CH643298A5 - Procede de fabrication de nouveaux antibiotiques. - Google Patents
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Description
Cette invention permet de disposer d'un nouveau procédé de préparation des facteures A, B, C et D de l'antibiotique A-40 104. Ces facteurs ont un spectre antibiotique utilisable s qui comprend non seulement un certain nombre de bactéries grampositives et gram-négatives et de bactéries anaérobies mais également les organismes Mycoplasma. On a trouvé de nouveau agents pouvant servir potentiellement pour le traitement des maladies de la volaille, des porcs et du bétail dues io aux organismes Mycoplasma, et pour le traitement de la dysenterie porcine due à Treponema hyodysenteriae.
Cette invention concerne un procédé de fabrication d'un élément du groupe comprenant: un mélange antibiotique A-40 104 comprenant les facteurs A, B et D et la pleuromuti- 15 line; le facteur A de l'antibiotique A-40 104, le facteur A 19, 20-dihydrogéné et les dérivés tétra-alcanoyliques en C2-C6 du facteur A et du facteur A 19,20-dihydrogéné. le facteur B de l'antibiotique A-40 104, le facteur B 19,20-dihydrogéné et les dérivés tri-alcanoyliques en C2-C6 du facteur B et du facteur B 20 19,20-dihydrogéné; la pleuromutiline; et le facteur D de l'antibiotique A-40 104, procédé qui consiste:
a) à cultiver Clitopilus pseudo-pinsitus NRRL 11 179 ou un de ses mutants producteurs de A-40 104, dans un milieu de culture contenant des sources assimilables de glucide, d'azote 25 et de sels minéraux dans des conditions de fermentation aérobie en immersion jusqu'à production d'une quantité substantielle d'activité antibiotique;
b) à séparer éventuellement le mélange antibiotique
A-40 104 du milieu de culture; 30
c) éventuellement à isoler du mélange réactionnel le facteur A de l'antibiotique A-40 104, le facteur B de l'antibiotique A-40 104, la pleuromutiline ou le facteure D de l'antibiotique A-40 104;
d) à hydrogéner éventuellement le facteur A ou le facteur 35 B de l'antibiotique A-40 104 pour obtenir le facteur A ou le facteur B 19,20-dihydrogénésdeA-40 104;
e) à acyler éventuellement le facteur A, le facteur A19, 20-dihydrogéné, le facteur B ou le facteur B 19,20-dihydro-géné de l'antibiotique A-40 104, pour obtenir les dérivés tètra- 40 alcanoyliques en C2-C6 du facteur A ou du facteur A 19,20-dihydrogéné ou les dérivés tri-alcanoyliques en C2-C6
du facteur B ou du facteur B 19,20-dihydrogéné.
Cette invention concerne également une composition pharmaceutique qui comporte un ingrédient inerte et, comme 45 ingrédient actif, un antibiotique du groupe décrit précédemment, et une composition vétérinaire qui comporte un ingrédient inerte et, comme ingrédient actif, un antibiotique du même groupe, obtenus par le procédé défini ci-dessus.
L'invention concerne également le microorganisme Clito- 50 pilus pseudo-pinsitus NRRL 11 179 qui est utilisé dans le procédé selon l'invention.
Les spectres d'absorption infra-rouge des facteurs suivantes de A-40 104 (effectués en pastilles de KBr) sont donnés dans les dessins annexés: 55
Figure 1 : facteur A de A-40 104
Figure 2: facteur B de A40 104.
Les dérivés 19,20-dihydrogénés des facteurs A et B de A-40 104 et les dérivés per-alcanoyliques en C2-C6 des facteurs A et B de A-40 104 et de leurs dérivés 19,20-dihydrogé- 60 nés font également partie de cette invention.
Les facteurs A et B de A-40 104 sont apparentés au point de vue structure l'un à l'autre et au facteur C de A-40 104 qui est l'antibiotique connu, la pleuromutiline. Au moins quatre facteurs antibiotiques sont produits simultanément pendant 65 la fermentation pour donner le complexe antibiotique A-40 104 de cette invention. La pleuromutiline et le facteur A de A-40 104 peuvent être séparés du bouillon de fermentation filtré par des modes opératoires d'extraction appropriés. Le facteur B de A-40 104, un facteur mineur, peut être séparé et isolés par des procédés chromato-graphiques. L'autre facteur mineur, le facteur D de A-40 104 peut être séparé par Chromatographie mais n'a pas encore été isolé en quantité suffisante pour la caractérisation.
Les paragraphes suivants décrivent les propriétés physiques et spectrales des facteurs A et B de A-40 104.
Facteur A de A-40104
Le facteur A de A-40 104 cristallise dans le chloroforme et a un point de fusion d'environ 117-120 °C. Il a une formule empirique de C27 H42 09, comme le montre l'analyse élémentaire, et un poids moléculaire de 510, comme le montre la spectrométrie de masse avec désorption de champ.
Le spectre d'absorption ultraviolet du facteur A de A-40 104 dans le trifluoroéthanol présente un maximum d'absorption à nm (e 32).
Le spectre de dichroïsme circulaire du facteur A de A-40 104 dans le trifluoroéthanol présente les maximum suivants:
Ae= +2,84 à 200 mm As= +1,72 à 295 nm
Le facteur A de A-40104 a le pouvoir rotatoire suivant: [a]^ —14° (c 1,0, C2H5OH).
Le titrage électrométrique du facteur A de A-40104 dans, le diméthylformamide aqueux à 66% indique qu'il n'y a pas de groupements titrables.
Le spectre d'absorption infrarouge du facteur A de A-40 104 en pastilles de KBr est représenté sur la figure 1 des dessins annexés. Les maxima d'absorption les plus significatifs se trouvent aux fréquences suivantes (cm"1): 3590,3500 3450 (large), 3280 (large), 2990,2980,2960,2940,2920,2890, 28'60,1755,1735,1645,1465,1447,1420,1380,1330,1310, 1274,1240,1220,1160,1117,1093 1070 1060,1040,1014, 984,955,940,921,905,865,760,742,698,674,603,530 et 442.
Le facteur A de A-40 104 est soluble dans les alcools comme le mêthanol et l'éthanol, est partiellement soluble dans le chloroforme et est insoluble dans l'eau.
En se basant sur ses caractéristiques physico-chimiques, on pense que le facteur A-40 104 est le dérivé acétal ß, D-xylo-pyranosylique de la pleuromutiline, ayant la formule développée suivante:
CHs
643 298
Facteur B de A-40104
Le facteur B de A-40 104 est un composé amorphe blanc qui constitue un facteur mineur dans le complexe antibiotique A-40 104. Il représente en fait seulement 0,01 à 0,1 % de l'activité du complexe antibiotique A-40 104. Par spectrométrie de masse avec choc d'électron, on a trouvé que le facteur B de A-40 104 a un poids moléculaire de 394. L'étude des pics de l'ion moléculaire et de certains des ions fragmentaires indique que le facteur B de A-40 104 a une formule empirique de C22 H34 06. Un pic â m/e 318 (C20 H30 03) dans le spectre de masse du facteur B est analogue à un pic à m/e 302 dans le spectre de la pleuromutiline, ce qui indique que l'oxygène additionnel du facteur B est sur le noyau plutôt que sur la chaîne latérale. Le fragment m/e 163 est commun au facteur B et à la pleuromutiline. Un petit pic à m/e 245 (C]7 H25 03) dans le spectre de la pleuromutiline est déplacé à m/e 261 (C17 H25 02) dans le spectre du facteur B. Le facteur B de A-40 104 a trois groupements hydroxyle pouvant subir une acylation. Par exemple, le facteur B de A-40 104 forme un dérivé triacétylé par traitement par la pyridine et l'anhydride acétique donnant un composé ayant la composition C28 H40 09 (poids moléculaire 520), montrant que la fonction oxygénée supplémentaire du facteur B de A-40 104 se trouve dans un groupement hydroxy.
Le spectre d'absorption infrarouge du facteur B de A-40 104, effectué en pastilles de KBr, est représenté sur la figure 2 des dessins annexés. Les maxima d'absorption les plus significatifs se trouvent aux fréquences suivantes (cm"1): 3430 (large), 2940,2880,1735,1660,1452,1385,1375,1305, 1280,1233,1152,1094,1020,997,967,933,912,888,752 et 660.
En se basant sur ses caractéristiques physico-chimiques, on pense que le facteur B de A-40 104 a la formule approximative suivante:
10
15
dérivés 19,20-dihydrogénés des facteurs A et B de A-40 104 sont les composés préférés dans ce groupe.
On peut séparer et identifier par des procédés chromato-graphiques les quatre facteurs du complexe A 40 104. Par exemple, on peut séparer les facteurs par Chromatographie sur couche mince (CCM), en utilisant du gel de silice (Merck, Darmstadt), un système solvant 9:1 chloroforme: méthanol, et Micrococcus luteus comme indicateur biologique. Les Rf approximatifs des facteurs A à D de A-40 104 dans ce système sont donnés dans le tableau I.
Tableau I
Facteur de A-40 104
A
B
C
D
Rf 0,21 0,36 0,52 0,67
On peut également séparer les facteurs par Chromatographie sur papier, en utilisant du papier non traité (Whatman n°l), un système d'eau saturée de butanol et Micrococcus luteus comme organisme de détection. Les Rf approximatifs des facteurs A à D de A 40 104 dans ce système sont donnés dans le tableau II.
25
30
Tableau II
Facteur de A-40 104
A
B
C
D
Rf
0,64 0,51 0,37 0,31
35
0 II
r
:-CH -OH e
"i/\
\/
/ \T
\
HaC
r
-+OH
45
55
Comme on le verra, les deux facteurs A et B ce A-40 104 contiennent un groupement vinyle qui peut être réduit par des modes opératoires classiques pour obtenir le dérivés 19,20-dihydrogénés correspondants. Les dérivés 19,20-dihydrogénés des facteurs A et B sont également des agents antibactériens actifs et font partie de cette invention.
Les deux facteurs A et B et leurs dérivés 19,20-dihydrogé-nés contiennent des groupements hydroxyle qui sont susceptibles d'acylation par des modes opératoires classiques (quatre 6c groupements hydroxyle dans les composés du facteur A et trois groupements hydroxyle dans les composés du facteur B). Il est entendu que les dérivés peracylés obtenus auront le même groupement acyle à chaque position à laquelle se fait Facylation (c'est-à-dire quatre dans les composés du facteur A 65 et trois dans les composés du facteur B). Ces dérivés peracylés sont également des agents anti-bactériens. Les dérivés per-al-canoyliques en C2-C6 des facteurs A et B de A-40 104 et des
Préparation du complexe antibiotique A-40 104
Cette invention concerne également un procédé de production du complexe antibiotique A-40 104 et, ainsi, un procédé de production des facteurs A et B de A-40 104 et de l'antibiotique connu, la pleuromutiline. Ce procédé consiste à cultiver une souche productrice de A-40 104 du basidiomy-cète Clitopilus pseudo-pinsitus dans des conditions aérobies en immersion dans un milieu de culture approprié jusqu'à production d'une activité antibiotique substantielle. On recueille le complexe antibiotique et les différents antibiotiques en utilisant divers modes opératoires d'isolement et de purification utilisés et connus dans la technique.
La souche de Clitopilus pseudo-pinsitus qui est utilisable pour la production des antibiotiques de A-40 104 a été obtenue au Centraalbureau voor Schimmelcultures (CBS) des Pays-Bas. La culture CBS (CBS 270.36) a été classée comme Octojuga pseudo-pinsita. Le nom générique Clitopilus, qui est synonyme d'Octojuga, sera utilisé ici pour désigner l'organisme. L'aptitude de cette culture à produire des antibiotiques n'était pas connue. On a découvert cette aptitude à produire les antibiotiques A-40 104 après un mode opératoire de sélection important.
La souche de Clitopilus pseudo-pinsitus qui est utilisable pour la production des facteurs A et B de A-40 104 et de la pleuro-mutiline a été déposée à la Northern Marketing and Nutrition Research Division, U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service Peoria, Illinois 61 604, où elle est disponible sous le n° NRRL 11 179.
Comme c'est le cas avec d'autres organismes, les caractéristiques de la culture productrice de A-40 104, Clitopilus-pseudo-pinsitus NRRL 11 179, sont sujettes à variations. Par exemple, l'on peut obtenir des variants et mutants artificiels de NRRL 11 179, par traitement par divers mutagènes connus comme les rayons ultraviolets, les rayons X, les ondes de fréquence élevée, les rayons radioactifs et les produits chimi-
5 643 298
ques. Tous les variants et mutants naturels et artificiels qui teur A de A-40 104 est donc environ 12 jours. L'addition ont essentiellement les mêmes caractéristiques d'identifica- d'huile de maïs au milieu améliore la transformation du factions que Clitopilus pseudo-pinsitus NRRL 11 179 et qui pro- teur C en facteur A pendant la fermentation. Dans les condi-duisent les antibiotiques A-40 104 peuvent être utilisés dans tions optimales pour la production du facteur A de A-40 104, cette invention. 5 70 à 90 % de l'antibiotique produit sont le facteur A.
Le milieu de culture utilisé pour cultiver Clitopilus pseu- Après leur production dans des conditions de fermenta-
do-pinsitus NRRL 11 179 peut être l'un quelconque d'un cer- tion aérobies en immersion, on peut récupérer les antibioti-tain nombre de milieux. Pour des raisons d'économie de pro- ques de A-40 104 précédemment décrits à partir du milieu de duction, de rendement optimal et de facilité d'isolement du fermentation par des procédés utilisés dans le domaine de la produit, on préfère cependant certains milieux de culture. 10 fermentation. L'activité antibiotique produite pendant la fer-Ainsi, par exemple, les sources de glucides préférées dans la mentation se trouve essentiellement dans le bouillon. On ef-fermentation à grande échelle sont le glucose, la dextrine de fectue donc une récupération maximale des antibiotiques de tapioca, l'amidon et l'huile de maïs, bien que l'on puisse éga- A-40 104 par une combinaison de méthodes comprenant la lement utiliser le glycérol, le maltose, le fructose, etc ... fïltration, l'extraction du bouillon filtré et la chromatogra-
L'oléate, le laurate et la lécithine sont d'autres sources utiles 15 phie d'absorption. Un procédé particulièrement préféré con-de carbone. Les sources d'azote préférées sont la farine de soja siste à extraire le bouillon filtré d'abord avec du toluène puis plus ou moins fine, ou une combinaison de levure et d'aliment avec du chloroforme. On isole le facteur C de A-40 104 à par-sec pour chiens. D'autres sources d'azote acceptables com- tir de l'extrait toluénique, et on isole le facteur A de A-40 104 prennent la levure, la farine de coton, la farine d'arachide, la à partir de l'extrait chloroformique. On sépare le facteur B de peptone de viande, et les aliments secs pour chiens. Bien que 20 A-40 104, le facteur mineur, par Chromatographie d'absorp-des sels minéraux nutritifs ne soient pas essentiels pour la tion pendant la purification du facteur A de A-40 104. croissance et la production d'antibiotiques, on peut ajouter Ou bien, on peut utiliser les matières solides de la culture des sels solubles pouvant donner des ions sodium, magné- comprenant les constituants du milieu et le mycélium, sans ex-sium, calcium, ammonium, chlorure, carbonate, sulfate, ni- traction ou séparation mais de préférence après élimination träte, etc ... Par exemple, l'addition de 0,05% de MgS04. 25 de l'eau comme source d'antibiotiques A-40 104. Par exem-7H20 et de 0,2% de CaC03 au milieu améliore la production pie, après production de l'activité antibiotique A-40 104, on d'antibiotiques. peut sécher le milieu de culture par lyophilisation et le mélan-
Les oligo-éléments essentiels nécessaires à la croissance et ger directement dans un pré-mélange alimentaire, au développement de l'organisme doivent être inclus dans le Dans un autre part, après production de l'activité de milieu de culture. Ces oligo-éléments se trouvent souvent sous 30 A-40 104 dans le milieu de culture et séparation du mycélium, forme d'impuretés dans les autres constituants du milieu en on peut lyophiliser le bouillon filtré pour obtenir le complexe quantité suffisante pour satisfaire les nécessités de croissance antibiotique A-40 104 sous une forme que l'on peut utiliser de l'organisme. directement dans un pré-mélange alimentaire.
Il peut être nécessaire d'ajouter de petites quantités (c'est- Pendant la production des antibiotiques A-40 104 et l'iso-à-dire 0,2 ml/1) d'un agent anti-moussant comme le poly- 35 lement et la séparation des différents facteurs antibiotiques, il propylèneglycol, aux milieux de fermentation en grande est préférable de contrôler les processus de production et de
échelle, si la formation de mousse pose des problèmes. séparation par des modes opératoires chromatographiques.
Pour la production de quantités substantielles des anfibio- Par exemple, on préfère un système en CCM utilisant un tiques A-40 104, on préfère la fermentation aérobie en immer- système solvant CHC13: CH3OH (9:1), du gel de silice comme sion dans des réservoirs. On peut obtenir de petites quantités 40 absorbant, et Micrococcus luteus comme indicateur bio-des antibiotiques A-40 104 par culture sur flacons agités. En logique.
raison du temps de latence dans la production d'antibiotiques couramment associé à l'inoculation de grands réservoirs par Activité des antibiotiques A-40104
de petites quantités de culture, il est préférable d'utiliser un Le complexe antibiotique A-40 104 et les facteurs A et B
inoculum végétatif qui contient de plus quantités de cellules 45 de A-40 104 séparément inhibent la croissance de certains or-dans un état de croissance active. On prépare l'inoculum végé- ganismes pathogènes, en particulier les bactéries gram-positi-tatif en inoculant un petit volume de milieu de culture avec ves. Le facteur A de A-40 104 est un agent anti-bactérien par-des fragments mycéliens de l'organisme pour obtenir une cul- ticulièrement utile. Les concentrations inhibitrices minimales ture fraîche en croissance active de l'organisme. Puis on trans- (CIM) auxquelles le facteur A-40 104 inhibe des bactéries sé-fère l'inoculum végétatif dans un réservoir plus grand. Le mi- 50 lectionnées, comme déterminé par des essais de dilution sur lieu utilisé pour la croissance de l'inoculum végétatif peut être gélose classique, sont résumées dans le tableau III.
le même que celui utilisé pour la fermentation en plus grande Tableau III
échelle, mais on peut également utiliser d'autres milieux. (Hg/ml
Le Clitopilus pseudo-pinsitus producteur de A-40 104 Organisme d'essai Facteur A
peut être cultivé à des températures comprises entre 20 et 55 de A-40 104
33 °C. La production optimale de A-40 104 semble se pro- Staphylococcus aureus 3055 < 0,5
duire à des temperatures d'environ 30 °C. Staphylococcus aureus 3074 < 0,5
Comme il est courant dans les procédés de culture aérobie Streptococcus faecalis < 0,5
en immersion, on insuffle de l'air stérile dans le milieu de cul- Bordetella bronchiseptica < 0,5
ture agité. Pour une croissance efficace de l'organisme, il doit 60
y avoir une aération et une agitation suffisantes pour mainte- Dans un aspect important de cette activité, les antibioti-
nir un taux d'oxygène dissous aussi proche de 80 % que possi- ques A-40104 inhibent la croissance d'organismes qui résis-ble. Des taux inférieurs d'oxygène suppriment la production tent aux autres antibiotiques. Dans le tableau IV, on résume des facteurs A et C de A-40 104, mais l'effet sur le facteur A l'activité des facteurs A et B de A-40 104 vis-à-vis d'organis-est plus prononcé. 65 mes représentatifs dans des essais disque-plaque classiques.
Au cours de la fermentation, le facteur C de A-40 104 est L'activité est mesurée par le diamètre en mm de la zone d'in-produit d'abord et le facteur A de A-40 104 apparaît ensuite. hibition observée; le diamètre du disque utilisé dans chaque La période d'incubation préférée pour la production du fac- cas est de 6,35 mm.
643 298
Tableau IV Organisme d'essai
6
Diamètre des zones (mm)
Staphylococcus aureus 30551 Staphylococcus aureus 30551 Staphylococcus aureus 30742 Staphylococcus aureus 30742 Staphylococcus aureus 31303 Staphylococcus aureus 31303 Streptococcus pyogenes4 Streptococcus pyogenes4 Streptococcus sp. 99605 Streptococcus sp. 99605 Diplococcus pneumoniae Diplococcus pneumoniae
Conc.
Facteur A de
Facteur B de
Hg/disque
A-40 104
A-40 104
100
31,2
27,1
10
27,2
18,9
100
29,2
25,4
10
25,4
13,5
100
34,0
29,5
10
29,2
19,0
100
27,0
23,0
10
21,0
19,0
100
8,7
0
10
0
0
100
20,0
17,0
10
14,0
12,0
1 sensible à la pénicilline G
2 résistant à la pénicilline G
3 résistant à la méthicilline
4 Groupe A
5 Groupe D
Le tableau V montre que le facteur A de A-40 104 se compare favorablement à l'ampicilline dans une série d'essais in 25 vitro utilisant la méthode de dilution sur plaques de gélose avec gradient.
Tableau V
Organisme d'essai
Streptococcus pyogenes Streptococcus sp. X-66 (groupe D) Streptococcus sp. 9960 (Groupe D) Neisseria gonorrhea Neisseria gonorrhea Sand. Neisseria gonorrhea Lind. Hemophilus influenzae Brun1 Hemophilus influenzae Dick1 Hemophilus influenzae Laiv.1 Hemophilus influenzae 2512 Hemophilus influenzae 2592 Hemophilus influenzae 2602
CIM (|ig/ml)
Facteur Ade A-40 104 Ampicilline
< 0,01
< 0,01
0,5
0,8
70
0,6
0,5
0,5
0,07
0,07
0,5
0,5
2
0,5
2
0,5
4
0,5
0,7
70
0,7
70
0,7
70
Le facteur A de A-40 104 et le facteur A 19,20-dihydro- 50 l'activité observée sous forme d'une valeur DE 50 [dose effi-
géné de A-40 104 (dihydro-A-40 104A) ont montré une acti- cace en mg/kg pour protéger 50 % des animaux d'essai; voir vité anti-microbienne in vivo vis-à-vis d'infections bactérien- Warren Wiek et al, J. Bacteriol 81,233-235 (1961)]. Les DE50
nés expérimentales. Quand on administre deux doses de ces observées pour ces composés sont données dans les tableaux composés à des souris atteintes d'infections types, on mesure vi et VII.
55
Tableau VI
Activité du facteur A de A-40 104
Organisme d'essai
Staphylococcus aureus 3055 Streptococcus pyogenes C203 Streptococcus pneumoniae Park I
Route sc sc sc
DE50 x 2
15,7 3,6 21,5
Dose infectante
1260 x DL50(ip) 195 x DL50 (ip) 1280 x DL50 (ip)
7
643298
Tableau VII
Activité de Dihydro-A-40 104-A
Organisme d'essai
Route
DE50 x 2
Dose infectante
Staphylococcus aureus 3055
sc
<4,4
69,5 x DL50 (ip)
Staphylococcus aureus 3055
oral
28
3400 x DL50(ip)
Staphylococcus aureus 3055
oral
27
500 x DL50(ip)
Streptococcus pyogenes C203
sc
5,8
1690 x DL50(ip)
Streptococcus pneumoniae BI-343
sc
35
30 x DL50 (ip)
Streptococcus pneumoniae BI-492
sc
15,2
340 x DL50(ip)
acétylé vis-à-vis de diverses espèces de Mycoplasma, déterminées par des études de dilution de bouillon in vitro, sont résumées dans le tableau IX.
Tableau IX
Organisme d'essai facteur A de Dihydro- Tétraacétyl-
A-40 104 A-40104 A A-40104A
Mycoplasma gallisepticum <0,78 0,195 12,5
Mycoplasma synoviae <0,78 0,195 50,0
Mycoplasma hyorhinis 1,56 0,195 25,0
Mycoplasma hyopneumoniae 0,195 0,097 12,5
35
Les antibiotiques A-40 104 peuvent être utilisés dans le traitement de la dysenterie porcine. Comme décrit dans le brevet des E.U.S. No. 4 041 175, la pleuromutiline est efficace dans le traitement de la dysenterie porcine. On a découvert que les antibiotiques de A-40 104 obtenus selon cette invention sont également actifs vis-à-vis de Treponema hyodysen-teriae, l'organisme le plus souvent associé assorcié à la dysen- w terie porcine. On a déterminé l'activité en utilisant un essai in vitro qui consiste à incorporer le composé à des taux de 50, 5,0,0,5 et 0,05 |ig/ml dans des plaques de trypticase-soja-gé-lose contenant 5 % de sang de bœuf défibriné. On inocule la surface de la gélose avec 0,1 ml d'une dilution 10"' d'une suspension de T. hyodysenteriae. On fait incuber les plaques dans des conditions anaérobies pendant 4 jours puis on évalue la présence ou l'absence de croissance du tréponème hémoly-tique. Dans cet essai, le facteur A de A-40 104 et son dérivé 19,20-dihydrogéné inhibent la croissance de T. hyodysenteriae aux concentrations de 50, 5,0 et 0,5 (ig/ml.
45
50
Quand on les utilise dans le traitement de la dysenterie porcine, les antibiotiques de A-40 104 peuvent être administrés à des porcs infectés, par voie orale sous forme de compri- 55 més, de capsules, de poudres, etc ... On peut préparer une composition vétérinaire d'un ingrédient inerte contenant comme agent actif un antibiotique A-40 104. Un procédé d'administration préféré consiste cependant à incorporer l'antibiotique de A-40 104 dans l'aliment pour porc. 60
Un autre aspect vétérinaire est l'activité des antibiotiques A-40 104 vis-à-vis des espèces Pasteurella. P. multocida par exemple est un agent responsable des infections respiratoires chez le bétail, la volaille et les porcs. P. hemolytica est une cause importante de maladie respiratoire chez le bétail. 65
L'activité du facteur A de A-40 104 et de son dérivé dihy-drogéné vis-à-vis de Pasteurella, déterminée par des essais classiques in vitro, est résumée dans le tableau X.
Tableau X CIM ((ig/ml)
Organisme d'essai
Pasteurella multocida (bovins) Pasteurella multocida (dindons) Pasteurella hemolytica facteur Ade A-40 104
6,25 12,5 25,0
Dihydro-A-40 104
6,25 12,5 16,5
On peut préparer une composition pharmaceutique contenant un ingrédient inerte et, comme ingrédient actif, un antibiotique A-40 104, pour l'administration à l'homme vis-à-vis d'organismes pathogènes sensibles. Un autre aspect important d'utilisation est l'activité des antibiotiques A-40 104 vis-à-vis des micro-organismes Spiroplasma. Spiroplasma citri est l'agent responsable de la maladie portée par les citrus; un autre Spiroplasma nuit à la croissance du maïs. Dans des essais in vitro vis-à-vis de Spiroplasma citri, le facteur A de A-40 104 et son dérivé dihydrogéné inhibent S. citri quand on les applique à des taux aussi faibles que 0,01 ppm.
Les antibiotiques de A-40 104 sont également actifs vis-à-vis des agents phytopathogènes. Par exemple, quand on les applique sous forme d'une pulvérisation sur les feuilles ou d'un arrosage du sol le facteur A de A-40 104 est actif vis-à-vis de l'oïdium poudreux. Dans des essais sur des plants de haricots et d'avoine, on peut lutter contre l'oïdium poudreux avec un arrosage du sol du facteur A de A-40 104 à un taux de 100 ppm, ce qui indique que ces composés ont une activité systémique. L'activité systémique de ces antibiotiques est particulièrement avantageuse dans la lutte contre les agents phytopathogènes ou les organismes Spiroplasma.
Pour illustrer plus complètement le fonctionnement de cette invention, on donne les exemples suivants.
643298
8
Exemple 1
A. Fermentation en flacon agité de A-40 104
On gratte avec un instrument stérile une culture à maturité sur plaque inclinée de gélose de Clitopilus pseudo-pinsitus NRRL 11 179, et on la transfère de façon aseptique sur une plaque inclinée de gélose ayant la composition suivante:
Ingrédient
Quantité
Saccharose 25 g
Mélasse noire 36 g
Liqueur de macération de maïs 6 g
Extrait de malt 10g
K2HP04 2 g
Caséine hydrolysée par voie enzymatique* 10g
Gélose lavée 25 g
Eau désionisée q.s. 1 litre
* N-Z Case, Humko Sheffield, Norwich N.Y.,U.S.A.
On fait incuber la culture inoculée à environ 30 ° C pendant environ 14 jours. On gratte avec un instrument stérile la culture inclinée arrivée à maturité et on utilise les mycéliums macérés provenant d'environ 5 cm2 de surface pour inoculer 50 ml d'un milieu végétatif ayant la composition suivante:
Ingrédient Glucose
Dextrine de tapioca*
Poudre d'hydrolysat de soja** Fraction de levure de brasserie*** Eau du robinet
Quantité
10 g 10g 10 g 5g q.s. 1 litre
Ingrédient
Glycérol
Lactose
Eau désionisée
Quantité
300 g 150 g q.s. 1 litre
10
B. Fermentation en réservoir
Pour obtenir un plus grand volume d'inoculum, on utilise 10 ml du milieu végétatif de premier stade incubé décrit précédemment, pour inoculer 400 ml d'un milieu de croissance végétatif de second stade ayant la même composition que celle du milieu végétatif. On fait incuber le milieu de second stade dans un Erlenmeyer à large col de 21 à 25 °C pendant environ 48 heures sur un agitateur tournant d'un arc de 5 cm de diamètre à 250 tours par minute.
On utilise le milieu végétatif de second stade incubé (800 ml), préparé comme décrit précédemment, pour inoculer 1001 d'un milieu de production stérile ayant la composition suivante:
i5 Ingrédient
Glucose Glycérol
Dextrine de tapioca Aliment sec pour chien* Extrait de levure KCl
S04-7H20
FeS04-7H20
MnCl2-4H20
ZnS04-7H,0
CaC03
Eau désionisée
Quantité
20
25
15 5
30 25 5 1
0,5 0,1
g/1 g/1 g/1 g/1 g/1 g/1 g/1 g/1
0,05 g/1 0,05 g/1 0,1 g/1 q.s. 1 litre
30 Ph ajusté à 5,0 avec HCl 4N
pH du milieu environ 3,5; ajuster à pH 6,9 avec NaOH
5 N
* Stadex 11, A.E. Staley, Decatur, III., U.S. A.
** HySoyT Humko Sheffield, Norwich, N.Y., U.S.A. *** Amber BYF 300, Amber Laboratories, Juneau, Wisc., U.S.A.
On fait incuber le milieu végétatif inoculé dans un flacon Erlenmeyer de 250 ml à environ 25 °C pendant 96 heures sur un agitateur tournant d'un arc de 5 cm de diamètre à 250 tours/minute.
On peut utiliser ce milieu végétatif incubé directement pour inoculer, le milieu végétatif de second stade. Ou bien et de préférence, on peut le conserver pour un usage ultérieur en maintenant la culture dans la phase vapeur d'azote liquide. On prépare la culture pour une telle conservation dans de nombreuses petites ampoules comme suit: dans chaque ampoule, on place 4 ml de milieu végétatif incubé et 2 ml d'une solution de glycérol-lactose ayant la composition suivante:
35
* Purina Dog Chow, Ralston Purina Co., St Louis. U.S. A. (Mo 63 188)
On laisse le milieu de production inoculé fermenter dans un réservoir de fermentation de 1651 à une température d'environ 30 °C pendant environ 12 jours. On aère le milieu de fermentation avec de l'air stérile en maintenant un taux d'oxygène dissous d'environ 80%.
40
Exemple 2
On effectue la fermentation comme dans l'exemple 1 mais en utilisant un milieu végétatif ayant la composition suivante:
55
On conserve les suspensions ainsi préparées dans la phase vapeur le l'azote liquide.
On utilise une suspension conservée (1 ml) ainsi préparée pour inoculer 50 ml d'un milieu végétatif de premier stade ayant la même composition que celle décrite précédemment pour le milieu végétatif. On fait incuber le milieu végétatif de premier stade inoculé dans une flacon Erlenmeyer de 250 ml à large col, à 25 °C pendant environ 4 jours sur un agitateur tournant d'un arc de 5 cm de diamètre à 250 tours par minute
60
Ingrédient
Quantité
Dextrose
5
g/1
Galactose
5
1
Glycérol
5
g/1
Amidon soluble
5
g/1
Extrait de levure
2
g/1
Aliment sec pour chien*
5
g/1
Huile de soja
2
g/1
Huile de Maïs
2
21
kh2po4
3
g/1
MgS04-7H20
0,5 g/1
FeS04-7H20
0,1 g/1
CaCOj
1,0 g/1
MgCl2-4H20
0,05 g/1
ZnS04-7H20
0,05 g/1
Eau désionisée q.s.
1 litre
65
pH du milieu environ 5,7 ajusté à 5,0 avec HCl 4N * Purina Dog Chow
9
643 298
Exemple 3
On effectue la fermentation en utilisant le procédé de l'exemple 1 mais en utilisant le milieu de fermentation ayant la composition suivante:
Ingrédient
Glucose Gruau de soja MgS04-7H20 Ca C03
Eau désionisée
Quantité
50 g/1 7,5 g/1 1,0 g/1 2,0 g/1 q.s. 1 litre pH d'environ 7,4; ajusté à pH 6,5 avec HCl 4N.
Exemple 4 Isolement des facteurs A et C de A-40 104
On filtre le bouillon de fermentation entier (45401) obtenu par le procédé décrit dans l'exemple 3, en utilisant un adjuvant de filtration (Hyflo Super-cel, une terre de diatomées, 2o Johns-Manville Products Corp.) et l'on obtient 34601 de filtrat. On lave le gâteau mycélien avec de l'eau désionisée et on obtient 18201 supplémentaires de filtrat. On extrait les filtrats réunis (54601) au pH du bouillon avec du toluène i}ji volume) pendant une heure et l'on obtient 25001 d'extrait de toluène. 25 Cet extrait toluénique contient essentiellement le facteur C de A-40 104 (pleuromutiline). On concentre l'extrait toluénique jusqu'à un volume d'environ 231. Une première récolte du facteur C de A-40 104 (1943 g) cristallise et on la recueille par filtration. On concentre la liqueur mère jusqu'à un volume 30 d'environ 8 litres. On sépare une seconde récolte de facteur C (282 g). On concentre à nouveau la liqueur mère jusqu'à un volume d'environ 61, en refroidissant à environ 4 °C pendant 72 heures, et l'on obtient 158 g supplémentaires de facteur C. On concentre jusqu'à une huile visqueuse la liqueur mère pro- 35 venant de cette troisième récolte; on dissout cette huile dans 6 1 d'éther diéthylique; on refroidit la solution à 4 °C pendant 72 heures et l'on obtient 112 g d'une quatrième récolte du facteur C de A-40 104.
On extrait ensuite la solution aqueuse restant après l'ex- 40 traction toluénique, avec 12 volume de chloroforme pendant une heure. On concentre l'extrait chloroformique obtenu jusqu'à un volume d'environ 101 et on refroidit à 4 °C pendant 72 heures. On sépare par filtration les cristaux qui se forment et on les sèche, ce qui donne 588 g du facteur A de A-40 104. 45
Exemple 5
Isolement du complexe A-40 104 et du facteur B
On filtre le bouillon de fermentation entier (2141) obtenu par le procédé décrit dans l'exemple 1 en utilisant un adjuvant 50 de filtration et l'on obtient 1191 de filtrat. On lave le gâteau mycélien avec de l'eau et l'on obtient 801 supplémentaires de filtrat. On extrait les filtrats réunis (1991) deux fois au pH du bouillon avec de l'acétate d'éthyle (801 à chaque fois). On concentre les extraits réunis d'acétate d'éthyle sous vide jus- 55 qu'à un volume d'environ 2 litres. On ajoute environ 201 d'hexane pour précipiter le complexe actif. On sépare par filtration le complexe antibiotique qui a précipité, puis on le redissout dans environ 300 ml d'acétate d'éthyle et on le précipite à nouveau avec de l'hexane. On lave le précipité avec de 60 l'hexane et on le sèche, ce qui donne 27,3 g du complexe antibiotique A-40 104 (contenant les facteurs A, B et C).
On dissout une portion (5 g) de ce complexe dans 40 ml de chloroforme. On filtre la solution chloroformique et on Chromatographie le filtrat sur une colonne en verre ouverte (5,6 x & 28 cm) sur gel de silice (Woelm). On garnit la colonne avec une suspension de gel de silice dans du chloroforme et on l'élue avec du chloroforme à un débit de 2 ml par minute, en recueillant des fractions ayant un volume de 20 ml. A la fraction n° 7, on change le solvant d'élution et l'on utilise un mélange 95:5 de chloroforme et de méthanol; à la fraction n° 28, on change à nouveau le solvant et l'on utilise un mélange 9:1 5 de chloroforme et de méthanol. On réunit les fractions 72 à 120 et on les évapore sous vide et l'on obtient 4 g d'une poudre sèche.
On traite du bouillon de fermentation supplémentaire de la même manière et l'on obtient 6 autres grammes de cette io substance. On ajoute 100 ml de chloroforme aux échantillons-réunis (10 g); la substance insoluble dans le chloroforme (1,6 g du facteur A de A-40 104) est séparée par filtration. On Chromatographie le filtrat sur une colonne de verre ouverte (58 x 48 cm) sur gel de silice (Woelm). On garnit la colonne et on la lave avec du chloroforme puis on l'élue avec un mélange 97,5:2,5 de chloroforme et de méthanol, en recueillant des fractions ayant un volume de 20 ml à un débit de 4 ml/mn. On réunit les fractions n° 156 à 190 et on les évapore à siccité sous vide. On dissout le résidu dans un petit volume de chloroforme; on ajoute de l'hexane à cette solution pour précipiter le produit. On sépare le précipité par filtration et on le sèche, ce qui donne 99 mg du facteur B de A-40 104.
15
Exemple 6
Préparation dufacteur A 19,20-dihydrogéné de A-40 104
On dissout 10,15 g (0,0199 mole) du facteur A de l'antibiotique A-40 104 dans 188 ml de tétrahydrofuranne et on ajoute 2,5 g de 5% de Pd/C. On hydrogène le mélange réac-tionnel pendant 4 heures à la température ambiante puis on le filtre sur un entonnoir en verre fritté avec une couche de Ce-lite. On évapore le filtrat sous vide à siccité. On cristallise le résidu dans un mélange 2:1 d'acétate d'éthyle et de méthanol, ce qui donne 7,0447 g (0,01375 mole, rendement de 69%) du facteur A, 19,20-dihydrogéné de A-40 104.
Exemple 7
Préparation du facteur B 19,20-dihydrogéné de A-40104
On hydrogène le facteur B de A-40 104 en utilisant les conditions décrites dans l'exemple 6 pour obtenir le facteur B 19,20-dihydrogéné de A-40 104.
Exemple 8
Préparation du facteur A tétraacétylé de A-40104.
On dissout 2 g du facteur A de A-40 104 dans 5 ml de Pyridine sèche et on ajoute 5 ml d'anhydride acétique. On laisse la solution limpide résultante reposer à la température ambiante pendant 120 heures. Puis on ajoute la solution à 20 ml d'étha-nol; on évapore la solution résultante sous vide jusqu'à ce que l'on ait éliminé les traces de pyridine et d'acide acétique et l'on obtient 2, lg du dérivé tétraacétylé du facteur A de A-40 104.
[a]p-22,2° (ç 1,0, C2H5OH); formule empirique C35H50O13 et poids moléculaire de 678,325 par spectrométrie de masse avec correspondance des pics.
Analyse calculée pour C35H50Oi3 :
C, 62,00; H, 7,40; 0,30,60;
trouvée :
C, 62,06; H, 7,32; 0,30,19.
643298
Exemples 9-14
On prépare le dérivé triacétylé du facteur B de A-40 104 à partir du facteur B de A-40 104, en utilisant un mode opératoire similaire à celui décrit dans l'exemple 8.
On prépare le dérivé tétraacétylé du facteur A 19,20-dihy-drogéné en faisant réagir le facteur A 19,20-dihydrogéné de la manière décrite dans l'exemple 8.
On prépare le dérivé triacétylé du facteur B 19,20-dihydrogéné en faisant réagir le facteur B 19,20-dihydrogéné selon le procédé de l'exemple 8.
10
On prépare le dérivé tétra(n-butyrylé) du facteur A de A-40 104 en faisant réagir le facteur A de A-40 104 avec l'anhydride n-butyrique selon le mode opératoire de l'exemple 8.
s On prépare le dérivé tripropionylé du facteur B de A-40 104 en faisant réagir le facteur B de A-40 104 avec l'anhydride propionique selon le mode opératoire de l'exemple 8.
On prépare le dérivé tétra(n-valérylé) du facteur A io 19,20-dihydrogéné en faisant réagir le facteur A 19,20-dihydrogéné avec l'anhydride valérique selon le mode opératoire de l'exemple 8.
C
2 feuilles dessins
Claims (9)
- 643 2982REVENDICATIONS1. Procédé de fabrication d'un composé du groupe comprenant: le mélange antibiotique A-40 104 comprenant les facteurs A, B, D et la pleuromutiline; le facteur A de l'antibiotique A-40 104; le facteur B de l'antibiotique A-40 104; la 5 pleuromultiline; et le facteur D de l'antibiotique A-40 104 procédé caractérisé en ce que a) on cultive Clitopilus pseudo-pinsitus NRRL11 179 dans un milieu de culture contenant des sources assimilables de glucide, d'azote et de sels minéraux dans des conditions de i0 fermentation aérobies en immersion jusqu'à production d'une quantité substantielle d'activité antibiotique;b) on sépare éventuellement du milieu de culture le mélange antibiotique A-40 104; et c) on isole éventuellement à partir du mélange antibioti- 15 que le facteur A de l'antibiotique A-40 104, le facteur B de l'antibiotique A-40 104, la pleuromutiline ou le facteur D de l'antibiotique A-40 104.
- 2. Procédé selon la revendication 1 pour la production du facteur A de l'antibiotique A-40 104 caractérisé en ce que: 20a) on cultive Clitopilus pseudo-pinsitus NRRL 11 179 dans le milieu de culture et dans le conditions décrits;b) on sépare le mélange antibiotique A-40 104 du milieu de culture; et c) on isole le facteur A de l'antibiotique A-40 104 à partir 25 du mélange antibiotique.
- 3. Procédé selon la revendication 1 de préparation d'un mélange antibiotique A-40 104 comprenant les facteurs A B et D et la pleuromutiline, caracaractérisé en ce qu'on cultive la souche Clitopilus pseudo-pinsitus NRRL 11 179 dans le 30 milieu de culture et dans les conditions décrits, et l'on sépare de ce milieu de culture le mélange antibiotique A-40 104 produit.
- 4. Procédé selon la revendication 1 pour la production du facteur B de l'antibiotique A-40 104, caractérisé en ce qu'on 35 cultive la souche Clitopilus pseudo-pinsitus NRRL 11 179 dans le milieu de culture et dans les conditions décrits, on sépare le mélange antibiotique A-40 104 du milieu de culture, et l'on isole le facteur B de l'antibiotique A-40 104 à partir du mélange antibiotique. 40
- 5. Procède de fabrication du facteur A 19,20-dihydrogéné ou du facteur B 19,20-dihydrogéné de l'antibiotiqueA-40 104, caractérisé en ce qu'on exécute l'étape (a) du procédé selon la revendication 1, (b) on sépare du milieu de culture le mélange antibiotique A-40 104, (c) on isole à partir du 45 mélange antibiotique le facteur A ou le facteur B et (d) on hydrogène le facteur A ou le facteur B de l'antibiotique A-40 104, pour obtenir le facteur correspondant 19,20-dihydrogéné.
- 6. Procédé de fabrication des dérivés tétra-alcanoyliques 50 en C2 à C6 du facteur A ou les dérivés tri-alcanoyliques en C2 à C6 du facteur B de l'antibiotique A-40 104, caractérisé en ce qu'on exécute l'étape (a) du procédé selon la revendication 1 (b) on sépare du milieu de culture le mélange antibiotique A-40 104, (c) on isole à partir du mélange antibiotique le fac- 55 teur A ou le facteur B, et (d) on acyle le facteur A ou le facteurB de l'antibiotique A-40 104 pour obtenir le facteur correspondant acylé.
- 7. Procédé de fabrication des dérivés tétra-alcanoyliques en C2 à C6 du facteur A 19,20-dihydrogéné ou les dérivés tri-alcanoyliques en C2 à hydrogéné ou les dérivés tri-alcanoyli-ques en C2 à C6 du facteur B 19,20-dihydrogéné de l'antibiotique A-40 104, caractérisé en ce qu'on exécute le procédé selon la revendication 5, et (e) on acyle le facteur A ou le facteur B 19,20-dihydrogénés de l'antibiotique A-40 104 pour obtenir 65 la facteur dihydrogéné correspondant acylé.
- 8. Composition pharmaceutique ou vétérinaire, caractérisée par un ingrédient inerte et comme ingrédient actif, un composé du groupe des antibiotiques obtenus par le procédé selon l'une des revendications 1 à 7.
- 9. Micro-organisme Clitopilus pseudo-pinsitus NRRL 11 179 pour la mise en œuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 7.L'antibiotique pleuromutiline a été isolé en 1951 par Ka-vanagh et al. (Proc. Nati. Acad. Soc. 37,570-574 (1951)]. Il a été montré par la suite que la formule développée de la pleuromutiline est:OCHzCH*ZO12»; 'iaL'hydrolyse alcaline de la pleuromutiline donne un composé qui est appelé mutiline. La mutiline a la formule développée suivante:Un grand nombre de dérivés de pleuromutiline ont été préparés: brevet suisse N° 572 894 (Derwent n° 26 553X); brevet néerlandais n° 69 11 083 (Derwent n° 40 642); brevet américain n° 3 716 579; brevet américain n° 3 919 290; brevet américain n° 3 949 079; brevet américain n° 3 979 423; brevet américain n° 3 987 194; brevet américain n° 4 032 530; K. Riedl, «Studies on Pleuromutilin and Some of Its Derivatives», J. Antibiotics 29,132-139 (1976); H. Egger and H. Reinshagen «New Pleuromutilin Derivatives with Enhanced Antimicrobial Activity. I. Synthesis,» J. antibiotics 29, 915-922 (1976) et «II. Structure-Activity Corrélations», ibid. 923-927 (1976); F. Knauseder et E. Brandi, «Pleuromutilins: Fermentation, Structure and Bio-synthesis,» J. Antibiotics 29,125-131 (1976); J. Drews et al., «Antimicrobial Activities of 81. 723 hfu, a New Pleuromutilin Derivate», Antimicrob. Agents and Chemotherapy 7,50-516 (1975)La titulaire a découvert deux antibiotiques qui sont de nouveaux éléments de la famille de la pleuromutiline parmi3643 298les antibiotiques. En outre, elle a découvert un nouveau procédé de préparation de la pleuromutiline.
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