> 0.07
<tb> <SEP> 1 <SEP> Ü <SEP> 0.27 <SEP> 0.13 <SEP> 0.05
*% Binding at the input value.
<tb> </TABLE>
FIG. 2 shows the results of the ELISA test for 56 clinical sera, which in this case originate from hemophilic patients and were treated with commercially available and unavailable factor VIII concentration and originate from homosexuals. It is clearly evident from the figure that there is a clear separation between sera which are reactive for anti-CEM / CBL-1 and non-reactive sera.
In this particular example, the mean optical density of 16 sera that are reactive for CEM / CBL-1 antibodies is 0.085 (0.037 to 0.327) and the mean optical density for 40 sera that are not reactive for this antibody 1.16 (0.738 to 1.352). Serum a comes from a terminally ill AIDS patient and is weakly reactive in IF and direct binding assays. Sera b and c are not reactive when tested again.
The exact same format was used in an overview of blood transfusion sera in the UK. To date, over 12,000 sera from donors have been tested. 3 sera gave screen test responses, however, when tested again, it was found that only one donor was reactive. The serum was repeatedly reactive, was titratable and demonstrated a strong reactivity in immunofluorescence to infected but not to uninfected cells. The random reactivity of sera unrelated to CEM / CBL-1 infections was accordingly extremely low. Subsequent experiments for titration of sera that were reactive to anti-HTLV III showed that the titers are broadly the same when tested according to both the CEM / CBL-1 ELISA and the direct assays.
This was confirmed by subsequent screening of sera taken from patients who had acute seroconversion after primary HTLV-III infection. Again there was roughly no difference in content or at the time of initial reactivity in either the direct binding assay or the competitor ELISA. Using the same assay, sera from patients with oligo- and pan-reactive anti-lymphocyte antibodies and sera from patients with autoimmune diseases were not active in the same competitor ELISA. In summary, these values indicate that the specificity and sensitivity of this competitive ELISA for antibodies to the AIDS-related retrovirus is high.
Example 4
Single-stage competition ELISA for anti-HTLV-I
Sera and reagents are selected and prepared in the same manner as in the CEM / CBL-1 immunoassay of Example 3, except that cells infected with HTLV-I are used for the antigen preparation, and sera from Patients infected with HTLV-I can be used as the source for the reagents. FIG. 3 shows the optical density which is obtained with 32 clinical sera including three known weakly positive controls. There is a clear difference between reactive and non-reactive sera, with the mean optical density of 5 reactive sera for this antibody 0.099 (0.060 to 0.129) and the mean optical density for 24 sera that are not reactive for this antibody 1.64 (1.48 to 1.83). The test was robust and the conditions can be varied in practice.
However, it was decided that an immuno-incubation of 1 hour at 45 ° C. was considered optimal. This is in parallel with the conditions for the detection of CEM / CBL-1 antibodies.
The test was used in the same format to screen over 1000 unselected British blood donors and no reactive sera were identified. In contrast, a selective screening of approximately 75 donors from Africa and the Caribbean gave a single donor that was seropositive for the first time.
The above procedure was repeated using sera from patients infected with HTLV-II as a source of globulin coating and a source of IgG. The cells infected with HTLV-II were used as the source of the antigen. These reagents are selected and prepared in the same manner as previously described in Example 2 for Anti-HTLV-III-RIA.
Example 5
Production and use of a test kit (or test kit or test product - the term kit is used below)
1. Reagents
A polystyrene plate with many bulges (a multiwell plate), which contained 96 bulges, was coated at least on the inner surface of the bulges with purified, heat-treated antibody for CBL-1. The antibody comes from a heat-treated human serum infected with AIDS retrovirus. After the polystyrene has been coated with the antibody, the free binding sites are quenched or bound with an inert protein, in this case bovine serum albumin. The antigen used for the insolubilization on the polystyrene plates was CBL-1. This was first treated with the vericidal beta-propiolactone, and then a suspension of inactivated CBL-1 in TRIS-BSA-Tween buffer was incubated with the treated polystyrene for about 2 days at room temperature.
In this way, the CBL-1 was insolubilized by indirect binding to the polystyrene support via the antibody. This component is the first component of the test kit.
The second component of the test kit is made by labeling the same human antibody used to coat the polystyrene as described above. The antibody was labeled by conjugation with horseradish peroxidase (HRPO) using known conjugation techniques. The antibody labeled with HRPO is stored in a freeze-dried state and reconstituted with a suspension in an aqueous diluent immediately before use.
In addition to the two components mentioned above, it is preferred to provide auxiliary reagents in the test kit so that all the necessary detection reagents and control reagents are available. For this kit, using HRPO as a label, it is convenient to use 3, 3 min, 5, 5 min tetramethylbenzidine (TMB) as the substrate for the enzyme, and the TMB has been provided in tablet form, each Tablet provided sufficient substrate for the 96 bulges. Immediately before use, the TMB tablets are dissolved in an aqueous solution containing trisodium citrate and hydrogen peroxide. It is also preferred to provide positive and negative control sera. The negative control serum is normal human serum, which is not reactive for the antibody for CBL-1 in this test.
The positive control serum is heat treated human serum which is reactive for antibodies to CBL-1 in the test procedure. In addition, it is preferred to provide a truncated control serum, a heat-treated human serum (which is reactive to the truncated content in the test) for CBL-1 antibodies, and also a wash solution containing salt and Tween 20.
2. Use of the test kit
The HRPO-labeled antibody is reconstituted immediately prior to use. The test is carried out using 25 microliter samples of serum per bulge. Two bulges are loaded with negative control serum and one with positive control serum, three with shortened control serum (the shortened term refers to the Anglo-Saxon term "cut-off") and the test samples are filled into the remaining bulges. 75 microliters of the reconstituted HRPO-labeled antibody are placed in each well and the plate with the wells is then covered and placed on a heating block at 45 ° C for 1 hour or alternatively at 20 to 25 ° C overnight for at least 16 hours of incubation incubated.
Towards the end of the incubation period, the plate is washed and 100 microliter portions of the substrate solution are added to each bulge. The plate is then incubated at 18 to 25 ° C. for 20 minutes. Then a blue color develops in the bulges that contain negative samples. 50 microliter parts of 2M sulfuric acid are then added to each bulge and the blue color changes to yellow. The absorbance of each bulge at 450 nm is read within 30 minutes after the addition of sulfuric acid using a microbump plate reader.
3. Results
The results are obtained in the following way. The mean absorption of the three shortened control sera is calculated. Any sample showing an absorption equal to or greater than that of the mean truncated control value is considered a negative antibody to AIDS retrovirus within the limits of the test system. Any samples with an absorption below that of the medium shortened control sample or up to 10% above that of the medium shortened control sample were tested again.
Any sera that repeatedly gave positive results in this test were then retested for confirmation purposes using the immunofluorescence test or Western blotting test.
The procedure described above was tested on 1600 routine blood bank donor samples with negative results. However, when other clinical specimens from patients with a clinical diagnosis of AIDS, an AIDS-related complex or other diseases were tested, positive results were obtained and confirmation was obtained in almost every case by the immunofluorescence test and by another enzyme immunoassay.
The following results were obtained.
<tb> <TABLE> Columns = 4
<tb> Title: table
<tb> Head Col 01 to 04 AL = L: reactivity for sera from blood donors and patients with AIDS, AIDS-related conditions and other diseases
<tb> SubHead Col 01 AL = L> Clinical group:
<tb> SubHead Col 02 AL = L> Number of samples:
<tb> SubHead Col 03 AL = L> Antibody positive using the test kit:
<tb> SubHead Col 04 AL = L> It was confirmed that the antibody is positive <a>:
<tb> <SEP> blood donor <SEP> 1600 <SEP> 0 <SEP> -
<tb> <SEP> AIDS <SEP> 4 <SEP> 4 <SEP> 4
<tb> <SEP> AIDS related complex <SEP> 39 <SEP> 39 <SEP> 39
<tb> <SEP> High risk groups <SEP> 7 <SEP> 7 <SEP> 7
<tb> <SEP> Other diseases <b>
<tb> <SEP> Infectious mononucleosis <SEP> 48 <SEP> 0 <SEP> -
<tb> <SEP> hepatitis B <SEP> 25 <SEP> 3 <c> <SEP> 2
<tb> <SEP> syphilis <SEP> 117 <SEP> 2 <SEP> 2
<tb> <SEP> rheumatoid arthritis <SEP> 9 <SEP> 0 <SEP> -
<tb> <SEP> other infections <d> <SEP> 37 <SEP> 0 <SEP> -
<a> The confirmation tests include immunofluorescence and another enzyme immunoassay.
<b> Only positive samples were confirmed.
<c> One sample positive in 2 or 4 test procedures; confirmed negative.
<d> Includes Rubella (18 cases), Parvovirus (9), Cytomegalovirus (5), Toxoplasmosis (5).
<tb> </TABLE>
The principle of using a human antiserum for the binding of viral antigen to the solid phase results in a solid phase which itself reflects the pattern of the viral antigens. This was best recognized in humans. This can be advantageous, since a good "fit" is obtained between the mixture of the captured or obtained antigens and the profile of the human antibodies. Furthermore, the mild conditions used to produce the antigen may allow preservation of delicate or complex, bulky epitopes that are not present in the gradient of the purified and destroyed preparations used in other solid phase assays.
It is now possible to adjust the mixture of solid phase antigens by coating the solid phase with murine monoclonal antibody of defined specificity so that the immobilized antigens have a predetermined specificity.
The values shown here demonstrate the superior nature of the test when a selected monoclonal antibody that reacts with p25 (a 25 K dalton protein) is used on the solid phase. The advantages lie in the lower amount of antigen required for a suitable assay (Table A) and the increased sensitivity of the resulting test, see Table B, where it is shown that the endpoint dilutions (ie low OD readings) of the individual Sera showed a higher inhibition in the monoclonal compared to the polyclonal tests. Increasing the sensitivity makes the test more effective in detecting antibody production compared to many other assays.
In addition, the use of murine antibody on the solid phase avoids the potential problem of rheumatoid factor cross-linking between solid phases human IgG and human IgG conjugate in the homologous assay. In practice, few sera have been identified that consistently show a greater degree of inhibition in the monoclonal-based assay compared to the polyclonal-based assay. This phenomenon is probably due to the low content and low titer reactivity, which binds conjugates to the solid phase in a non-specific manner only in the homologous assay.
This or a similar phenomenon can also explain another unexpected fact that the distribution of optical density reactivity of the normal sera is much narrower in the monoclonal-based assay than in the concurrent polyclonal assay.
Since it has been found to be easy to use a monoclonal antibody for a retroviral gag gene product, one essentially obtains a competitive assay for the core human anti-HTLV-III response, and it is likely that the use of antibodies for defined env -Products allowed the development of analog assays for antibodies for selected envelope antigens.
This will allow a much more accurate investigation of the human response to different virus antigens, which can be important in clinical, prognostic, and infection control studies.
<tb> <TABLE> Columns = 7
<tb> Title: Table A
<tb> Head Col 01 to 07 AL = L: Titration of CEM / CBL-1 antigen on polyclonal and monoclonal solid phases.
<tb> SubHead Col 01 AL = L> Antigen dilution:
<tb> SubHead Col 02 to 07 AL = L: coating of the solid phase
<tb> SubHead Col 02 to 04 AL = L: polyclonal
<tb> SubHead Col 05 to 07 AL = L:
Monoclonal
<tb> SubHead Col 02 AL = L> neg .:
<tb> SubHead Col 03 AL = L> shortened *:
<tb> SubHead Col 04 AL = L> pos .:
<tb> SubHead Col 05 AL = L> neg .:
<tb> SubHead Col 06 AL = L> shortened:
<tb> SubHead Col 07 AL = L> pos .:
<tb> <SEP> 10 <SEP> 1.34 ** <SEP> 0.69 <SEP> 0.05 <SEP> NT <SEP> NT <SEP> NT
<tb> <SEP> 20 *** <SEP> 1.14 <SEP> 0.45 <SEP> 0.03 <SEP> 1.85 <SEP> 0.86 <SEP> 0.11
<tb> <SEP> 30 <SEP> 0.82 <SEP> 0.42 <SEP> 0.03 <SEP> NT <SEP> NT <SEP> NT
<tb> <SEP> 40 <SEP> NT <SEP> NT <SEP> NT <SEP> 1.50 <SEP> 0.37 <SEP> 0.09
<tb> <SEP> 60 <SEP> NT <SEP> NT <SEP> NT <SEP> 1.36 <SEP> 0.38 <SEP> 0.08
<tb> <SEP> 80 <SEP> NT <SEP> NT <SEP> NT <SEP> 1.23 <SEP> 0.28 <SEP> 0.07
<tb> <SEP> 100 <SEP> NT <SEP> NT <SEP> NT *** <SEP> 1.18 <SEP> 0.27 <SEP> 0.07
* shortened - weak positive comparison
** OD at 450 nm in the standard condition test for Anti-CEM / CBL-1
*** "Working" titers for antigen preparation
NT = not tested
<tb> </TABLE>
<tb> <TABLE>
Columns = 4
<tb> Title: Table B
<tb> Head Col 01 to 04 AL = L: OD 450 nm dilution of 19 sera, titrated for 50% inhibition endpoint, tested with polyclonal and monoclonal solid phase.
<tb> SubHead Col 01 to 02 AL = L: serum
<tb> SubHead Col 03 to 04 AL = L: coating of the solid phase
<tb> SubHead Col 03 AL = L> Polyclonal:
<tb> SubHead Col 04 AL = L> Monoclonal:
<tb> <SEP> comparison positive <SEP> 0.08 <SEP> 0.09
<tb> <SEP> Shortened <SEP> 0.76 <SEP> 0.55
<tb> <SEP> negative <SEP> 1.39 <SEP> 1.42
<tb> <SEP> Haemophile <SEP> 1 <SEP> 1.08 <SEP> 0.86
<tb> <SEP> 2 <SEP> 0.95 <SEP> 0.77
<tb> <SEP> 3 <SEP> 1.01 <SEP> 0.77
<tb> <SEP> 4 <SEP> 1.04 <SEP> 0.74
<tb> <SEP> AIDS <SEP> 1 <SEP> 0.63 <SEP> 0.48
<tb> <SEP> 2 <SEP> 0.93 <SEP> 0.71
<tb> <SEP> 3 <SEP> 0.85 <SEP> 0.52
<tb> <SEP> 4 <SEP> 0.70 <SEP> 0.56
<tb> <SEP> PGL
(persistent general lymphadenopathy) <SEP> 1 <SEP> 0.84 <SEP> 0.62
<tb> <SEP> 2 <SEP> 0.84 <SEP> 0.58
<tb> <SEP> 3 <SEP> 0.73 <SEP> 0.56
<tb> <SEP> 4 <SEP> 0.60 <SEP> 0.48
<tb> <SEP> drug addict <SEP> 1 <SEP> 0.50 <SEP> 0.44
<tb> <SEP> 2 <SEP> 0.66 <SEP> 0.50
<tb> <SEP> 3 <SEP> 0.95 <SEP> 0.73
<tb> <SEP> 4 <SEP> 0.85 <SEP> 0.63
<tb> <SEP> Healthy <SEP> 1 <SEP> 0.50 <SEP> 0.41
<tb> <SEP> 2 <SEP> 0.56 <SEP> 0.42
<tb> <SEP> 3 <SEP> 0.69 <SEP> 0.49
<tb> </TABLE>
In the above examples, the assay is performed by determining the label associated with the solid phase. However, since the label content associated with the starting serum can also be determined, it is also possible to reduce the radioactive count or the enzyme content associated with the liquid phase after a known labeled serum and the test sera in contact with the solid phase antigen, and to determine the reduction in the level of the liquid phase label used as a measure of the antibody level in the test serum.
The advantages of the simultaneous competition assay can be summarized under the following headings.
Antigen production
Although the use of purified HTLV-III viruses is described in Example 2, the enhanced binding resulting from the use of the immobilized antibody allows the use of a crude cell lysate preparation for coating when alone, such an antigen not directly binds to a solid phase in any useful way. This step removes the restriction that highly purified antigen must be used for diagnostic tests, and it makes their manufacture easier. This is an advantage which is not applicable to direct assays where an entire human globulin coating would give an unavoidable signal with the finished anti-human globulin label.
Format or size
Using a volume of undiluted serum offers a great advantage for blood transfusion centers where, if an initial dilution would be required, the workload would be greater. The ratio between serum and enzyme labeled volume can be varied within the range of 1: 1 to 1:10 with only a small change in the test result. The optimum is 1: 3, using 25 μl serum and 75 μl enzyme label, and a good differentiation between positive and negative sera is obtained. Assay time can be reduced to 1 hour or less using the ELISA technique.
sensitivity
A measure of the sensitivity of any assay for AIDS antibodies is determined by the ratio of the sera that must be taken from terminally ill patients with AIDS that remains positive. In direct assays, it appears that a different number of patients lose their antibody reactivity. This does not occur with the competition assay, which suggests that the sensitivity of the competition assay is as good or better than that of one of the assays currently used.
Specificity
A competitive assay is not expected to cause major problems with false positive reactivity. The inclusion of lymphocyte membrane antigens in the envelope of HTLV virions certainly leads to false reactivity, such as the presence of aggregates of IgG, which do not adhere specifically to the solid phase. Such a phenomenon does not result in an increase in reactivity in the competitive assay. Non-specific affects of variable protein concentrations can be kept to a minimum by selecting suitable serum / labeling ratios (1: 3 as above) and by using the reduction of over 50% inhibition. Sera which result in an inhibition of label binding equal to or greater than that of the internal control serum are considered positive as a screen test. However, the test should be repeated.
Due to the low values for false reactivity, which is assumed to be less than 1 at 5000, it is unlikely that false positive reactions in the competitor ELISA will cause numerically great difficulties, as is the case with other direct assays. This is especially true where the direct assays are performed without a control antigen. This is believed to be the case with transfusion centers because the use of control antigen would double the reagent requirements for direct assay.
Summary
The combination of a simple format, high sensitivity and high specificity makes the competitive assay ideal for screening blood donations and for diagnostic use. In addition, where centers use a direct anti-HTLV-III assay, it can be better at determining serum reactivity for competitive assay retest rather than subjecting the sera to the more laborious and less sensitive Western blotting tests that recommended by the FDA in the United States.