CH646714A5 - Aprosamin-derivate. - Google Patents

Description

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1. Aprosamin-Derivate der Formel

PATENTANSPRÜCHE

(I)

HOy worin n null oder eins und die Wellenlinie axiale oder äquatoriale Konfiguration bedeuten,

und deren pharmazeutisch annehmbaren Säureadditionssalze.

2. Aprosamin-Derivat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass in der Formel I n null und die Wellenlinie äquatoriale Konfiguration bedeuten.

Chemische Modifikationen von Aminoglykosid-Antibio-tika wurden intensiv erforscht, um deren antimikrobielle

Wirksamkeit zu erhöhen und Nebenwirkungen zu vermindern.

20 Es wurde gefunden, dass chemische Modifizierung der 8'-Hydroxygruppe von Aprosamin, das durch Hydrolyse von Apramycin hergestellt ist und beispielsweise in der JP-AS 51-36358 als Nebramycin Faktor II beschrieben ist, die antimikrobielle Wirksamkeit erhöht.

25 Gegenstand der Erfindung sind somit die im Patentanspruch 1 definierten Aprosamin-Derivate der Formel I und deren pharmazeutisch annehmbaren Säureadditionssalze.

Im nachstehenden ist die Strukturformel I der erfindungs-gemässen Aprosamin-Derivate unter Angabe der Numerie-

30 rung zur Verdeutlichung wiederholt.

C^nü on,

ÇH2-(OT^n-CH.OT2-°-^gr 6

NH,

OH

Die erfindungsgemässen Aprosamin-Derivate der Formel I umfassen sowohl die freie Base wie auch deren pharmazeutisch annehmbare, nicht toxische Säureadditionssalze. Für die Salzbildung geeignete Säuren sind beispielsweise anorganische, wie Chlorwasserstoff-, Bromwasserstoff-, Jodwasserstoff-, Schwefel-, Phosphor-, Kohlensäure und dergleichen;

. und organische, wie Essig-, Fumar-, Apfel-, Wein-, Malein-, Zitronen-, Mandel-, Ascorbin-, Gallussäure und dergleichen.

Die erfindungsgemässen Verbindungen der Formel I können nach dem nachstehenden Reaktionsschema herge-50 stellt werden, wie im nachstehenden angegeben:

h2N Aß'zK ÏS3

HO—U-Nl" NH OH

(II)

V \ nh2

3

HO—i®2 5 OH

1. Schritt: Hydrolyse

cox

NHCOX

(.IV)

NHCOX

OH

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2. Schritt:

>

Schutz von Aminogruppen

3. Schritt:

->

Schutz der 5- und 6-Hydroxygruppen

4. Schritt:

Acylierung der 8'-Hydroxygruppe

Y.—-0

Z

5. Schritt:

Basenbehandlung

6. Schritt:

Austausch der 5- und 6-Schutzgruppen

(VIIX)

JHCOX

Z20 —NHCOX OZ2

8. Schritt:

t

NHCOX

0 -^T^H HOCH -CH

Z20-Sf^J^ NHCOX j

(IX) OZ2

0 II

CH,

1 '

.NH

C*

il

0

(X)

+

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Im vorstehenden Reaktionsschema bedeuten Y eine zyklische Hydroxy-Schutzgruppe, Z1 Acyl, Z2 eine Hydroxy-Schutzgruppe, R Halogen, und n und die Wellenlinie haben die im Patentanspruch 1 definierte Bedeutung.

s

1. Schritt:

Apramycin wird hydrolysiert, was nach der im «Journal of Organic Chemistry», 41, S. 2087 (1976) beschriebenen Methode erfolgen kann. Zur Erhöhung der Ausbeute können Isolation und Reinigung mittels Ionenaustauscherharzen io ausgeführt werden.

2. Schritt:

Schutz der 1-, 3-, 2'- und 7'-Aminogruppen von Apro-samin. Als einzuführende Schutzgruppen werden solche is bevorzugt, die leicht abgespalten werden können, beispielsweise Benzyloxycarbonyl mit gegebenenfalls substituiertem Benzolring, Formyl, t-Butyloxycarbonyl, t-Amyloxycar-bonyl, Methoxy- und Äthoxycarbonyl, p-Toluolsulfonyl, Phthaloyl, m-Nitrophenylthio und Triphenylmethylthio, 20 wovon insbesondere Benzyloxycarbonyl bevorzugt wird.

Die Einführung von Schutzgruppen kann auf bekannte Art erfolgen, beispielsweise können, wenn die Schutzgruppe Benzyloxycarbonyl ist, mehr als 4 Äquivalente Carbobenz-oxychlorid eingesetzt werden. 25

3. Schritt:

Schutz der 5- und 6-Hydroxygruppen. Als Schutzgruppen werden solche bevorzugt, welche zu Ringschluss der 5- und 6-Hydroxygruppen führen, beispielsweise werden als Schutz- 30 mittel Cyclohexanon-dialkylketal, Dialkoxypropan und dergleichen verwendet, wobei insbesondere Cyclohexanon-dimethylketal bevorzugt wird. Das Schutzmittel kann in äquivalentem Mengenanteil oder im Überschuss, vorzugsweise in einem Mengenanteil von 1 -8 Äquivalenten, einge- 35 setzt werden. Dieser Schritt ist eine konventionelle, im Gebiet der Zuckerchemie gebräuchliche Methode und kann in einem inerten Lösungsmittel, wie Benzol, Toluol, Xylol und dergleichen, in Gegenwart eines katalytischen Mengenanteils einer Säure, wie Ameisen-, Essig-, p-Toluolsulfonsäure, aus- 40 geführt werden.

4. Schritt:

Die 8'-Hydroxygruppe wird acyliert. Als einzuführende Acylgruppe wird Formyl und Acetyl bevorzugt, die in Form 45 des entsprechenden Carbonsäureanhydrids oder -halogenids, beispielsweise Carbonsäurechlorid, -bromid und dergleichen, bei Zimmertemperatur oder unter Erwärmung eingesetzt werden können. Für die Einführung der Acetylgruppe kann beispielsweise Essigsäureanhydrid in äquivalentem so oder überschüssigem Mengenanteil, vorzugsweise 1-3 Äquivalente, eingesetzt werden. Das Acylierungsmittel in diesem Schritt reagiert auch mit der 6' -Hydroxygruppe unter Bildung des 6', 8'-di-geschützten Derivats als Nebenprodukt. In diesem Fall kann das 8' -geschützte Derivat nach konventio- 55 neiler Methode, beispielsweise durch Chromatographie, abgetrennt werden.

5. Schritt:

Die intramolekulare Kondensation zwischen der 60

6'-Hydroxygruppe und der 7'-Amino-Schutzgruppe kann in einem zweckentsprechenden Lösungsmittel, beispielsweise Hexan, Diäthyläther, Tetrahydrofuran, Dimethylformamid, Toluol, in Gegenwart einer Base ausgeführt werden. Hierfür geeignete Basen sind beispielsweise Alkalimetallhydride, wie 65 Lithium-, Natrium-, Kaliumhydrid und dergleichen; Alkali-metallhydroxide, wie Natrium-, Kaliumhydroxid und dergleichen; und Alkalimetall-Alkoholate, wie Natrium- und

Kalium-äthylat und dergleichen, wovon Alkalimetallhydride, insbesondere Natriumhydrid, bevorzugt werden beziehungsweise wird.

6. Schritt:

Elimination einer zyklischen, im 3. Schritt eingeführten Hydroxy-Schutzgruppe in 5- und 6-Stellung und anschliessende Einführung von Hydroxy-Schutzgruppen in die Hydroxygruppen in 5- und 6-Stellung.

Die Abspaltung kann durch Hydrolyse mit einer Säure, beispielsweise einer anorganischen, wie Salz-, Schwefel-, Phosphorsäure und dergleichen; einer organischen, wie Ameisen-, Essigsäure und dergleichen, in Abhängigkeit von der Art der jeweiligen Schutzgruppe, erfolgen. Diese Reaktion verläuft bei Zimmertemperatur und kann durch Erwärmen angeregt werden.

Die anschliessende Einführung von Schutzgruppen kann auf gleiche Art erfolgen, wie im 4. Schritt, und es können auch die in diesem Schritt genannten Schutzmittel verwendet werden. In dieser Reaktion können mehr als 2 Äquivalente des Schutzmittels eingesetzt werden.

7. Schritt:

Substitution des 8'-Acyloxy durch Halogen kann auf konventionelle Art erfolgen. Als Halogenierungsmittel geeignet sind beispielsweise Wasserstoffhalogenide, Phosphorhalogenide, Brom oder Jod in Gegenwart von Phosphor, Thionyl-und Sulfuryl-chlorid, wobei gasförmiger Halogenwasserstoff, insbesondere gasförmiger Chlorwasserstoff bevorzugt wird, der unter Kühlung in das Reaktionsgemisch eingeleitet werden kann.

8. Schritt:

Kondensation zwischen den Verbindungen der Formeln IX und X kann in Gegenwart einer Silberverbindung ausgeführt werden. Hierfür bevorzugte Silberverbindungen sind Silbercarbonat und/oder -perchlorat. Die Reaktion kann vorzugsweise unter Stickstoffatmosphäre und Lichtschutz bei Zimmertemperatur ausgeführt werden. Vorzugsweise wird dem Reaktionsmedium ein Trocknungsmittel, wie wasserfreies Calciumsulfat oder -carbonat, zugesetzt.

Die Produkte der Formel XI kommen aufgrund der in der Formel mit einem * bezeichneten C-Atome in 8'-Stellung, durch konventionelle Abtrennmethoden, wie Chromatographie, abgeschieden werden können, als vier Stereoisomere vor.

9. Schritt:

Hydrolytische Abspaltung des im 8. Schritt unter Kettenbildung eingeführten zyklischen Substituenten und hydrolytische Abspaltung der im 2. und 6. Schritt eingeführten Schutzgruppen. Die Hydrolyse kann nach bekannter Methode in Gegenwart eines Alkalis, wie Natrium-, Kaliumoder Calciumhydroxid, ausgeführt werden.

Die erhaltenen Produkte bestehen aus Isomeren und nötigenfalls können diese durch Trennmethoden, wie Chromatographie, voneinander getrennt werden. Zur Bildung der Säureadditionssalze können die erhaltenen Produkte vorzugsweise mit einer Säure, beispielsweise Schwefelsäure, behandelt werden.

Die erfindungsgemässen Aprosamin-Derivate der Formel I und deren pharmazeutisch annehmbaren, nicht toxischen Salze, zeigen überlegene antimikrobielle Wirksamkeit und sind gegenüber einiger Arten von gram-positiven und -negativen Bakterien wirksamer als Apramycin. Im nachstehenden sind die mit MIC bezeichneten minimalen inhibierenden Konzentrationen in (ig/ml der erfindungsgemässen Verbindung der Formel I, worin n null und die Wellenlinie äquato

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riale Konfiguration bedeuten, und vergleichsweise von Apramycin angeführt.

Getesteter Mikroorganismus Erfindungs- Apramycin gemässe Verbindung der Formel I

Staphylococcus aureus

APOIAAD (4')

3,13

6,25

Staphylococcus aureus

FDA209PJC-1

0,78

1,56

Staphylococcus aureus S-25

0,78

1,56

Staphylococcus aureus No. 74

1,56

3,13

Staphylococcus epidermis

ATCC-14990

0,2

0,39

Staphylococcus epidermis EP-18

0,39

0,78

Staphylococcus epidermis TB-172

0,2

0,39

Klebsiella pneumoniae Kl-159

25

50

Pseudomonas aeruginosa TB-766

25

>100

Serratia marcescens MA-23

3,13

6,25

Serratia marcescens MA-81

3,13

6,25

Enterobacter aerogenes AE-16

3,13

6,25

Enterobacter aerogenes AE-27

3,13

6,25

Proteus rettgeri Ret-48

12,5

25

Proteus rettgeri Ret-55

25

50

Proteus morganii Morg-74

3,13

6,25

Proteus morganii Morg-96

50

>100

Proteus vulgaris ATCC-6390

1,56

3,13

Aus der Tabelle geht hervor, dass die erfindungsgemässen Verbindungen der Formel I potente antimikrobielle Wirksamkeit gegen gram-positive und -negative Bakterien aufweisen und somit nützliche Arzneimittel für die Behandlung oder Verhinderung von verschiedenen, durch die vorstehend genannten Mikroorganismen erzeugten Infektionen bei Menschen und Tieren darstellen. Ausserdem können die Verbindungen der Formel I verderblichen Nahrungsmitteln als Germizide zugesetzt und als Desinfektionsmittel an Stellen eingesetzt werden, wo Bakterienbefall vorhanden oder zu befürchten ist.

Die erfindungsgemässen Verbindungen der Formel I können Menschen und Tieren oral oder parenteral verabreicht werden. Insbesondere pharmazeutisch annehmbare Säureadditionssalze, beispielsweise Sulfate und dergleichen, können in Form wässeriger Lösungen durch intravenöse, intramuskuläre oder subcutane Injektion verabreicht werden. Die Verbindungen der Formel I können in Form von Lösungen in hermetisch verschlossenen Ampullen, oder in Form von Kristallen, Feinkristallen, Pulver, Lyophilisat und dergleichen, die vor dem Gebrauch zu lösen sind, in Ampullen verpackt werden, wobei auch Stabilisatoren zugesetzt werden können.

In dieser Hinsicht können die Verbindungen der Formel I zusammen mit pharmazeutischen Hilfsmitteln, wie Verdünnungsmitteln, z.B. Stärke, Sucrose, Lactose, Calciumcarbonat, Kaolin und dergleichen; Streckmitteln, z.B. Lactose, Stärke, Calciumcarbonat und -phosphat, Kaolin, Bentonit, Tale und dergleichen; Gleitmitteln, z.B. Stearinsäure, Paraffin, Borsäure, Siliciumdioxyd, Natriumbenzoat, Poly-äthylenglykol und dergleichen, zu Pulvern, Tabletten, Granulat, Kapseln, Suppositorien, Trockensirup, Pastillen, Suspensionen, Emulsionen, Inhalationsmitteln, Augentropfen, Pulvern für lokale Behandlung, Lotionen, formuliert und angewendet werden.

Bei der Verwendung für die Behandlung von empfindlichen Infektionen an Menschen und Tieren können die Verbindungen der Formel I in einer täglichen Dosierung bei Injektionen von 0,01-5 g/kg, bei oraler Verabreichung von 0,01—10 g/kg und bei lokaler Anwendung in einer Dosierung von 0,01-10 g/kg alle 3-12 h verabreicht werden. Die Dosie-5 rang kann jedoch in Abhängigkeit der Empfindlichkeit patho-gener Bakterien, der Verabreichungsfrequenz und dem Zustand des Patienten, erhöht oder vermindert werden.

Im nachstehenden Beispiel wird die Erfindung unter Bezugnahme auf das vorstehende Reaktionsschema detail-10 liert erläutert:

Beispiel

3-Amino-2-hydroxypropyl-ß-aprosaminid a) Aprosamin der Formel III

ls 11,880 g (20 mmol) Apramycin-trihydrat der Formel II werden in 500 ml 4N Salzsäure gelöst und unter Erwärmung während 5,5 h bei 95°C gerührt. Dann werden dem Reaktionsgemisch zur Entfärbung 20 g Aktivkohle zugesetzt und es wird abfiltriert und unter vermindertem Druck konzen-20 triert. Der Rückstand wird mit 100 ml Wasser versetzt und weiterhin unter vermindertem Druck konzentriert. Dieses Vorgehen wird so lange wiederholt, bis 18,28 g eines hellgelben, schaumigen Materials erhalten werden, das in 100 ml Wasser gelöst und innert einer Zeitdauer von 36 min an 25 240 ml Ionenaustauscherharz «Dowex» 50 W x 2 vom H+-Typ adsorbiert wird. Dann wird die Säule mit 300 ml Wasser gewaschen und danach mit 5% Salzsäure zu 8 Fraktionen und dann nach der 9. aufeinanderfolgenden Fraktion von je 100 ml mit 10% Salzsäure eluiert. Die Fraktionen 30 Nrn. 3-5 werden vereinigt und unter vermindertem Druck verdampft. Der erhaltene Rückstand wird in 20 ml Wasser gelöst, mit 1 g Aktivkohle entfärbt und dann unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, wobei mit 85,8% Ausbeute 4,077 g 4-Amino-4-deoxy-D-glucopyranose-35 hydrochlorid erhalten werden.

Die Fraktionen Nrn. 13-24 werden vereinigt und unter vermindertem Druck konzentriert. Dem erhaltenen sirupartigen Rückstand wird Wasser zugesetzt und danach erneut unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wird in 40 10 ml Wasser gelöst und mit 200 ml Aceton versetzt, wonach die Wandung des Glasbehälters mit einem Glasstab gerieben wird. Überstehendes wird dekantiert und der resultierende ölige Rückstand wird in 3 ml Wasser erneut gelöst, dann mit 150 ml Aceton versetzt und die Wandung des Glasbehälters 45 erneut mit einem Glasstab gerieben. Das resultierende Pulver wird abfiltriert, mit Aceton gewaschen, in 150 ml Wasser gelöst und mit 3 g Aktivkohle entfärbt. Filtrat und Waschflüssigkeiten werden vereinigt und unter vermindertem Druck zur Trockne verdampft, wobei mit 88,8% Ausbeute so 10,280 g des Tetrahydrochlorid-trihydrats der Titelverbindung mit den nachstehenden Analysendaten erhalten werden:

[ag° + 53,0 ± 0,9°C (c = 1,075, H2O)

55

Elementaranalyse für C15H30N4O7 • 4HC1 • 3 H2O, Gew.%:

Ber.: C 31,15; H 6,97; Cl 24,52; N 9,69 Gef.: C 31,36; H 6,95; Cl 24,72; N 9,82

60

NMR: 6,40 (d, Hi, J=4Hz), 6,10 (d, J=4Hz), 5,80 (d, J=9Hz), 3,45 (s)

b) 1,3,2',7'-Tetra-N-benzyloxycarbonylaprosamin der 65 Formel IV, worin COX für COOCH2PI1 steht.

2,312 g (4 mmol) des Endproduktes vom Schritt a) werden in 20 ml Wasser gelöst, mit 1,90g (17,9 mmol) Natriumcar-bonat und 20 ml Aceton versetzt, wonach unter Kühlen und

7

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Rühren 2,56 ml (17,8 mmol, 1,12 Äquivalente) Carbobenz-oxychlorid zugegeben werden. Nach 10 min wird das Gemisch auf Zimmertemperatur erwärmt, während 3 h gerührt und dann mit Äthylacetat extrahiert. Die organische Schicht wird mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck konzentriert, wonach Diäthyläther zugesetzt wird. Die resultierende Ausfällung wird abfiltriert, in Methanol gelöst und zwecks erneuter Ausfällung mit Diäthyläther versetzt. Die Ausfällung wird über Phosphorpentoxyd unter vermindertem Druck getrocknet, wobei mit 94,0% Ausbeute 3,477 g der Titelverbindung erhalten werden. Ein Teil der erhaltenen Verbindung wird in Chloroform/Äthanol gelöst und zwecks Kristallisation mit Hexan versetzt, wobei die Titelverbindung in Form von feinen Prismen mit F. 233-234,5°C und den nachstehenden Analysendaten erhalten wird:

[a]g ° + 48,8 ± 0,9° (c= 1,005, DMF)

IR: vi**" 3570,3366,1692, 1531 cm"1

Elementaranalyse für C47H54N4O15 • 0,5H20, Gew.%:

Äquivalente) Essigsäureanhydrid unter Eiskühlung zugesetzt und das Gemisch wird während 3 h bei 0°C gehalten und danach unter vermindertem Druck konzentriert. Der Rückstand wird in 150 ml Diäthyläther gelöst, mit Saatkristallen 5 der Titelverbindung versetzt und bei Zimmertemperatur stehengelassen. Die erhaltenen 19,6 g Kristalle werden aus Chloroform/Äthanol umkristallisiert, wobei mit 65,3% Ausbeute 15,964 g der Titelverbindung in Form von Prismen mit F. 210-212°C und den nachstehenden Analysendaten 10 erhalten werden.

[a]2D3'° + 32,0 ± 0,7° (c= 1,012, CHCb) IR: v^i0'3585,3360,1755,1697, 1525 cm"1

15 Elementaranalyse für C55H64N4OÌ6, Gew.%:

Ber.: C 63,64; Gef.: C 63,37;

H 6,22; H 6,22;

N 5,40 N 5,40

Ber.: C 61,10; Gef.: C 61,05;

H 6,00; H 5,94;

N 6,06 N 6,09

c) l,3,2',7'-Tetra-N-benzyloxycarbonyl-5,6-0-cyclohexy-liden-aprosamin der Formel V, worin COX für COOCH2PI1

steht und Y die Konfiguration <ËX aufweist.

2,823 g (3,09 mmol) des Produktes aus Schritt b) werden in 110 ml Dimethylformamid gelöst, mit 3,03 ml (20,43 mmol, 6,6 Äquivalente) Cyclohexanon-dimethylketal und 360 mg Toluolsulfonsäure versetzt und das Gemisch wird unter Rühren bei vermindertem Druck von 26,7 mbar auf 50°C erwärmt und während 7,5 h gerührt. Das Reaktionsgemisch wird auf Zimmertemperatur gekühlt und nach Zugabe von 1 ml Triäthylamid in 400 ml Eiswasser gegossen. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen, in Chloroform gelöst, über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck verdampft. Der erhaltene Rückstand von 4 g wird säulenchromatographiert unter Verwendung von 110 g «Kieselgel» 60 v. Merck & Co. und eines 3:1 bis l:l-Gemi-sches von Benzol und Äthylacetat als Eluierungsmittel eluiert und das Eluat unter vermindertem Druck konzentriert, wobei mit 84% Ausbeute, 2,575 g der Titelverb, erhalten werden. Ein Teil der erhaltenen Verbindung wird aus Chloroform/Di-äthyläther umkristallisiert, wobei das reine Produkt in Form von feinen Prismen mit F. 142-150°C und den nachstehenden Analysendaten erhalten wurde:

[a]2D2'° + 33,0 ± 0,7° (c= 1,022, CHCb)

IR: 3430,3375,3340,1720,1698,1665, 1545, 1523 cm"1

Elementaranalyse für C53H62NtOi5* 1,5H20, Gew.%:

Ber.: C 62,28; H 6,41; N 5,48 Gef.: C 62,29; H 6,32; N 5,37

d) 8'-0-Acetyl-l,3,2',7'-tetra-N-benzyloxycarbonyl-5,6-O-cyclohexyliden-aprosamin der Formel VI, worin COX für COOCH2PI1 und Z1 für CH3CO stehen und Y die Konfigura-

20 6 g der in der ersten Kristallisationsstufe erhaltenen Mutterlauge und 3,6 g derjenigen aus der Umkristallisation werden vereinigt und säulenchromatographiert unter Verwendung von 190 g «Kieselgel» 60 und einem 8:2-Gemisch von Benzol und Äthylacetat, wobei mit 10,1% Ausbeute 25 2,589 g 6',8'-Di-0-acetyl-l,3,2',7'-tetra-N-benzyl-oxycar-bonyl-5,6-0-cyclohexylidenaprosamin als Nebenprodukt der nachstehenden Analysendaten erhalten werden.

[a]"'5 + 37,2 ± 0,7° (c= 1,047, CHCb) 30 IR:v™cl,3440,1752,1720,1511 cm"1

Elementaranalyse für C58H66N4O17, Gew.%:

Ber.: C 63,44; H 6,16; N 5,19 35 Gef.: C 63,26; H 6,11; N 5,15

Zusätzliche Elution mit einem 7,5:2,5-Gemisch von Benzol und Äthylacetat ergibt eine zusätzliche Menge von 5,0 g der Titelverbindung, die aus Chloroform/Äther umkristallisiert 40 mit 14,8% Ausbeute 3,602 g Prismen mit F. 203-206°C

ergeben. Die Gesamtausbeute von 80,1 % der Titelverbindung beträgt somit 19,566 g.

e) 8 ' -O-Acetyl-1,3,2' -tri-N-benzyloxycarbonyl-7 ' -N-6' -0-carbonyl-5,6-0-cyclohexyliden-aprosamin der Formel 45 VII, worin COX für COOCIfcPh und Z' für CH3CO stehen und Y die Konfiguration aufweist.

tion dX

aufweist.

23,50 g(23,6 mmol) des Produktes aus Schritt c) werden in 450 ml Pyridin gelöst und daraus unter vermindertem Druck 20 ml Pyridin verdampft. Dann werden 4,7 ml (50 mmol, 2,1

25,780 g (24,86 mmol) des Produktes aus Schritt d) werden 50 in 200 ml Dimethylformamid und 800 ml Tetrahydrofuran gelöst und unter Rühren und Stickstoffatmosphäre eisgekühlt. Dann werden ohne Waschen 1,40 g (29,16 mmol, 1,17 Äquivalente) 50% Natriumhydrid zugegeben. Nach 50 min werden 1,8 ml (30 mmol) Essigsäure zugesetzt und das 55 Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck verdampft. Dem Rückstand werden 200 ml Pyridin und 100 ml Essigsäureanhydrid zugesetzt, dieser dann während 2 h bei Zimmertemperatur stehengelassen und danach unter vermindertem Druck konzentriert, wonach der Rückstand in Eiswasser «0 gegossen wird. Die resultierende Ausfällung wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen, in Chloroform gelöst, über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck konzentriert. Der konzentrierten Lösung wird n-Hexan zugesetzt und die resultierende Ausfällung wird abfiltriert, wobei 24 g «s der Titelverbindung in Form des Rohproduktes erhalten werden. Ein Teil der erhaltenen Verbindung wird säulenchromatographiert unter Verwendung von «Kieselgel» 60 als Adsorbtionsmittel und 1% Methanol enthaltendem Chloro

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8

form als Eluierungsmittel. Das erhaltene Endprodukt zeigt die nachstehenden Analysendaten:

[afe3 + 32,7 ± 0,7° (c=0,952, CHCb)

IR:v™c1'3440, 1762,1720,1512cm"1

Elementaranalyse für CtsHsóNtOis, Gew.%:

Ber.: C 62,06; H 6,08; N 6,03 Gef.: C 61,84; H 6,07; N 5,94

0 5,6,8'-Tri-O-acetyl-1,3,2'-tri-N-benzyloxycarbonyl-7'-N-6'-0-carbonylaprosamin der Formel VIII, worin COX für COOCH2PI1 und Z1 und Z2 beide für CH3CO stehen.

23,9 g des im Schritt e) erhaltenen Rohproduktes werden in 200 ml Essigsäure und 50 ml Wasser gelöst, unter Erwärmung auf 60°C während 1 h gerührt und dann auf 3°C abgekühlt. Die resultierende Ausfällung wird abfiltriert, nacheinander mit Aceton und Diäthyläther gewaschen und in 200 ml Pyridin und 100 ml Essigsäureanhydrid gelöst. Die erhaltene Lösung wird während 8 h auf 60°C erwärmt, über Nacht bei Zimmertemperatur stehengelassen und dann in Eiswasser gegossen. Die Ausfällung wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen, in Chloroform gelöst, mit 10%-Salzsäure-Wasser-5%-Natriumhydrogencarbonat-Wasser in der angegebenen Reihenfolge gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck verdampft. Der erhaltene Rückstand chromatographiert unter Verwendung von «Kieselgel» 60 als Adsorptionsmittel und einem 98:2-Gemisch von Chloroform und Chloroform/Methanol. Das Eluat wird unter vermindertem Druck zur Trockne verdampft und zur Titelverbindung aus Chloroform/Äthanol umkristallisiert. Bei der ersten Ernte werden mit 78,1% Ausbeute 18,113 g der Titelverbindung mit F. 261,5-263°C und bei der zweiten Ernte mit 4,8% Ausbeute 1,009 g der Titelverbindung mit F. 262-263°C erhalten, so dass bei der Gesamtausbeute von 82,9% insgesamt 19,122 g der Titelverbindung erhalten werden.

Ein Teil der Kristalle aus der ersten Ernte wird erneut aus Chloroform/Hexan umkristallisiert, wobei die reine Titelverbindung mit F. 263-265°C und den nachstehenden Analysendaten erhalten wird:

[afe5 + 34,5 ± 0,7° (c= 1,041, CHCb) IR: v^013360,1758,1744,1697,1531 cm"1

Elementaranalyse für C46H52N4O17, Gew.%:

Ber.: C 59,22; H 5,62; N 6,06 Gef.: C 59,24; H 5,55; N 6,00

g) 5,6-Di-O-acetyl-1,3,2' -tri-N-benzyloxycarbonyl-7' -N-6'-0-carbonylaprosaminyl-chlorid der Formel IX, worin COX für COOCHzPh, Z2 für CH3CO und R für Cl stehen.

3,000 g (3,22 mmol) des Produktes aus Schritt f) werden in 105 ml wasserfreiem Chloroform gelöst und dann etwa 10 ml des Lösungsmittels durch azeotrope Destillation bei normalem Atmosphärendruck entfernt. Dann wird unter Kühlung 0,38 ml Essigsäureanhydrid zugesetzt und während 3,5 h gasförmiger Chlorwasserstoff eingeleitet, wonach das Lösungsmittel unter vermindertem Druck bei Zimmertemperatur verdampft wird, wobei 3,153 g der Titelverbindung erhalten werden. Diese wird zweimal aus einem Gemisch von Chloroform und Acetonitril und danach einmal aus Acetoni-tril umkristallisiert, wobei mit 70,0% Ausbeute 2,047 g der Titelverbindung in Form feiner Nadeln mit F. 257-257,5°C (Zers.) und den nachstehenden Analysendaten erhalten werden:

[afe65 - 35,1 ± 0,8° (c= 1,001, DMF)

Elementaranalyse für C44H49CIN4O15, Gew.%:

s Ber.: C 58,11; H 5,43; Cl 3,90; N 6,16 Gef.: C 58,16; H 5,37; Cl 4,12; N 6,16

h) (2-Oxazolidin-5-yl)-methyl-5,6-di-0-acetyl-l,3,2'-tri-N-benzyloxycarbonyl-7'-N-6'-0-carbonyl-ß-aprosaminid 10 der Formel XI, worin COX für COOCH2PI1, Z2 für CH3CO und n für null stehen.

2,000 g (2,2 mmol) des Produktes aus Schritt g) und 618 mg (5,28 mmol, 2,4 Äquivalente) 5-Hydroxymethyl-2-oxazoli-dinon der Formel X, hergestellt nach der in der JP-OS 15 51-16661 beschriebenen Methode, werden in 600 ml Chloroform gelöst und bei normalem Atmosphärendruck auf etwa 400 ml eingedickt. Dann werden nacheinander unter Stickstoffatmosphäre bei Zimmertemperatur 1,280 g (4,64 mmol, 1,14 Äquivalente) Silbercarbonat, 8,780 g unter vermin-20 dertem Druck bei 110°C über Phosphorpentoxid getrocknetes «Drierite» von W.A. Hammond Drierite Co., Xenia, Ohio, USA, und 130 mg (0,627 mmol) Silberperchlorat zugesetzt und das Gemisch wird unter Lichtschutz bei Zimmertemperatur gerührt. Nach 1,5 h Rühren wird anorganisches 25 Material abfiltriert und mit Chloroform gewaschen. Das Filtrat und Waschchloroform werden vereinigt, mit 5% wäss-riger Lösung von Natrium-hydrogencarbonat und dann mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck verdampft. Der Rückstand von 2,23 g 30 wird flüssigchromatographiert unter Verwendung von zwei in Serie geschalteten «Prepack»-Säulen, Grösse B, von Merck & Co., und mit einem l:l-Gemisch von Acetonitril und Chloroform zur Fraktion 150 und danach mit Acetonitril mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 10 ml/min in Frak-35 tionen von 20 ml eluiert. Die Fraktionen Nrn 54-130 werden vereinigt, das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck verdampft und der Rückstand von 1,349 g auf der gleichen Säule wie vorstehend beschrieben mit einem 19:1-Gemisch von Chloroform und Methanol mit einer Durchflussge-40 schwindigkeit von 15 ml/min in Fraktionen von 15 ml eluiert. Die Fraktionen Nrn 27-42 werden vereinigt, das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck verdampft und der erhaltene Rückstand von 1,243 g wird mit Chloroform/Hexan ausgefällt, wobei mit 56,0% Ausbeute ein 45 Gemisch von Stereoisomeren der Titelverbindung der Formel XI, worin die Wellenlinie äquatoriale Konfiguration bedeutet, in Form eines Pulvers mit den nachstehenden Analysendaten erhalten werden:

so [afe4 5 + 21,8 ± 0,6° (c= 1,060, CHCb)

IR: v™Ch 3480,3430,3303, 1755,1717,1509 cm"1

Elementaranalyse für C48H55N5O18 • H2O, Gew.%:

ss Ber.: C 57,19; H 5,70; N 6,95 Gef.: C 57,41; H 5,58; N 6,75

NMR: 8£pDmc|-CD'OD(2:" 7,38 (s), 5,10 (s), 2,74 (s), 1,86 (s), 1,77 (s)

60 Die Fraktionen Nrn 152-161 aus dem ersten Chromatogra-phie-Durchgang werden vereinigt und das Lösungsmittel wird verdampft, wobei 100 mg Stereoisomere a) der Titelverbindung der Formel XI, worin die Wellenlinie axiale Konfiguration bedeutet, erhalten werden.

65 Die Fraktionen Nrn 162-210 werden vereinigt und das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck abdestilliert, wobei 584 mg eines Gemisches (a+b) von Stereoisomeren der Titelverbindung der Formel XI, worin die Wellenlinie axiale

9

646 714

Konfiguration bedeutet, erhalten werden. Das erhaltene Gemisch wird auf der gleichen, vorstehend beschriebenen Säule chromatographiert und mit einem 19:1 -Gemisch von Chloroform und Methanol mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 8 ml/min in Fraktionen von 20 ml eluiert.

Die Fraktionen Nrn 10-14 werden vereinigt und das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck abdestilliert. Der erhaltene Rückstand von 240 mg und die 100 mg der wie vorstehend erhaltenen Stereoisomere a) werden vereinigt und mit Chloroform/Hexan ausgefällt, wobei mit 14,6% Ausbeute 323 mg Stereoisomere a) der Titelverbindung der Formel XI, worin die Wellenlinie axiale Konfiguration bedeutet, erhalten werden. Die Fraktionen 16-27 werden vereinigt und das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck abdestilliert. Der erhaltene Rückstand von 328 mg wird mit Chloroform/Hexan ausgefällt, wobei mit 14,5% Ausbeute 317 mg des Stereoisomers b) der Titelverbindung der Formel XI, worin die Wellenlinie axiale Konfiguration bedeutet, erhalten werden.

Die erhaltenen Stereoisomere a) und b) weisen die nachstehenden Analysendaten auf:

Stereoisomer a)

[afe45 - 21,8 ± 0,6° (c-1,071, CHCb)

IR: v™Cb 3425,3290, 1756,1720,1505 cm"1

Elementaranalyse für GtsHssNsOis- H2O, Gew.%:

Die Fraktionen Nrn 74-85 werden vereinigt, unter vermindertem Druck konzentriert und der erhaltene Rückstand von 180 mg wird an 132 ml «CM-Sephadex» C-25 vom NH^-Typ adsorbiert. Dann wird die Säule mit 660 ml Wasser gewa-s sehen und mit je 11 Wasser und 0,5N Ammoniumhydroxidlösung nach der Gradientmethode mit Fraktionen von 14 ml eluiert.

Die Fraktionen Nrn 82-93 werden vereinigt und unter vermindertem Druck konzentriert. Der erhaltene Rückstand von 1» 162 mg wird mit 15 ml 0,1 N Schwefelsäure auf pH-Wert 4,5 gestellt, unter vermindertem Druck auf 1-2 ml Volumen eingeengt und dann mit Äthanol versetzt. Die resultierende Ausfällung wird abfiltriert, mit Äthanol gewaschen, in Wasser gelöst und mit 23 mg Aktivkohle behandelt. Nach 30 min »s wird das Gemisch durch ein Glasfilter der Millipore Corp. filtriert, mit Wasser gewaschen und das Filtrat und die Waschflüssigkeiten werden vereinigt und dann lyophilisiert. Der erhaltene Rückstand wird in einem 200 g Natrium-bromid und 100 ml Wasser enthaltendem Exsikkator bis zur 2» Gewichtskonstanz gelagert, wobei mit 49,6% Ausbeute 251 mg der Titelverbindung als Sulfat mit den nachstehenden Analysendaten erhalten werden:

25

[afe3 + 66,8 ± 1,0° (c= 1,066, H2O)

Elementaranalyse für C18H37N5O8 • 2,5H2SC>4 • 8,5H20, Gew.%

Ber.: C 57,19; Gef.: C 56,92;

H 5,70; H 5,42;

N 6,95 N 6,82

Ber.: C 25,44; 30 Gef.: C 25,35;

H 7,00; H 6,93;

N 8,24; N 8,33;

S 9,43 S 9,58

NMR: S™cb-CDlOD(2;1) 7,40 (s), 5,07 (s), 2,55 (s), 1,83 (s), 1,70 (sj NMR: 8PD$ 6,33 (d, J=4Hz), 5,57 (d, J=9Hz), 3,38 (s)

Stereoisomer b)

[afe4-5 + 4,0 ± 0,4° (c=0,986, CHCb)

IR: v™cb 3430,3290, 1758,1720, 1513 cm"1

Elementaranalyse für GjsHssNsOis • H2O, Gew.%:

Ber.: C 57,19; Gef.: C 56,92;

H 5,70; H 5,38;

N 6,95 N 6,85

NMR: ôpcpDmCb-CDlOD(2:1) 7,38 (s), 5,10 (s), 2,60 (s), 1,86 (s), 1,83 (s)

i) 3-Amino-2-hydroxypropyl-ß-aprosaminid der Formel I, worin n null bedeutet.

600 mg (0,595 mmol) des im Schritt h) erhaltenen Gemisches von Stereoisomeren der Formel XI, worin die Wellenlinie äquatoriale Konfiguration bedeutet, wird in 7,2 ml Dioxan gelöst, dann mit 7,2 ml Wasser und 17,8 ml (35,6 mmol, 59,8 Äquivalente) 2N Natriumhydroxidlösung versetzt und unter Stickstoff während 3 h auf Rückflusstemperatur gehalten. Dann wird das Reaktionsgemisch auf Zimmertemperatur gekühlt und durch Zusatz von 12 ml 10% Salzsäure auf pH-Wert 7 gestellt. Die erhaltene Lösung wird an 144 ml Ionenaustauscherharz «Amberlite» CG-50 vom NH4-Typ adsorbiert und dann wird die Säule mit 720 ml Wasser gewaschen und mit 11 Wasser und 0,3N Ammoniumhydroxidlösung nach der Gradientmethode bis zu der Fraktion Nr. 150 und danach mit IN Amminiumhydroxidlösung mit Fraktionen von 10 ml eluiert. Ab Fraktion Nr. 151 werden alle weiteren Fraktionen vereinigt und unter vermindertem Druck konzentriert und der erhaltene Rückstand von 188 mg wird an 132 ml des vorstehend genannten Ionenaustauscherharzes adsorbiert und die Säule mit 660 ml Wasser gewaschen und dann mit je 11 Wasser und IN Ammoniumhydroxidlösung nach der Gradientmethode mit Fraktionen von 13 ml eluiert.

Die Fraktionen Nrn 120-150 der ersten Chromatographie 35 werden vereinigt und unter vermindertem Druck konzentriert. Der erhaltene Rückstand von 98 mg wird an 60 ml «CM-Sephadex» C-25 vom NH4-Typ adsorbiert. Dann wird die Säule mit 300 ml Wasser gewaschen und mit je 11 Wasser und 0,15N Ammoniumhydroxidlösung nach der Gradient-40 methode mit Fraktionen von 11 ml eluiert.

Die Fraktionen Nrn 82-97 werden vereinigt und unter vermindertem Druck konzentriert. Der erhaltene Rückstand von 90 mg wird in 1 ml Wasser gelöst und mit 5 ml 0,1N Schwefelsäure auf pH-Wert 4,5 gestellt. Die Lösung wird unter ver-45 mindertem Druck auf 1-2 ml Volumen eingeengt und dann mit Äthanol versetzt. Die resultierende Ausfällung wird abfiltriert, mit Äthanol gewaschen, in Wasser gelöst und mit 10 mg Aktivkohle behandelt. Nach 30 min wird das Gemisch durch ein Glasfilter der Millipore Corp. filtriert; das Filtrat 50 und die Waschflüssigkeiten werden vereinigt und dann lyophilisiert. Der erhaltene Rückstand wird in einem 200 g Natriumbromid und 100 ml Wasser enthaltenden Exsikkator bis zur Gewichtskonstanz gelagert, wobei mit 26,8% Ausbeute 120 mg 3-Amino-2-hydroxypropyl-l-3-N,N-carbonyl-55 ß-aprosaminid der Formel XII, worin n null bedeutet, in Form von Sulfat als Nebenprodukt mit den folgenden Analysendaten erhalten werden:

60 [afe4-0 + 93,1 ± 1,3° (c= 1,001, H2O)

Elementaranalyse für C19H35N5O9 • 1,5H2S04 - 7H2O, Gew.%:

es Ber.: C 30,40; H 6,98; N 9,33; S 6,41 Gef.: C 30,53; H 6,97; N 9,41; S 6,50

NMR: 5pDp° 5,93 (d, J=4Hz), 5,60' (d, J=9Hz), 3,40 (s)