CH633716A5 - Method for separating and purifying products having interferon activity, purified preparations having interferon activity and use of the preparations - Google Patents

Description

L'invention a pour objet un procédé pour séparer sélectivement, en éliminant les substances contaminantes, des produits à activité interféron de préparations les renfermant, et vise plus particulièrement un procédé de purification de tels produits.

Elle a également pour objet les préparations purifiées correspondantes et l'utilisation de ces dernières comme principe actif de médicament.

On sait que l'interféron est un produit thérapeutique de grande valeur, notamment en raison de ses remarquables propriétés antivirales et immunodépressives.

Selon les modes de synthèse in vitro habituels, ce produit est obtenu par action de virus ou de substances chimiques sur des cultures de tissus. Mais les préparations résultantes renferment également des substances contaminantes. Notamment, ces préparations contiennent des protéines qui possèdent une action pyrogène et présentent en outre l'inconvénient de pouvoir induire une sensibilisation spécifique chez le receveur.

Les préparations brutes d'interféron ne peuvent pas, de ce fait, être utilisées directement, en particulier pour les applications envisagées ci-dessus, et doivent être purifiées.

Diverses méthodes de purification ont été proposées, notamment des méthodes par filtration sur gel ou par échangeurs d'ions.

Mais l'utilisation à grande échelle de telles techniques pour la purification de préparations d'interféron s'est heurtée à des difficultés, en raison notamment de très faibles rendements.

On a également proposé des procédés de Chromatographie d'affinité.

On sait que ces derniers sont fondés sur une affinité sélective entre un produit donné et une phase adsorbante comprenant un ligand fixé de manière covalente sur un support solide. Le passage, sur la phase adsorbante, d'une préparation renfermant le produit qu'on désire séparer permet de retenir de manière sélective le produit en question sur le ligand, et ainsi de le séparer à partir de la préparation le renfermant. Pour récupérer le produit fixé, il est ensuite nécessaire de disposer d'un agent de désorption.

Selon des techniques fondées sur le principe de la Chromatographie d'affinité, on utilise, en tant que ligand, des anticorps anti-interféron. Mais les résultats obtenus à ce jour ne donnent pas encore satisfaction, en raison notamment de la production d'antisérums qui est difficile, longue et coûteuse, et ce à fortiori si l'on essaie de la développer à l'échelle industrielle.

On connaît également des procédés de Chromatographie d'affinité dans lesquels le ligand mis en œuvre est choisi en raison des propriétés hydrophobes de l'interféron. Ces procédés font alors appel à des solvants organiques pour la désorption.

Or, en vue de l'utilisation en thérapeutique de l'interféron, il est nécessaire d'éliminer toute trace de solvant organique, et ce sans détruire l'activité interféron en le transférant en milieu aqueux. Ces procédés entraînent donc des manipulations extrêmement complexes.

Dans d'autres procédés de ce type, le ligand utilisé est constitué par un dérivé possédant une structure polycyclique du type de celle du chromophore bleu, tel que celui commercialisé sous la marque Bleu Cibacron F3GA.

Ces derniers procédés présentent l'avantage de pouvoir être mis en œuvre dans des conditions où l'on peut travailler en milieu aqueux, ce qui élimine les inconvénients rencontrés dans les techniques précédentes dans le cas de l'utilisation en thérapeutique des préparations purifiées d'interféron.

Ces procédés permettent en outre d'éliminer une grande partie des protéines contaminantes.

Or, les inventeurs ont à présent établi qu'il est possible d'améliorer encore ces résultats en utilisant, pour séparer et fixer les produits à activité interféron de préparations les contenant, de nouveaux agents ligands. Dans la suite de la description et dans les revendications, il est entendu qu'on désigne par le terme préparation aussi bien une composition renfermant les produits à activité interféron sous forme non liée que liée, et notamment sous forme de complexe.

Cette invention repose donc sur la constatation d'une remarquable affinité des produits à activité interféron pour un certain type de structure.

Il est ainsi possible, en utilisant cette affinité particulière, de séparer de manière extrêmement spécifique des produits à activité interféron de préparations, ou analogues, les renfermant, et d'obtenir, de manière aisée, des préparations d'interféron plus satisfaisantes que celles proposées à ce jour, notamment tant du point de vue de leur titre en interféron que de leur pureté.

Le procédé selon l'invention, pour séparer sélectivement, en éliminant les substances contaminantes, des produits à activité interféron de préparations les renfermant est caractérisé par le fait qu'on met en contact ces préparations avec une phase comprenant au moins un polynucléotide, jouant de manière spécifique le rôle de ligand vis-à-vis des produits à activité interféron.

La remarquable affinité spécifique entre les polynucléotides et les produits à activité interféron permet de séparer ces derniers, avec une très grande sélectivité, de préparations les renfermant.

Les résultats obtenus donnent entière satisfaction avec des préparations d'interféron aussi bien d'origine humaine qu'animale et notamment constituées par des surnageants de cultures de tissus, d'explantation fraîche (cultures primaires ou secondaires) ou de lignées continues, où les cellules ont été induites à produire de l'interféron, avantageusement dans un milieu de culture dépourvu de sérum, par un virus ou un acide nucléique synthétique tel le poly-I.C. Les interférons des préparations mises en œuvre peuvent être par ailleurs d'origine fibroblastique ou leucocytaire. Des préparations obtenues par traduction en milieu acellulaire, notamment selon les techniques rapportées dans «Molecular Mechanism of Prot. Biol. Synthesis» édité par H. Weissbach et S. Pestka, Acad. Press 1977, pp. 574 à 582, peuvent également être utilisées dans le procédé de l'invention.

Selon une disposition de l'invention, on met en contact une préparation à purifier de produits à activité interféron avec un adsorbant équilibré par un tampon dont la concentration en sels est isomolaire ou de préférence hypomolaire par rapport à celle du sang, ledit adsorbant comportant, d'une part, un support solide formant gel, dont la grosseur des mailles est telle qu'elle permet le passage de macromolécules et, d'autre part, un composé du type polynucléotide, fixé sur ledit support, jouant le rôle de ligand vis-à-vis des produits qu'on désire séparer de manière sélective, la quantité d'adsorbant mise en œuvre et la durée de contact entre le ligand et la préparation à purifier étant suffisantes pour permettre la fixation désirée des produits'à activité interféron.

Pour l'obtention de préparations purifiées à activité interféron, on a recours à une étape supplémentaire selon laquelle on réalise la désorption des produits fixés à l'aide d'un tampon dont la concentration en sels est hypermolaire par rapport à celle du sang.

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On peut ainsi disposer de produits à activité interféron extrêmement purs, à titre élevé en interféron, utilisables directement en thérapeutique.

On notera que l'interféron est aisément récupérable à partir du produit de couplage qu'il forme avec le ligand, et ce de manière pratiquement totale et sans qu'il soit dénaturé. L'intérêt de ce procédé est encore accru du fait que la capacité d'adsorption de l'adsorbant utilisé n'est pratiquement pas endommagée. Le même adsorbant peut alors être utilisé pour de nombreuses opérations de purification, et par conséquent est avantageux d'un point de vue économique.

Selon une autre disposition de l'invention, on met en contact une composition comprenant un complexe renfermant des produits à activité interféron fixés sur un ligand avec une phase comportant au moins un composé du type polynucléotide, capable d'entrer en compétition avec le ligand pour la fixation des produits à activité interféron et de détacher ces derniers, les composition et phase en question étant équilibrées à l'aide d'un tampon dont la concentration en sels est isomolaire ou hypomolaire par rapport à celle du sang, la quantité de polynucléotides dans la susdite phase et la durée de contact entre les polynucléotides et les produits à activité interféron fixés sur le ligand étant suffisantes pour permettre la désorption des produits à activité interféron.

On remarquera que, dans la mise en œuvre de cette disposition, les produits à activité interféron se trouvent fixés sur un ligand pour lequel ils possèdent moins d'affinité que pour les polynucléotides. Etant donné le caractère très important de l'affinité de l'interféron pour les polynucléotides, la compétition pour la fixation de l'interféron se fait au profit de ces derniers.

On observera, de plus, qu'il en résulte une purification supplémentaire pour les produits à activité interféron. En effet, les substances contaminantes, en particulier les protéines qui se trouvent présentes dans les préparations brutes d'interféron et qui ont tendance à se fixer avec l'interféron sur l'adsorbant considéré ne seront pratiquement pas détachées par les polynucléotides. Cette disposition de l'invention constitue un procédé de purification très sélectif.

En outre, ce procédé offre l'avantage de conférer à l'interféron une protection importante contre la dénaturation thermique et, en conséquence, une grande stabilité.

Selon un mode préféré de réalisation de la susdite première disposition de l'invention, on sépare des produits à activité interféron de préparations brutes les renfermant par mise en contact de ces préparations avec une phase adsorbante constituée par au moins un dérivé de type polynucléotide couplé à un support solide.

Le dérivé de type polynucléotide est un polyribonucléotide ou un polydésoxyribonucléotide dans lequel un ou plusieurs éléments dans les motifs constitutifs est éventuellement modifié, sans que cette modification altère le phénomène de reconnaissance spécifique que présente à son égard l'interféron.

Avantageusement, on met en œuvre les polynucléotides, comportant d'environ 10 à 500 motifs nucléotides. Ces dérivés propres, de par leur configuration et leur constitution, à fixer les produits à activité interféron peuvent être aussi bien de synthèse que d'origine naturelle.

Parmi les dérivés du premier type de polynucléotides tels que l'acide polyribo-inosinique ou poly-I, l'acide polyniboadénosique ou poly-A et l'acide polyribo-uridylique ou poly-U, sont particulièrement appropriés. On utilise, d'une manière générale, des produits ayant un poids moléculaire de l'ordre de 50 000 à environ 250 000.

Comme polynucléotides d'origine naturelle convenant pour la mise en œuvre du procédé de l'invention, on utilise avantageusement les acides ribonucléiques cellulaires, et plus particulièrement les acides ribonucléiques de transfert ou ARN-t.

Il peut s'agir aussi bien de la totalité des fractions d'ARN-t extraites des cellules que d'une partie de ces fractions, ou encore de fractions spécifiques vis-à-vis de la synthèse d'un acide aminé donné.

On sait que ces ARN-t comprennent environ 70 à 85 motifs nucléotides et possèdent un poids moléculaire de l'ordre de 25 000.

Différentes sources d'ARN-t peuvent être utilisées, notamment parmi les eucaryotes ou les procaryotes, on peut avoir recours à des bactéries, telles que celles appartenant au genre E. coli, ou encore des levures, telles que celle appartenant au type de la levure de bière.

Le support solide de l'adsorbant formant gel comprend un Polysaccharide tel que l'agarose ou un dérivé de celui-ci, notamment un agarose modifié dans lequel les chaînes Polysaccharides sont réticulées en un réseau tridimensionnel, en particulier celui commercialisé sous la marque Sepharose, ou encore un Polyacrylamide ou une résine acrylique.

Pour des raisons physiologiques encore inexpliquées, il s'avère que les produits à activité interféron présentent une affinité très grande pour les susdits polynucléotides. Cette propriété peut donc être utilisée d'un point de vue pratique pour purifier l'interféron.

Par simple contact, suivant les conditions d'iso- ou d'hypo-molarité évoquées ci-dessus, avantageusement établies à l'aide d'un tampon ayant une molarité d'environ 0,01 à 0,05 M, lesdits produits sont adsorbés sélectivement, tandis que la majeure partie des substances indésirables présentes dans les préparations ne sont pas retenues.

Il est particulièrement commode de réaliser la mise en contact de l'adsorbant et de la préparation à purifier dans une colonne de Chromatographie, en faisant passer au travers de cette colonne la préparation à purifier. La colonne chargée avec l'adsorbant est équilibrée avec le susdit tampon dont le pH est de l'ordre de 3 à 9, de préférence voisin de la neutralité.

On utilise des préparations brutes d'interféron dont le titre en interféron est d'environ 10+ à 10® unités internationales pour 0,1 à 0,2 g de protéines, ce qui donne une activité spécifique (unités internationales d'interféron ou UIF, par milligramme de protéines) se situant entre IO5 et 107. Ces préparations peuvent être utilisées telles quelles en conditions d'isomolarité, pour le passage sur colonne, ou subir une dialyse préalable contre le tampon qui a servi à équilibrer ladite colonne. En opérant dans les conditions d'isomolarité d'un milieu de culture tissulaire, le rendement en interféron est d'environ 80 à 90%, alors qu'il est de 100% en conditions d'hypomo-larité. Dans cette dernière éventualité, un tampon particulièrement approprié est constitué par du tris-HCl lOmM pH 7,5 (on rappelle que tris est l'abréviation couramment adoptée pour désigner le tris-(hydroxyméthylaminométhane).

L'étape de séparation des produits à activité interféron à partir de préparations les renfermant entre donc dans le cadre de l'invention.

L'invention vise en outre, à titre de produits industriels nouveaux, les complexes formés par les produits à activité interféron fixés sur les phases adsorbantes décrites ci-dessus comprenant au moins un dérivé de type polynucléotide.

De tels complexes résultent de l'interaction entre les produits à activité interféron et les polynucléotides. Le mode d'interaction n'est pas clarifié à ce jour, mais les travaux effectués conduisent à penser qu'il s'agit de liaisons noncovalentes et qu'il peut exister des forces de Van der Waals, des liaisons hydrogène, des liaisons hydrophobes, des forces ioniques faibles...

Les produits fixés peuvent être récupérés en augmentant la concentration en sels du tampon—notamment par addition d'acétates, phosphates, chlorures ou autres sels — de manière à obtenir une concentration en sels hypermolaire par rapport à celle du sang et d'au moins 0,5 M, et de préférence 1 M.

Cette récupération des produits à activité interféron est effectuée avantageusement par élution en colonne. En recueillant les fractions éluées, on dispose de préparations d'interféron purifiées, à teneur élevée en interféron et pratiquement totalement dépourvues de protéines contaminantes.

En outre, en réalisant la phase de désorption avec un débit n'excédant pas 0,2 ml/cmz/min, on recueille la majeure partie des produits à activité interféron dans une fraction d'éluat de faible volume, en particulier lorsque la phase d'adsorption a été conduite

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dans des conditions hypomolaires, ce qui présente l'avantage de fournir des préparations ayant une concentration élevée en interféron par rapport à la concentration dans les préparations brutes.

Par utilisation du procédé de l'invention, avec un rendement quasi total et en une seule étape, on peut obtenir des préparations 5 d'interféron de très grande pureté.

On notera, de plus, que ces préparations se trouvent d'une manière avantageuse en solution aqueuse et peuvent donc être utilisées telles quelles dans des applications thérapeutiques comme indiqué ci-après. 10

Ainsi, en ce qui concerne par exemple l'interféron de souris pour lequel la méthode a été mise au point la première fois, on obtient des préparations pouvant atteindre 10® unités par milligramme de protéines.

Comme indiqué ci-dessus, il est également possible, grâce à la 15 remarquable affinité, mise en évidence par les inventeurs, entre les produits à activité interféron et les polyribonucléotides, de séparer ces derniers de complexes ou compositions dans lesquels ils se trouvent liés et de former un nouveau complexe de type poly-nucléotides/produits à activité interféron.

Selon un mode de réalisation préféré de cette disposition de l'invention, on met en contact, d'une part, une composition comprenant des produits à activité interféron fixés sur un adsorbant et, d'autre part, une phase renfermant au moins un dérivé de type polynucléotide.

Ledit adsorbant comprend un support solide formant gel, dont la grosseur des mailles est telle qu'elle permet le passage de macromolécules et, d'autre part, un composé fixé sur ledit support, jouant le rôle de ligand vis-à-vis des produits qu'on désire séparer de manière sélective et qui possède une structure polycyclique du type de celle du chromophore bleu, commercialisé sous la marque Bleu Cibacron F3GA, de formule

S020Na

SOgONa ou un produit équivalent dont la configuration permet de retenir l'interféron de manière sélective.

Comme support solide de ce type, on utilise avantageusement un support formant gel, tel que celui mis en œuvre pour former un produit de couplage avec un polynucléotide selon la susdite première disposition de l'invention.

Le ligand couplé au support solide est avantageusement constitué par le Bleu Cibacron F3GA lui-même, ou le produit commercialisé sous la marque Bleu Cibacron 3GA (qui diffère essentiellement du précédent par la présence d'un atome d'hydrogène à la place du groupe — S020Na sur le radical phényle en extrémité de chaîne), ou encore un produit équivalent. Par produit équivalent, on entend,

dans la description et les revendications, un produit qui, même s'il diffère des chromophores bleus susindiqués par la nature et/ou la position des substitutions, permet toutefois d'obtenir la fixation sélective désirée de l'interféron.

Le composé cyclique utilisé comme ligand peut être attaché sans inconvénient à un Polysaccharide, notamment à un Polysaccharide de poids moléculaire élevé, de l'ordre de 2 millions, dénommé Dextran 2000. Dans ce cas, c'est le Polysaccharide qui est fixé au support solide.

Un composé préféré de ce genre, c'est-à-dire constitué par un composé cyclique fixé sur du Dextran 2000, est le produit connu sous la marque Bleu Dextran 2000, qui correspond au susdit Bleu Cibacron F3GA fixé sur du Dextran 2000. Ce produit est avantageusement fixé par l'intermédiaire du Dextran 2000 sur un support solide constitué par de l'agarose, en particulier du Sepharose, ce qui correspond au produit commercialisé sous la marque Bleu Dextran Sepharose.

L'adsorbant comprenant les produits à activité interféron liés au susdit support solide est équilibré par un tampon dont la concentra60

tion en sels est isomolaire ou de préférence hypomolaire par rapport à celle du sang. On établit avantageusement ces conditions à l'aide d'un tampon ayant une molarité inférieure à 50 mM et notamment avec le tampon tris utilisé dans la phase d'adsorption de produits à activité interféron sur une phase comportant des polynucléotides telle que décrite ci-dessus.

En ce qui concerne la phase renfermant au moins un dérivé du type polynucléotide, elle comprend ces polynucléotides en solution dans un tampon dont la concentration en sels est avantageusement hypomolaire par rapport à celle du sang.

Les polynucléotides en question sont tels qu'évoqués plus haut. Ainsi, les polyribonucléotides comportant d'environ 10 à 500 motifs nucléotides constituent de remarquables agents de désorption. Parmi les polyribonucléotides appropriés, on peut citer l'acide poly-riboguanylique ou poly-G, le poly-I, le poly-U.

On peut également utiliser des acides ribonucléiques, en particulier les ARN-t. Ces derniers peuvent être extraits de bactéries telles que celles du genre de E. coli. Ils peuvent également provenir de levures telles que la levure de bière. On a également avantageusement recours à des acides ribonucléiques d'origine animale ou humaine, plus particulièrement provenant d'organes d'animaux.

Parmi ces derniers, ceux extraits des cellules mêmes qui ont produit l'interféron que l'on désire purifier sont tout spécialement préférés. Ainsi, pour purifier des préparations renfermant des produits possédant l'activité de l'interféron de souris, on utilise de manière avantageuse les cellules de souris de la lignée cellulaire dite C 243.

D'une manière préférée, les polynucléotides utilisés comme agents de désorption sont mis en solution dans un tampon à raison de 10 à 100 ng/ml, de préférence de 30 à 50 |_ig.

Un tampon approprié à cet effet est constitué par le tris-HCl lOmM, pH 7,5.

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D'un point de vue pratique, il est avantageux que la mise en contact, d'une part, des complexes comportant les produits à activité interféron avec, d'autre part, les polynucléotides, corresponde à une opération de désorption sur colonne de Chromatographie d'affinité.

Cette opération consiste alors à récupérer, à l'aide des polynucléotides, les produits à activité interféron fixés sur l'adsorbant remplissant la colonne.

A cette fin, on fait passer une solution de polynucléotides renfermant de 10 à 100 ng/ml et de préférence de 30 à 50 (ig/ml d'un tampon d'élution constitué par du tris-HCl lOmM, pH 7,5, sur une colonne renfermant un gel adsorbant constitué par du Bleu Dextran Sepharose auquel sont fixés des produits à activité interféron.

Le passage de cette solution est réalisé avantageusement à raison d'environ 0,2 ml/cm2/min.

Pour faciliter une désorption sur un faible volume d'êluant, notamment dans le cas où l'affinité entre les polynucléotides et les produits à activité interféron n'est pas nettement marquée, on laisse avantageusement la solution de polynucléotides en contact avec le gel adsorbant avant de procéder à l'élution. D'une manière générale, un temps de contact de 'A h à 18 h environ est suffisant.

L'expérience a montré que la phase de désorption est avantageusement réalisée avec un volume d'éluant correspondant environ de 2 à 4 fois le volume total de gel adsorbant.

Grâce à la remarquable spécificité de ce procédé, on recueille des produits à activité interféron de très grande pureté.

L'interféron est fixé sur les polynucléotides et les produits de couplage résultants entrent également dans le cadre de l'invention.

Comme indiqué ci-dessus, les polynucléotides assurent, d'une manière avantageuse, une protection des produits à activité interféron contre la dénaturation thermique. Ainsi, on constate, en chauffant à environ 60° C un produit de couplage selon l'invention, qu'une partie importante notamment de l'activité antivirale est conservée, alors que plus de 95% de cette activité disparaît dans les préparations témoins.

Les préparations purifiées de produits à activité interféron et qui comprennent les produits à activité interféron récupérés par désorption à partir de complexes qu'ils forment avec des polynucléotides fixés sur un support solide, ainsi que les complexes qu'ils forment selon une autre disposition de l'invention avec lesdits polynucléotides, possèdent de remarquables propriétés thérapeutiques, et il s'y ajoute notamment l'avantage d'une action antivirale de grand intérêt. Cette activité a été mise en évidence notamment chez des patients souffrant d'hépatite B chronique, en procédant selon les techniques décrites par Desmyter et al. dans «The Lancet», ii 645-647,1976, et Greenberg et al. (New England) dans « J. Med.», 295, 517,522,1976.

Ces préparations d'interféron sont également utilisables pour guérir des cas de kératite dendritique, comme le montrent les essais effectués selon les techniques décrites par Sundmacher et al. dans Albrecht v. Graefes, «Arch. Klin. Exp. Ophtal.», 201:39-45,1976.

Ces préparations se montrent également efficaces pour prévenir les récurrences de la kératite herpétique, comme mis en évidence par les essais réalisés selon Kaufman et al., «J. Infect. Dis.», 133 (suppt) A 165-168,1976. En outre, les préparations d'interféron peuvent avoir un effet favorable chez les patients atteints de tumeurs cancéreuses. D'une part, ces préparations diminuent la fréquence et la durée des complications virales, notamment dues à l'herpès zoster, ainsi qu'il apparaît en réalisant des essais selon Jordan et al., « J. Infect. Dis.», 130:56-62,1974. D'autre part, elles semblent favoriser, par leurs propriétés antitumorales, la survie de patients atteints d'ostéosarcome. Ces expériences peuvent être mises en évidence en opérant selon Strander et al., «Acta Orthop. Scand.», 45:958-959, 1974.

Tous ces essais ont permis de constater une innocuité remarquable des préparations à activité interféron selon l'invention.

Comme l'ont montré de nombreux travaux, l'interféron ne provoque d'ailleurs pas de phénomènes de toxicité évidents. On peut se reporter à ce sujet aux résultats donnés par J. Desmyter et al. dans

«The Lancet», septembre 25,1976, pp. 645 à 647, et aux références indiquées dans cet article concernant l'absence de toxicité de tels produits, à savoir l'article de H. Strander et al. dans «Natn. Cancer Inst.», 1973, 51,733, de G.W. Jordan et al. dans «Infect. Dis.», 1974, 130,56, et de G. Emödi et al. dans «Natn. Cancer Inst.», 1975,54, 1045.

L'interféron étant spécifique de l'espèce, on doit alors disposer, par exemple pour des applications thérapeutiques chez l'homme, d'interféron provenant de cellules humaines.

Les médicaments selon l'invention, qui renferment les préparations purifiées de l'invention en tant que principes actifs, peuvent être administrés à l'homme notamment par voie intramusculaire et par voie sous-cutanée sous forme de solution. A titre d'exemple, on a administré une dose d'interféron fibroblastique de 107 unités tous les

2 d, pendant deux semaines, dans les cas d'hépatite chronique ou

3 x 10fi unités d'interféron leucocytaire, 3 fois par semaine dans les cas d'ostéosarcome.

Exemple 1:

Préparation d'une colonne d'affinité de polynucléotides en vue de la séparation de produits à activité interféron de préparations les renfermant.

On forme tout d'abord un gel de Sepharose activé qui servira de support solide aux polynucléotides puis, dans une seconde étape, on réalise la fixation des polynucléotides au Sepharose activé en procédant selon une méthode dérivée de celle décrite par D.L. Robberson et N. Davidson dans «Biochem. », II, 4,1973,533.

a) Préparation du gel de Sepharose activé

On met en œuvre de l'agarose du type Sepharose 4 B tel que celui commercialisé par Pharmacia (Uppsala, Suède). Ce produit se présente sous forme de billes. Ces dernières sont lavées à l'eau par filtration sur verre fritté, puis remises en suspension dans de l'eau selon ime proportion de 5 ml de Sepharose initial pour 10 ml d'eau.

Le Sepharose est ensuite activé par du bromure de cyanogène CNBr. A chaque 10 ml de suspension de Sepharose, ce dernier étant maintenu en suspension par une légère agitation magnétique, on ajoute peu à peu 15 ml d'une solution aqueuse de CNBr à 6,5-7%.

La température de la suspension est maintenue à 4° C par un bain de glace; le pH, contrôlé par un pH-mètre, est ajusté à 10 par addition de NaOH. Une fois le pH stabilisé et une température d'environ 20°C atteinte, on filtre le Sepharose ainsi activé sur un filtre à verre fritté et on le lave avec un tampon bicarbonate 0,1M, pH 9, préalablement refroidi en utilisant un volume de tampon correspondant à environ 10 fois le volume de gel de Sepharose. On remet ensuite en suspension le gel dans le même tampon bicarbonate, en utilisant 8,5 ml pour 10 ml de suspension initiale. Le Sepharose ainsi activé est couplé à l'ester méthylique de l'acide s-amino-caproïque. On complète chaque fraction de 8,5 à 10 ml avec une solution de l'ester à 30% dans le tampon de bicarbonate à pH 9. Le pH du mélange est ajusté à 9 à l'aide de NaOH et le mélange est laissé à 4° C pendant 24 h avec une agitation rotatoire lente.

Le gel de Sepharose est ensuite lavé avec 10 volumes d'eau glacée et remis en suspension dans l'eau jusqu'au volume initial. On ajoute ensuite 0,7 ml d'une solution d'hydrate d'hydrazine à 98%, puis on porte ce mélange à 70° C pendant 15 min et on le refroidit.

Le gel est à nouveau filtré et lavé abondamment avec de l'eau glacée et ensuite remis en suspension dans l'eau jusqu'au volume initial.

Pour bloquer les groupements carboxyles du Sepharose, on ajoute 9 g de chlorhydrate de glycinamide par 100 ml de suspension de Sepharose/hydrazide. Le pH est ajusté à 4,75 puis on ajoute au mélange 1,12 g de carbodiimide (pour 100 ml de suspension). Le mélange est laissé pendant 2 h, tout en maintenant le pH à 4,75 par addition de HCl IN.

Après lavage à l'eau glacée par filtration, le gel de Sepharose est mis en suspension dans un volume double d'une solution de EDTA 5x 10_4M, pH7.

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Le Sepharose ainsi activé peut être conservé à 4°C.

b) Fixation de Sepharose sur les polynucléotides

Plusieurs méthodes ont été proposées pour former un complexe de polynucléotides et d'agarose activé tel que le susdit Sepharose et elles peuvent permettre d'obtenir la fixation désirée notamment à l'extrémité du groupe P04 en position 3' dans la portion ose des polynucléotides ou encore à l'extrémité du groupe P04 en position 5'.

Pour fixer du Sepharose activé par l'extrémité du groupe P04 en position 3' de la portion ose de polynucléotides tels que des poly-I, poly-U ou des ARN-t, on procédera avantageusement selon une méthode fondée sur celle décrite par D.L. Robberson et N. Davidson dans l'article évoqué ci-dessus. Cette méthode comprend le traitement des polynucléotides avec une phosphatase alcaline, puis une étape d'oxydation des polynucléotides et leur couplage avec le gel de Sepharose activé.

a-Traitement avec une phosphatase alcaline

Avant de réaliser cette fixation, les polynucléotides sont soumis à une réaction d'oxydation par du periodate de sodium. Pour augmenter le rendement de la réaction, les polynucléotides sont systématiquement traités préalablement par la phosphatase alcaline pour enlever toute présence possible d'un groupement P04 à l'extrémité 3' de la portion ose des polynucléotides.

ß-Etape d'oxydation des polynucléotides

L'oxydation au periodate est effectuée selon la méthode de Hunt («Bioch. J.», 1965,95,542).

Les polynucléotides, à une concentration de 1-2 mg/ml dans un tampon acétate de pH 5,2, sont oxydés par addition d'un dixième de volume d'une solution de NaI04 0,2M fraîchement préparée. La réaction est effectuée à l'abri de la lumière pendant 45 min. L'excès de periodate est éliminé par addition d'un dixième de volume d'éthylèneglycol. On récupère les polynucléotides ainsi oxydés par précipitation à l'éthanol, puis on le met en solution dans un tampon d'acétate de sodium 0,1 M, pH 5, et on effectue une dialyse de cette solution contre le même tampon d'aeétate 0,1M, ce qui permet l'élimination du formaldéhyde formé précédemment.

y-Couplage des polynucléotides au gel de Sepharose activé

On ajoute environ 50 à 60 unités de A 260 de polynucléotides par millilitre de gel de Sepharose activé, bloqué par l'hydrazine comme indiqué ci-dessus (volume mesuré en dépôt). Ce mélange est mis en suspension dans 5-6 ml et laissé en agitation douce à 4°C pendant 12-15 h. Les polynucléotides non fixés sont éliminés par lavages successifs avec un tampon acétate 0,1 M de pH 5,2, puis un tampon bicarbonate 0,1 M de pH 9.

Le gel de Sepharose portant les chaînes de polynucléotides est alors remis en suspension dans le tampon désiré. Pour former un complexe de Sepharose activé et de polynucléotides tels que le poly-A et le poly-C, on opère avantageusement en milieu tampon à pH 6 selon le procédé décrit par Wagner et al. dans «BBRC» (1971) 45,

184.

A une solution de polynucléotides (à une concentration de 2-4 mg/ml dans de l'acide 4-morpholinoéthanesulfonique 0,2M, de pH 6,0), on ajoute une suspension de gel de Sepharose activé obtenu comme décrit ci-dessus dans une proportion de 1/3 (v/v).

Le mélange est agité doucement à 4°C pendant 12-15 h. Les polynucléotides qui n'ont pas réagi avec le Sepharose sont éliminés par filtration puis, par lavages successifs, avec le tampon d'acide 4-morpholinoéthanesulfonique, puis avec de l'eau.

Dans ce cas, les polynucléotides sont supposés fixés par l'intermédiaire du groupe P04 qui se trouve à l'extrémité du groupe en position 5' dans la portion ose des polynucléotides.

Pour fixer du poly-U sur du Sepharose activé, on opère comme indiqué ci-dessus dans un tampon à pH neutre tel que le tris, à faibles concentrations de 10-20 mM.

c) Préparation de la colonne de Chromatographie d'affinité

On verse le gel de polynucléotides Sepharose dans une colonne de Chromatographie de dimensions appropriées. On estime que 1 ml de gel est capable de fixer environ 8 millions d'unités internationales d'interféron.

Avant la toute première utilisation de la colonne, on procède à un rinçage avec 20 fois le volume mort de tampon tris-HCl lOmM, pH 7,5, additionné de 0,02% d'azide de soude.

Etant donné que l'azide de soude est toxique pour les cellules, il faut faire passer au travers de la colonne au moins trois volumes morts de tampon tris-HCl sans azide avant de procéder à la fixation de l'interféron.

Exemple 2:

Purification d'une préparation d'interféron de souris par Chromatographie d'affinité sur une colonne selon l'exemple 1 de poly-U/Sepharose.

La préparation brute d'interféron consiste en un surnageant de culture tissulaire dérivé de cellules C 243 induites à produire de l'interféron par le virus de la maladie de Newcastle. Après inactiva-tion du virus à pH 2, le surnageant est dialysé contre du tris-HCl lOmM, pH 7,5, pendant 24 h environ à une température de 4°C environ.

Le titre en interféron de la préparation brute est de 1,3 x 10® unités internationales, sa teneur en protéines est de 0,1 mg/ml, et l'activité spécifique est de 1,3 x 107 unités d'interféron par milligramme de protéines.

Le chromatogramme de l'opération de purification est représenté surlafig. 1.

On fait passer 10 ml de la préparation à purifier sur une colonne de 0,9 cm de diamètre, contenant 2 ml de gel de poly-U/Sepha-rose 4 B (produit obtenu commercialement chez Pharmacia,

Uppsala, Suède).

Pendant la phase de sorption ainsi que durant les phases subséquentes de lavage et de désorption, on recueille des fractions d'un volume de 2 ml.

Après pénétration de la préparation d'interféron dans le gel (fractions 1 à 4 du chromatogramme), on effectue un lavage de la colonne avec 6 ml de tampon tris-HCl lOmM, pH 7,5, pour s'assurer de l'élimination des substances contaminantes non adsorbées (fractions 5 à 7).

Pour récupérer l'interféron, on procède à la phase de désorption en faisant passer au travers de la colonne 10 ml de tris-HCl lOmM, pH 7,5, additionné de 1M de NaCl (fractions 8 à 13 sur le chromatogramme de la fig. 1).

On mesure le titre en interféron dans chaque fraction recueillie pendant les phases de sorption, lavage et désorption. On constate alors que l'interféron contenu dans la préparation brute de départ est récupéré en totalité et est recueilli quasi totalement dans 2 tubes, à savoir les tubes Nos 8 et 9 (soit 4 ml), pendant la phase de désorption.

Le titre en interféron (UIF/ml) dans ces tubes est respectivement de

2,5 x 10e (tube 8), et 5 x 10® (tube 9)

La récupération de l'interféron est donc totale.

La teneur en protéines dans le tube N° 9 est inférieure à 2,5 (ig/ml; l'activité spécifique se situe donc au-dessus de 2 x 109, ce qui correspond à une purification supérieure à 150 fois.

Exemple 3:

Purification d'une préparation d'interféron humain par Chromatographie d'affinité sur une colonne selon l'exemple 1 de poly-I/Sepharose.

La préparation brute d'interféron est un surnageant d'une culture de fibroblastes humains induits à produire de l'interféron par le poly-I/poly-C.

Le titre en interféron est de 4096 UI d'interféron par millilitre et

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

633716

8

la teneur en protéines de 660 (ig/ml, ce qui donne une activité spécifique de 6,2 x IO3 UI par milligramme de protéines.

On fait passer, à raison de 1 ml/min, 5 ml (20 480 UI) de la préparation, non dialysée au préalable, à travers une colonne de

0.9 cm de diamètre renfermant 2 ml de gel de Sepharose/poly-I selon l'exemple 1, cette colonne étant équilibrée avec du tampon tris-HCl lOmM, pH 7,5.

Dès que toute la préparation a pénétré dans le gel, on procède au lavage comme indiqué dans l'exemple 2.

On effectue ensuite la désorption de l'interféron en faisant passer au travers de la colonne, avec un débit d'environ 0,2 ml/min, 10 ml de tris-HCl lOmM de pH 7,5 enrichi de 1M de NaCl.

Au cours de ces différentes phases d'adsorption, rinçage, lavage et désorption, on recueille des fractions de 2 ml. En déterminant le titre en interféron dans ces différentes fractions, on constate qu'on recueille 1024 unités dans les 3 premiers tubes (fractions de 2 ml), soit au total 6144 unités, ce qui équivaut à 30% de l'interféron passé sur la colonne. Aucune activité interféron n'est décelable dans les tubes de lavage.

A la désorption, on constate que les produits à activité interféron sont principalement recueillis dans les fractions des tubes 10 et 11 (le tube 10 contenant une fraction de 1 ml seulement). Le titre en interféron dans ces tubes est respectivement de

2048 (tube 10), et 16 384 (tube 11),

ce qui correspond à un total de 18 432 UI d'interféron/ml.

Etant donné que la préparation brute qui a été purifiée sur la colonne renfermait au départ 20480 UI, on a donc récupéré 90% d'interféron.

Exemple 4:

Préparation d'une colonne d'affinité de Bleu Dextran Sepharose en vue de la purification d'interféron d'origine animale, d'une part, et d'interféron d'origine humaine, d'autre part, avec utilisation, comme agents de désorption, de polynucléotides.

1. Préparation du gel de Bleu Dextran Sepharose

Le procédé de fabrication de gels de Bleu Dextran Sepharose a été décrit par L.D. Ryan et C.S. Vestling («Arch. Biochem. Biophys.», 160,279-284,1974). Depuis cette publication, il n'est plus nécessaire de procéder à l'activation du Sepharose par le bromure de cyanogène selon Cuatrecasas (Cuatrecasas P., «J. Biol. Chem.», 3059-3065, 1970) puisqu'il existe des préparations commerciales lyophilisées prêtes à l'emploi de Sepharose déjà activé.

On utilise du Sepharose 4B activé au bromure de cyanogène et du Bleu Dextran 2000, tels que ceux commercialisés par Pharmacia (Uppsala, Suède).

a) Préparation du gel de Sepharose (CNBr Sepharose 4B)

Pour faire gonfler le gel et éliminer les agents bactéricides présents dans la préparation lyophilisée, on lave, sur un filtre en verre fritté avec une solution de HCl ImM, pendant V* h environ, la quantité désirée de CNBr-Sepharose, sachant que 1 g de produit sec donne environ 3,5 ml de gel. On utilise à cet effet 200 ml de HCl ImM/g de poids sec de CNBr-Sepharose. Le gel ainsi formé est aussitôt couplé au Bleu Dextran 2000.

b) Couplage du gel de Sepharose avec le Bleu Dextran 2000

On détermine la quantité de Bleu Dextran nécessaire au couplage, considérant que 1 g de poids sec de Sepharose est susceptible de fixer de 80 à 100 mg de Bleu Dextran.

On dissout cette quantité dans un tampon alcalin d'un pH de l'ordre de 8 à 10, en particulier un tampon carbonate 0,4M de pH 10 (20 mg de Bleu Dextran 2000 sont dissous aisément dans 1 ml de tampon carbonate).

On verse la solution de Bleu Dextran sur le gel de Sepharose rincé au préalable avec 3 ou 4 fois son volume de tampon carbonate 0,4M,

pH 10. Le mélange de gel et de Bleu Dextran est versé dans un flacon en verre foncé et est soumis à une légère agitation, par exemple avec une roue tournante, pendant environ 18 à 24 h, à une température de l'ordre de 4°C pour favoriser le couplage.

Après la phase de couplage, on rince le produit Bleu Dextran Sepharose obtenu, sur un filtre en verre fritté, avec un excès de tampon carbonate 0,4M, pH 10, afin d'éliminer le Bleu Dextran non fixé, jusqu'à ce que le tampon reste incolore (densité optique inférieure ou égale à 0,02).

Pour éliminer les sites actifs qui n'auraient pas été fixés au Bleu Dextran, le produit de couplage est mis ensuite en contact avec une solution d'alcanolamine, en particulier d'éthanolamine 1M à pH 8, pendant environ 2 h, à une température de +4°C. Pour cette opération, on transvase de préférence le produit de couplage du flacon dans un autre récipient.

Pour rendre le gel résistant aux variations de pH, de molarité ou autres, on le soumet ensuite à trois cycles de rinçages alternés avec une solution acide constituée par un tampon acétate 0,1 M de pH 4,0 additionné de NaCl 1M, et une solution aslcaline constituée par un tampon borate 0,1 M de pH 8,5 additionné de NaCl 1M.

Après ces cycles de rinçages, le gel est équilibré avec un tampon tris-HCl lOmM, pH 7,5, additionné d'un agent bactéricide et antiseptique, en particulier par de l'azide de soude à 0,02%.

2. Préparation de la colonne de Chromatographie d'affinité

On verse le Bleu Dextran Sepharose dans une colonne de Chromatographie de dimensions appropriées (on estime que 1 ml de gel est capable de fixer environ 8 millions d'unités internationales d'interféron).

Avant la toute première utilisation de la colonne, on rince avec 20 fois le volume mort du tampon tris-HCl lOmM, pH 7,5, additionné de 0,02% d'azide de soude.

Pour éliminer les molécules de Bleu Dextran qui auraient tendance à se détacher, on fait passer le tampon d'élution, constitué par du tris-HCl lOmM, pH 7,5, additionné de NaCl 1M, jusqu'à ce que la densité optique à 254 nm reste à 0. (Dans le cas de colonnes de grandes dimensions, il est recommandé de procéder à plusieurs cycles de rinçages successifs avec du tampon tris avec et sans NaCl pour renforcer l'adaptation des colonnes aux variations de pH, de molarité, ou autres.)

Une colonne de Bleu Dextran Sepharose peut être utilisée pendant plusieurs mois et pour de nombreux cycles de purification d'interféron, à condition de ne pas être contaminée par des bactéries. Il convient donc de la garder sous azide de soude et au froid, à environ +4°C en dehors des périodes d'utilisation.

Mais, étant donné que l'azide de soude est toxique pour les cellules, il faut faire passer, avant de procéder à la fixation de l'interféron, au moins trois volumes morts de tampon tris-HCl sans azide pour éliminer toute trace d'antiseptique.

Exemple 5:

Purification d'une préparation d'interféron de souris, d'une part, et d'une préparation d'interféron humain, d'autre part, par Chromatographie sur une colonne de Bleu Dextran Sepharose selon l'exemple 4, à l'aide de polynucléotides comme agents de désorption.

a) Les préparations d'interféron

En ce qui concerne la préparation d'interféron de souris, elle consiste en un surnageant de culture tissulaire (cellules C 243) induites à produire de l'interféron par le virus de la maladie de Newcastle. Après inactivation du virus à pH 2, le surnageant est dialysé contre du tris-HCl lOmM, pH 7,5, pendant environ 24 h à une température d'environ 4°C.

Le titre en interféron, la teneur en protéines de la préparation et l'activité spécifique correspondent à ceux de la préparation utilisée dans l'exemple 2.

Pour ce qui est de la préparation d'interféron humain à purifier, elle est constituée par un surnageant d'une culture de fibroblastes

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

9

633 716

telle que celle de l'exemple 3. Cette préparation est utilisée telle quelle sans dialyse préalable.

b) Phase d'adsorption

On fait passer de 3 à 8 ml de la préparation d'interféron de souris évoquée plus haut (soit 3,8 x 10® à 1 x 107 UI d'interféron) sur une colonne de Bleu Dextran Sepharose de 1,5 à 4 ml selon l'expérience, à raison de 0,5 ml/min. Dans le cas de la purification d'interféron humain, on dépose sur la colonne 7 ml de la préparation décrite ci-dessus titrant 2560 unités interféron par millilitre, ce qui correspond au total à 17 920 unités interféron.

Cette phase d'adsorption est conduite comme décrit dans les exemples 2 et 3.

c) Phase de désorption

Après pénétration des préparations et rinçage de la colonne, selon les exemples 2 et 3, on procède à la désorption de l'interféron à l'aide de polynucléotides en opérant comme suit:

On fait passer au travers de la colonne, à raison de 0,5 ml/min, un éluant comprenant 0,1 g de polynucléotides par millilitre d'un tampon tris-HCl lOmM de pH 7,5. Le volume total d'éluant utilisé correspond à deux volumes de gel (on a également utilisé, dans le cas du poly-U, une quantité correspondant à 4 volumes de gel). Comme polynucléotides, on utilise des polyribonucléotides de synthèse, à savoir du poly-G, du poly-I et du poly-U tels que ceux commercialisés par les laboratoires Choay.

On met en œuvre également des polynucléotides d'origine naturelle tels que les ARN-t (fraction totale) de levure de bière, ceux d'Escherichia coli et ceux de cellules de type C 243 de souris. Ces produits sont commercialisés sous leur dénomination chimique, l'acide polynosinique étant commercialisé par exemple sous la dénomination poly-I.

Après la phase de désorption décrite ci-dessus, on procède à un deuxième lavage, et on élue le reste des produits à activité interféron encore fixés sur la colonne au moyen de NaCl 1M dans le tampon tris lOmM, pH 7,5.

On recueille des fractions correspondant chacune au tiers du volume total de la colonne de Bleu Dextran Sepharose (BDS). Dans le tableau donné ci-après, on rapporte les pourcentages d'interféron recueilli avec deux volumes totaux d'éluant selon le polynucléotide utilisé. (Les valeurs ont été corrigées de manière que le pourcentage d'interféron désorbé par les polynucléotides et le pourcentage d'interféron désorbé ensuite par le tampon hypermolaire soient égaux à 100.)

Pourcentage de désorption obtenu selon le type de polynucléotides utilisé

Pourcentage

Type de polynucléotide d'interféron désorbé

de la colonne de BDS

I. Interféron de souris

poly-G

17

poly-I

86

poly-U

43 (si on poursuit l'élution,

on obtient 73%)

ARN-t (fraction totale

extraite de la levure

de bière)

90

ARN-t (fraction totale

extraite d'£. coli)

23

ARN-t (fraction totale

extraite de cellules C 243)

30

II. Interféron humain

poly-I

94

Dans une autre série d'expériences, on étudie le degré de purification obtenu en effectuant la désorption par des polynucléotides d'interféron fixé sur une colonne de Bleu Dextran Sepharose.

Les résultats obtenus avec des préparations d'interféron de souris et d'interféron humain sont respectivement rapportés dans les exemples 6 et 7.

Exemple 6:

On utilise une préparation d'interféron de souris (cellules C 243) induites à produire de l'interféron par le virus de la maladie de Newcastle, telles que celles mises en œuvre dans l'exemple 2.

Le titre en interféron de la préparation brute est de 2,6 x 106 UI/ ml. Sa teneur en protéines est de 100 ng/ml et son activité spécifique de 2,6 x 107 unités d'interféron/mg de protéines.

On fait passer 130 ml d'une telle préparation (ce qui correspond donc au total à 3,3 x 108 unités d'interféron) sur une colonne de Bleu Dextran Sepharose selon l'exemple 4, ayant un volume total de 9 ml.

Les phases d'adsorption, rinçage, lavage sont réalisées comme décrit précédemment. La désorption est effectuée selon le procédé décrit dans l'exemple 5 en utilisant 18 ml d'une solution d'élution renfermant comme agent désorbant du poly-I à raison de 100 y/ml de tampon.

L'interféron est recueilli dans deux fractions a et b respectivement de 7 et 5 ml. Leur titre en interféron est de 4,1 x 107 et de 5,1 x 106.

Au total, on recueille 3,16 x 10s UI, ce qui correspond à un pourcentage de récupération de 96%.

Dans la fraction a, on observe la présence de 19 y de protéines, ce qui donne une activité spécifique de 2,1 x 109.

Le degré de purification est donc de 80 (activité spécifique du départ/activité spécifique finale: 2,1 x 109/2,6 x 107).

Exemple 7:

La préparation d'interféron humain à purifier est constituée par un surnageant d'une culture de fibroblastes humains induits par le poly-IC à produire de l'interféron.

Le titre de cette préparation est 2560 Ul/ml, sa teneur en protéines est de 410 ng/ml et l'activité spécifique de 6,2 x 103.

On fait passer 7 ml de cette préparation (ce qui correspond à 17 920 unités) sur une colonne de Bleu Dextran Sepharose de 5 ml.

Les phases d'adsorption, rinçage, lavage sont réalisées selon les modes opératoires décrits dans les exemples qui précèdent.

La désorption des produits à activité interféron est effectuée par 10 ml de poly-I en solution dans un tampon tris-HCl lOmM, pH 7,5. à raison de 100 (i/ml.

On recueille les produits à activité interféron dans 5 fractions de 2 ml. Le titre de chacune de ces fractions est rapporté ci-après.

Fraction

Titre

1

650

2

5120

3

1280 Ì

x 2 = au total 16 960 unités

4

1280 V

5

160 J

Le pourcentage de récupération est donc de:

17920

La fraction 2 renferme 10 Jig/ml de protéines. L'activité spécifique de cette fraction est de 5,1 x 105.

Le degré de purification est donc de:

82 fois (5,1 x 105/6,2x 103).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

633 716

10

Exemple 8:

Comme indiqué plus haut, les polynucléotides couplés aux produits à activité interféron leur confèrent une protection de grand intérêt vis-à-vis de la dénaturation thermique. Pour illustrer cet effet, on donne en annexe des courbes représentant, en fonction du temps d'incubation à 60° C des produits de couplage en question, le pourcentage d'activité de ces derniers.

Sur la fig. 2, on a indiqué les résultats obtenus des produits de couplage, d'une part, d'interféron de souris de cellules C 243 induites à produire de l'interféron par le virus de la maladie de Newcastle avec, d'autre part, du poly-U, du poly-I, du poly-C, du poly-I/ poly-C, du poly-A par rapport à des préparations d'interféron témoins ne renfermant pas de polynucléotides. La concentration en polynucléotides est de 10 ng/ml de préparation.

La fig. 3 représente les résultats obtenus, en opérant avec des produits de couplage de l'interféron avec les ARN-t (valine); ARN-t ftryptophone); ARN-t (fraction totale de levure de bière); ARN-t (tyrosine); ARN-t (fraction totale de germe de blé), et ARN-t (lysine).

Selon ces essais, l'activité antivirale des préparations d'interféron est mesurée par un dosage en micro test selon la méthode suivante: des dilutions appropriées des échantillons à mesurer sont effectuées dans des plaques commercialisées par Falcon pour les microdosages (microtiter plates - Falcon Plastic Company). A chaque godet de la plaque, on ajoute ensuite 100 |xl d'une suspension de cellules dérivées de la même espèce que l'interféron à doser, et on laisse incuber les plaques pendant 18 h à 37°C dans un incubateur à C02. Le virus révélateur est ensuite ajouté (dans les exemples cités, on a utilisé le virus de la stomatite vésiculaire à un titre de 100 unités infectieuses par godet).

Les plaques sont alors remises dans l'incubateur à C02 et, 24 h plus tard, on lit au microscope la destruction cellulaire causée par le virus.

Le titre d'interféron correspond à l'inverse de la dilution à laquelle 50% des cellules, au moins, sont protégées contre l'effet destructeur du virus. Ainsi, si à la dilution de 1/20000 on a 50% des cellules encore intactes, le titre est de 20000.

Les unités microtests du laboratoire ont été converties en unités de référence internationales (1 unité microtest/0,2 ml correspond à 10 unités internationales/ml).

Dans l'essai dont les résultats sont rapportés dans la fig. 2, la préparation brute d'interféron de souris a été dialysée dans du tris-

HCl lOmM, pH 7,5. On y a incorporé des polynucléotides à la concentration de 10 [ig/ml. Des aliquotes de 0,3 ml (soit 3,9 x 105 unités d'interféron et 3 |ig de polynucléotide) ont été incubés au bain-marie à 60° C. Aux temps indiqués dans la figure, on a prélevé des s échantillons de 20 jj.1. Ces derniers ont été dilués 100 fois dans du milieu de culture contenant 3% de sérum de veau et immédiatement refroidis dans un bain de glace. On a procédé aux titrages d'interféron à la fin de l'incubation.

Dans les essais dont les résultats sont rapportés dans la fig. 2, on io procède dans les mêmes conditions que celles indiquées ci-dessus pour l'étude de la dénaturation thermique en présence de polynucléotides mais, au lieu de ces derniers, on utilise des ARN-t.

L'examen de ces courbes montre que les produits à activité interféron couplés avec les polynucléotides conservent une activité 15 thérapeutique importante, même après plus de 30 min d'un traitement thermique à 60° C, alors que cette activité décroît rapidement chez les témoins; grâce à cet effet protecteur des polynucléotides vis-à-vis des produits à activité interféron, il est possible de conserver sans problèmes les préparations d'interféron et de les soumettre, lors de divers essais, à des variations de température sans qu'il en résulte de dénaturation de leurs propriétés.

Exemple 9:

Purification d'une préparation d'interféron de souris par Chromatographie sur une colonne de Bleu Dextran Sepharose à l'aide d'ARN-t comme agents de désorption.

La préparation d'interféron de souris à purifier est semblable à celle mise en œuvre dans l'exemple 5. En procédant comme décrit dans cet exemple 5, on dépose sur une colonne de Bleu Dextran Sepharose, après dialyse de la préparation, 1 x 107 unités d'interféron. On rince la colonne avec du tampon tris (4 volumes totaux), puis on effectue la désorption de l'interféron en déposant sur la colonne 3 à 4 ml d'ARN-t, à une concentration de 100 ng/ml, dans le susdit tampon tris-HCl lOmM.

On procède à une deuxième phase de rinçage avec le tampon en question puis, à l'aide d'un tampon tris-HCl lOmM, pH 7,5, additionné de NaCl 1M, on opère la désorption des produits à activité interféron restants.

Les pourcentages de désorption d'interféron de souris à l'aide de fractions totales d'ARN-t de levure de bière, d'E. coli, de cellules C 243 de souris et de foie de rat sont respectivement de 91,23, 54 et 10.

25

30

35

R

1 feuille dessin

Claims (23)

1. 633716

   2

   REVENDICATIONS

   1. Procédé pour séparer sélectivement, en éliminant les substances contaminantes, des produits à activité interféron de préparations les renfermant, caractérisé par le fait qu'on met en contact ces préparations avec une phase comprenant au moins un polynucléo-tide, jouant de manière spécifique le rôle de ligand vis-à-vis des produits à activité interféron.
2. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le dérivé de polynucléotide mis en œuvre est constitué par au moins un polyribonucléotide et/ou un polydésoxyribonucléotide de synthèse ou d'origine naturelle.
3. 3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait qu'on met en œuvre un polyribonucléotide comportant de 10 à 300 motifs nucléotides.
4. 4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que ledit polyribonucléotide est choisi dans le groupe comprenant l'acide polyribo-inosinique, l'acide polyriboadénosique, l'acide polyribo-uridylique et l'acide polyriboguanilique.
5. 5. Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que ledit polyribonucléotide est constitué par un acide ribonucléique de transfert.
6. 6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé par le fait qu'il s'agit de la fraction totale des acides ribonucléiques de transfert provenant de bactéries, de levures ou d'organes de mammifères.
7. 7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé par le fait que les susdits acides ribonucléiques de transfert proviennent de bactéries du genre Escherichia coli, de levures du genre de la levure de bière ou de cellules d'origine animale ou humaine, notamment des cellules mêmes qui ont produit l'interféron que l'on désire purifier.
8. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé par le fait qu'on met en contact une préparation à purifier de produits à activité interféron avec un adsorbant équilibré par un tampon dont la concentration en sels est isomolaire ou de préférence hypomolaire par rapport à celle du sang, ledit adsorbant comportant, d'une part, un support solide formant gel, dont la grosseur des mailles est telle qu'elle permet le passage de macromolécules et, d'autre part, un polynucléotide, fixé sur ledit support, jouant le rôle de ligand vis-à-vis des produits qu'on désire séparer de manière sélective, la quantité d'adsorbant mise en œuvre et la durée de contact entre le ligand et la préparation à purifier étant suffisantes pour permettre la fixation désirée des produits à activité interféron.
9. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé par le fait que, pour constituer le support solide de l'adsorbant formant gel, on s utilise un Polysaccharide tel que l'agarose ou un dérivé de celui-ci, notamment un agarose modifié dans lequel les chaînes Polysaccharides sont réticulées en un réseau tridimensionnel, par exemple un Polyacrylamide ou une résine acrylique.
10. 10. Procédé selon l'une des revendications 8 ou 9, caractérisé par io le fait que la concentration en sels du tampon utilisé pour équilibrer l'adsorbant est inférieure ou égale à 0,15 M.
11. 11. Procédé selon l'une des revendications 8 à 10, pour l'obtention de préparations purifiées possédant une activité interféron, caractérisé par une étape supplémentaire selon laquelle on réalise la

    15 désorption des produits à activité interféron fixés à l'aide d'un tampon dont la concentration en sels est hypermolaire par rapport à celle du sang.
12. 12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé par le fait que la concentration en sels du tampon d'élution est d'au moins 0,5 M.

    20 13. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé par le fait qu'on met en contact une préparation comprenant un complexe renfermant des produits à activité interféron fixés sur un premier ligand avec une phase comportant au moins un polynucléotide, capable d'entrer en compétition avec le premier ligand pour la 25 fixation des produits à activité interféron et de détacher ces derniers, les préparations et phases en question étant équilibrées à l'aide d'un tampon dont la concentration en sels est isomolaire ou hypomolaire par rapport à celle du sang, la quantité de polynucléotides dans la susdite phase et la durée de contact entre les polynucléotides et les 30 produits à activité interféron fixés sur le premier ligand étant suffisantes pour permettre la désorption des produits à activité interféron.
13. 14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé par le fait que la préparation comprenant des produits à activité interféron à mettre 35 en contact avec une phase comportant au moins un polynucléotide comporte un support solide formant gel, dont la grosseur des mailles est telle qu'elle permet le passage de macromolécules et, d'autre part, un composé fixé sur ledit support, jouant le rôle de ligand vis-à-vis des produits qu'on désire séparer de manière sélective et qui possède 40 la structure polycyclique du chromophore bleu de formule

    S020Na

    SOgONa dont la configuration permet de retenir l'interféron de manière sélective.
14. 15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé par le fait que le ligand couplé au support solide est constitué par le chromophore bleu ou le produit correspondant dans lequel le groupe — S020Na sous le radical phényle en extrémité de chaîne de la formule donnée dans la revendication 14 est remplacé par un atome d'hydrogène.
15. 16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé par le fait que ledit chromophore est lié à un Polysaccharide, qui possède un poids moléculaire de l'ordre de 2 000 000.
16. 17. Procédé selon la revendication 16, caractérisé par le fait que ledit chromophore lié au Polysaccharide est fixé sur un support

    65 constitué par de l'agarose.
17. 18. Procédé selon l'une des revendications 14 à 17, caractérisé par le fait que la concentration en sels du tampon utilisé pour équilibrer l'adsorbant est inférieure ou égale à 0,5 M.

    3

    633716
18. 19. Procédé selon l'une des revendications 14 à 18, caractérisé par le fait que la phase comportant au moins un polynucléotide comprend ces polynucléotides en solution dans un tampon dont la concentration en sels est hypomolaire par rapport à celle du sang.
19. 20. Procédé selon la revendication 19, caractérisé par le fait qu'on utilise les susdits polyribonucléotides en solution dans un tampon à raison de 10 à 100 ng/ml, de préférence de 30 à 50 ng/ml.
20. 21. Préprations purifiées à activité interféron obtenues par mise en œuvre du procédé selon la revendication 1.
21. 22. Préparations selon la revendication 21, obtenues par mise en œuvre du procédé selon l'une des revendications 2 à 12.
22. 23. Préparations selon la revendication 21, composées de produits à activité interféron fixés sur des nucléotides et obtenues par mise en œuvre du procédé selon l'une des revendications 13 à 20.
23. 24. Utilisation des préparations selon la revendication 21 en tant que principe actif de médicaments.