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PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Gewinnung von reinen plasminogenaktivierenden Proteinasen aus plasminogenaktivierenden Materialien, die neben plasminogenaktivierenden Substanzen noch Fremdstoffe enthalten, dadurch gekennzeichnet, dass man das plasminogenaktivierende Material in einem ersten wässrigen Medium aufnimmt, gegebenenfalls vorhandene ungelöste Feststoffe abtrennt, die verbleibende Lösung mit einem Trennmittel, das aus mit an einem in Wasser unlöslichen Träger gebundenem insolubilisiertem Chondroitinsulfat oder auch Chitin oder Chitosan besteht, in Berührung bringt, um die plasminogenaktivierende Proteinase an das Trennmittel zu binden und die plasminogenaktivierende Proteinase mittels eines zweiten wässrigen Mediums von dem Trennmittel abspaltet.
2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als erstes wässriges Medium a) Wasser oder b) eine wässrige 0,005-0,2molare Pufferlösung, die ein pH von 6 bis 9 aufweist, oder c) eine wässrige 0,005-0,2molare Elektrolytlösung, z.B.
eine wässrige Natriumchloridlösung, die keine oder höchstens eine schwache Pufferwirkung und ein pH von 6 bis 9 aufweist, oder d) eine sowohl einen Puffer als auch ein Neutralsalz enthaltende wässrige Lösung, die eine Gesamtkonzentration von 0,005 bis 0,2 Mol/Liter und ein pH von 6 bis 9 aufweist, verwendet.
3. Verfahren nach einem der Patentansprüche 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als Trennmittel ein durch Bindung von Chondroitinsulfat an die reaktiven Gruppen einer polymeren wasserunlöslichen Trägersubstanz, z.B.
Agarose, Putrescinagarose, Epsilonaminocaproylagarose oder Cyanogenbromidagarose, erhaltenes insolubilisiertes Chondroitinsulfatprodukt verwendet.
4. Verfahren nach einem der Patentansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man als zweites wässriges Medium eine wässrige Pufferlösung verwendet, welche eine molare Konzentration, die grösser ist als diejenige des ersten wässrigen Mediums und zwischen 0,05 und 1 Mol/Liter liegt, und welche ein pH von 6 bis 9 aufweist.
5. Verfahren nach Patentanspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Pufferlösung ein Neutralsalz, z.B. Natriumchlorid, enthält und eine Gesamtkonzentration von 0,05 bis 1 Mol/Liter aufweist.
6. Verfahren nach einem der Patentansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass es chargenmässig durchgeführt wird, indem man die Lösung der plasminogenaktivierenden Proteinase mit dem insolubilisierten Chondroitinsulfat rührt, das erhaltene unlösliche Reaktionsprodukt abfiltriert und mit dem zweiten wässrigen Medium rührt, um die plasminogenaktivierende Proteinase von dem insolubilisierten Chondroitinsulfat abzutrennen.
7. Verfahren nach einem der Patentansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass es mittels Chromatographie durchgeführt wird, indem man die Lösung der plasminogenaktivierenden Proteinase in dem ersten wässrigen Medium auf eine aus dem insolubilisierten Chondroitinsulfat bestehende Säule gibt, die Fremdstoffe aus der Säule herauswäscht und die Säule mit dem zweiten wässrigen Medium wäscht, um die plasminogenaktivierende Proteinase von dem insolubilisierten Chondroitinsulfat abzuspalten und aus der Säule herauszuwaschen.
8. Verfahren zur Herstellung von reiner Urokinase nach einem der Patentansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass man als plasminogenaktivierendes Ausgangsmaterial ein aus menschlichem Urin gewonnenes urokinasehaltiges Proteingemisch verwendet.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von reinen plasminogenaktivierenden Proteinasen, z.B. Urokinase, aus plasminogenaktivierenden Materialien, die neben plasminogenaktivierenden Proteinasen noch Fremdstoffe enthalten.
Urokinase ist bekanntlich eine im menschlichen Urin in kleiner Menge enthaltene Proteinase, welche durch begrenzte Proteolyse die Aktivierung des im Blut enthaltenen Zymogens Plasminogen zur fibrinolytisch wirksamen Proteinase Plasmin bewirkt. Da die Aktivierung von Plasminogen im zirkulierenden Blut die Auflösung von Blutgerinseln bewirken kann, wird Urokinase als Medikament zur Behandlung von thromboembolischen Leiden eingesetzt.
Urokinase existiert in mindestens zwei aktiven molekularen Formen: Urokinase I mit einem Molekulargewicht von 31 000 bis 32 000 und Urokinase II mit einem Molekulargewicht von 53 000 bis 55 000. Urokinase list ein proteolytisches Spaltprodukt von Urokinase II. Reine Urokinase II weist eine spezifische Aktivität von 93 500 CTA-Einheiten und ihre therapeutische Wirkung ist stärker und anhaltender; Urokinase I hat eine spezifische Aktivität von 218000 CTA Einheiten und ihre therapeutische Wirkung ist schwächer und kürzer.
Die CTA-Einheit ist die vom Committee on Thrombolytic Agents , National Heart Institute (USA), bestimmte Masseinheit. Sie bezieht sich auf die fibrinolytische Wirkung eines Standardpräparates der Weltgesundheitsorganisation.
Zur Abtrennung der urokinasehaltigen Proteinfraktion aus menschlichem Urin sind zahlreiche Verfahren bekannt. So kann Rohurokinase durch Einstellung des pH des Urins auf 4,3 ausgefällt werden oder dem Urin durch Adsorption an Kaolin, Bentonit, Bariumsulfat, Kieselgel, Diatomeenerde, Calciumphosphat oder an Ionenaustauscher wie Carboxymethylcellulose, z.B. Amberlite IRC-50, entzogen werden.
Eine urokinasehaltige Proteinfraktion wird nach Celander und Guest [Am. J. Cardiol. 6,409 (1960)1 dadurch gewonnen, dass man den gesammelten Urin durch Belüftung, Rühren oder Schütteln zum Schäumen bringt und den Schaum sammelt, der 70% der im Urin enthaltenen Urokinase in etwa 20facher Anreicherung enthält.
Eine Übersicht über die verschiedenen Techniken zur Gewinnung von Urokinase aus Urin vermitteln R. Paoletti und S. Sherry: Thrombosis and Urokinase, Academic Press, London, New York, San Francisco (1977).
Nach den genannten Verfahren gewonnene urokinasehaltige Proteinfraktionen aus menschlichem Urin werden als Rohurokinase gehandelt.
Handelsübliche Rohurokinase kann neben Urokinase auch die Enzyme Kallikrein, Trypsin, Uropepsin, ferner die biologisch aktiven Polypeptide Urogastron, Uroplastin, mehrere Hypophysenhormone, Polysaccharide und ausserdem wechselnde Mengen an fiebererzeugenden (pyrogenen) bakteriellen Endotoxinen enthalten.
White und Barlow [W. F. White und G. Barlow in: Methods of Enzymology Vol. 19, G. E. Perlmann und L.
Lorand (Ed.), S. 665, Academic Press, New York, London (1970)] beschreiben ein Verfahren zur Gewinnung von reiner Urokinase aus Urinschaum durch Präzipitation mit Ammoniumsulfat, Auflösen des Präzipitates in 3%iger Natriumchloridlösung, Dialyse der Lösung gegen 0,1 M Phosphatpuffer mit pH 6,5, nachfolgender Zentrifugation, Chromatographie an Amberlite IRC-50 in 0,1 M Phosphatpuffer mit pH 6,5, Konzentration der aktiven Fraktion durch Ultrafil
tration, Lyophilisation und zweimalige Chromatographie des Lyophilisates an Sephadex G-100. Nach diesem Verfahren wird in einer Ausbeute von 35-42% eine gereinigte Urokinase mit einer spezifischen Aktivität von 50 000 bis 75 000 CTA Einheitn pro mg Protein erhalten.
Nach dem US-Patent Nr. 3 355 361 wird Urokinase durch Adsorption an Bentonit, Eluierung mit einer Lösung von 6,9-Diamino-2-äthoxy-acridinlactat, nachfolgender Adsorption an Calciumphosphat und Eluierung mit Natriumphosphatpuffer, Behandlung des Eluates mit Carboxymethylcellulose, Hitzebehandlung und zwei weitere Adsorptions- und Eluierungsstufen mit Carboxymethylcellulose gewonnen.
G. H. Barlow [in: Methods in Enzymology XLV, L. Lorand (Ed.) S.239, Academic Press, New York, San Francisco, London (1976)] beschreibt ein Verfahren zur Reinigung von Rohurokinase durch Ultrafiltration, Chromatographie an einem sauren Ionenaustauscher (CG-50) unter Verwendung von Phosphatpuffer und einem Natriumchlorid-Gradienten von 0-1 M, nachfolgender Dialyse des aktiven Eluates, Chromatographie an CM- Sephadex unter Verwendung von Acetatpuffer und einem NaC1-Gradienten, Dialyse gegen eine Lösung von Natriumchlorid und Äthylendiamintetraessigsäure und Gelchromatographie an Sephadex G-75.
Die genannten Verfahren sind unwirtschaftlich, da sie viele zeitraubende Arbeitsschritte, einen grossen Aufwand an Apparaten und Arbeitskraft erfordern und geringe Ausbeuten liefern.
Johnson et al. [in: Thrombosis and Urokinase, R. Paoletti und S. Sherry (Ed.)] beschreiben die Auftrennung von Urokinase durch Affinitätchromatographie an Agmatinsepharose in zwei fibrinolytisch aktive Fraktionen mit unterschiedlichem Molekulargewicht. Dieses rationell und einfach durchzuführende Verfahren eignet sich leider nicht zur Reinigung von Rohurokinase, welche noch andere Serinproteasen enthält, da alle Serinproteasen, wie das im Urin enthaltene Trypsin und Kallikrein, eine Affinität zu Agmatin aufweisen.
Nach der japanischen Offenlegungsschrift 7 899 383 wird Urokinase durch Affinitätschromatographie an insolubilisiertem Arginin oder Lysin gereinigt und mit einem Reinheitsgrad von 25 000 CTA-Einheiten pro mg Protein gewonnen. Insolubilisiertes Lysin und Arginin sind wiederum wenig spezifische Adsorbentien, welche zahlreiche Serinproteasen (wie Trypsin, Kallikrein, Plasmin, Plasminogen, Thrombin u.a.) adsorbieren. Ausserdem sind Arginin und Lysin relativ starke Basen und können wie Anionenaustauscher verschiedene Substanzen mit sauren Eigenschaften unspezifisch binden.
Nach der japanischen Offenlegungsschrift 7 896 384 wird Urokinase durch Chromatographie an insolubilisiertem Heparin mit einer spezifischen Aktivität von 5369 CTA-Einheiten pro mg Protein erhalten. Insolubilisiertes Heparin vermag jedoch ausser Urokinase auch andere Serinproteasen, verschiedene Plasmaproteine, Lipoproteine und Lipasen zu binden; ausserdem bindet insolubilisiertes Heparin verschiedene thrombinartige Schlangengiftproteasen, weshalb es auch zur Reinigung dieser Enzyme nach dem deutschen Patent Nr. 2734427 eingesetzt wird.
Es wurde nun gefunden, dass insolubilisiertes Chondroitinsulfat, welches trotz seiner heparinverwandten Struktur die Fähigkeit zur Bindung von thrombinartigen Schlangengiftproteasen nicht besitzt und, im Gegensatz zu Heparin, Thrombin nicht zu hemmen vermag, überraschenderweise eine ausgeprägte Affinität gegenüber plasminogenaktivierenden Schlangengiftproteinasen, gegenüber einer fibrinoyltisch wirksamen Verunreinigung in Thrombinpräparaten und gegenüber Urokinase aufweist. Es wurde ausserdem gefunden, dass Urokinase eine Affinität zu Chitin und Chitosan aufweist.
Es wurde ferner gefunden, dass in Rohurokinase beziehungsweise in Urin enthaltene bakterielle Endotoxine (Pyrogene), Kallikrein, Trypsin und andere Proteine keine Affinität zu insolubilisiertem Chrondroitinsulfat aufweisen.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Gewinnung von reinen plasminogenaktivierenden Proteinasen besteht darin, ein plasminogenaktivierendes Material, das neben einer plasminogenaktivierenden Substanz noch Fremstoffe enthält, in einem ersten wässrigen Medium aufzunehmen, gegebenenfalls vorhandene ungelöste Feststoffe abzutrennen, die verbleibende Lösung mit einem Trennmittel, das aus mit an einem in Wasser unlöslichen Träger gebundenen insolubilisiertem Chondroitinsulfat oder aus Chitin oder Chitosan besteht, in Berührung zu bringen, um die plasminogenaktivierende Substanz an das Trennmittel zu binden und die plasminogenaktivierende Substanz mittels eines zweiten wässrigen Mediums von dem Trennmittel abzuspalten.
Das erfindungsgemässe Verfahren eignet sich besonders zur Gewinnung von reiner Urokinase aus urokinasehaltigen Präparaten, z.B. den nach bekannten Verfahren aus menschlichem Urin gewonnenen urokinasehaltigen Proteinfraktionen oder handelsüblichen Rohurokinasepräparaten oder aus Schlangengiftfraktionen. Bei der Gewinnung von reiner Urokinase nach dem erfindungsgemässen Verfahren verwendet man als Trennmittel vorzugsweise insolubilisiertes Chondroitinsulfat.
Für die Herstellung des insolubilisierten Chondroitinsulfates eignen sich die Chondroitinsulfate A, B oder C oder die im Handel erhältlichen technischen Gemische der drei Chondroitinsulfate A, B und C sowie deren Alkali- und Erdalkalisalze. Chondroitinsulfat kann dadurch insolubilisiert werden, dass man es nach einer an sich bekannten Methode mit den reaktiven Gruppen einer polymeren wasserunlöslichen Trägersubstanz zur Reaktion bringt und dadurch kovalent an den Träger bindet. Das insolubilisierte Chondroitinsulfat kann z.B. nach einem der von Schmer für die Insolubilisierung von Heparin beschriebenen Verfahren durch Bindung des Chondroitinsulfates an Agarose nach der Cyanogenbromidmethode, durch Bindung an Putrescinagarose nach der Thiophosgenmethode oder durch Bindung an Epsilonaminocaproylagarose nach der Carbodiimidmethode gewonnen werden [siehe G.
Schmer: The Biological Activity of Covalent Immobilized Heparin , Trans. Am. Soc. Artif.
Org. 18,321-323(1972)]. Man kann als Trägersubstanz auch Cellulose und ihre entsprechenden Derivate, d.h. Putrescincellulose und Epsilonaminocaproylcellulose, verwenden.
Insolubilisiertes Chondroitinsulfat kann zweckmässigerweise auch durch Umsetzung von Chondroitinsulfat mit in Form von Perlen genormter Grösse käuflich erhältlicher Cyanogenbromidagarose (z.B. CNBr- Sepharose 4B von der Firma AB Pharmacia, Uppsala, Schweden) hergestellt werden.
Die Behandlung des z.B. urokinasehaltigen Ausgangsmaterials mit insolubilisiertem Chondroitinsulfat, Chitin oder Chitosan (d.h. die Umsetzung der Urokinase mit Chondroitinsulfat) und die Abspaltung der Urokinase aus dem Umsetzungsprodukt kann chargenmässig durch Ausrühren des in Wasser, einer wässrigen Pufferlösung, einer wässrigen Neutralsalzlösung oder einer sowohl einen Puffer als auch ein Neutralsalz enthaltenden wässrigen Lösung gelösten Ausgangsmaterials mit dem insolubilisierten Chondroitinsulfat, Chitin oder Chitosan und nachfolgende Filtration oder aber vorzugsweise durch Affinitätschromatographie an einer Säule durchgeführt werden.
Bei der Affinitätschromatographie wird beispielsweise das insolubilisierte Chondroitinsulfat in einer Säule, deren Durchmesser etwa einem Zehntel ihrer Höhe entspricht, eingefüllt und mit demselben ersten wässrigen Medium, in welchem auch das Ausgangsmaterial gelöst ist, äquilibriert. Der Säulenauslauf wird zweckmässigerweise mit einem Durchflussphotometer verbunden, welches die optische Dichte der ausfliessenden Eluate bei einer geeigneten Wellenlänge (üblicherweise 280 nm oder 254 nm) misst und automatisch registriert. Die Eluate werden vorzugsweise mittels eines automatischen Fraktionensammlers in Fraktionen unterteilt und gesammelt.
Die Affinitätschromatographie kann im einzelnen wie folgt durchgeführt werden:
Das Ausgangsmaterial (Rohurokinase) wird in Wasser, einer wässrigen Pufferlösung oder Neutralsalzlösung gelöst bzw. verdünnt, klar filtriert oder zentrifugiert und dann auf die Chromatographiesäule gegeben. Die Säule wird mit dem gleichen ersten wässrigen Medium wie dasjenige, in welchem das Ausgangsmaterial gelöst wurde, so lange gewaschen, bis im auslaufenden Eluat keine UV-absorbierenden Substanzen mehr nachweisbar sind.
Nun wird die Säule mit dem zweiten wässrigen Medium (als Eluierungsmittel), z.B. einer Pufferoder Neutral salzlösung oder einer sowohl einen Puffer als auch ein Neutralsalz enthaltenden Lösung, deren Konzentration grösser ist als diejenige des ersten wässrigen Mediums, in welchem das Ausgangsmaterial gelöst wurde, gewaschen, um die Urokinase von dem insolubilisierten Chondroitinsulfat abzuspalten. Die Säule wird so lange gewaschen, bis kein UV-absorbierendes Material mehr eluiert wird.
Schliesslich wird die Säule mit einer Puffer- oder Neutralsalzlösung oder einer sowohl einen Puffer als auch ein Neutralsalz enthaltenden Lösung von so hoher Konzentration nachgewaschen, dass auch Substanzen, die stärker an das insolubilisierte Chondroitinsulfat gebunden sind als Urokinase, restlos aus der Säule entfernt werden, so dass das Affinitätsadsorbens nach Äquilibrierung mit dem gleichen Äquilibrierungsmittel wieder regeneriert wird und somit für einen neuen Arbeitsgang bereit ist.
Als Pufferlösungen eignen sich wässrige Lösungen von Salzen anorganischer oder organischer Basen mit anorganischen oder organischen Säuren oder Salze vom amphoteren Substanzen mit anorganischen oder organischen Säuren oder Basen, welche eine Pufferwirkung innerhalb des pH-Bereiches von 6 bis 9 entfalten.
Besonders geeignet sind untoxische Substanzen oder Substanzgemische, die keine aromatischen Gruppen aufweisen, daher Licht von einer Wellenlänge von 280 bzw. 254 nm nicht absorbieren und somit die UV-photometrische Uberwachung des Chromatographieverlaufs nicht stören, insbesondere Glycin/NaOH-, Essigsäure/NaOH-, Lysin/HC1-, Triäthanolamin/HC1-, Glycylglycin/HC1- und Natriumphosphatpuffer sowie auch vakuumflüchtige Puffersysteme wie Ammoniumformiat-, Ammoniumacetat- und Äthylendiamintetraacetatpuffer. Für das chargenmässige Arbeiten eignen sich auch Natriumhydrogencarbonat- und Ammoniumhydrogencarbonatpuffer, die jedoch wegen CO2-Entwicklung für das chromatographische Verfahren unbrauchbar sind.
Die Bindung der Urokinase an das insolubilisierte Chondroitinsulfat erfolgt bei einem pH von 6 bis 9 aus einer Puffer- oder Neutralsalzoder Puffer-Neutralsalz-Lösung in einem Molaritätsbereich von 0,005 bis 0,2. Zur Abspaltung der Urokinase können im gleichen pH-Bereich Puffer- oder Neutralsalzlösungen oder Puffer-Neutralsalz-Lösungen verwendet werden, die jedoch eine höhere Konzentration aufweisen als die zur Umsetzung der Urokinase mit dem insolubilisierten Chondroitinsulfat verwendete Lösung. Vorzugsweise verwendet man die gleiche Pufferlösung wie diejenige, welche zur Bindung der Urokinase an das insolubilisierte Chondroitinsulfat verwendet wurde, erhöht jedoch deren Konzentration durch Zusatz eines stark dissoziierenden Neutralsalzes, vorzugsweise Natriumchlorid, derart, dass das gebundene Enzym von dem insolubilisierten Chondroitinsulfat abgespalten wird.
Vorzugsweise wählt man zur Bindung der Urokinase an das insolubilisierte Chondroitinsulfat eine Puffer-Salz-Konzentration, die gerade noch die Urokinasebindung ermöglicht, eine unspezifische Proteinadsorption jedoch zurückdrängt, und zweckmässigerweise eine Konzentration von 0,005 bis 0,2 Mol pro Liter aufweist. Zur Eluierung wählt man vorzugsweise eine Puffer-Salz- Konzentration, welche die Bindung Urokinase-Chondroitinsulfat gerade löst, allfällig stärker gebundene Verunreinigungen jedoch nicht eluiert, vorzugsweise eine Konzentration von 0,05 bis 1 Mol pro Liter.
Der Urokinasegehalt der bei der Säulenchromatographie erhaltenen Eluate kann durch einen Lysetest an Rinderfibrin geprüft und anhand einer mit dem Internationalen Urokinasestandardpräparat aufgenommenen Eichkurve in Internationalen Einheiten berechnet werden; siehe G. H. Barlow in: Methods in Enzymology XLV, L. Lorand (Ed.), S.239, Academic Press, London, New York, San Francisco (1976).
Beispiel
10 g Natriumchondroitinsulfat wurden in 1 Liter 0,1 molarem Natriumbicarbonatpuffer, der 0,5 Mol pro Liter Natriumchlorid enthielt und ein pH von 8,3 aufwies, gelöst.
Der Lösung wurden 45 g CNBr- Sepharose 4B (AB Pharmacia, Uppsala), welche zuvor in 0,001 N Salzsäure gewaschen worden war, zugesetzt. Die Mischung wurde während 2 Stunden gerührt. Nach beendeter Reaktion wurde die Mischung durch eine Glasfilternutsche G-3 filtriert und das abfiltrierte Sepharose -Chondroitinsulfat fünfmal mit je 300 ml Natriumbicarbonatpuffer der oben angegebenen Zusammensetzung gewaschen. Zur Absättigung von allfällig noch vorhandenen reaktionsfähigen CNBr-Gruppen wurde das Sepharose -Chondroitinsulfat während 2 Stunden mit 1 Liter 0,5%dem Äthanolamin in Natriumbicarbonatpuffer der obigen Zusammensetzung gerührt. Das Sepharose Chondroitinsulfat wurde wiederum auf einer Glasfilternutsche gesammelt und noch dreimal mit je 300 ml Natriumbicarbonatpuffer gewaschen.
Nun wurde das Sepharose Chondroitinsulfat so lange mit 0,1 molaren Natriumacetatpuffer von pH 4,0 nachgewaschen, bis das pH des Filtrates 4,0 betrug. Schliesslich wurde das insolubilisierte Chondroitinsulfat mit mehreren Portionen 0,01molarem Lysinhydrochlorid, pH 7,2, nachgewaschen, in eine Säule von 26 mm Durchmesser eingefüllt und mit demselben Phosphatpuffer äquilibriert. Die Säule, die eine Höhe von 30 cm aufwies und somit etwa 160 ml gequollenes, insolubilisiertes Chondroitinsulfat enthielt, wurde nun zur absteigenden Chromatographie eingerichtet.
Der Säulenauslauf wurde über ein auf die Messung bei 280 nm eingestelltes, mit einem automatischen Schreiber ausgerüstetes Durchflussphotometer an einen Fraktionensammler, der zur Sammlung von Fraktionen von je 350 Tropfen (= ca. 23 ml) eingestellt war, angeschlossen.
5 g Rohurokinase mit einer Aktivität von 850 CTA-Einheiten pro mg (= insgesamt 4250000 CTA-Einheiten) wurden in 400 ml wässrigem 0,01 molarem Lysinhydrochlorid, pH 7,2, aufgenommen, während 30 Minuten am Magnetrührer gerührt und hierauf durch Zentrifugation bei 3000 Umdrehungen pro Minute während 5 Minuten von ungelösten Ballaststoffen befreit. Die schwach opaleszente Lösung wurde auf die äquilibrierte Chondroitinsulfatsäule gegeben. Ballaststoffe, Kallikrein und eine weitere, nicht identifizierte Protease wurden mittels 800 ml 0,01 molaren Lysinhydrochlorid, pH 7,2, aus der Kolonne herausgewasuchen. Hierauf wurde mit 0, Molarem Lysinhydrochlorid, pH 7,2, eluiert, bis 400 ml Flüssigkeit durchgeflossen waren, wobei in einem UV-absorbierenden Gipfel die Urokinase enthalten war.
Die Urokinase enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt, durch Ultrafiltration durch eine Diaflo Membran (Amicon, Lexington, Mass., USA) eingeengt. Es wurde ein Urokinasekonzentrat mit total 3 230 000 CTA-Einheiten und einer spezifischen Aktivität von 32000 Einheiten pro mg Protein erhalten.
Dieses Präparat erwies sich in einer Dosis von 25 000 Einheiten pro kg Körpergewicht am Kaninchen als pyrogenfrei; es war frei von blutdrucksenkenden Substanzen und von thromboplastischer Aktivität. Es konnte durch Elektrophorese in Natriumdodecylsulfat enthaltendem Polyacrylamidgel in zwei Hauptbanden zerlegt werden, deren Mobilität auf Molekulargewichte von a) etwa 31 500 (Urokinase I) und b) etwa 53 000 (Urokinase II) schliessen lassen. Die Ausbeute betrug 76,0%, und es wurde gegenüber dem Ausgangsmaterial eine 38fache Anreicherung an Urokinase erzielt.
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PATENT CLAIMS
1. A process for the production of pure plasminogen-activating proteinases from plasminogen-activating materials which, in addition to plasminogen-activating substances, also contain foreign substances, characterized in that the plasminogen-activating material is taken up in a first aqueous medium, any undissolved solids present, the remaining solution with a separating agent which consists of insolubilized chondroitin sulfate or chitin or chitosan bound to a water-insoluble carrier, in order to bind the plasminogen-activating proteinase to the separating agent and cleaves the plasminogen-activating proteinase from the separating agent by means of a second aqueous medium.
2. The method according to claim 1, characterized in that a) water or b) an aqueous 0.005-0.2 molar buffer solution having a pH of 6 to 9, or c) an aqueous 0.005-0.2 molar as the first aqueous medium Electrolyte solution, e.g.
an aqueous sodium chloride solution which has no or at most a weak buffer effect and a pH of 6 to 9, or d) an aqueous solution which contains both a buffer and a neutral salt and which has a total concentration of 0.005 to 0.2 mol / liter and a pH from 6 to 9 is used.
3. The method according to any one of claims 1 and 2, characterized in that one as a release agent by binding chondroitin sulfate to the reactive groups of a polymeric water-insoluble carrier, e.g.
Agarose, putrescine agarose, epsilonaminocaproyl agarose or cyanogen bromide agarose, obtained insolubilized chondroitin sulfate product is used.
4. The method according to any one of claims 1 to 3, characterized in that an aqueous buffer solution is used as the second aqueous medium, which has a molar concentration which is greater than that of the first aqueous medium and between 0.05 and 1 mol / liter , and which has a pH of 6 to 9.
5. The method according to claim 4, characterized in that the buffer solution is a neutral salt, e.g. Contains sodium chloride and has a total concentration of 0.05 to 1 mol / liter.
6. The method according to any one of claims 1 to 5, characterized in that it is carried out in batches by stirring the solution of the plasminogen-activating proteinase with the insolubilized chondroitin sulfate, filtering off the insoluble reaction product obtained and stirring with the second aqueous medium to the plasminogen-activating proteinase to separate from the insolubilized chondroitin sulfate.
7. The method according to any one of claims 1 to 5, characterized in that it is carried out by means of chromatography, by placing the solution of the plasminogen-activating proteinase in the first aqueous medium on a column consisting of the insolubilized chondroitin sulfate, washing the foreign substances out of the column and washes the column with the second aqueous medium to cleave the plasminogen activating proteinase from the insolubilized chondroitin sulfate and wash it out of the column.
8. A process for the preparation of pure urokinase according to one of claims 1 to 7, characterized in that a urokinase-containing protein mixture obtained from human urine is used as the plasminogen-activating starting material.
The present invention relates to a method for obtaining pure plasminogen activating proteinases, e.g. Urokinase, from plasminogen-activating materials that contain foreign substances in addition to plasminogen-activating proteinases.
Urokinase is known to be a proteinase contained in human urine in a small amount, which by limited proteolysis causes the activation of the zymogen plasminogen contained in the blood to the fibrinolytically active proteinase plasmin. Since the activation of plasminogen in the circulating blood can cause clots to dissolve, urokinase is used as a medication for the treatment of thromboembolic disorders.
Urokinase exists in at least two active molecular forms: urokinase I with a molecular weight of 31,000 to 32,000 and urokinase II with a molecular weight of 53,000 to 55,000. Urokinase is a proteolytic cleavage product of urokinase II. Pure urokinase II has a specific activity of 93 500 CTA units and their therapeutic effect is stronger and more persistent; Urokinase I has a specific activity of 218,000 CTA units and its therapeutic effect is weaker and shorter.
The CTA unit is the unit of measure determined by the Committee on Thrombolytic Agents, National Heart Institute (USA). It relates to the fibrinolytic effect of a standard preparation from the World Health Organization.
Numerous methods are known for separating the urokinase-containing protein fraction from human urine. For example, crude urokinase can be precipitated by adjusting the pH of the urine to 4.3 or the urine by adsorption on kaolin, bentonite, barium sulfate, silica gel, diatomaceous earth, calcium phosphate or on ion exchangers such as carboxymethyl cellulose, e.g. Amberlite IRC-50.
A protein fraction containing urokinase is according to Celander and Guest [Am. J. Cardiol. 6.409 (1960) 1 by foaming the collected urine by aeration, stirring or shaking and collecting the foam which contains 70% of the urokinase contained in the urine in about 20-fold enrichment.
An overview of the various techniques for obtaining urokinase from urine is provided by R. Paoletti and S. Sherry: Thrombosis and Urokinase, Academic Press, London, New York, San Francisco (1977).
Protein fractions from human urine containing urokinase obtained by the above-mentioned processes are traded as crude urokinase.
In addition to urokinase, commercially available raw urokinase can also contain the enzymes kallikrein, trypsin, uropepsin, the biologically active polypeptides urogastron, uroplastin, several pituitary hormones, polysaccharides and, in addition, changing amounts of febrile (pyrogenic) bacterial endotoxins.
White and Barlow [W. F. White and G. Barlow in: Methods of Enzymology Vol. 19, G. E. Perlmann and L.
Lorand (Ed.), P. 665, Academic Press, New York, London (1970)] describe a process for obtaining pure urokinase from urine foam by precipitation with ammonium sulfate, dissolving the precipitate in 3% sodium chloride solution, dialysis of the solution against 0 , 1 M phosphate buffer with pH 6.5, subsequent centrifugation, chromatography on Amberlite IRC-50 in 0.1 M phosphate buffer with pH 6.5, concentration of the active fraction by Ultrafil
tration, lyophilization and twice chromatography of the lyophilisate on Sephadex G-100. According to this method, a purified urokinase with a specific activity of 50,000 to 75,000 CTA units per mg protein is obtained in a yield of 35-42%.
According to US Patent No. 3,355,361, urokinase is obtained by adsorption on bentonite, elution with a solution of 6,9-diamino-2-ethoxy-acridine lactate, subsequent adsorption on calcium phosphate and elution with sodium phosphate buffer, treatment of the eluate with carboxymethyl cellulose, heat treatment and two further adsorption and elution stages with carboxymethyl cellulose.
GH Barlow [in: Methods in Enzymology XLV, L. Lorand (Ed.) P.239, Academic Press, New York, San Francisco, London (1976)] describes a process for the purification of crude urokinase by ultrafiltration, chromatography on an acidic ion exchanger (CG-50) using phosphate buffer and a sodium chloride gradient of 0-1 M, subsequent dialysis of the active eluate, chromatography on CM-Sephadex using acetate buffer and a NaC1 gradient, dialysis against a solution of sodium chloride and ethylenediaminetetraacetic acid and Gel chromatography on Sephadex G-75.
The processes mentioned are uneconomical, since they require many time-consuming work steps, a large outlay on equipment and labor, and deliver low yields.
Johnson et al. [in: Thrombosis and Urokinase, R. Paoletti and S. Sherry (Ed.)] describe the separation of urokinase by affinity chromatography on agmatine sepharose into two fibrinolytically active fractions with different molecular weights. This rational and easy to carry out process is unfortunately not suitable for the purification of crude urokinase, which also contains other serine proteases, since all serine proteases, such as the trypsin and kallikrein contained in the urine, have an affinity for agmatine.
According to Japanese Patent Application Laid-Open No. 7 899 383, urokinase is purified by affinity chromatography on insolubilized arginine or lysine and obtained with a purity of 25,000 CTA units per mg protein. Insolubilized lysine and arginine are again not very specific adsorbents, which adsorb numerous serine proteases (such as trypsin, kallikrein, plasmin, plasminogen, thrombin, etc.). In addition, arginine and lysine are relatively strong bases and, like anion exchangers, can bind various substances with acid properties non-specifically.
According to Japanese laid-open patent application 7 896 384, urokinase is obtained by chromatography on insolubilized heparin with a specific activity of 5369 CTA units per mg protein. However, insolubilized heparin is also able to bind other serine proteases, various plasma proteins, lipoproteins and lipases in addition to urokinase; In addition, insolubilized heparin binds various thrombin-like snake venom proteases, which is why it is also used to purify these enzymes according to German Patent No. 2734427.
It has now been found that insolubilized chondroitin sulfate, which despite its heparin-related structure does not have the ability to bind thrombin-like snake venom proteases and, in contrast to heparin, is unable to inhibit thrombin, surprisingly has a pronounced affinity for plasminogen-activating snake venom proteinases against a fibrinoyl-active tablet Thrombin preparations and urokinase. Urokinase was also found to have an affinity for chitin and chitosan.
It was also found that bacterial endotoxins (pyrogens), kallikrein, trypsin and other proteins contained in raw urokinase or urine have no affinity for insolubilized chrondroitin sulfate.
The process according to the invention for the production of pure plasminogen-activating proteinases consists in taking up a plasminogen-activating material, which in addition to a plasminogen-activating substance also contains foreign substances, in a first aqueous medium, and to separate any undissolved solids which may be present, the remaining solution with a separating agent which consists of at a insolubilized chondroitin sulfate bound in water-insoluble carrier or consisting of chitin or chitosan, in order to bind the plasminogen-activating substance to the separating agent and to split off the plasminogen-activating substance by means of a second aqueous medium from the separating agent.
The method according to the invention is particularly suitable for obtaining pure urokinase from urokinase-containing preparations, e.g. the protein fractions containing urokinase obtained from human urine or commercially available crude urokinase preparations or from snake venom fractions by known methods. When pure urokinase is obtained by the process according to the invention, preferably insolubilized chondroitin sulfate is used as the separating agent.
Chondroitin sulfates A, B or C or the commercially available technical mixtures of the three chondroitin sulfates A, B and C and their alkali metal and alkaline earth metal salts are suitable for producing the insolubilized chondroitin sulfate. Chondroitin sulfate can be insolubilized by reacting it with the reactive groups of a polymeric water-insoluble carrier substance by a method known per se and thereby covalently binding it to the carrier. The insolubilized chondroitin sulfate can e.g. by one of the methods described by Schmer for the insolubilization of heparin by binding the chondroitin sulfate to agarose using the cyanogen bromide method, by binding to putrescine agarose using the thiophosgene method or by binding to epsilonaminocaproyl agarose using the carbodiimide method [see G.
Schmer: The Biological Activity of Covalent Immobilized Heparin, Trans. Am. Soc. Artif.
Org. 18,321-323 (1972)]. Cellulose and its corresponding derivatives, i.e. Putrescincellulose and Epsilonaminocaproylcellulose, use.
Insolubilized chondroitin sulfate can expediently also be prepared by reacting chondroitin sulfate with cyanogen bromide agarose commercially available in the form of beads of standardized size (e.g. CNBr-Sepharose 4B from AB Pharmacia, Uppsala, Sweden).
The treatment of e.g. Urokinase-containing starting material with insolubilized chondroitin sulfate, chitin or chitosan (ie the reaction of the urokinase with chondroitin sulfate) and the cleavage of the urokinase from the reaction product can be carried out in batches by stirring the in water, an aqueous buffer solution, an aqueous neutral salt solution or a buffer as well containing aqueous solution of dissolved starting material with the insolubilized chondroitin sulfate, chitin or chitosan and subsequent filtration or preferably by affinity chromatography on a column.
In affinity chromatography, for example, the insolubilized chondroitin sulfate is poured into a column, the diameter of which corresponds to approximately one tenth of its height, and equilibrated with the same first aqueous medium in which the starting material is also dissolved. The column outlet is expediently connected to a flow photometer, which measures the optical density of the outflowing eluates at a suitable wavelength (usually 280 nm or 254 nm) and automatically registers them. The eluates are preferably divided into fractions and collected using an automatic fraction collector.
The affinity chromatography can be carried out in detail as follows:
The starting material (raw urokinase) is dissolved or diluted in water, an aqueous buffer solution or neutral salt solution, filtered clear or centrifuged and then added to the chromatography column. The column is washed with the same first aqueous medium as that in which the starting material was dissolved until no more UV-absorbing substances can be detected in the effluent.
Now the column with the second aqueous medium (as eluent), e.g. a buffer or neutral salt solution or a solution containing both a buffer and a neutral salt, the concentration of which is greater than that of the first aqueous medium in which the starting material has been dissolved, in order to cleave the urokinase from the insolubilized chondroitin sulfate. The column is washed until no more UV-absorbing material is eluted.
Finally, the column is washed with a buffer or neutral salt solution or a solution containing both a buffer and a neutral salt of such a high concentration that even substances that are more strongly bound to the insolubilized chondroitin sulfate than urokinase are completely removed from the column that the affinity adsorbent is regenerated again after equilibration with the same equilibration agent and is thus ready for a new operation.
Suitable buffer solutions are aqueous solutions of salts of inorganic or organic bases with inorganic or organic acids or salts of amphoteric substances with inorganic or organic acids or bases which have a buffering action within the pH range from 6 to 9.
Non-toxic substances or mixtures of substances which have no aromatic groups and are therefore particularly suitable are therefore not absorbing light of a wavelength of 280 or 254 nm and thus do not interfere with UV-photometric monitoring of the chromatography process, in particular glycine / NaOH, acetic acid / NaOH, Lysine / HC1, triethanolamine / HC1, glycylglycine / HC1 and sodium phosphate buffers as well as vacuum volatile buffer systems such as ammonium formate, ammonium acetate and ethylenediaminetetraacetate buffers. Sodium bicarbonate and ammonium bicarbonate buffers are also suitable for batch work, but are unusable for the chromatographic process due to the development of CO2.
The urokinase is bound to the insolubilized chondroitin sulfate at a pH of 6 to 9 from a buffer or neutral salt or buffer neutral salt solution in a molarity range of 0.005 to 0.2. To split off the urokinase, buffer or neutral salt solutions or buffer neutral salt solutions can be used in the same pH range, but which have a higher concentration than the solution used to react the urokinase with the insolubilized chondroitin sulfate. It is preferred to use the same buffer solution as that used to bind the urokinase to the insolubilized chondroitin sulfate, but increase its concentration by adding a strongly dissociating neutral salt, preferably sodium chloride, such that the bound enzyme is cleaved from the insolubilized chondroitin sulfate.
For the binding of the urokinase to the insolubilized chondroitin sulfate, a buffer salt concentration is preferably selected which just enables urokinase binding, but suppresses unspecific protein adsorption, and expediently has a concentration of 0.005 to 0.2 mol per liter. For the elution, a buffer salt concentration is preferably chosen which just releases the urokinase-chondroitin sulfate bond, but does not elute any more strongly bound impurities, preferably a concentration of 0.05 to 1 mol per liter.
The urokinase content of the eluates obtained by column chromatography can be checked by a lysis test on bovine fibrin and calculated in international units on the basis of a calibration curve recorded with the international urokinase preparation. see G.H. Barlow in: Methods in Enzymology XLV, L. Lorand (Ed.), p.239, Academic Press, London, New York, San Francisco (1976).
example
10 g of sodium chondroitin sulfate were dissolved in 1 liter of 0.1 molar sodium bicarbonate buffer, which contained 0.5 mol per liter of sodium chloride and had a pH of 8.3.
45 g of CNBr-Sepharose 4B (AB Pharmacia, Uppsala), which had previously been washed in 0.001 N hydrochloric acid, were added to the solution. The mixture was stirred for 2 hours. After the reaction had ended, the mixture was filtered through a glass suction filter G-3 and the filtered off Sepharose chondroitin sulfate was washed five times with 300 ml of sodium bicarbonate buffer of the composition indicated above. To saturate any remaining reactive CNBr groups, the Sepharose chondroitin sulfate was stirred for 2 hours with 1 liter of 0.5% of the ethanolamine in sodium bicarbonate buffer of the above composition. The Sepharose chondroitin sulfate was again collected on a glass suction filter and washed three times with 300 ml of sodium bicarbonate buffer.
The Sepharose chondroitin sulfate was then washed with 0.1 molar sodium acetate buffer of pH 4.0 until the pH of the filtrate was 4.0. Finally, the insolubilized chondroitin sulfate was washed with several portions of 0.01 molar lysine hydrochloride, pH 7.2, poured into a 26 mm diameter column and equilibrated with the same phosphate buffer. The column, which was 30 cm high and thus contained about 160 ml of swollen, insolubilized chondroitin sulfate, was now set up for descending chromatography.
The column outlet was connected via a flow photometer set to the measurement at 280 nm and equipped with an automatic recorder to a fraction collector which was set to collect fractions of 350 drops (= approx. 23 ml) each.
5 g of crude urokinase with an activity of 850 CTA units per mg (= a total of 4250000 CTA units) were taken up in 400 ml of aqueous 0.01 molar lysine hydrochloride, pH 7.2, stirred for 30 minutes on a magnetic stirrer and then by centrifugation 3000 revolutions per minute freed from undissolved fiber for 5 minutes. The weakly opalescent solution was applied to the equilibrated chondroitin sulfate column. Dietary fiber, kallikrein and another, unidentified protease were washed out of the column using 800 ml of 0.01 molar lysine hydrochloride, pH 7.2. The mixture was then eluted with 0 molar lysine hydrochloride, pH 7.2, until 400 ml of liquid had flowed through, the urokinase being contained in a UV-absorbing peak.
The fractions containing urokinase were pooled, concentrated by ultrafiltration through a Diaflo membrane (Amicon, Lexington, Mass., USA). A urokinase concentrate with a total of 3,230,000 CTA units and a specific activity of 32,000 units per mg protein was obtained.
In a dose of 25,000 units per kg of body weight in rabbits, this preparation was found to be pyrogen-free; it was free from hypotensive substances and from thromboplastic activity. It could be broken down into two main bands by electrophoresis in polyacrylamide gel containing sodium dodecyl sulfate, the mobility of which suggests molecular weights of a) about 31,500 (urokinase I) and b) about 53,000 (urokinase II). The yield was 76.0% and a 38-fold enrichment in urokinase was achieved compared to the starting material.