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CH649709A5 - Antitumor-praeparat und verfahren zu dessen herstellung. - Google Patents

Antitumor-praeparat und verfahren zu dessen herstellung. Download PDF

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Publication number
CH649709A5
CH649709A5 CH4961/79A CH496179A CH649709A5 CH 649709 A5 CH649709 A5 CH 649709A5 CH 4961/79 A CH4961/79 A CH 4961/79A CH 496179 A CH496179 A CH 496179A CH 649709 A5 CH649709 A5 CH 649709A5
Authority
CH
Switzerland
Prior art keywords
cells
preparation
streptococcus equisimilis
saline solution
streptococcus
Prior art date
Application number
CH4961/79A
Other languages
English (en)
Inventor
Hiroshi Okazaki
Mitsuaki Handa
Yutaka Sugawara
Haruki Ogawa
Yasuhisa Takeda
Takashi Matsuno
Mihoko Ohtaka
Hiroki Mitsui
Tsutomu Kawaguchi
Hisako Masuda
Original Assignee
Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by Chugai Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Publication of CH649709A5 publication Critical patent/CH649709A5/de

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    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Antitumor-Präparat, das Bakterienzellen des Streptococcus equisimilis enthält. Des weiteren werden Verfahren zur Herstellung derartiger Antitumor-Präparate beschrieben.
Aus der klinischen Erfahrung ist es bekannt, dass die Infektion mit Bakterien, welche zur Klasse Streptococcus hae-molyticus gehören, und welche eine ß-hämolytische Aktivität besitzen, zu einer gewissen Antikrebs-Wirkung führen. Es ist jedoch auch bekannt, dass die fraglichen Bakterien pathogen sind, d.h. Krankheiten hervorrufen, und beispielsweise Wundrose (Erysipel), Rotlauf und ähnliche Krankheiten hervorrufen. Ferner ist auch bekannt, dass die Antitu-mor-Wirksamkeit ausserordentlich unbeständig ist, d.h. dass die Zellen leicht inaktiviert werden, indem man sie erhitzt oder anderen Behandlungen unterwirft. Aus diesen Gründen war es nicht möglich die lebenden Bakterienzellen zur Behandlung von Tumoren zu verwenden. Es wurden verschiedenste Arbeitsverfahren versucht, um Bakterien anzuwenden, die zur Klasse Streptococcus haemolyticus gehören, um eine Krebsbehandlung durchzuführen. Beispielsweise werden bei einem dieser Verfahren lebende Zellen von Bakterien, die zur Klasse Streptococcus haemolyticus gehören, in dem Bernheimer-Grundmedium suspendiert, man gibt Penicillin zu der Suspension in einer sehr hohen Konzentration und erhitzt dann die Mischung. Dieses Verfahren ist in der japanischen Patentveröffentlichung Nr. 6690/70 beschrieben. Andere Verfahren wurden in den japanischen Patentveröffentlichungen Nr. 8871/70; Nr. 2674/71 und Nr. 37003/ 72 beschrieben.
40 Bei den im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung gemachten Arbeiten stellte es sich heraus, dass der Stamm des Streptococcus equisimilis eine Antitumor-Wirk-samkeit besitzt, die wesentlich stärker ist als diejenige eines üblichen Stammes des Streptococcus haemolyticus. Insbe-45 sondere zeigt es sich, dass ein pharmazeutisches Präparat, welches sich von dem speziellen Stamm des Streptococcus equisimilis ableitet, welcher bei der American Type Culture Collection, 12 301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20 852, USA, am 21. August 1970 mit der Hinterlegungsso nummer ATCC 21597 hinterlegt wurde, eine hohe Aktivität gegen den MH 134 Tumor aufweist, gegen welchen ein pharmazeutisches Präparat, welches Zellen bekannter Stämme des Streptococcus haemolyticus enthält, überhaupt keine Wirksamkeit aufweist. Ferner zeigt es sich, dass die Zellen 55 dieses Stammes des Streptococcus equisimilis sogar eine Aktivität zeigen, wenn sie intraperitoneal gegen den festen Tumor verabreicht werden, gegen welchen ein übliches Präparat nur eine geringe oder überhaupt keine Antitumor-Akiti-vität aufweist, wenn es intraperitoneal verabreicht wird. 60 Ausserdem ist die Antitumor-Aktivität des Stammes von Streptococcus equisimilis relativ beständig gegenüber Hitze, und deshalb besitzen sogar Zellen dieses Stammes, die durch eine Hitzebehandlung getötet wurden, eine ausreichende Aktivität, um in einem pharmazeutischen Präparat eingesetzt 65 zu werden.
Durch die ausgedehnten Untersuchungen wurden die hier beschriebenen erfmdungsgemässen Präparate und erfin-dungsgemässen Methoden entwickelt.
3
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Es sei daraufhingewiesen, dass ein Stamm des Streptococcus equisimilis, der besonders gut zur Verwendung in dem erfindungsgemässen Präparat und zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens geeignet ist, beispielsweise derjenige Stamm ist, der bei der American Type Culture Collection mit der Hinterlegungsnummer ATCC 21597 hinterlegt wurde. Dieser fragliche Stamm wurde ferner auch beim Fermentation Research Institute (FRI = FERM), Agency of Industriai Science and Industry, Inage, Chiba City, Japan, hinterlegt, und zwar mit der Deposit Application Acceptance Nr. 4509, und ausserdem bei der American Type Culture Collection unter Gruppe C, Streptococcus sp. ATCC 21597.
Die mikrobiologischen Eigenschaften dieses Stammes werden weiter unten erläutert, und sie sind äquivalent denjenigen des Streptococcus equisimils, die im Handbuch zur bestimmenden Bakteriologie, nämlich im «Manual of Determination Bacteriology» von Bergey, 8. Auflage, angegeben sind.
1. Morphologische Eigenschaften
Die Zellen sind kugelförmig oder eiförmig, und sie haben einen Durchmesser von bis zu 2 (im und bilden im Todd He-witt Medium eine typische Kette.
2. Physiologische Eigenschaften
(1) Art der Hämolyse: ß-Hämolyse
(2) Seriologische Klassifizierung nach Lancefield: C-Gruppe
(3) Katalase Aktivität: negativ
(4) Wachstum bei 10 °C und 45 °C: negativ
(5) Wachstum bei einem pH-Wert von 9,6: negativ
(6) Wachstum in einem 10% Galle enthaltenden Medium: positiv
(7) Wachstum in einem 40% Galle enthaltenden Medium: negativ
(8) Wachstum in einem 6,5% NaCl enthaltenden Medium: negativ
(9) Hydrolyse der Hippursäure: negativ
(10) Abbau der Zucker (Bildung von Säure aus Kohlehydraten): siehe die in der folgenden Tabelle 1 angegebenen Ergebnisse.
Tabelle 1
Glycerin:
positiv
Trehalos:
positiv
Lactose:
positiv
Maltose:
positiv
Salicin:
negativ
Manit:
negativ
Glucose:
positiv
Raffinose:
negativ
Saccharose:
positiv
Inosit:
positiv
Inulin:
negativ
Arabinose:
negativ
Sorbitol:
negativ
Xylose:
positiv
(11) Arginin-decarboxylase-Aktivität: positiv
(12) Ornithin-decarboxylase-Aktivität: negativ
(13) Lysin-decarboxylase-Aktivität: negativ
(14) Assimilation eines Salzes der Zitronensäure: negativ
(15) Bildung von Schwefelwasserstoff: negativ
(16) Bildung von Indol: negativ
(17) Urease-Aktivität: negativ
(18) o-Nitrophenyl-ß-D-galactopyranosid-Test (abgekürzt als ONPG-Test): negativ
(19) Boges-Pros Kauer Test: negativ
(20) Auflösung von Cellulose: schwach positiv
Die Züchtung der Bakterien des Streptococcus equisimilis kann erfindungsgemäss beispielsweise so durchgeführt werden, indem man ein Bouillon-Medium oder ein 3-5%iges Hefeextrakt-Medium bei einer Temperatur in der Umgebung von 37 °C anwendet. Die Züchtungszeit beträgt üblicherweise 18 bis 20 Stunden, sie variiert jedoch etwas je nach dem speziellen Medium, das eingesetzt wird, den verwendeten Zellenmengen, die eingeimpft werden, und ähnlichen Faktoren. Nach der Züchtung werden die Zellen aus der Zuchtbrühe nach üblichen Arbeitsverfahren abgetrennt, beispielsweise durch Zentrifugieren, und sie werden dann mit einem geeigneten flüssigen Medium gewaschen, beispielsweise einer physiologischen Kochsalzlösung, und dann zu den erfindungsgemässen Zwecken verwendet.
Wenn man die Erfindung durchführt, dann kann eine übliche Arbeitstechnik angewandt werden, um ein pharmazeutisches Präparat zu formulieren, welches Zellen des Streptococcus haemolyticus enthält. So können beispielsweise Zellen des Streptococcus equisimilis in einer Salzlösung suspendiert werden, beispielsweise einer Lösung mit der Bezeichnung BBM, und dann wird Penicillin zu der Suspension in einer solchen Menge zugesetzt, dass die Konzentration des Penicillines in der Suspension vorzugsweise oberhalb von 25 000 Einheiten pro ml liegt, und speziell bevorzugt im Bereich von 26 000 bis 60 000 Einheiten pro ml liegt. Die BBM Lösung ist eine Lösung, die hergestellt wird, indem man Maltose sowie KH2P04 und MgS04 • 7H20 in destilliertem Wasser auflöst und den pH-Wert unter Verwendung von Natriumhydroxyd auf einen Bereich von 6,8 bis 7,0 einstellt. Bei der Herstellung des pharmazeutischen Präparates wird die so erhaltene Zellsuspension in der Penicillin enthaltenden Lösung dann mehr als 10 Minuten bei einer Temperatur von 30 bis 38 °C stehen gelassen, und insbesondere bei dieser Temperatur während einer Zeit von 10 bis 30 Minuten belassen. Anschliessend unterwirft man die Suspension einer Hitzebehandlung von 40-50 °C während 20 bis 40 Minuten.
Obwohl die oben erwähnte Lösung mit der Bezeichnung BBM eine gut geeignete Salzlösung ist, kann auch eine Phos-phorsäurepuffer enthaltende physiologische Kochsalzlösung oder eine physiologische Kochsalzlösung alleine als Salzlösung verwendet werden.
Da die Antitumor-Aktivität des Streptococcus equisimilis über Hitze relativ beständig ist, können die Zellen in einer Salzlösung, wie zum Beispiel BBM, einer physiologischen Kochsalzlösung, welche Phosphorsäurepuffer enthält, oder einer physiologischen Kochsalzlösung suspendiert, und diese Suspension dann einer Hitzebehandlung bei einer Temperatur von 65 bis 100 °C während 5-30 Minuten unterworfen werden, damit dann die Zellen für ein Antitumor-Präparat verwendet werden können.
Die so erhaltenen Präparate können klinisch so wie sie sind verwendet werden, oder sie können während langer Zeiträume gelagert werden, nachdem man sie einer Lyophili-sierung unterworfen hat. Wenn man eine Lyophilisierung durchführt, dann kann es wünschenswert sein eine Aminosäure, wie zum Beispiel Methionin, Arginin, Ornithin, Cy-stein, Asparaginsäure, Glutaminsäure, oder eine ähnliche Aminosäure und/oder einen Zucker wie zum Beispiel Saccharose, Maltose, Raffinose, Lactose und/oder Dextran und/oder eine lösliche Stärke oder ein ähnliches Material diesem Präparat zuzusetzen.
Die Erfindung sei nun anhand der Beispiele und Versuche näher erläutert.
Beispiel 1
Ein Stamm des Streptococcus equisimilis, der bei der American Type Culture Collection mit der Nummer ATCC 21597 hinterlegt ist, wurde in 100 ml des Bouillon-Mediums eingeimpft und einer Vorzüchtung bei 37 °C während 20 Stunden unterworfen. Die Kulturbrühe wurde dann
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
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in 2 Liter eines 5% igen Hefeextrakt-Mediums eingeimpft, und man züchtete 20 Stunden lang bei 37 °C. Dann wurde die Zuchtbrühe zentrifugiert um die Zellen zu isolieren. Die Zellen wurden dann in 40 ml einer physiologischen Kochsalzlösung suspendiert, und dann wurden 4 ml einer 10%igen wässrigen Wasserstoffperoxidlösung zugesetzt, und man mischte kräftig durch und Hess die Mischung bei 0 °C während 30 Minuten stehen. Anschliessend wurde die Mischung zentrifugiert um die Zellen zu gewinnen, und man setzte 30 ml einer physiologischen Kochsalzlösung zu den Zellen zu und wusch die Zellen zweimal, indem man jeweils 30 ml einer physiologischen Kochsalzlösung den Zellen zusetzte und die Zellen durch Zentrifugieren gewann.
Die Zellen wurden dann in 90 ml BBM suspendiert, wobei sich eine Kokken-suspension in dem BBM bildete. Eine 1: 20 mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnte Lösung dieser Kokken-suspension besitzt in einem Hitachi Spectro-photometer Modell 101 eine Absorption von 0.460 bis 660 nm. Zu 85 ml dieser Kokken-suspension in BBM setzte man 17 ml einer Natriumbenzpenicillinlösung zu, die 1,6 x 105 Einheiten pro ml enthielt, und die so erhaltene Mischung liess man dann 20 Minuten bei 37 °C stehen und erhitzte anschliessend 30 Minuten lang auf 45 °C, wobei man eine Kokken-suspension erhielt.
Zu 102 ml dieser Kokken-suspension setzte man 102 ml einer Lösung aus Penicillin und DL-Methionin zu und mischt dann. Die zugesetzte, das Penicillin und das DL-Methionin enthaltende Lösung enthielt 1,8 x 105 Einheiten pro ml an Kaliumbenzylpenicillin, und sie war eine wässrige Lösung mit einem Gehalt von 1,0% DL-Methionin. Die so erhaltene Suspension wurde dann in 90 Ampullen eingegossen, wobei in jede Ampulle 2 ml dieser Lösung gegeben wurde, und man lyophilisierte und verschloss die Ampullen in trockener Luft unter Atmosphärendruck, wobei man dadurch 90 Ampullen erhielt von denen jede 5 mg an getrockneten Zellen enthielt.
Beispiel 2
Der Stamm des Streptococcus equisimilis mit der Hinterlegungsnummer ATCC 21597 wurde in der gleichen Weise gezüchtet, wie dies in Beispiel 1 beschrieben ist, und 2,11 der Zuchtbrühe wurden zentrifugiert um die lebenden Zellen zu isolieren. Die so gewonnenen Zellen wurden zweimal gewaschen, indem man eine physiologische Kochsalzlösimg zu den Zellen zugab und die Mischung zentrifugierte.
Die Zellen wurden in 108 ml BBM suspendiert, wobei man eine Kokken-suspension in BBM erhielt. Wenn man diese Kokken-suspension in BBM mit physiologischer Kochsalzlösung auf 1:20 verdünnte, dann besass sie in einem Hitachi Spectrophotometer Modell 101 eine Absorption bei 660 nm von 0,400. Die Kokken-suspension in dem BBM wurde auf einem Wasserbad bei 90 °C während 10 Minuten erhitzt, und dann kühlte man mit Eis ab.
Zu 102 ml der Suspension setzte man 102 ml einer 10%igen wässrigen Lösung von DL-Methionin zu und mischte gründlich durch und schüttete dann die so erhaltene Suspension in 90 Ampullen ein, wobei in jede dieser Ampullen 2 ml der Suspension eingefüllt wurden. Die in den Ampullen befindliche Suspension wurde dann lyophilisiert, und die Ampullen wurden an trockener Luft unter Atmosphärendruck verschlossen, wobei man 90 Ampullen erhielt von denen jede 5 mg an getrockneten Zellen enthielt.
Beispiel 3
Nach einem Arbeitsverfahren, das ähnlich demjenigen ist, das in Beispiel 2 beschrieben wurde, erhielt man eine Kokken-suspension in BBM des Stammes Streptococcus equisimilis. Die Suspension wurde auf einem Wasserbad bei
65 °C während 10 Minuten erhitzt und dann in der gleichen Weise lyophilisiert, wie dies in Beispiel 2 beschrieben ist.
Versuch 1
s MH 134 Tumorzellen wurden subkutan in den Rücken von männlichen, drei Wochen alten Mäusen der Rasse C3H/ HeN inokkuliert, wobei man eine Menge von 10® Tumorzellen pro Maus verwendete. Drei Tage nach der Einimpfung verabreichte man an jede Maus 5mal an jedem zweiten Tag io eine Suspension eines lyophilisierten trockenen Pulvers, das nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren erhalten wurde, wobei das trockene Pulver in physiologischer Kochsalzlösung in einer Dosis von 0,1 mg Trockengewicht der Zellen verabreicht wurde. 20 Tage nach der Inokkulierung 15 wurde das Gewicht des Tumors bestimmt. Zur Durchführung eines positiven Vergleichsversuches wurden die Zellen des Su-Stammes (Su-strain) des Streptococcus pyogenes, der bei der American Type Culture Collection, 12 301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20 852, USA mit der Hinterle-20 gungsnummer ATCC 21060 hinterlegt wurde, herangezogen, wobei diese Zellen in der gleichen Weise behandelt worden waren, wie dies in Beispiel 1 beschrieben ist, und in der gleichen Weise wie dort beschrieben in der physiologischen Kochsalzlösung suspendiert worden waren und auch dem 25 gleichen Test unterworfen wurden.
Die bei diesem Test erzielten Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 2 zusammengestellt. Wie man aus dieser Tabelle 2 sieht, zeigte das Präparat aus den Zellen des Streptococcus equisimilis mit der Hinterlegungsnummer 30 ATCC 21597 eine deutliche Wirksamkeit gegen die MH 134 Tumorzellen, während das Präparat, das aus dem Su-Stamm des Streptococcus pyrogenes gewonnen worden war, nur eine sehr geringe Aktivität aufwies.
Tabelle 2
Art des Präparates
Anzahl der Mäuse (Köpfe)
Tumorgewicht in g
(Durchschnitt + S.F.1
Prozent Unterdrückung
Streptococcus
equisimilis, Stamm
10
0,24±0,072
81,8
ATCC 21597
Streptococcus pyrogenes
Su-Stamm
10
1,03 + 0,19
22,0
50 Vergleichsversuch (Keine Verabrei- 1,32 + 0,21
chung eines Prapa- —
rates)
1 S.F. = Standard-Fehler 55 2 P <0,001 (durch t-Test, bezogen auf den Vergleichsversuch)
Versuch 2
BAMC 1 Tumorzellen wurden subkutan in den Rücken 60 von 6 Wochen alten weiblichen Mäusen der Rasse BALB/ cAnN inokuliert, und zwar in einer Menge von 10® Zellen pro Maus. Drei Tage nach dieser Einimpfung der Tumorzellen wurde an jede Maus intravenös oder introperitoneal 5mal jeden zweiten Tag eine Suspension des lyophilisierten 65 trockenen Pulvers verabreicht, das nach dem Verfahren gemäss Beispiel 1 erhalten wurde. Dieses Pulver wurde in physiologischer Kochsalzlösung verabreicht, und zwar in einer Dosierung von 0,1 mg Trockengewicht der Zellen.
21 Tage nach der Okulation wurde das Gewicht des Tumors jeder Maus bestimmt. Als positiver Kontrollversuch wurde ein Präparat in der gleichen Weise formuliert wie in Beispiel 1, und zwar indem man den Su-Stamm des Streptococcus pyrogenes in einer physiologischen Kochsalzlösung 5 suspendierte, und dieses Material zu Vergleichszwecken im gleichen Test verwendete.
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Die bei diesem Versuch erzielten Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 3 zusammengestellt. Wie man deutlich sieht, ist die Antitumor-Aktivität des Präparates aus dem Stamm des Streptococcus equisimilis mit der Hinterlegungsnummer ATCC 21597 gegen den BAMC 1 Tumor wesentlich besser als die Aktivität des Su-Stammes des Streptococcus pyrogenes.
Tabelle 3
Art des Präparates
Streptococcus equisimilis Stamm ATCC 21597
Streptococcus pyrogenes Su-Stamm
Vergleichsversuch (Keine Verabreichung)
S.E. = Standardfehler i.v. = intravenös i.p. = intraperitoneal
WegderVerab- Anzahl der Tumorgewicht (g) Prozent reichung Mäuse (Köpfe) Durchschnitt ± S.E. Unterdrückung l.p i.v.
i.v. i.p.
11 10
10
10
11
1.07 + 0,14 0,72 + 0,01
1,00 + 0,11 1,84+0,10
2.08 + 0,29
48,2 65,9
51,1 10,4
Versuch 3
Ehrlich-Tumorzellen wurden subkutan in den Rücken von nackten Mäusen inokuliert. Die Mäuse waren 5 Wochen alt, und die Hälfte der Tiere waren Männchen. Die Inokulierung erfolgte in einer Menge von 106 Zellen pro Maus. 3 Tage nach der Einimpfung der Tumorzellen wurde an jede Maus intravenös oder intraperitoneal 5mal jeden zweiten Tag eine Suspension des lyophilisierten trockenen Pulvers verabreicht, das nach dem Verfahren gemäss Beispiel 1 erhalten wurde. Die Verabreichung des Pulvers erfolgte in einer physiologischen Kochsalzlösung in einer Dosierung von 0,1 mg an Trockengewicht der Zellen. 21 Tage nach der Inokkulierung wurde das Tumorgewicht bei jeder Maus bestimmt.
Als positiver Vergleichsversuch wurde ein Präparat in der gleichen Weise formuliert, wie in Beispiel 1, jedoch wurde jetzt der Su-Stamm des Streptococcus pyrogenes verwendet, und diese Zellen wurden wieder in physiologischer Kochsalzlösung suspendiert und im gleichen Test eingesetzt.
Die bei diesem Test erzielten Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 4 zusammengestellt. Man sieht deutlich, dass
Tabelle 4
Art des Anzahl der Tumorgewicht Prozent
Präparates Mäuse in g Unter-
(Köpfe) Durchschnitt+S.E. drückung
Streptococcus equisimils „
Stamm ATCC 21597
Streptococcus pyrogenes 9 Su-Stamm
0,50+0,04!
1,14 + 0,23!
89,0
74,8
12
4,53 ±0,50
Vergleichsversuch (Keine Verabreichung)
S.E. Standardfehler
1 = P<0,001 (Durch t-Test, bezogen auf den Vergleichs versuch)
25
die Antitumoraktivität des Präparates aus dem Stamm Streptococcus equisimilis mit der Hinterlegungsnummer ATCC 21597 gegen den Ehrlich-Tumor wesentlich besser ist, als die Aktivität des Präparates aus dem Su-Stamm des 30 Streptococcus pyrogenes.
Versuch 4
Meth A-Tumorzellen wurden subkutan in den Rücken von 6 Wochen alten männlichen Mäusen der Rasse BALB/ 35 cAnN inokuliert, und zwar in einer Menge von 10e Zellen pro Maus. 3 Tage nach diesem Einimpfen der Tumorzellen wurde an jede Mause intravenös oder intraperitoneal 5mal an jedem zweiten Tage eine Suspension des lyophilisierten trockenen Pulvers verabreicht, das nach dem in Beispiel 1 40 beschriebenen Verfahren erhalten wurde, und zwar erfolgte die Verabreichung des trockenen Pulvers in physiologischer Kochsalzlösung in einer Dosierung von 0,1 mg Trockengewicht der Zellen. 21 Tage nach der Inokulation wurde das Gewicht des Tumors jeder Maus bestimmt.
45 Die bei diesem Versuch erzielten Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 5 zusammengestellt. Man sieht deutlich, dass die Antitumor-Aktivität des Präparates aus dem Stamm des Streptococcus equisimilis mit der Hinterlegungsnummer ATCC 21597 gegen den Meth A-Tumor hervorra-50 gend gut ist.
Tabelle 5
Art des 55 Präparates
Streptococcus equisimilis so Stamm ATCC 21597
Anzahl der Tumorgewicht Prozent
Mäuse in g Unter-
(Köpfe) Durchschnitt+S.E. drückung
10
0,57 + 0,12!
76,8
Vergleichsversuch (Keine 10 2,46 + 0,42 -65 Verabreichung)
S.E. = Standardfehler
1 = P< 0,001 (durch t-Test basierend auf dem Vergleichsversuch)
649 709
6
Versuch 5
Durch ein Arbeitsverfahren, das ähnlich dem in Versuch 1 beschriebenen ist, wurde an 6 Wochen alte männliche Mäuse der Rasse C3H/HeN das pharmazeutische Präparat verabreicht, das nach dem Verfahren gemäss Beispiel 1 oder dem Verfahren gemäss Beispiel 2 aus dem Stamm des Streptococcus equisimilis mit der Hinterlegungsnummer ATCC 21597 gewonnen wurde. Es wurde die Antitumor-Aktivität dieser Präparate gegen den MH 134-Tumor durch Vergleichsversuche bestimmt, indem man die Tumore 19 Tage nach der Inokulation wog.
Die Ergebnisse dieses Versuches sind in der nachfolgenden Tabelle 6 zusammengestellt. Beide Präparate zeigten eine hervorragend gute Antitumor-Aktivität gegen den MH 134-Tumor.
Tabelle 6
Art des Anzahl der Tumorgewicht Prozent
Präparates Mäuse in g Unter-
(Köpfe) Durchschnitt+S.E. drückung
Präparat gem.
Beispiel 1 10 0,27 fO^ó1 65,4 Präparat gem.
Beispiel 2 10 0,27+O^1 65,4
Vergleichsversuch (Keine 10 0,78 + 0,15 -Verabreichung)
S.E. = Standardfehler
1 = P < 0,01 (durch t-Test bezogen auf den Vergleichsversuch) Versuch 6
Durch ein Arbeitsverfahren, das ähnlich demjenigen ist, das in Beispiel 1 beschrieben ist, wurde an 5 Wochen alte männliche Mäuse der Rasse BALB/cAnN Crj das Präparat verabreicht, das nach Beispiel 1 oder Beispiel 2 oder Beispiel
3 hergestellt wurde, und zwar ausgehend jeweils von dem Streptococcus equisimilis Stamm mit der Hinterlegungsnummer ATCC 21:597. Die Antitumor-Aktivität dieser Präparate gegen den Meth A-Tumor wurde bestimmt, indem man das Gewicht der Tumore 19 Tage nach der Okulation bestimmte.
Die bei diesem Versuch erzielten Ergebnisse sind in der Tabelle 7 zusammengestellt. Man sieht, dass alle Präparate eine hervorragend gute Antitumor-Aktivität gegen den Meth A-Tumor aufweisen.
Tabelle 7
Art des Anzahl der Tumorgewicht Prozent
Präparates Mäuse in g Unter-
(Köpfe) Durchschnitt+S.E. drückung
Präparat des
Beispiels 1 9 0,43+0,0s1 85,1 Präparat des
Beispiels 2 9 0,42+0,15' 85,5 Präparat des
Beispiels 3 9 0,7510,1s1 74,0
Vergleichsversuch (Keine 9 2,89+0,25 -Verabreichung)
S.F. = Standard-Fehler
1 = P< 0,001 (durch t-Test, bezogen auf den Vergleichsversuch) Versuch 7
Jedes der Präparate, das nach den Beispielen 1,2 und 3 erhalten wurde, wurde in einer physiologischen Kochsalzlösung suspendiert und nachdem man das Penicillin inaktiviert hatte, das in der Suspension des Präparates gemäss Beispiel 1, und zwar nur gemäss Beispiel 1, enthalten war, mischte man die Suspensionen in üblicher Weise mit dem defibrinier-ten Blut-Agar-Agar von Pferden. Die erwähnte Inaktivie-rung des Penicillines erfolgte durch eine Behandlung mit Pe-nicillinase. Die so erhaltenen Mischungen wurden in eine Schale eingebracht, und man züchtete bei 37 °C während 48 Stunden. Nach dem Züchten wurden die lebenden Zellen gezählt.
Durch diesen Test wurde bestätigt, dass keines der Präparate lebende Zellen enthielt.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65

Claims (17)

  1. 649709
    2
    PATENTANSPRÜCHE
    1. Antitumor-Präparat, dadurch gekennzeichnet, dass es Zellen des Streptococcus equisimilis enthält.
  2. 2. Präparat nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen diejenigen des Streptococcus equisimilis sind, der bei der American Type Culture Collection mit der Hinterlegungsnummer ATCC 21597 hinterlegt ist.
  3. 3. Präparat nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es lyophilisiert ist und ausserdem ein Stabilisierungsmittel enthält, welches eine Aminosäure, ein Zucker, Dextran und/oder eine lösliche Stärke ist.
  4. 4. Präparat nach Patentanspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass es als Aminosäure Methionin, Arginin, Ornithin, Cystein, Asparaginsäure, Glutaminsäure oder eine Mischung aus zwei oder mehreren derartigen Aminosäuren enthält.
  5. 5. Präparat nach Patentanspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass es Dextran, eine lösliche Stärke oder als Zucker Saccharose, Maltose, Raffinose oder Lactose oder eine Mischung aus zwei oder mehreren derartigen Komponenten enthält.
  6. 6. Verfahren zur Herstellung eines Antitumorpräparates nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man Zellen des Streptococcus equisimilis in einer Salzlösung, welche Penicillin enthält, bei einer Temperatur von 30-38 °C belässt und dann die Zellen einer Hitzebehandlung bei einer Temperatur von 40-50 °C unterwirft.
  7. 7. Verfahren nach Patentanspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die verwendeten Zellen diejenigen des Streptococcus equisimilis sind, die bei der American Type Culture Collection mit der Nummer ATCC 21597 hinterlegt wurden.
  8. 8. Verfahren nach Patentanspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration an Penicillin in der Lösung über 25 000 Einheiten pro ml liegt.
  9. 9. Verfahren nach Patentanspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration an Penicillin in der Lösung im Bereich von 26 000 bis 60 000 Einheiten pro ml liegt.
  10. 10. Verfahren nach einem der Patentansprüche 6 bis 9,
    5 dadurch gekennzeichnet, dass man die Zellen bei der Temperatur von 30 bis 38 °C während 10 bis 30 Minuten belässt und der Hitzebehandlung bei der höheren Temperatur während einer Zeit von 20 bis 40 Minuten unterwirft.
  11. 11. Verfahren nach einem der Patentansprüche 6 bis 10,
    io dadurch gekennzeichnet, dass die verwendete Salzlösung das
    Bernheimer-Grundmedium ist.
  12. 12. Verfahren nach einem der Patentansprüche 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Salzlösung eine Phosphorsäurepuffer enthaltende physiologische Kochsalzlösung
    15 ist.
  13. 13. Verfahren zur Herstellung eines Antitumor-Präpara-tes nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man Zellen des Streptococcus equisimilis einer Hitzebehandlung in einer Salzlösung bei einer Temperatur von 65-100 °C
    20 unterwirft.
  14. 14. Verfahren nach Patentanspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass die verwendeten Zellen des Streptococcus equisimilis diejenigen sind, die bei der American Type Culture Collection mit der Hinterlegungsnummer ATCC 21597
    25 hinterlegt sind.
  15. 15. Verfahren nach Patentanspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Behandlungszeit 5 bis 30 Minuten beträgt.
  16. 16. Verfahren nach einem der Patentansprüche 13 bis 15,
    30 dadurch gekennzeichnet, dass man als Salzlösung das Bern-
    heimer-Grundmedium verwendet.
  17. 17. Verfahren nach einem der Patentansprüche 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass man als Salzlösung eine Phosphorsäurepuffer enthaltende physiologische Kochsalzlösung
    35 verwendet.
CH4961/79A 1978-05-29 1979-05-28 Antitumor-praeparat und verfahren zu dessen herstellung. CH649709A5 (de)

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