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PATENTANSPRÜCHE
1. Verfahren zur Gewinnung der Streptokokkenstoffwechselprodukte Streptolysin 0, Hyaluronatlyase, Streptokinase und Streptodornase, dadurch gekennzeichnet, dass man eine fermentierte Streptokokkenkultur auf pH 3,5 einstellt, dadurch die Streptokokken obtötet und an die abgetöteten Streptokokken die Stoffwechselprodukte bindet, danach mit 0,1 M Phosphatpuffer bei pH 8 eluiert und anschliessend mit (NH4)2SO4-Lösung fällt, erneut in 0,02 M Phosphatpuffer aufnimmt und einer Chromatographie an quervenetzter Diäthylaminoäthyl-agarose unterwirft, wobei man durch Gradientenelution mit einem linearen Gradienten bestehend aus etwa 0,02 M Phosphatpuffer und gleichen Volumenteilen desselben Puffers mit 0,4 M NaC1-Zusatz Streptolysin 0, Hyaluronatlyase,
Streptokinase und Streptodornase in für analytische Zwecke erforderlicher Reinheit gewinnt.
2. Verfahren zur Gewinnung des Streptokokkenstoffwechselproduktes Hyaluronatlyase, dadurch gekennzeichnet, dass man eine fermentierte Streptokokkenkultur auf pH 3,5 einstellt, dadurch die Streptokokken abtötet und an die abgetöteten Streptokokken die Stoffwechselprodukte bindet, danach mit 0,1 M Phosphatpuffer bei pH 8 eluiert und anschliessend mit dem etwa gleichen Volumen 0,1 M Phosphatpuffer verdünnt, hochdisperses Siliziumdioxid bei pH 6 bis 7 einrührt und aus der vom Adsorbat getrennten Lösung die Hyaluronatlyase mittels (NH4)2SO4 ausfällt, abzentrifugiert, gegen 0,02 M Phosphatpuffer dialysiert und durch Chromatographie an quervernetzter Diäthylaminoäthyl-agarose und Gradientenelution wie in Anspruch 1 in reiner Form gewinnt.
3. Verfahren zur Gewinnung der Streptokokkenstoffwechselprodukte Streptokinase und Streptodornase, dadurch gekennzeichnet, dass man eine fermentierte Streptokokkenkultur auf pH 3,5 einstellt, dadurch die Streptokokken abtötet und an die abgetöteten Streptokokken die Stoffwechselprodukte bindet, danach mit 0,1 M Phosphatpuffer bei pH 8 eluiert und anschliessend durch Fällung mit 10% NaCI, Ca-Phosphatfällung, fraktionierte (NH4)2SO4-Fällung, Chromatographie an quervernetzter Diäthylaminoäthyl-agarose und Gradientenelution wie in Anspruch 1 Streptokinase und Streptodornase gewinnt.
4. Verfahren zur Gewinnung der Streptokokkenstoff wechselprodukte Streptokinase und Streptodornase, dadurch gekennzeichnet, dass man eine fermentierte Streptokokkenkultur auf pH 3,5 einstellt, dadurch die Streptokokken abtötet und an die abgetöteten Streptokokken die Stoffwechselprodukte bindet, danach mit 0,1 M Phosphatpuffer bei pH 8 eluiert und anschliessend mit dem etwa gleichen Volumen 0,1 M Phosphatpuffer verdünnt, hochdisperses Siliziumdioxid bei pH 6 bis 7 einrührt, die Lösung vom Adsorbat trennt, die an dem hochdispersen Siliziumdioxid adsorbierten Stoffwechselprodukte mit Wasser bei einem pH-Wert von 9,5 bis 10,5 eluiert und durch Fällung mit 10% NaCI, Ca Phosphatfällung, fraktionierte (NH4)2SO4-Fällung,
Gelchromatographie an quervernetzter Diäthylaminoäthyl-agarose und Gradientenelution wie in Anspruch 1 reine Streptokinase und Streptodornase gewinnt.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass man die an dem hochdispersen Siliziumdioxid adsorbierten Stoffwechselprodukte mit Wasser bei einem pH Wert von 10,0 eluiert.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Streptokokkenstoffwechselprodukten mit grosser Reinheit.
Streptokokken sind grampositive kettenförmig wachsende Kugelbakterien, die physiologisch zu den Milchsäurebakterien zu rechnen sind. Sie bilden in flüssigen Nährboden gezüchtet eine Reihe interessanter extrazellulärer Stoffwechselprodukte. Die bekanntesten sind Streptolysin 0, Hyaluronatlyase, Desoxyribonuklease (Streptodornase) und Streptokinase. Je nach Art des eingesetzten Stammes, des Nährbodens und der Kulturbedingungen (pH-Wert, Temperatur, Glucosespiegel) werden unterschiedliche Mengen dieser Proteine gebildet. Für serologische Untersuchungen werden Streptolysin 0 (Antistreptolysinreaktion = ASR), Hyaluronatlyase (Antihyaluronidasereaktion) und Streptodornase (Antistreptodornasereaktion) zur Erkennung von Streptokokkenerkrankungen verwendet.
Für den klinischen Gebrauch haben sich Streptokinase und Streptodornase entweder für sich oder in Kombination miteinander eingeführt.
Die bisher bekannten Reinigungsvorschriften gelten meist nur für ein einzelnes Streptokokkenprotein. Man benötigt zur Isolierung aus dem Kulturfiltrat grössere Mengen an Zusatzstoffen zur Fällung wie beispielsweise Äthanol, Methanol oder Ammonsulfat. Auch die Einführung von Absorptionsmitteln wie Celite erfordert einen grösseren Aufwand, obwohl hierbei schon erhebliche Fortschritte erkennbar sind. Es wurde bereits vorgeschlagen, die Fällung der Streptokinase auf CM-Cellulose durchzuführen, womit schon ein neues Prinzip, des als Kristallisationszentrum fungierenden Ionenaustauschers zur Anwendung käme.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Gewinnung von Streptokokkenstoffwechselprodukten zu beschreiben, in dem Methoden zur gleichzeitigen Isolierung möglichst vieler Stoffwechselprodukte unter Bedingungen angegeben werden, die eine Infektion ausschliessen. Dabei soll die Reinigung in einfacher Weise möglich sein.
Es wurde nun überraschend gefunden, dass die abgetöteten Streptokokken selbst diese Rolle eines als Ionenaustauscher fungierenden Kristallisationszentrums übernehmen können. Wenn die gewachsene Streptokokkenkultur mit konzentrierter Salzsäure auf pH 3,5 gebracht und eine Stunde bei Raumtemperatur oder Fermentationstemperatur gerührt wird, werden alle Streptokokken abgetötet. Die an die toten Streptokokken adsorbierten Proteine (Streptolysin 0, Hyaluronidase, Streptolysin S und Streptokinase) werden zusammen mit den Kokken abzentrifugiert. Die einzelnen Produkte werden dann durch Elution mit 0,1 M Phosphatpuffer bei pH 8,0 wieder eluiert und von den toten Kokken separiert. Die Konzentrierung der Stoffwechselprodukte erfordert nach dieser Variante der Erfindung überraschenderweise keinerlei Hilfsstoffe, wenn man von der verwendeten Säure absieht.
Auf den biologischen Teil des Verfahrens, der nicht Gegenstand der Erfindung ist, soll hier nicht näher eingegangen werden. Zur Herstellung der Fermentationslösung, welche die o. g. Streptokokkenstoffwechselprodukte enthält, findet der Stamm Streptokokkus equisimilis Verwendung und gegebenenfalls das im DDR-Patent Nr. 111 096 veröffentlichte Verfahren.
Die aus den eluierten Streptokokken isolierten Stoffwechselprodukte können nun entweder simultan oder einzeln nach speziellen Verfahren gereinigt werden. Als letzter Reinigungsschritt wird immer die Chromatographie an einem neu entwickelten Ionenaustauscher durchgeführt, der aus quervernetzter Agarose besteht, an welche Diäthylamino äthylgruppen in bekannter Weise fixiert wurden. Mit diesem Ionenaustauscher, der autoklavierbar und auf der Säule regenerierbar ist, chromatographiert man immer in prinzipiell der gleichen Weise, indem ein linearer Gradient zwischen 0,02 M Phosphatpuffer (pH 8,0) und 0,02 M Phosphatpuffer mit 0,4 M NaCi (pH 7,6) Anwendung findet.
Hierbei werden die erwähnten Stoffwechselprodukte in der
Reihenfolge Streptolysin, Hyaluronatlyase, Streptokinase und Streptodornase getrennt.
Es wird als letzter Reinigungsschritt immer eine Ionenaustauschchromatographie über einem neuen Austauscher aus Agarose mit daran fixierten Diäthylaminoäthylgruppen durchgeführt. Dabei spielen sich folgende chemische Vorgänge ab:
1. Adsorption
Die Anionen der positiv geladenen Diäthylaminoäthylgruppen (Phosphationen) werden bei pH 8,0 (oberhalb des isoelektrischen Punktes) gegen negativ geladene Moleküle des Wirkstoffes ausgetauscht und an die Diäthylaminoäthylgruppen der Agarose gebunden.
2. Elution
Durch steigende Ionenkonzentration bei der Elution werden die Wirkstoffe stufenweise von den Diäthylaminogruppen durch Chlorid- und Phosphationen verdrängt.
Es erfolgt also intermediär eine salzartige oder Ionenbindung zwischen Wirkstoff und Ionenaustauscher, die bei der Elution wieder aufgelöst wird.
Der Ionenaustauscher wird regeneriert, indem die Säule (2,5 X 25 cm) mit 1 Liter 0,5 N NaOH, sterilem H2O und sterilem Phosphat-Puffer (0,02 M pH 8,0) gewaschen wird.
Auch der Zusatz von Chloroform (4 ml pro 1 Liter Puffer) hat sich als Konservierungsmittel gut bewährt.
Zusammenfassend ist das erfindungsgemässe Verfahren also dadurch gekennzeichnet, dass eine fermentierte Streptokokkenkultur auf pH 3,5 eingestellt und die Stoffwechselprodukte, insbesondere Streptolysin 0, Hyaluronatlyase, Streptokinase und Streptodornase, an die abgetöteten Streptokokken gebunden werden, wonach mit 0,1 M Phosphatpuffer bei pH 8 eluiert wird und anschliessend - mit (NH4)2SO4-Lösung gefällt, erneut in 0,02 M Phos phatpuffer aufgenommen und einer Chromatographie an quervernetzter DEAE-Agarose unterworfen wird, wobei man durch Gradientenelution Streptolysin 0, Hyaluronat lyase, Streptokinase und Streptodornase in für analyti sche Zwecke erforderlichen Reinheit gewinnt oder - mit dem etwa gleichen Volumen 0,1 M Phosphatpuffer verdünnt,
hochdisperses Siliziumdioxid bei pH 6 bis 7 einrührt und aus der vom Adsorbat getrennten Lösung die Hyaluronatlyase mittels (NH4)2SO4 ausfällt, abzentri fugiert, gegen 0,02 M Phosphatpuffer dialysiert und an quervernetzter DEAE Agarose in reiner Form gewinnt oder durch Fällung mit 10% NaCI, Ca-Phosphatfällung, frak tionierte (NH4)2SO4-Fällung und Chromatographie an quervernetzter DEAE Agarose reine Streptokinase und
Streptodornase gewinnt oder - die bei der Hyaluronatlyasegewinnung an dem hoch dispersen Siliziumdioxid adsorbierten Stoffwechselpro dukte wie Streptolysin 0, Streptokinase und Streptodor nase mit Wasser bei einem pH-Wert von 9,5 bis 10,5, vorzugsweise 10,0, eluiert und durch die genannten frak tionierten Fällungsschritte sowie Gelchromatographie an quervernetzter DEAE Agarose reine Streptokinase und
Streptodornase gewinnt.
Die Vorteile des Verfahrens bestehen darin, dass keine Zusatzstoffe zur Isolierung benötigt werden und die Streptokokken abgetötet sind, wodurch keine Infektionsgefahr besteht. Weiterhin lassen sich auf diese einfache Weise simultan alle wichtigen Stoffwechselprodukte isolieren und in gleicher Weise am gleichen speziellen Ionenaustauscher reinigen.
Das Verfahren soll an folgenden Ausführungsbeispielen näher erläutert werden:
Beispiel 1
5 Liter 30h Streptokokkenkultur (Streptokokken Gruppe C), die bei pH 7,2 und 28"C Titer von 128 HU/ml Streptolysin 0, 100 TE/ml Hyaluronatlyase (0,24 U/ml nach Definition von Gerlach und Köhler) und 4200 Christenseneinheiten/ml Streptokinase liefert, wird mit konzentrierter Salzsäure auf pH 3,5 gebracht und 1 h gerührt. Man zentrifugiert ab und verwirft den Überstand. Die abgetöteten Streptokokken werden mit zweimal 250 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 8,0) gewaschen. Hierbei werden praktisch alle Stoffwechselprodukte quantitativ eluiert. Die vereinigten Eluate werden klar zentrifugiert und mit 60 g Ammonsulfat pro 100 ml Lösung gefällt. Man löst den Niederschlag in 50 ml 0,02 M Phosphatpuffer (pH 8,0) und dialysiert gegen den gleichen Puffer sulfatfrei.
Diese Lösung trägt man nun auf eine 2,5 X 25 cm Säule von quervernetzter Agarose auf, an welche Diäthylaminoäthylgruppen gebunden sind. Diese sogenannte DEAE-Agarose-Q wird vorher durch Waschen in der Säule mit 1 Liter 0,5 N NaOH, H2O und durch Äquilibrieren mit 0,02 M Phosphatpuffer vom pH 8,0 vorbereitet. Eluiert wird mit einem linearen Gradienten, der aus 1 Liter 0,02 M Phosphatpuffer (pH 8,0) und 1 Liter 0,02 M Phosphatpuffer mit 0,4 M NaC1-Zusatz (pH 7,6) besteht. Man eluiert dann bei etwa 0,01 M NaCI das Streptolysin, bei 0,05 M NaCI die Hyaluronatlyase, bei 0,10 M NaCI die Streptokinase und bei 0,2 M NaCI die Streptodornase. Die aktiven Fraktionen können vereinigt werden und sind für Testzwecke ausreichend sauber. Alle Arbeiten werden bei Raumtemperatur, die Chromatographie bei 4"C ausgeführt.
Beispiel 2
In gleicher Weise wie bei Beispiel 1 werden 5 Liter Streptokokkenkultur aufgearbeitet. Nach Elution der Streptokokkenstoffwechselprodukte aus den abgetöteten Kokken erhält man 500 ml Lösung in 0,1 M Phosphatpuffer. Diese Lösung wird mit etwa dem gleichen Volumen 0,1 M Phosphatpuffer verdünnt und bei einem pH-Wert von 6-7 mit 15 g hochdispersem Siliziumdioxid 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Streptolysin 0, Streptodornase und Streptokinase werden adsorbiert, während die Hyaluronatlyase in Lösung bleibt. Diese kann nach Fällung mit 300 g Ammoniumsulfat wie folgt weiter gereinigt werden. Man lässt über Nacht stehen und zentrifugiert ab. Es wird in 10 ml Wasser gelöst und klarzentrifugiert. Daraufhin dialysiert man gegen 0,02 M Phosphatpuffer und trägt dann wie bei Beispiel 1 auf eine 2,5 X 25 cm DEAE-Agarose-Q-Säule auf und chromatographiert in gleicher Weise.
Die an dem Siliziumdioxid gebundenen Komponenten wie Streptolysin, Streptodornase oder Streptokinase lassen sich mit Wasser, dessen pH-Wert auf 9,5 bis 10,5 eingestellt wurde, vorzugsweise 10,0, durch 20minütiges Rühren wieder isolieren. Sie können nach Beispiel 3 weitergereinigt werden.
Beispiel 3
Man geht auch hier vom Rohkonzentrat aus, das nach Beispiel 1 aus 5 Liter Streptokokkenkultur durch Elution der abgetöteten Kokken mit zweimal 250 ml 0,1 M Phosphatpuffer (pH 8,0) gewonnen wurde. 450 ml der klarzentrifugierten Lösung bringt man auf pH 3,5 und fällt durch Zugabe von 10% v/w NaCI (45 g NaCI). Nach 30 Minuten wird abzentrifugiert und in 100 ml Wasser unter Zugabe 1 N NaOH (tropfenweise) gelöst. Der unlösliche Rest wird verworfen. Zu dieser Lösung setzt man nun 10 ml 0,5 M Lösung von Na2HPO4 und bringt den pH-Wert auf 6,9. Unter Rühren und Konstanthaltung des pH-Wertes durch Zusatz von 1 N NaOH fällt man durch tropfenweisen Zusatz 1 M CaCl2-Lösung (5,0 ml). Es wird 15 Minuten gerührt und nach weiteren 45 Minuten abzentrifugiert.
Der Calciumphosphatniederschlag wird mit 50 ml 0,02 M Phosphatpuffer (pH 8,0) gewaschen. Aus diesem Niederschlag ist die Rückgewinnung des gebundenen Streptolysins nach E. J.
Pentz und G. Shigemura [J. Bacteriol. 69, 210 (1955)] möglich. 140 ml vereinigte Lösung werden nun unter Rühren mit 38 ml gesättigter Ammonsulfatlösung auf 21,3% Ammonsulfatsättigung gebracht. Nach 15 Minuten Rührung lässt man 45 Minuten absitzen und zentrifugiert dann ab.
Der Niederschlag wird mit 22%iger gesättigter Ammonsulfatlösung (50 ml) gewaschen und verworfen. Das Zentrifugat und Waschwasser werden vereinigt, man erhält 175 ml.
Aus dieser Lösung lässt sich die Streptokinase durch Fällung bei pH 7,0 und 45% Ammonsulfat vom grössten Teil der Streptodornase trennen. Hierzu kontrolliert man den pH Wert und fügt weitere 77 ml gesättigte Ammonsulfatlösung zu. Nach 15 Minuten Rührung und 45 Minuten absitzen wird abzentrifugiert. Der Niederschlag wird einmal mit 50 ml 505wo gesättigter Ammonsulfatlösung gewaschen und dann in 20 ml Wasser gelöst. Diese Lösung dialysiert man gegen 0,02 M Phosphatpuffer vom pH-Wert 8,0 und trägt auf die in gleicher Weise präparierte Säule wie bei Beispiel 1 auf. Auch die Elution erfolgt in derselben Art. Man erhält etwa 50% der Ausgangsmenge an Streptokinase.
Aus dem Überstand der Streptokinasefällung, welche 60% der Streptodornase enthält, lässt sich diese leicht gewinnen, indem man sie durch Zusatz von 20 g festem Ammonsulfat pro 100 ml Lösung ausfällt (pro 235 ml 47 g).
Nach 30 Minuten Rührung und 60 Minuten Absitzen wird zentrifugiert.
Die Streptodornase wird in 0,02 M Phosphatpuffer (20 ml) gelöst, gegen den gleichen Puffer dialysiert und auf die DEAE-Agarose-Säule gebracht. Man eluiert hier ebenfalls mit einem linearen Gradienten zwischen 0,02 M Phosphat (pH 8,0) und 0,02 M Phosphat + 0,4 M NaCI (pH 7,6). Unter Verwendung eines C-Streptokokkenstammes erhält man hier drei aktive Gipfel, die bei Kochsalzkonzentration von etwa 0,02 M, 0,05 M und 0,2 M eluiert werden. Der letzte Gipfel enthält praktisch 90% aller Streptodornaseaktivität und wird allein isoliert, während die anderen Isoenzyme verworfen werden. Die Ausbeute beträgt 20%.
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PATENT CLAIMS
1. A process for obtaining the streptococcal metabolites streptolysin 0, hyaluronate lyase, streptokinase and streptodornase, characterized in that a fermented streptococcal culture is adjusted to pH 3.5, thereby killing the streptococci and binding the metabolites to the killed streptococci, then with 0.1 M. Phosphate buffer eluted at pH 8 and then precipitated with (NH4) 2SO4 solution, taken up again in 0.02 M phosphate buffer and subjected to chromatography on cross-linked diethylaminoethyl agarose, with gradient elution using a linear gradient consisting of approximately 0.02 M phosphate buffer and equal parts by volume of the same buffer with 0.4 M NaC1 addition streptolysin 0, hyaluronate lyase,
Streptokinase and Streptodornase in purity required for analytical purposes wins.
2. Process for obtaining the streptococcal metabolite hyaluronate lyase, characterized in that a fermented streptococcal culture is adjusted to pH 3.5, thereby killing the streptococci and binding the metabolites to the killed streptococci, then eluting with 0.1 M phosphate buffer at pH 8 and then diluted with approximately the same volume of 0.1 M phosphate buffer, stirred in highly disperse silicon dioxide at pH 6 to 7 and the hyaluronate lyase precipitated from the solution separated from the adsorbate using (NH4) 2SO4, centrifuged off, dialyzed against 0.02 M phosphate buffer and chromatographed on cross-linked Diethylaminoethyl-agarose and gradient elution as in claim 1 wins in pure form.
3. A process for obtaining the streptococcal metabolites streptokinase and streptodornase, characterized in that a fermented streptococcal culture is adjusted to pH 3.5, thereby killing the streptococci and binding the metabolites to the killed streptococci, then eluting with 0.1 M phosphate buffer at pH 8 and then by precipitation with 10% NaCl, calcium phosphate precipitation, fractionated (NH4) 2SO4 precipitation, chromatography on cross-linked diethylaminoethyl agarose and gradient elution as in claim 1, streptokinase and streptodornase.
4. A process for obtaining the streptococcal metabolites streptokinase and streptodornase, characterized in that a fermented streptococcal culture is adjusted to pH 3.5, thereby killing the streptococci and binding the metabolites to the killed streptococci, then with 0.1 M phosphate buffer at pH 8 eluted and then diluted with approximately the same volume of 0.1 M phosphate buffer, stirred in highly disperse silicon dioxide at pH 6 to 7, separated the solution from the adsorbate, and the metabolic products adsorbed on the highly dispersed silicon dioxide with water at a pH of 9.5 to 10 , 5 eluted and by precipitation with 10% NaCl, Ca phosphate precipitation, fractionated (NH4) 2SO4 precipitation,
Gel chromatography on cross-linked diethylaminoethyl-agarose and gradient elution as in claim 1 pure streptokinase and streptodornase wins.
5. The method according to claim 4, characterized in that the metabolic products adsorbed on the highly disperse silicon dioxide are eluted with water at a pH of 10.0.
The invention relates to a method for obtaining streptococcal metabolites with high purity.
Streptococci are gram-positive, ball-like globular bacteria that are physiologically classified as lactic acid bacteria. They form a series of interesting extracellular metabolites grown in liquid culture media. The best known are streptolysin 0, hyaluronate lyase, deoxyribonuclease (streptodornase) and streptokinase. Depending on the type of strain used, the nutrient medium and the culture conditions (pH value, temperature, glucose level), different amounts of these proteins are formed. Streptolysin 0 (antistreptolysin reaction = ASR), hyaluronate lyase (antihyaluronidase reaction) and streptodornase (antistreptodornase reaction) are used for the detection of streptococcal diseases for serological tests.
For clinical use, streptokinase and streptodornase have been introduced either alone or in combination with one another.
The previously known cleaning instructions mostly only apply to a single streptococcal protein. Larger amounts of additives for precipitation, such as, for example, ethanol, methanol or ammonium sulfate, are required for isolation from the culture filtrate. The introduction of absorbents such as Celite also requires more effort, although considerable progress can already be seen here. It has already been proposed to carry out the precipitation of the streptokinase on CM cellulose, which means that a new principle of the ion exchanger functioning as the crystallization center would be used.
The invention is based on the object of describing a process for the production of streptococcal metabolic products in which methods for the simultaneous isolation of as many metabolic products as possible are specified under conditions which rule out infection. The cleaning should be possible in a simple manner.
It has now surprisingly been found that the killed streptococci themselves can take on this role of a crystallization center which acts as an ion exchanger. When the grown streptococcal culture is brought to pH 3.5 with concentrated hydrochloric acid and stirred for one hour at room temperature or fermentation temperature, all streptococci are killed. The proteins adsorbed on the dead streptococci (streptolysin 0, hyaluronidase, streptolysin S and streptokinase) are centrifuged off together with the cocci. The individual products are then eluted again by elution with 0.1 M phosphate buffer at pH 8.0 and separated from the dead cocci. According to this variant of the invention, the concentration of the metabolic products surprisingly does not require any auxiliary substances, apart from the acid used.
The biological part of the method, which is not the subject of the invention, will not be discussed in more detail here. For the preparation of the fermentation solution, which the above-mentioned. Contains streptococcal metabolism products, the strain Streptococcus equisimilis is used and, if appropriate, the process published in GDR Patent No. 111,096.
The metabolites isolated from the eluted streptococci can now be purified either simultaneously or individually using special processes. As the last purification step, the chromatography is always carried out on a newly developed ion exchanger which consists of cross-linked agarose, to which diethylamino ethyl groups have been fixed in a known manner. With this ion exchanger, which is autoclavable and regenerable on the column, one always chromatographs in basically the same way, using a linear gradient between 0.02 M phosphate buffer (pH 8.0) and 0.02 M phosphate buffer with 0.4 M NaCi (pH 7.6) is used.
Here, the metabolic products mentioned in the
Order of streptolysin, hyaluronate lyase, streptokinase and streptodornase separately.
As the last purification step, ion exchange chromatography is always carried out over a new agarose exchanger with diethylaminoethyl groups attached to it. The following chemical processes take place:
1. Adsorption
The anions of the positively charged diethylaminoethyl groups (phosphate ions) are exchanged at pH 8.0 (above the isoelectric point) for negatively charged molecules of the active ingredient and bound to the diethylaminoethyl groups of the agarose.
2. Elution
As the ion concentration increases during elution, the active ingredients are gradually displaced from the diethylamino groups by chloride and phosphate ions.
So there is an intermediate salt-like or ionic bond between the active ingredient and the ion exchanger, which is dissolved again during the elution.
The ion exchanger is regenerated by washing the column (2.5 × 25 cm) with 1 liter of 0.5 N NaOH, sterile H2O and sterile phosphate buffer (0.02 M pH 8.0).
The addition of chloroform (4 ml per 1 liter of buffer) has also proven to be a good preservative.
In summary, the method according to the invention is thus characterized in that a fermented streptococcal culture is adjusted to pH 3.5 and the metabolic products, in particular streptolysin 0, hyaluronate lyase, streptokinase and streptodornase, are bound to the killed streptococci, after which 0.1 M phosphate buffer at pH 8 is eluted and then precipitated with (NH4) 2SO4 solution, again taken up in 0.02 M phosphate buffer and subjected to chromatography on cross-linked DEAE agarose, with streptolysin 0, hyaluronate lyase, streptokinase and streptodornase in for analyti by gradient elution required purity or - diluted with approximately the same volume of 0.1 M phosphate buffer,
highly disperse silicon dioxide is stirred in at pH 6 to 7 and the hyaluronate lyase precipitates from the solution separated from the adsorbate using (NH4) 2SO4, centrifuged, dialyzed against 0.02 M phosphate buffer and obtained in pure form on cross-linked DEAE agarose or by precipitation with 10% NaCI , Ca phosphate precipitation, fractionated (NH4) 2SO4 precipitation and chromatography on cross-linked DEAE agarose pure streptokinase and
Streptodornase wins or - the metabolic products such as streptolysin 0, streptokinase and streptodorase, which are adsorbed on the highly disperse silicon dioxide during the extraction of hyaluronate lyase, are eluted with water at a pH of 9.5 to 10.5, preferably 10.0, and by the named fractionated precipitation steps and gel chromatography on cross-linked DEAE agarose pure streptokinase and
Streptodorn nose wins.
The advantages of the method are that no additives are required for isolation and the streptococci are killed, which means that there is no risk of infection. Furthermore, all important metabolic products can be isolated simultaneously in this simple manner and cleaned in the same way on the same special ion exchanger.
The method will be explained in more detail using the following exemplary embodiments:
example 1
5 liters of 30 h streptococcal culture (streptococcal group C), the pH 7.2 and 28 "C titers of 128 HU / ml streptolysin 0, 100 TE / ml hyaluronate lyase (0.24 U / ml as defined by Gerlach and Köhler) and 4200 Christensen units / ml streptokinase, is brought to pH 3.5 with concentrated hydrochloric acid and stirred for 1 hour, centrifuged off and the supernatant discarded, and the killed streptococci are washed with twice 250 ml of 0.1 M phosphate buffer (pH 8.0). Practically all metabolic products are eluted quantitatively. The combined eluates are centrifuged clearly and precipitated with 60 g ammonium sulfate per 100 ml solution. The precipitate is dissolved in 50 ml 0.02 M phosphate buffer (pH 8.0) and dialyzed against the same buffer free of sulfate .
This solution is now applied to a 2.5 X 25 cm column of cross-linked agarose to which diethylaminoethyl groups are bound. This so-called DEAE-Agarose-Q is prepared beforehand by washing in the column with 1 liter of 0.5 N NaOH, H2O and by equilibration with 0.02 M phosphate buffer of pH 8.0. Elution is carried out using a linear gradient consisting of 1 liter of 0.02 M phosphate buffer (pH 8.0) and 1 liter of 0.02 M phosphate buffer with 0.4 M NaCl addition (pH 7.6). The streptolysin is then eluted at about 0.01 M NaCI, the hyaluronate lyase at 0.05 M NaCI, the streptokinase at 0.10 M NaCI and the streptodornase at 0.2 M NaCI. The active fractions can be pooled and are sufficiently clean for test purposes. All work is carried out at room temperature, the chromatography at 4 "C.
Example 2
5 liters of streptococcal culture are worked up in the same way as in Example 1. After elution of the streptococcal metabolites from the killed cocci, 500 ml of solution in 0.1 M phosphate buffer are obtained. This solution is diluted with approximately the same volume of 0.1 M phosphate buffer and stirred at pH 6-7 with 15 g of highly disperse silicon dioxide for 2 hours at room temperature. Streptolysin 0, streptodornase and streptokinase are adsorbed while the hyaluronate lyase remains in solution. After precipitation with 300 g ammonium sulfate, this can be further cleaned as follows. The mixture is left to stand overnight and centrifuged off. It is dissolved in 10 ml of water and centrifuged clearly. The mixture is then dialyzed against 0.02 M phosphate buffer and then applied to a 2.5 × 25 cm DEAE agarose Q column as in Example 1 and chromatographed in the same way.
The components bound to the silicon dioxide, such as streptolysin, streptodornase or streptokinase, can be isolated again with water, the pH of which has been adjusted to 9.5 to 10.5, preferably 10.0, by stirring for 20 minutes. They can be further cleaned according to example 3.
Example 3
The raw concentrate is also used here, which was obtained according to Example 1 from 5 liters of streptococcal culture by eluting the killed cocci with twice 250 ml of 0.1 M phosphate buffer (pH 8.0). 450 ml of the clear-centrifuged solution are brought to pH 3.5 and precipitated by adding 10% v / w NaCl (45 g NaCl). After 30 minutes, the mixture is centrifuged off and dissolved in 100 ml of water with the addition of 1 N NaOH (dropwise). The insoluble rest is discarded. 10 ml of 0.5 M solution of Na2HPO4 are then added to this solution and the pH is brought to 6.9. While stirring and keeping the pH constant by adding 1N NaOH, 1M CaCl2 solution (5.0 ml) is added by dropwise addition. The mixture is stirred for 15 minutes and centrifuged after a further 45 minutes.
The calcium phosphate precipitate is washed with 50 ml of 0.02 M phosphate buffer (pH 8.0). The recovery of the bound streptolysin according to E.J.
Pentz and G. Shigemura [J. Bacteriol. 69, 210 (1955)] possible. 140 ml of combined solution are now brought to 21.3% ammonium sulfate saturation with stirring with 38 ml of saturated ammonium sulfate solution. After stirring for 15 minutes, let sit for 45 minutes and then centrifuge.
The precipitate is washed with 22% saturated ammonium sulfate solution (50 ml) and discarded. The centrifugate and wash water are combined to give 175 ml.
The streptokinase can be separated from this solution from most of the streptodornase by precipitation at pH 7.0 and 45% ammonium sulfate. To do this, check the pH and add another 77 ml of saturated ammonium sulfate solution. After stirring for 15 minutes and sitting for 45 minutes, the mixture is centrifuged off. The precipitate is washed once with 50 ml of 505 wo saturated ammonium sulfate solution and then dissolved in 20 ml of water. This solution is dialyzed against 0.02 M phosphate buffer with a pH of 8.0 and applied to the column prepared in the same way as in Example 1. Elution is also carried out in the same way. About 50% of the starting amount of streptokinase is obtained.
This can easily be obtained from the supernatant of the streptokinase precipitation, which contains 60% of the streptodornase, by precipitating it by adding 20 g of solid ammonium sulfate per 100 ml of solution (per 235 ml of 47 g).
After stirring for 30 minutes and sitting for 60 minutes, the mixture is centrifuged.
The streptodornase is dissolved in 0.02 M phosphate buffer (20 ml), dialyzed against the same buffer and transferred to the DEAE agarose column. One also elutes here with a linear gradient between 0.02 M phosphate (pH 8.0) and 0.02 M phosphate + 0.4 M NaCl (pH 7.6). Using a C-streptococcal strain, three active peaks are obtained, which are eluted at a salt concentration of approximately 0.02 M, 0.05 M and 0.2 M. The last peak contains virtually 90% of all streptodornase activity and is isolated on its own while the other isoenzymes are discarded. The yield is 20%.