CH641570A5

CH641570A5 - Process for the determination of an immunologically active material and reagent for carrying out this process

Info

Publication number: CH641570A5
Application number: CH246378A
Authority: CH
Inventors: Douglas E Hawley; Peter G Tonkes
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1977-03-15
Filing date: 1978-03-07
Publication date: 1984-02-29
Also published as: DK152313C; AT367203B; SE447026B; ES475984A1; SE7802923L; IT7821256A0; CA1102789A; FR2384262A1; FR2384262B1; IL54234A0; ES467831A1; NO152955B; DE2811257A1; GB1595101A; BE864856A; NO780902L; JPS53115814A; NL7802845A; NO154814B; ATA182178A

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Bestimmung immunologisch aktiver Materialien sowie auf ein Reagens zur Durchführung dieses Verfahrens.

40 In den letzten Jahren sind zahlreiche analytische Systeme auf der Grundlage konkurrierender Proteinbindungsanalyse (auch als Sättigungsanalyse bezeichnet) entwickelt worden.

Die Begriffe «Sättigungsanalyse» und «konkurrierende Proteinbildungsanalyse», die gleichbedeutend sind, beziehen 45 sich auf analytische Systeme, die zur Bestimmung immunologisch aktiver Materialien (Liganden) verwendet werden. Die Ergebnisse dieser Bestimmungen in biologischen Flüssigkeiten werden in der medizinischen und veterinärmedizinischen Diagnose angewandt. Die Diagnose hängt davon ab, ob der so Gehalt der bestimmten Substanz normal oder pathologisch ist. Das analytische Prinzip beruht z.B. auf der Konkurrenz zwischen einem Liganden und einem markierten Liganden für ein übliches spezifisches bindendes Mittel (Rezeptor), wie durch die folgende Gleichung veranschaulicht:

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Markierung Ligand + Ligand + Rezeptor—»•

6o Markierung Markierung

Ligand + Ligand + Ligand + Ligand

I I

Rezeptor Rezeptor 05 (1) (2) (3) (4)

Gleichung 1

Die Primärreaktion ist eine Kombination eines Liganden-moleküls mit einem Rezeptormolekül unter Bildung eines

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bimolekularen Ligand-Rezeptor-Komplexes (1). Eine Sekundärreaktion wird durch Addition eines markierten Liganden verursacht, der ähnlich mit Rezeptor unter Bildung eines markierten Liganden-Rezeptor-Komplexes (2) kombiniert. Bei der Sättigungsanalyse sind die Konzentrationen des Rezeptors und des markierten Liganden konstant. Die Rezeptorkonzentration ist so begrenzt, dass der markierte Ligand relativ zum Rezeptor im Überschuss vorliegt. Unter diesen Bedingungen löst die Addition des Liganden eine Konkurrenz zwischen Ligand und markiertem Ligand bei der Bindung an den Rezeptor aus. Folglich setzt eine Erhöhung der Ligandenkon-zentration die Menge an markiertem Ligand-Rezeptor-Komplex herab. Das Testprinzip beruht auf der Bestimmung des Prozentsatzes des gesamten markierten, an den Rezeptor gebundenen Liganden. Dieser Prozentsatz ist umgekehrt proportional der Menge an dem Reaktionsgemisch von der zu messenden Probe oder von dem beim Test verwendeten Standard zugesetzten Liganden. Die Abnahme der Konzentration des markierten Ligand-Rezeptor-Komplexes oder die Zunahme der Konzentration des markierten Liganden im Reaktionsgemisch kann zur Bestimmung der Ligandenkon-zentration verwendet werden.

Die Empfindlichkeit der Sättigungsanalyse hängt von der Verwendung eines Rezeptors ab, der eine sehr hohe Affinität zum Liganden und zum markierten Liganden aufweist. Zum anderen hängt die Empfindlichkeit auch von der Verwendung einer Markierung ab, die bei sehr geringer Konzentration nachweisbar ist.

Die Spezifität der Sättigungsanalyse hängt von dem Vermögen des Rezeptors ab, ausschliesslich den Liganden und den markierten Liganden in einem komplexen Gemisch verschiedener Moleküle zu binden.

Die Sättigungsanalyse ist unter Anwendung zahlreicher unterschiedlicher Techniken eingesetzt worden, wobei die Unterschiede in erster Linie mit der Art der verwendeten Markierung zusammenhängen. Im allgemeinen werden diese Techniken durch die breiten Bezeichnungen «Radioaktivtest» oder «Nicht-Radioaktivtest» eingeteilt, in Abhängigkeit davon, ob ein radioaktiver Tracer als Markierung verwendet wird oder nicht.

Der Radioaktivtest ist in grösserem Umfang angewandt worden als Nicht-Radioaktivtests. Der Radioaktivtest kann weiter als Radioimmuntest oder Radiorezeptortest unterteilt werden, je nach der Art des bei dem Test verwendeten Rezeptors. Beim Radioimmuntest wird ein Antikörper verwendet, der den Liganden und den markierten Liganden spezifisch bindet. Andererseits bezieht sich die Radiorezeptoranalyse auf die Verwendung irgendeines anderen Typs eines biologischen Rezeptors, der den Liganden und den markierten Liganden ähnlich spezifisch bindet.

Bei allen radioaktivenTesttechniken ist es wesentlich, die gebundene Fraktion (1 und 2 in Gleichung 1) von der ungebundenen Fraktion (3 und 4 der Gleichung 1) des Reaktionsgemisches physikalisch zu trennen. Ein Index der Liganden-konzentration kann dann durch Auszählen dieser Fraktionen in einem Radioaktivitätszähler und durch Vergleich der für unbekannte Proben erhaltenen Zählwerte mit solchen, wie sie für geeignete, dem gleichen Test unterworfene Standard-Ligandenproben erhalten wurden, erhalten werden. Zahlreiche verschiedene und auseinanderstrebende Methoden sind für die Trennung der gebundenen und freien Anteile des Radioaktivtest-Reaktionsgemischs beschrieben worden,

wobei Techniken wie z.B. Gelfiltration, Absorption und Ionenaustauschchromatographie, fraktionierte Fällung, Feststoffphase oder Elektrophorese, eingesetzt wurden.

Nach der Entwicklung von Radioaktivtesttechniken bei der Sättigungsanalyse wurden Methoden entwickelt, die nichtradioaktive Markierungen anwenden. Verfahren unter

Einsatz von Enzymen als Markierung sind aufgezeigt worden. Diese Verfahren können den Vorteil haben, dass physikalische Trennung der gebundenen (1 +2) und freien (3+4) Fraktionen oder Anteile des markierten Liganden beim Testablauf nicht notwendig ist.

Wenn ein Antikörper einem mit einem Enzym markierten Liganden bindet, wird die Aktivität des Enzyms verändert. Der Grad oder das Ausmass der Veränderung der Enzymaktivität ist ein Anzeichen für die Konzentration des markierten Liganden in der gebundenen Fraktion und liefert folglich einen Konzentrationsindex des Liganden im Reaktionsgemisch.

Die chemische Struktur des Ligand-Enzym-Komplexes ist extrem schwer zu ermitteln, und dies ist ein Hauptnachteil des Enzymimmuntests. Dies beruht zweifellos auf der grossen Vielfalt der Aminosäureseitenketten, die auf der Enzymoberfläche zur Komplexbildung mit dem Liganden zur Verfügung stehen. Dies führt zu grossen Schwierigkeiten beim Reproduzieren des Ligand-Enzyms bei verschiedenen Herstellungen des Komplexes. Das allgemeine Fehlen der Steuerung der Komplexierungsreaktion führt zur Bindung vieler Liganden-moleküle an ein einziges Enzymmolekül, obgleich es leicht sein kann, dass die Bindung nur einiger weniger dieser Ligan-denmoleküle durch Antikörper an der Hemmung der Enzymaktivität beteiligt ist. Daher führen nicht alle Antikörpermarkierte Antigen-Wechselwirkungen zu einer Veränderung der Enzymaktivität, wodurch die Empfindlichkeit dieser Technik gemindert wird.

Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen verschiedenen Antikörpermolekülen und Antikörper- und Enzymmolekülen ist eine weitere Folge der Vielfalt der Ligandenmoleküle an der Enzymoberfläche. Protein-Protein-Wechselwirkung nimmt ferner zu, wenn der Ligand ebenfalls ein Polypeptid ist. Somit induziert das Enzymmolekül eine örtlich begrenzte Mikroumgebung hoher Proteinkonzentration. In solchen Situationen wurde gezeigt, dass Proteinausfällung eintritt, wodurch der Verlust eines der Hauptvorteile des Enzymimmuntestes verursacht wird, indem nämlich die Trennung von antikörpergebundenen und freien Fraktionen notwendig wird.

Es wurde eine Abwandlung des Enzymimmuntests beschrieben, die diese Probleme teilweise überwindet, indem nämlich der Ligand mit einem Detektormolekül niedrigen Molekulargewichts markiert wird. Bei diesem Test hindert die Antikörperbindung des markierten Liganden sterisch die Bindung eines Detektormoleküls durch einen anderen, für das Detektormolekül spezifischen Antikörper. Das Ausmass der Hinderung wird durch die Konkurrenz um die Bindung des freien Liganden-Detektor-Moleküls und des mit dem Detektormolekül markierten Enzyms mit Detektormolekül-Antikör-per bestimmt. Der Grad der Veränderung der Enzymaktivität, wie er beim normalen Enzymimmuntest bestimmt wird, gibt einen Hinweis auf die Konzentration an freiem Ligand-Detektor-Molekül, was wiederum auf die Konzentration des Liganden im Reaktionsgemisch hinweist.

Der Vorteil dieser Technik liegt darin, dass ein kleines Molekül anstelle eines Enzyms an den Liganden gebunden ist, was es zulässt, die chemische Struktur des markierten Liganden zu bestimmen und damit viele der früher beschriebenen Nachteile des Enzymimmuntestes zu überwinden. Dieses System überwindet jedoch nur die Nachteile der primären Bindungsreaktion, an der der Ligand und der markierte Ligand beteiligt sind, und überträgt sie auf das Detektorsystem zur Bestimmung des Ausmasses der antikörpergebundenen und antikörperfreien Anteile des markierten Liganden.

Die Nachteile der Verfahren nach dem Stand der Technik werden durch die Erfindung überwunden, wonach als Markierung eine Enzymmodifizierung verwendet wird.

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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung eines immunologisch aktiven Materials in einer Probe, wobei die Probe mit einem Rezeptor, der das immunologisch aktive Material spezifisch zu binden vermag, dem mit einer Substanz, das die Aktivität eines Enzyms zu modifizieren vermag, markierten immunologisch aktiven Material, einem Enzym und einem Enzymsubstrat zusammengebracht wird, und wobei der Grad oder die Art der anfallenden Enzymaktivität gemessen und mit der mit einem Standard erhaltenen verglichen wird.

Eine Ausgestaltung des erfindungsgemässen Verfahrens besteht darin, dass das immunologisch aktive Material in unlöslich gemachter Form mit einem Enzym und einem Enzymsubstrat zusammengebracht wird, wobei der Grad oder die Art der Enzymaktivität nach der Abtrennung der festen Phase gemessen und mit der mit einem Standard erhaltenen verglichen wird.

Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf ein Reagens zur Durchführung des Verfahrens, welches das immunologisch aktive Material spezifisch zu binden vermag, markiert mit einer Substanz, die den Grad oder die Art der Aktivität eines Enzyms zu modifizieren vermag.

Die Begriffe «immunologisch aktives Material» oder «Ligand» in dieser Beschreibung beziehen sich auf irgendeine immunologisch aktive Substanz oder einen Teil von dieser, die bzw. der immunologsich bestimmbar ist, z.B. durch Anwendung der Techniken der Sättigungsanalyse. Wesentliches Erfordernis ist, dass ein Rezeptor vorliegt, der den Liganden spezifisch bindet. Ist der Rezeptor ein Antikörper, so ist der Ligand ein Hapten oder Antigen, so dass ein spezifischer Antikörper entstehen kann. Ein Ligand wird als Hapten bezeichnet, wenn er Antikörperbildung nur bei Bindung an eine Verbindung mit Antigeneigenschaften hervorruft. Andererseits wird ein Ligand als Antigen bezeichnet, wenn er Antikörperbildung ohne chemische Abwandlung zeigt. Der Ligand kann im Molekulargewicht stark variieren, von etwa 100 bis 1000000. Dieser Molekulargewichtsbereich setzt beim Test keine Grenzen, vorausgesetzt, es steht ein Rezeptor zur Verfügung, der den Liganden spezifisch bindet.

Der Ligand kann strukturell entweder polymer oder nicht-polymer sein. Ist er polymer, wird er gewöhnlich biologischen Ursprungs sein und als Nucleinsäurepolysaccharid und/oder -polypeptid zu klassifizieren sein. Ist der Ligand andererseits nicht-polymer, hat er im allgemeinen ein Molekulargewicht von weniger als 2000 und kann zahlreiche Strukturen, Funktionalitäten und physiologische Eigenschaften aufweisen.

Besonders wichtige Liganden sind Amine, Aminosäuren, Peptide, Proteine, Lipoproteine, Glykoproteine, Sterine, Steroide, Lipoide, Nucleinsäuren, Mono- und Polysaccharide, Alkaloide, Vitamine, Drogen, Narkotika, Antibiotika, Stoffwechselprodukte, Pesticide, Toxine, Industrieverunreinigungen, Geschmacks- und Aromamittel, Hormone, Enzyme, Coenzyme, zelluläre oder extrazelluläre Gewebekomponenten und aus Menschen oder Tieren isolierte Antikörper. Der Test ist jedoch nicht auf nur diese Liganden beschränkt.

Komponenten mit unmittelbarer Möglichkeit zur Analyse mit dem System sind Hepatitis-B-Oberflächen-Antigen, Ferritin, Tumor-Antigene, wie CEA, a-Fetoprotein, Rheumatoid-Faktor, C-reaktive Proteine, Immunoglobulin-Klassen IgG, IgM oder IgA, Myoglobulin, Thyroidhormone einschliesslich T3 und T», Insulin, Steroidhormone, einschliesslich Testosteron oder Östradiol, missbrauchgefährdete Arzneimttel, wie narkotisierende Analgetika, wie Morphin, Barbiturate, Stimu-lantien, wie Amphetamin, Arzneimittel zur Behandlung von Epilepsie, einschliesslich Diphenylhydantoin und Phenobar-bitural, Herzglykozyten, wie Digoxin, Vitamine, wie Vitamin Bj2 und Folsäure. Weiter sind Antikörper, die der Analyse mit dem System unmittelbar zugänglich sind, solche, die mit einer

Infektion durch Syphillis, Gonorrhöe, Brucellose, Rubella und Rheumatismus verbunden sind.

Der Begriff «markiertes immunologisch aktives Material» oder «markierter Rezeptor» in der vorliegenden Beschreibung bezieht sich auf einen Liganden, ein Analogon eines Liganden oder dessen Teil oder einen Rezeptor, der mit einem Enzymabwandler markiert ist. Ein, mehr als ein und im allgemeinen weniger als 100 Markierungsmolekül(e) können an einem Liganden oder einem Rezeptormolekül befestigt sein. Ähnlich können ein, mehr als ein und gewöhnlich weniger als 5 Liganden- oder Rezeptor-Molekül(e) an einem Markierungsmolekül befestigt sein. Die Verknüpfung gesonderter Markierungsmoleküle mit einem Liganden- oder Rezeptor-Molekül erhöht im allgemeinen die Empfindlichkeit des Tests, vorausgesetzt, die Sondermarkierungen beeinträchtigen nicht die Bindung.

Die Verknüpfung eines modifizierenden Moleküls mit einem Liganden- oder Rezeptor-Molekül beinhaltet die Ausbildung intermolekularer Bindungen, die meist, aber nicht notwendigerweise, von kovalenter Natur sind. Die Verknüpfung kann zuweilen in Gegenwart eines Kupplungsmittels durch Einschub einer verbindenden Gruppe zwischen der Markierung und dem Liganden oder dem Rezeptor erfolgen.

Das modifizierende Molekül kann direkt an den Liganden oder das Rezeptor-Molekül gebunden werden. Es kann jedoch wünschenswert sein, chemische Brücken unterschiedlicher Länge zwischen dem modifizierenden Molekül und den Liganden- oder Rezeptor-Molekülen einzubauen, in Abhängigkeit von dem jeweils speziell ins Auge gefassten Test. Manchmal kann es sogar vorteilhaft sein, das modifizierende Molekül und die Liganden- oder Rezeptor-Moleküle getrennt an dasselbe Trägermolekül zu binden, z.B. ein Makromolekül, wie ein Polypeptid oder ein Polysaccharid.

Der hier gebrauchte Ausdruck «Rezeptor» bezieht sich auf jede Substanz, die einen Liganden oder einen markierten Liganden oder einen Teil hiervon spezifisch zu binden vermag. Im allgemeinen ist der beim Test verwendete Rezeptor ein spezifischer Antikörper zu dem im Blut von Vertebraten nach Injektion eines geeigneten Haptens oder Antigens gebildeten Liganden. Andererseits können bei dem Test auch natürlich vorkommende Rezeptoren eingesetzt werden. Diese letztere Gruppe umfasst, ohne hierauf zu beschränken, Proteine, Nucleinsäuren und Zellmembranen. Solche Rezeptoren wurden bei Radioaktivtest-Techniken für Thyroxin, Insulin, Angiotensin und verschiedene Steroidhormone verwendet.

Für den Fall, dass der Ligand ein Antikörper ist, kann der Rezeptor das zum Induzieren des Antikörpers in einem Wirtstier verwendete Antigen sein. Bei einer anderen Ausführungsform kann der Rezeptor ein Antikörper gegen den zu bestimmenden Antikörper sein.

Es ist unmöglich, mit Gewissheit die Art der Rezeptorwirkung zu bestimmen, die bei Bindung des markierten Liganden die Wechselwirkung zwischen Enzym und modifizierendem Molekül herabsetzt. Die plausibelste Erklärung ist die, dass die Affinität des Enzyms für das modifizierende Molekül als Folge einer Änderung in Grösse und Ladung des Komplexes Rezeptor-Liganden-Abwandler im Vergleich zum Liganden-anwandler alleine herabgesetzt ist.

Der Begriff «modifizierende Substanz» oder «Abwand-ler» in der vorliegenden Beschreibung bezieht sich auf jede Substanz, die mit einem Enzym so in Wechselwirkung zu treten vermag, dass das Ausmass bzw. der Grad oder die Art der Enzymaktivität modifiziert oder abgewandelt wird. Diese Modifizierung kann zu einer Hemmung, Aktivierung oder einer Veränderung der Spezifität oder irgendeiner anderen Eigenschaft des Enzyms führen, das entweder direkt oder indirekt durch eine Änderung der Enzymaktivitäten oder in der Art der Aktivität nachweisbar ist, z.B. einer Änderung der

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Reaktionsbedingungen wie Kofaktor-Anforderungen oder pH-Optimum, der kinetischen Eigenschaften oder der Aktivierungsenergie. Die modifizierende Substanz kann in der Grösse zwischen einem kleinen Molekül und einem Makromolekül liegen, und ihre Wechselwirkung mit einem Enzymmolekül kann entweder reversibel oder irreversibel sein, in Abhängigkeit davon, ob die intermolekulare Assoziation ionisch oder von kovalenter Natur ist.

Die Empfindlichkeit des Tests hängt u.a. ab von der Affinität des Rezeptors für den Liganden und der Fähigkeit der modifizierenden Substanz, eine Änderung im Grad der Art der Enzymaktivität hervorzurufen. Vorzugsweise erfolgt eine Modifizierung des Ausmasses oder der Art der Enzymaktivität mit einer Minimalkonzentration an modifizierender Substanz. Je näher diese Konzentration bei der des Enzyms auf molekularer Basis liegt, um so grösser ist die Empfindlichkeit des Tests.

Vorzugsweise ist die modifizierende Substanz ein Enzymhemmstoff, der bei Wechselwirkung mit einem Enzym dessen Aktivität hemmt. Die Wirkungsweise des Hemmstoffs kann kompetitiv, nicht-kompetitiv, unkompetitiv und/oder allo-sterisch sein. Vorzugsweise sollte der Hemmstoff oder Inhibitor eine Hemmkonstante (Hemmstoffkonzentration, die für 50%ige Hemmung des Enzymsystems notwendig ist) unter 10~3 Mol/1, je nach dem durchgeführten Test, haben. Insbesondere bevorzugt liegt die Hemmkonstante zwischen 10~15 und 10"5.

Bei dem Test kann jedes Enzym verwendet werden, vorausgesetzt, es gibt ein modifizierendes Mittel, das die Enzymaktivität in der oben beschriebenen Weise spezifisch modifiziert. Enzyme der Wahl sind stabil, leicht mit geringen Kosten erhältlich und haben einen hohe Wechselzahl und ein einfach durchgeführtes Testsystem. Vorzugsweise liegt die Wechselzahl (pro Enzymmolekül in 1 min gebildete Produktmoleküle) über 100, je nach dem speziell durchgeführten Test. Insbesondere bevorzugt liegt die Wechselzahl so hoch wie möglich und wenigstens bei 200.

Enzymmodifizierende Systeme, die erfindungsgemäss besonders brauchbar sind, sind Dihydrofolat-Reduktase/ Methotrexat, Dihydrofolat-Reduktase/4-Aminopterin, Dihy-drofolat-Reduktase/andere spezifische Inhibitoren dieses Enzyms, ß-Glucuronidase/4-Desoxy-5-amino-zuckersäure und deren Derivate, biotinhaltige Enzyme/Avidin, wie Carboxylase/Avidin, Chymotrypsin/TPCK

S0o-HH-C-C —CH«C1

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y-Cystathionase/Propargylglycin, Alanin-Racemase/Tri-fluoralanin, Tryptophanase/Trifluoralanin, Tryptophan-Synthetase/Trifluoralanin, ß-Cystathionase/Trifluoralanin, Pyruvat-Glutamat-Transaminase/Trifluoralanin, Milchsäure-Oxidase/2-Hydroxy-3-butinsäure, Monoamin-Oxidase/ N,N-Dimethyl-propargyl-amin und Diamin-Oxidase/ H2N-CH-C = C-CH2-NH2.

Die Bestimmung der Enzymaktivitäten kann durch direkte oder indirekte Aufzeichnung des Substratverbrauches oder der Produktbildung bei geeigneten pH und geeigneter Temperatur unter Anwendung von Nachweissystemen wie der Koloriemetrie, Spektrophotometrie, Fluoreszenz-Spektro-photometrie, Gaseometrie, Thermometrie (Wärmetönung), Szintillationszählung, erfolgen.

Um die Empfindlichkeit des Systems zu steigern, können Biolumineszenz- und Enzymzyklus-Techniken angewandt werden, z.B. die Techniken, wie sie beschrieben wurden von J. Lee et al. in Liquid Scintillation Counting: Recent Developments, Stanley P.E. und Scoggins, B.A., Academic Press, New York, S. 403 und Lowry O.H. et al. in J. Biol. Chem. 236. S. 2746-2755.

Bei einer Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens kann ein markierter Ligand zur Bestimmung der Anwesenheit eines Liganden in einer unbekannten Probe durch gleichzeitige oder aufeinanderfolgende Zugabe des markierten Liganden und der unbekannten Probe zu einem wässrigen Medium bei geeignetem pH und mit einem Gehalt an für den Liganden und den markierten Liganden spezifischem Rezeptor verwendet werden. Nach einer geeigneten Inkubationszeit wird die Verteilung des an den Liganden und den markierten Liganden gebundenen Rezeptors durch Zusatz von Enzym und Substraten bestimmt. Der Rezeptor, der für den Liganden spezifisch ist, bindet auch den markierten Liganden und setzt damit die Wechselwirkung zwischen dem modifizierenden Mittel und dem Enzym herab und vermindert so die Abwandlung der Enzymaktivität. Der Zusatz des Liganden bei dem Test führt zur Konkurrenz mit dem markierten Liganden bei der Bindung an den Rezeptor und setzt dadurch die Konzentration an friem Liganden in der Probe herab. Die Wechselwirkung zwischen Ligand/modifi-zierendem Mittel und Enzym nimmt zu und die Enzymaktivität wird wiederum beeinträchtigt. Die Veränderung der Enzymaktivität ist daher eine Funktion der Ligandenkonzen-tration in der Probe und wird durch ungebundenen markierten Liganden verursacht. Folglich ist der Unterschied zwischen der erhaltenen Enzymaktivität und der in Abwesenheit des Liganden erhaltenen Aktivität ein Hinweis auf die Konzentration des Liganden in der unbekannten Probe.

Einer der Hauptvorteile dieses Verfahrens liegt darin,

dass eine Trennung gebundener und freier Anteile bei der Arbeitsweise unnötig ist. Dies schliesst jedoch die Anwendung einer solchen Trennstufe bei dem Test nach der Inkubation von Ligand und markiertem Ligand mit dem Rezeptor und vor der Abschätzung der Enzymaktivität nicht aus. Eine Trennung der Anteile oder Fraktionen kann zuweilen wünschenswert sein, um Substanzen in der Probe zu entfernen, die den Enzymtest stören können. Die Trennung kann unter Anwendung irgendeiner der vielen für den Radioimmuntest beschriebenen Techniken, einschliesslich Gelfiltration, Adsorption und Ionenaustauschchromatographie, fraktionierter Fällung, fester Phase und Elektrophorese, durchgeführt werden. Dieser Test ist natürlich nicht auf die Bestimmung von Haptenen und Antigenen als Ligand beschränkt, sondern kann auch zur Identifizierung und Messung von Antikörpern als Ligand angepasst werden.

Dies kann z.B. durch Markieren des Antikörpers mit einem Enzym modifizierenden Mittel und Messen des Grades der Veränderung der Enzymaktivität nach Inkubation des markierten Antikörpers und des Antikörpers der Probe mit einer begrenzten Konzentration an Antigen oder Hapten geschehen. Die Abwandlung oder Veränderung der Enzymaktivität hängt mit der Konzentration des Antikörpers der Probe zusammen. Wenn nötig, können die gebundenen und freien Anteile vor Zugabe des Enzyms und des Substrats getrennt werden.

Das erfindungsgemässe Verfahren ermöglicht zur Bestimmung eines Liganden auch die Verwendung eines markierten Rezeptors anstelle eines markierten Liganden. Ein Ligand in der unbekannten Probe reagiert mit überschüssigem Rezeptor, der mit einem enzymmodifizierenden Mittel markiert ist, und nach der Inkubation wird überschüssiger unlöslich gemachter Festphasenligand zugesetzt und reagiert mit dem übrigen freien markierten Rezeptor. Nach Abtrennung der festen Phase wird die Veränderung der Enzymaktivität, die

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mit dem löslichen Liganden verbunden ist, gemessen und auf die Ligandenkonzentration bezogen.

Die erforderlichen Reagentien können auch in einer «Sandwich»-Technik verwendet werden, vorausgesetzt, der Ligand besitzt wenigstens zwei Verknüpfungsstellen. Der Ligand reagiert mit überschüssigem Festphasen-Rezeptor, und nach der Inkubation mit anschliessendem Waschen wird der Festphasen-Rezeptor/Ligand mit überschüssigem Rezeptor, der mit einem enzymmodifizierenden Mittel markiert ist, umgesetzt. Freier markierter Rezeptor wird durch Waschen entfernt, und das Ausmass der Enzymabwandlung in den abgetrennten Fraktionen wird bestimmt. Dies ergibt dann einen Index der Ligandenkonzentration.

Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung.

Beispiel 1

Herstellung von « Amino-digoxin»

Zu einer Suspension von 156 mg (0,2 mMol) Digoxin in 5 ml absolutem Äthanol wurden 10 ml 0,2 m Natriummetaper-jodat unter Rühren gegeben. Das Gemisch wurde nach 10 min homogen, und dann bildete sich langsam ein Niederschlag. Nach 2 h wurden 5 ml Wasser und 5 ml Äthanol zugesetzt. 122 jil (2,2 mMol) Äthylenglykol wurden nach weiteren 30 min zugesetzt, und ein dichter weisser Niederschlag begann sich sofort zu bilden. Nach 80 min Rühren wurden 133 ji.1 (2,0 mMol) Äthylendiamin zugesetzt, und der sich ergebende pH von 11,0 wurde auf 9,5 mit 0,1 m HCl eingestellt, und das Reaktionsgemisch konnte 18 h bei Raumtemperatur stehen. Der pH veränderte sich während dieser Zeit nicht.

151,4 mg (4,0 mMol) Natriumborhydrid wurden dann zugegeben, und das Gemisch wurde 3,5 h gerührt. Der pH wurde dann von 10,5 auf 6,5 mit 1 m Ameisensäure (etwa 3 ml) eingestellt, und ein Dünnschichtchromatogramm dieses Gemischs zeigte einen einzigen Hauptfleck mit einen Rf-Wert von 0,15 (Kieselgel auf Aluminium, entwickelt in Butanol/ Essigsäure/Wasser 4:1:1). Digoxin hatte einen Rf-Wert von 0,7 bei Entwicklung im gleichen System.

Die Lösungsmittel wurden unter Vakuum in einem Rotationsverdampfer mit einem Wasserbad bei 60° nahezu bis zur Trockne abgedampft. Die letzten wenigen ml Wasser wurden durch Zugabe von 95%igem Äthanol (3 x 20 ml) und Wiederholen des vorstehenden Abdampfens entfernt.

Der anfallende blassgelbe Feststoff wurde dreimal mit absolutem Äthanol extrahiert, und diese vereinigten Extrakte wurden auf etwa 4 ml aufkonzentriert und zentrifugiert, um eine kleine Menge Salz abzutrennen, die verworfen wurde. Die blassgelbe überstehende Lösung wurde unter einem Strom trocknen Stickstoffs bis zur Trockne eingedampft, um ein gelbes Öl zu erhalten, das den gleichen Rf-Wert bei der Dünnschichtchromatographie wie das oben beschriebene Reaktionsgemisch zeigte. Das Produkt erwies sich als eine freie Aminogruppe enthaltend, indem es mit Fluram (4-Phenylspiro[fluran-2(3H),l'-phthalan]-3,3'-dion) zu einer intensiv fluoreszierenden Verbindung umgesetzt wurde. Das Produkt zeigte ein Spektrum in konzentrierter Schwefelsäure, das dem von Digoxin ähnlich war, mit Absorptionspeaks bei 385 und 495 nm (m|i). Das Produkt zeigte auch eine starke Affinität zu Antiseren (Kaninchen), die für Digoxin spezifisch sind.

Beispiel 2

Herstellung Methotrexat-Aminodigoxin-Konjugat

11 mg Methotrexat wurden in 5 ml H2O gelöst und auf pH 6,5 eingestellt. 10 mg «Aminodigoxin» wurden in dieser Lösung gelöst, und das Volumen wurde mit H2O auf 20 ml eingestellt. Der pH wurde erneut auf 6,5 eingestellt und 484 mg N-Äthyl-N"-(3-dimethylamino)propyl-carbodiimid-

Hydrochlorid, gelöst in 5 ml H2O, wurden zu dem Reaktionsgemisch gegeben. Der pH wurde für 24 h bei Raumtemperatur bei 6,2 gehalten. Das Konjugal wurde an einer Kieselgelsäule unter Verwendung von 3%igem Ammoniumeitrat als Solvens gereinigt. Die das gewünschte Produkt enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und zeigten das zweifache Vermögen, Antiseren (Kaninchen), die für Digoxin spezifisch sind, stark zu binden und auch das Enzym Dihydrofolat-Reduktase (Hühnerleber) stark zu hemmen.

Beispiel 3

Enzym-Inhibitor-Immuntest für Digoxin

100 ul Serum wurden 15 min bei 30° C mit 100 ul Antidi-goxin-Antikörper-Lösung, 100 jil NADPH-Lösung, 100 ji.1 2-Mercapto-äthanol-Lösung und 550 (il Natriumphosphatpuffer pH 7,5 inkubiert. 100 j-il Methotrexat-Digoxin-Konjugat des Beispiels 2 (70 |i,g/ml) wurden zugesetzt, und das Gemisch wurde 15-min inkubiert, worauf 100 jil Dihydrofo-lat-Reduktase-Lösung zugesetzt wurden. Das eingesetzte Dihydrofolat-Reduktase-Präparat wurde aus Hühnerleber nach der Methode von Kaufman, B.T., & Gardiner, R.C., Journal of Biological Chemistry, Bd. 211, S. 1319 (1966) isoliert. Das Gemisch wurde weitere 3 min inkubiert und die Enzymaktivität durch Zugabe von 100 jil Dihydrofolat-Lösung bestimmt und bei 340 nm mit einem Varian-Schrei-ber-Spektrophotometer aufgezeichnet. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle wiedergegeben.

Tabelle I

Reaktionskomponenten Enzym-Aktivität

Digoxin

Anti-

Metho-

Enzym-

OD/min

%

(Proben digoxin-

trexat-Dig-

test-

Hem konzen

Antikör-

oxin-

Kompo-

mung tration per

Konjugat nenten

ng/ml)

(ng in Testprobe)

0

fehlt

0

vorhanden

0,150

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fehlt

7

vorhanden

0,100

33

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vorhanden

7

vorhanden

0,145

3

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vorhanden

7

vorhanden

0,125

16

10

vorhanden

7

vorhanden

0,115

23

Die Reaktionskomponenten wurden in der oben beschriebenen Reihenfolge zugesetzt.

OD = optische Dichte

Die obigen Ergebnisse lassen erkennen, dass einige wenige ng Digoxin in Serum, in dem beschriebenen System bestimmt werden können.

Beispiel 4

Herstellung eines Konjugates aus Methotrexat und menschlichem Serumalbumin

45 mg Methotrexat wurden in 1,0 ml N,N-Dimethylform-amid gelöst, und 25 mg N-Hydroxysuccinimid wurden zugesetzt.

41 mg N,N-Dicyclohexylcarbodiimid wurden gelöst, und das Gemisch wurde 13 h bei Raumtemperatur gehalten. Das unlösliche Harnstoff-Nebenprodukt wurde abgefiltriert, und 100 (il des Filtrats wurden zu einer Lösung gegeben, die 5 mg menschliches Serumalbumin in 800 jil 0,1 m Natriumphosphatpuffer vom pH 7,5 und 100 u.1 Dioxan enthielt. Dieses

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Reaktionsgemisch wurde 30 min bei Raumtemperatur gehalten und dann auf eine Sephadex G-25-Säule gebracht, die mit 0,2 m Natriumphosphatpuffer vom pH 7,5 ins Gleichgewicht gebracht war. Die Säule wurde mit diesem Puffer entwickelt, und es wurden zwei Methotrexat enthaltende Elutionspeaks erhalten, von denen der erste das Konjugat aus Methotrexat und menschlichem Serumalbumin enthielt.

Beispiel 5

Enzym-Inhibitor-Immuntest für menschliches Serumalbumin 100 |il verdünntes Serum wurden bei 30 °C 15 min mit 100 U.1 Antihuman-Serumalbumin-Antikörper (Kaninchen)-Lösung, 100 ni NADPH-Lösung, 100 u.12-Mercaptoäthanol-Lösung und 550 jil Natriumphosphatpuffer vom pH 7,5 inkubiert. 100 |il Methotrexat-Humanserumalbumin-Konjugat (8 |xg/ml) wurden zugesetzt, und das Gemisch wurde 15 min inkubiert, worauf 100 jil Dihydrofolat-Reduktase-Lösung zugesetzt wurden. Das Gemisch wurde weitere 3 min inkubiert und die Enzymaktivität durch Zugabe von 100 jxl Dihy-drofolat-Lösung bestimmt und bei 340 nm mit einem Varian-Schreiber-Spektrophotometer aufgezeichnet. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle II wiedergegeben.

Tabelle II

Reaktionskomponenten

Enzym-Aktivität

Human

Anti-

Metho-

Enzym-

OD/min

%

serum human-

trexat-

test-

Hem albumin serum-

Humanser-

Kompo-

mung

(Proben albumin-

um-

nenten

konz.

Anti-

albumin-

Hg/ml)

körper

Konjugat (Hg in Testprobe)

0

fehlt

0

vorhanden

0,123

0

fehlt

0,8

vorhanden

0,068

45

0

vorhanden

0,8

vorhanden

0,105

16

5

vorhanden

0,8

vorhanden

0,092

25

10

vorhanden

0,8

vorhanden

0,085

31

Die obigen Ergebnisse zeigen deutlich, dass einige wenige [ig menschliches Serumalbumin in dem beschriebenen System bestimmt werden können.

Beispiel 6

Synthese von Methotrexat-Aminoäthylmorphin-Konjugat a) Synthese von 03-Aminoäthylmorphin

In 10 ml frisch von Lithiumaluminiumhydrid (LAH) destillierten Tetrahydrofurans (THF) wurden 400 mg LAH unter Stickstoff suspendiert. Eine Lösung von 400 mg Morphin und 400 mg Chloracetonitril in 4 ml frisch destilliertem THF wurde über 5 min zugesetzt, worauf 1 h rückflussge-kocht wurde. Das Gemisch konnte sich abkühlen, und 0,6 ml Wasser wurden zugesetzt, dann 0,6 ml 10 gewichtsprozentiges Natriumhydroxid und 2 ml Wasser. Nach dem Filtrieren des Gemischs wurden die Salze mit THF gewaschen, die THF-Anteile wurden vereinigt, mit Magnesiumsulfat unter Stickstoff getrocknet, filtriert und das Filtrat eingedampft, um 380 mg 03-Aminoäthylmorphin zu ergeben.

b) Synthese von N-t-Butoxycarbonyl-y-(03-aminoäthylmor-phin)-glutaminsäure-a-benzylester

641 570

Ein Gemisch von 03-Aminoäthylmorphin (50 mg, wie oben hergestellt), N-t-BOC-glutaminsäure-a-benzylester (34 mg) und Dicyclohexylcarbodiimid (25 mg) in Methylenchlorid (5 ml) wurde 4 h bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde mit Äthylacetat verdünnt und mit verdünnter Natriumcarbonatlösung gewaschen. Die Äthylacetatlösung wurde dann zweimal mit 0,1 n Salzsäure extrahiert, und die vereinigten sauren Extrakte wurden mit genügend 10 gewichtsprozentiger Natriumhydroxidlösung behandelt, um den pH auf 8,0 einzustellen. Die Lösung wurde zweimal mit Äthylacetat extrahiert, und die vereinigten Äthylacetatex-trakte wurden mit Salzlösung gewaschen, getrocknet (wasserfreies Natriumsulfat) und abgedampft, um ein farbloses Öl (36 mg) zu ergeben.

c) Synthese von Glutaminsäure-y-(03-amidoäthylmorphin)-a-benzylester-trifluoracetat

Eine Lösung von N-t-BOC-glutaminsäure-morphin-Derivat (36 mg, hergestellt wie oben beschrieben) in Methylenchlorid (3 ml) wurde bei Raumtemperatur gerührt, und Trifluoressigsäure (1 ml) wurde zugesetzt. Das Gemisch wurde 15 min gerührt und dann zur Trockne eingeengt. Der Rückstand war ein farbloses Glas (40 mg).

d) Synthese von Methotrexat-y-(03-amidoäthylmorphin)-a-benzylester

Eine Lösung von 4-Amino-4-desoxy-N10-methylpteroin-säure (37 mg) in 3 ml Dimethylsulfoxid (DMSO), bei Raumtemperatur gerührt, wurde mit Triäthylamin (28 jxl) und i-Butylchlorformiat (25 (il) behandelt, und das Gemisch wurde 30 min gerührt. Es wurde dann zu einem Gemisch des Morphinderivats (75 mg, hergestellt wie unter c) beschrieben) und Triäthylamin (28 jil) in DMSO (2 ml) gegeben, und das Gemisch wurde 1 h bei 60° gerührt. Das gekühlte Gemisch wurde mit Wasser verdünnt und zweimal mit Äthylacetat extrahiert. Die vereinigten Äthylacetatextrakte wurden mit Wasser gewaschen und dann zweimal mit 0,1 n Salzsäure extrahiert. Die vereinigten sauren Extrakte wurden mit genügend 10 gewichtsprozentigem Natriumhydroxid behandelt, um den pH auf 8,0 zu erhöhen. Das Gemisch wurde dreimal mit Äthylacetat extrahiert, und die vereinigten Extrakte wurden mit Salzlösung gewaschen (über wasserfreiem Natriumsulfat) getrocknet und eingeengt, um ein gelbes Öl (15 mg) zu liefern. Dieses wurde durch präparative Dünnschichtchromatographie an Kieselgel unter Entwicklung mit Chloroform/ Methanol, 4:1, gereinigt. Die gewünschte Verbindung wurde in Form eines gelben Feststoffs erhalten (4 mg).

e) Synthese von Metrotrexat-y-(03-amidoäthylmorphin)

Das wie unter d) beschrieben hergestellte Produkt (4 mg) wurde mit 0,1 n Natriumhydroxidlösung (5 ml) gemischt, und das Gemisch wurde 8 h bei Raumtemperatur gerührt, was zu einer klaren gelben Lösung führte.

Sie wurde mit 0,1 n Salzsäure (5 ml) versetzt, und das Gemisch wurde mit Natriumorthophosphatpuffer (0,05 m, pH 7,4) auf 25 ml aufgefüllt, um eine Lösung der gewünschten Verbindung zu ergeben, die sich zur Verwendung beim Enzymtest eignet.

Beispiel 7

Enzym-Inhibitor-Immuntest für Morphin

Ein Gemisch von 10 jil Morphinlösung geeigneter Konzentration, 50 (il Methotrexat-y-(03-amidoäthylmorphin)-Lösung (4 ng/25 ml), 50 jil Antimorphin-Antikörper-Lösung, 10 |j.l NAD PH-Lösung, 10 jal 2-Mercaptoäthanol-Lösung, 50 ji.1 Kaliumchloridlösung, 150 ul Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,5) mit ÄDTA und 10 ul Dihydrofolat-Reduktase (E. casei)-Lösung wurde 20 min bei 37° inkubiert. Die Enzymaktivität

7

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

o5

641 570

8

in dem Gemisch wurde nach Zusatz von 10 ul Dihydrofolat-Lösung bestimmt, indem die Änderung der Extinktion der Lösung bei 340 nm unter Verwendung eines Centrifichem-Centrifugalanalysators aufgezeichnet wurde. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle III wiedergegeben:

Tabelle III

Reaktionskomponenten Enzym-Aktivität

Morphin Antimor- Morphin- Enzym- OD/min %-Hem-

tig/Probe phin- Metho- test- mung

Antikör- trexat- Kompo-

per Konjugat nenten

0

fehlt fehlt

vorhan

0,54

0

den

0

fehlt

3x 10"1

!m vorhan

0,14

76

den

0

vorhan

3x 10"1

!m vorhan

0,41

29

den

0,04

vorhan

3x10-'

!m vorhan

0,37

36

den

0,04

vorhan

3 x 10~!

!m vorhan

0,35

40

den

4,0

vorhan

3x IO"1

sm vorhan

0,31

46

den

20

vorhan

3 x 10"'

!m vorhan

0,27

54

den

40

vorhan

3x10-'

!m vorhan

0,23

60

den

10

20

25

Die obige Tabelle zeigt, dass mit zunehmender Konzentration an Morphin die Aktivität der Dihydrofolat-Reduktase abnimmt. So konnten Morphinlösungen mit vier ug/ml bis 4 mg/ml Morphin getestet werden, wobei nur 10 |j.l Lösung zur Verfügung standen. Dies soll jedoch nicht bedeuten, dass dies der erforderliche Bereich ist, sondern nur die erfolgreiche Anwendung demonstriert.

Beispiel 8

Synthese von Ferritin-Methotrexat-Konjugat

Eine Lösung von Ferritin aus menschlicher Leber (1,3 mg) in Natriumphosphatpuffer (0,05 m, pH 8,0,5 ml) und 1 ml Dimethylformamid (DMF) wurde bei Raumtemperatur gerührt, und 100 jj.1 einer Lösung, erhalten durch Behandeln von Methotrexat (23 mg) in DMF (2 ml) mit Triäthylamin (21 jil) und i-Butylchlorformiat (15 p.1) bei Raumtemperatur für 30 min, wurden zugesetzt. Das Gemisch wurde 2 h bei Raumtemperatur gerührt und dann gegen 2x21 Natriumortho-phosphatpuffer (0,05 m, pH 7,4, 0,1 m an Natriumchlorid und mit 0,05 Gewichtsprozent Natriumazid) 24 h dialysiert. Die Lösung wurde dann durch eine Sephadex G-25-Säule geführt, die mit dem gleichen Puffer ins Gleichgewicht gebracht worden war, und die Ferritin enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und mit dem Puffer auf 10 ml aufgefüllt.

Die anfallende Lösung eignet sich zur Verwendung bei einem Enzym-Immuntest zur Bestimmung von Ferritin.

Claims

641 570

2

PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Bestimmung eines immunologisch aktiven Materials in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe mit einem Rezeptor, der das immunologisch aktive Material spezifisch zu binden vermag, mit dem immunologisch aktiven Material, das mit einer Substanz, die den Grad und die Art der Aktivität eines Enzyms zu modifizieren vermag, markiert ist, und mit einem Enzym und einem Enzymsubstrat zusammengebracht wird, wobei der Grad oder die Art der erhaltenen Enzymaktivität gemessen und mit der mit einem Standard erhaltenen verglichen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das immunologisch aktive Material in unlöslich gemachter Form mit einem Enzym und einem Enzymsubstrat zusammengebracht wird, wobei der Grad oder die Art der Enzymaktivität nach der Abtrennung der festen Phase gemessen und mit der mit einem Standard erhaltenen verglichen wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass als zum Modifizieren der Aktivität eines Enzyms befähigte Substanz ein Enzymhemmstoff verwendet wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Rezeptor ein Antikörper ist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass als Hemmstoff ein Hemmstoff des Enzyms Dihydrofolat-Reduktase verwendet wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass als Hemmstoff Methotrexat und als Enzym Dihydrofolat-Reduktase verwendet wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass als immunologisch aktives Material ein Hapten verwendet wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass als Hapten Digoxin und als Rezeptor ein Antikörper zu Digoxin verwendet wird.
9. Verfahren nach Asnpruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass als Hapten Morphin und als Rezeptor ein Antikörper zu Morphin verwendet wird.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass als immunologisch aktives Material ein Protein verwendet wird.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass als Protein menschliches Serumalbumin und als Rezeptor ein Antikörper zu menschlichem Serumalbumin verwendet wird.
12. Reagens zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 oder 2, enthaltend das immunologisch aktive Material oder einen Rezeptor, der das immunologisch aktive Material spezifisch zu binden vermag, markiert mit einer Substanz, die den Grad oder die Art der Aktivität eines Enzyms zu modifizieren vermag.
13. Reagens nach Anspruch 12, dessen immunologisch aktives Material mit einer Substanz markiert ist, die den Grad oder die Art der Aktivität eines Enzyms zu modifizieren vermag.
14. Reagens nach Anspruch 12, dessen Rezeptor, der das immunologisch aktive Material spezifisch zu binden vermag, mit einer Substanz markiert ist, die den Grad oder die Art der Aktivität eines Enzyms zu modifizieren vermag.
15. Reagens nach Anspruch 14, dessen Rezeptor ein für das zu bestimmende immunologisch aktive Material spezifischer Antikörper ist.
16. Reagens nach einem der Ansprüche 12 bis 14, dessen zum Modifizieren der Aktivität eines Enzyms befähigte Substanz ein Enzymhemmstoff ist.
17. Reagens nach Anspruch 16, dessen Enzymhemmstoff eine Hemmkonstante unter 10-3 Mol/1 aufweist.
18. Reagens nach Anspruch 17, dessen Enzymhemmstoff eine Hemmkonstante zwischen 10~15 und 10~15 Mol/1 aufweist.
19. Reagens nach Anspruch 18, dessen Hemmstoff

5 Methotrexat und dessen Enzym Dihydrofolat-Reduktase ist.
20. Reagens nach einem der Ansprüche 12 bis 15, dessen zum Modifizieren der Aktivität eines Enzyms befähigte Substanz ein Enzym-Aktivator ist.
21. Reagens nach einem der Ansprüche 12 bis 20, dessen i° immunologisch aktives Material Digoxin ist.
22. Reagens nach einem der Ansprüche 12 bis 20, dessen immunologisch aktives Material menschliches Serumalbumin ist.
23. Reagens nach einem der Ansprüche 12 bis 20, dessen '5 immunologisch aktives Material Morphin ist.
24. Reagens nach einem der Ansprüche 12 bis 20, dessen immunologisch aktives Material Ferritin ist.
25. Reagens nach einem der Ansprüche 12 bis 24, dessen immunologisch aktives Material oder dessen Rezeptor, der

20 das immunologisch aktive Material spezifisch zu binden vermag, an die Substanz, die den Grad oder die Art der Aktivität eines Enzyms zu modifizieren vermag, kovalent gebunden ist.
26. Reagens nach Anspruch 21, bestehend aus einem Kon-jugat von Digoxin und Methotrexat.

25 27. Reagens nach Anspruch 22, bestehend aus einem Kon-jugat von menschlichem Serumalbumin und Methotrexat.
28. Reagens nach Anspruch 23, bestehend aus einem Kon-jugat von Morphin und Methotrexat.
29. Reagens nach Anspruch 24, bestehend aus einem Kon-30 jugat von Ferritin und Methotrexat.