CH622826A5

CH622826A5 -

Info

Publication number: CH622826A5
Application number: CH94978A
Authority: CH
Inventors: Alan Clarkson Curtiss; Charles Blake Bidwell; Bruce Henry Sielaff; Julius Praglin; James Edward Mckie; David Kenneth Longhenry
Original assignee: Pfizer
Priority date: 1977-01-28
Filing date: 1978-01-27
Publication date: 1981-04-30
Also published as: CA1093947A; NL7800994A; DK40278A; FR2378858A1; US4288543A; FI780276A; IL53898A0; IT1092026B; DE2803044A1; FI63063B; AU3280678A; LU78947A1; FI63063C; IT7819747A0; YU11378A; IL53898A; FR2378858B1; BR7800530A; IE46316B1; DE2803044B2

Description

L'invention a pour objet un procédé pour l'identification d'une souche de micro-organisme dans un échantillon liquide, caractérisé en ce qu'on divise l'échantillon en sous-échantillons,

on inocule tous les sous-échantillons simultanément avec un agent inhibiteur de croissance qui est différent pour chacun des sous-échantillons et dont la réaction avec le micro-organisme du sous-échantillon fournit des particularités permettant l'identification de la souche, on incube les sous-échantillons pour développer des différences de croissance significatives dans chacun des sous-échantillons, on détermine par lecture photométrique la croissance du micro-organisme dans chacun des sous-échantillons, ces lectures étant éffectuées dans une période si courte que la différence de croissance dans les sous-échantillons par rapport à cette période soit pratiquement nulle, et l'on compare les lectures de croissance avec un ensemble de données d'identification de micro-organismes par rapport aux agents inhibiteurs utilisés, identifiant ainsi la souche de micro-organisme contenue dans l'échantillon.

Le concept de l'utilisation de schémas d'inhibition de croissance ou de susceptibilité antibactérienne pour l'identification de bactéries n'est pas entièrement nouveau. En 1971, Gilardi (G.L. Gilardi, 1971, «Appi. Microbiol. » 22:821-823) a découvert que des profils de susceptibilité pouvaient être utilisés pour faciliter l'identification de bactéries gram-négatives ne fermentant pas le lactose. Il a utilisé une information de sensibilité, vis-à-vis de seize antibiotiques, obtenue par la méthode de diffusion sur gélose, avec utilisation de disques. Sutter et Finegold (V.L. Sutter et S.M. Finegold, 1971, «Appi. Microbiol.» 21:13-20) ont utilisé des profils de susceptibilité pour ranger des bacilles gram-négatifs anaérobies dans cinq groupes différents. Des essais complémentaires étaient ensuite requis pour achever l'identification.

Un modèle mathématique de Bayes a été utilisé par Friedman et MacLowry (R. Friedman et J. MacLowry, 1973, «Appi. Microbiol.» 26:314—317) pour la classification de bactéries. Leur base de données comportait des données de probabilité sur les profils de susceptibilité de 31 espèces de bactéries. Ces données ont été rassemblées au cours d'une période de plusieurs années. L'identification de 1000 isolats cliniques par cette méthode a concordé à 86% avec l'identification obtenue par des méthodes biochimiques traditionnelles.

Le brevet des Etats-Unis d'Amérique n° 3 852 532 décrit une méthode et un appareil qui permettent de déterminer la sensibilité aux antibiotiques conjointement avec une détermination de l'indice de diffusion de la lumière des bactéries en cours d'étude. Des méthodes et un appareillage destinés à être utilisés accessoirement dans ces déterminations sont décrits dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique n° 3 832 532 précité, n° 3 895 661,3 889 011,3 901 588,3 934 753,3 942 899 et «Des.» n° 230 587. L'appareillage décrit dans ces brevets allie la vitesse de l'automatisation avec la souplesse des méthodes manuelles. Il est conçu pour déterminer simultanément la sensibilité d'une bactérie à un ensemble choisi pouvant aller jusqu'à 12 agents antimicrobiens. Le résultat obtenu pour chaque agent antimicrobien est un indice de sensibilité appelé «indice de diffusion de la lumière». L'indice va de 0,00 (résistant) à 1,00 (sensible) par accroissements de 0,01. Les résultats de l'essai, sauf pour certains organismes à croissance lente, sont disponibles 3 à 5 heures après le début de l'essai.

L'invention a pour but de trouver un procédé destiné à être utilisé pour identifier des bactéries d'après une détermination de leur croissance par lecture photométrique, par exemple des valeurs de l'indice de diffusion de la lumière, de solution d'échantillons, que l'on fait réagir avec ces agents.

Un nombre choisi, par exemple de 10 à 14, dans un groupe d'environ 36 agents spéciaux inhibant le développement d'organismes, tels que des agents antimicrobiens (définis plus loin) est utilisé pour déterminer les valeurs de l'indice de diffusion de la lumière après développement sur des solutions échantillons de bactéries ayant réagi avec les agents en question. Les données numériques de croissance obtenues par des comparaisons de la

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diffusion de la lumière sont analysées, par exemple par des techniques assistées d'un équipement calculateur, pour identifier les souches des bactéries. Une méthode très utile de calcul est la méthode statistique basée sur la fonction discriminatoire du second degré. Cette technique illustre la forme de réalisation préférée de la présente invention, mais d'autres méthodes statistiques peuvent être utilisées, avec de moindres degrés de succès.

Cette méthodologie est particulièrement apte à être utilisée avec la méthode et l'appareil décrits dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n° 3 832 532 précité, mais elle peut aussi être adaptée par l'homme de l'art de manière à pouvoir être utilisée avec toute méthode d'essai de sensibilité qui donne une mesure raisonnablement quantitative du développement d'un organisme en présence de substances inhibitrices.

La méthodologie décrite dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n° 3 837 746 peut vraisemblablement être rendue apte, elle aussi, à être utilisée avec cette méthode d'identification de bactéries.

En conséquence, l'invention n'est pas limitée à l'usage avec l'appareil décrit dans les brevets précités, mais on peut l'utiliser avec toute méthode d'essai capable de donner une expression quantitative d'un développement bactérien vis-à-vis de divers agents inhibiteurs. Une forme de réalisation appréciée est la combinaison de la méthode analytique décrite ci-dessous avec un mode de détermination rapide de la sensibilité, du type décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n° 3 832 532 précité. Toutefois, l'intérêt général du concept n'est pas limité à toute méthode particulière de détermination quantitative de la sensibilité, rapide ou classique.

L'indice de diffusion de la lumière («IDL») est l'indice inhibiteur quantitatif engendré par le système « Autobac» d'essai de sensibilité. Toutefois, cet indice peut être remplacé par tout autre indice de croissance quantitative à échelle convenable, engendré par un autre système d'essai sans aucune perte d'applicabilité.

Les caractéristiques et avantages de la présente invention ressortiront de la description détaillée qui va suivre faite en regard des dessins annexés sur lesquels:

- la figure 1 est une représentation partiellement schématique d'un appareil monté en vue de la mise en œuvre de la méthode de l'invention, dont la réalisation comporte certaines caractéristiques de la présente invention ; et

- la figure 2 est une représentation en perspective d'un dispositif qui constitue le pupitre central d'un appareil permettant la mise en œuvre de la présente invention.

Comme le fait apparaître la figure 1, un appareil connu pour déterminer l'efficacité relative avec laquelle plusieurs antibiotiques différents (12 par exemple) inhibent le développement de bactéries comprend: une cuvette sacrifiable 12 en matière plastique dans laquelle les tests de sensibilité sont effectués, un distributeur 14 de disques qui a pour fonction d'insérer des disques dans la cuvette 12, un incubateur à secousses 30 qui a pour fonction de faire incuber et d'agiter les cuvettes et un photomètre-analyseur automatique 62 de diffusion de la lumière, destiné à évaluer la croissance bactérienne et à imprimer les résultats sur un formulaire pré-imprimé ou bande 22 comme décrit en détail dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n° 3 832 532 précité. Toutefois, on peut utiliser d'autres méthodes d'évaluation de la croissance, par exemple la détermination d'une densité optique, un comptage de cellules, une mesure d'impédance, une détermination de la concentration en ATP, une absorption de radio-isotopes ou une émission de radio-isotopes par des composés marqués, l'absorption d'oxygène, la production de C02, un dégagement de chaleur et des réactions chimiques dues à une utilisation métabolique ou à des métabo-lites résiduaires. Bien que ces méthodologies puissent présenter des différences de commodité et de précision, la présente invention enseigne que le principe de l'identification est indépendant de la méthode utilisée pour évaluer quantitativement la croissance ou déterminer le degré d'inhibition.

Préalablement à la mise en œuvre de la méthode d'essai décrite en détail dans ce qui suit, on prend un isolât clinique que 5 l'on transfère dans une boîte de Pétri 20 et que l'on fait incuber pendant environ 16 heures. Plusieurs colonies de morphologie similaire sont ensuite prélévées dans la boîte par le bactériologiste à l'aide d'une anse 24 et les échantillons sont mis en suspension par agitation tourbillonnaire dans une solution saline m contenue dans le tube 13. Cette étape peut être omise dans certains cas lorsqu'un seul organisme est susceptible d'avoir causé l'infection. L'inoculum peut alors être préparé par une dilution convenable à partir de sang centrifugé, de liquide céphalo-rachidien ou d'urine filtrée. En utilisant le mode de 15 normalisation des instruments photométriques, on ajuste la suspension contenue dans le tube à une concentration bactérienne normale que l'on contrôle dans l'analyseur 62 par insertion dans une lumière ménagée dans le couvercle 74 et qu'on lit sur l'appareil de mesure 68. On ajoute 2 ml de la suspension ci-no dessus à 18 ml de bouillon artificiel dans un tube à essai 78 dont la partie supérieure présente un pas de vis. Le tube à essai 78 est mis en place par vissage sur la cuvette 12 en matière plastique et une manipulation simple permet de transférer régulièrement le contenu du tube à essai dans 13 chambres d'essai de la cuvette. 25 Les agents antimicrobiens absorbés de préférence sur des disques en papier sont ensuite ajoutés par des lumières, libérés par l'enlèvement du couvercle par un distributeur 14 et ils sont maintenus en position de suspension dans le milieu de croissance dans douze compartiments non communicants des cham-3o bres par des doigts tubulaires en matière plastique prévus à la partie supérieure de la cuvette. La treizième chambre est utilisée comme témoin. La cuvette 12 est à présent maintenue en incubation de préférence pendant 3 heures dans un incubateur 30 équipé d'un dispositif d'agitation par secousses, pouvant 35 contenir jusqu'à 30 cuvettes. A la fin de cette période de 3 heures, une cuvette 12 est inséré dans l'analyseur 62 et le développement dans chacune des chambres est évalué. Par comparaison avec la chambre témoin, on calcule l'effet inhibiteur relatif de chaque agent antimicrobien dans les chambres et 40 les résultats sont imprimés de la manière décrite en détail dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n° 3 832 532 précité.

Les éléments suivants sont décrits en détail dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique: tubes à cartouches 39 ; supports 42 ; levier 51 ; étagères 54; thermostat de sûreté 60; bouton de 45 réglage de vitesse 63 ; bouton de réglage de température 65 ; appareil de mesure 65 a; tableau de commande 66 ; fente de sortie 70 de l'imprimante, boîtier 72 de l'instrument; porte 75 ; interrupteur général 77.

La figure 2 représente un pupitre 62A destiné à la mise en so œuvre de la présente invention; ce pupitre est semblable à l'appareil décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n° 3 832 532 précité et peut être utilisé conjointement avec l'appareil et les méthodes qui ont été décrits dans les autres brevets apparentés précités. Le pupitre 62A a, par rapport 55 à l'appareil décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n° 3 832 532 précité, les similitudes et les différences suivantes:

1. tableau frontal: Les dimensions du tableau frontal ont été étendues à la largeur totale de l'instrument de manière à pouvoir insérer le clavier E et l'affichage numérique D. 60 2. L'ancien ensemble de commutateurs utilisé pour régler la constante de base de la machine a été remplacé par le bloc de touches A.

3. La fente B de l'imprimante; l'appareil de mesure F de l'inoculum; et le tableau de commande C sont essentiellement 65 inchangés.

Le mode de fonctionnement est le suivant:

1. Lorsqu'une procédure à été choisie et que la constante de base a été mémorisée, le fonctionnement de la machine est

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exactement le même que décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n° 3 832 532 précité.

2. On choisit le mode de fonctionnement en pressant les boutons correspondants sur le clavier E. Par exemple, la machine est mise en service pour la conduite d'un essai normal de sensibilité par l'enfoncement de boutons qui portent des marques correspondant à l'essai de sensibilité aérobie. Lorsqu'un bouton est enfoncé, le voyant lumineux correspondant s'allume en indiquant le mode instrumental choisi. Un mode d'essai d'identification aérobie sera déclenché par exemple par l'enfoncement des boutons successifs correspondant à essai d'identification aérobie.

3. L'opération de calcul et de mémorisation de la constante de base est déclenchée par la sélection du mode d'essai désiré, par enfoncement d'une touche calcul au lieu d'une touche essai. Ainsi, pour calculer la constante de base requise dans la procédure de sensibilité qui a été choisie, il faut enfoncer le bouton calcul de sensibilité aérobie. L'opérateur introduit ensuite deux ou plusieurs cuvettes inoculées de la manière prescrite pour l'étalonnage. La machine calcule automatiquement la moyenne des chambres pour chaque cuvette et la moyenne globale pour toutes les cuvettes et elle fait apparaître ce nombre sur l'affichage numérique D. Si ce nombre satisfait l'opérateur, il enfonce la touche mémoire du clavier E et le nombre est mémorisé en vue de son utilisation dans la procédure subséquente. L'enfoncement de la touche essai ramène la machine au mode normal de fonctionnement.

Si l'on désire une constante de base de valeur bien déterminée, cette valeur peut être mémorisée par l'intermédiaire du bloc de touches A et du bouton mémoire du clavier E.

Toute cuvette pour laquelle plus de deux chambres diffèrent de la valeur moyenne calculée de diffusion de la lumière, d'une quantité supérieure à une quantité prédéterminée, est automatiquement refusée et l'opérateur doit travailler sur une cuvette additionnelle.

4. Les espaces vides ménagés sur le clavier E permettent d'ajouter à la machine jusqu'à 20 autres procédures d'essai par l'actionnement des boutons vierges correspondants et addition interne de circuits imprimés modulaires.

La méthode de l'invention est mise en œuvre de la manière suivante. Les cuvettes en matière plastique décrites dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n° 3 895 661 et le brevet «Des.» 230 587 précités, qui sont conservées dans des sacs en matière plastique, sont retirées de leurs enveloppes. Un couvercle blanc en matière plastique souple est détaché de la partie supérieure de la cuvette. Cette dernière est ensuite insérée dans le distributeur de disques, comme décrit dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique n° 3 899 011 précité, et le distributeur est actionné, en libérant des disques antimicrobiens choisis dans chacune des chambres de la cuvette. Un seul disque est délivré par chambre, et la matière renfermée dans ce disque a été préalablement choisie d'après la sensibilité antimicrobienne ou pour son aptitude à différencier des espèces bactériennes. Le couvercle blanc est ensuite remis en place sur la cuvette.

L'étape suivante consiste à choisir une souche bactérienne dans la boîte d'isolement primaire. Une colonie est inoculée dans un tube de solution saline tamponnée de préférence au phosphate. Ce tube de solution saline est ensuite inséré dans le photomètre de mesure de diffusion de la lumière, appartenant là encore au composant central de base du circuit, de manière à normaliser les inoculums; on observe la déviation de l'aiguille de l'appareil de mesure pour la normalisation. Lorsque l'aiguille coïncide avec la portion centrale de la jauge de repère, la normalisation est terminée. On introduit ensuite à la pipette 2 ml de l'inoculum de normalisation dans un tube de bouillon artificiel. En maintenant verticalement la cuvette, on visse dans cette dernière le tube renfermant le bouillon artificiel. La cuvette est ensuite placée à l'envers sur une surface de niveau de manière que le bouillon artificiel contenu dans le tube passe entièrement dans une chambre réceptrice qui se trouve à une extrémité de la cuvette. Pendant que ce transfert s'effectue, la 5 cuvette repose verticalement sur l'extrémité. Deux autres manipulations de la cuvette sont effectuées, à savoir (1) pour distribuer uniformément le bouillon sur toute la longueur de la cuvette, et (2) pour délivrer des échantillons égaux de 1,5 ml de bouillon dans les chambres individuelles de la cuvette, qui ont io été préalablement pourvues de disques antimicrobiens.

On place ensuite la cuvette dans l'incubateur à agitation par secousses où on la fait tourner à 220 tours/minute dans une atmosphère à 36° pendant environ 3 heures. A la fin de la période d'incubation, la cuvette est placée sur une barre ou un i5 chariot de support dans le photomètre de mesure de la diffusion de la lumière qui forme un composant du circuit. Le couvercle du photomètre est fermé, une carte est insérée en vue de l'enregistrement des résultats et la machine commence son calcul. Un développement suffisant doit être obtenu dans la 20 chambre témoin, sinon le photomètre rejette automatiquement l'essai. Dans le cas d'un tel rejet, la cuvette est retournée à l'incubateur dans lequel elle est soumise à l'incubation pendant une certaine période additionnelle. Si un développement suffisant a lieu dans la chambre témoin, un indice de diffusion de la 25 lumière est calculé au moyen d'une calculatrice miniature incorporée au boîtier du photomètre. Cet indice de diffusion de la lumière est une valeur numérique comprise entre 0 et 1 et cette valeur numérique sert de base au calcul d'une interprétation «sensible», «intermédiaire» ou «résistant», pour chaque agent 30 antimicrobien.

Comme on l'a mentionné ci-dessus, les résultats que l'on obtient avec ce système dans le test de sensibilité supportent favorablement la comparaison d'une part avec la méthode normalisée de diffusion avec disques de Kirby-Bauer (A.W. Bauer, 35 W.M.M. Kirby, J.C. Sherris et M. Turck, 1966, «Am. J. Clin, Path.» 45:493^496 ; et «National Committee For Clinical Labo-ratory Standards Subcommittee on Antimicrobial Susceptibility Testing», 1974, in A. Balows (Ed.), «Current Techniques for Antibiotic Susceptibility Testing», Charles C. Thomas, Spring-40 field, Illinois, pages 138—155, et d'autre part avec la méthode normalisée de dilution en gélose de l'International Collaborative Study (H. Ericsson et J.C. Sherris, 1971, «Acta. Pathol. Microbiol. Scand. Suppl.» 217).

Toutefois, cette méthode de mesure n'est pas limitée à 45 l'utilisation du circuit ci-dessus mais s'applique tout aussi bien à d'autres systèmes de mesures d'un développement microbien, à condition que ces systèmes soient capables d'effectuer une mesure antimicrobienne quantitative satisfaisante.

La méthode d'identification utilise les résultats de chaque so agent antimicrobien soumis à l'essai. L'indice de diffusion de la lumière, qui va de —0,5 à 1,5 par paliers de 0,01, est utilisé dans une méthode d'analyse à plusieurs variables appelée fonction discriminatoire quadratique (FDQ). Il s'agit de la forme de réalisation préférée, mais non de la seule forme de réalisation 55 possible de l'invention. La fonction FDQ est basée sur l'hypothèse selon laquelle des représentants de chacun des groupes bactériens tendent à suivre une distribution normale caractéristique avec chacun des composés antimicrobiens testés et utilisés dans le système d'analyse (B.H. Sielaff, E. A. Johnson et J.M. su Matsen, 1976, «J. Clin. Microbiol.» (3:105-109)). S'il arrive que deux groupes de bactéries ont des courbes de distribution qui se recouvrent, un point d'égale probabilité est créé dans la zone de recouvrement. Ce point d'égale probabilité peut être utilisé comme limite pour la classification. Si le recouvrement us est considérable, une technique de calcul même élaborée ne parvient pas à séparer les groupes de bactéries avec une seule variable. A mesure que l'on ajoute des variables, la probabilité de séparation des groupes croît. Si les groupes à séparer ont des

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valeurs très différentes pour chacun des divers agents antimicrobiens, une erreur de classification est minimisée et l'identification est assez directe et facile à effectuer.

Par conséquent, l'objectif est de trouver des composés qui soient capables d'une large discrimination sur la base de valeurs de l'indice de diffusion de la lumière obtenues avec chacun des agents antimicrobiens utilisés, ou de trouver au moins un agent antimicrobien sur la base duquel une discrimination nette est possible. On s'est efforcé initialement de n'utiliser que les agents qui avaient été utilisés en thérapeutique chez l'homme, contre des organismes bactériens. Les travaux ont débuté avec les organismes gram-négatifs, à cause de la plus grande difficulté qui se fait remarquer en ce qui concerne la division de ces organismes en les diverses espèces d'importance clinique. Ce groupe d'organismes comprend des genres qui sont difficiles à séparer, tels que Citrobacter, Enterobacter, Escherichia, et Klebsiella, de même que les quatre espèces du genre Proteus. Les composés antimicrobiens utilisés dans cette étude ont été l'ampicilline, la bacitracine, la carbénicilline à deux concentrations, la céphalothine, le sulfate de Colistine à deux concentrations, l'érythromycine, la furazolidone, la kanamycine, le man-délate de méthénamine, l'acide nalidixique, la néomycine, la nitrofurantoïne, la novobiocine, la polymixine B, la streptomycine et la tétracycline. Les matrices ou données de base utilisées dans le programme de calcul de la fonction discriminatoire quadratique pour analyser les résultats de l'essai ont été engendrées par introduction dans la calculatrice des valeurs de l'indice de diffusion de la lumière correspondant à des organismes connus appartenant à ces groupes de bactéries.

En utilisant ce profil impliquant 18 agents, on a obtenu pour les essais portant sur 481 organismes une précision de ce profil de 97,3%.

Toutefois, il existe des problèmes en ce qui concerne l'ampleur de ce profil, le nombre limité d'espèces à impliquer dans la méthode d'identification, et le fait que l'on court toujours le risque qu'une résistance spontanée se développe, dans un milieu hospitalier, vis-à-vis d'agents qui sont utilisés thérapeutique-ment pour les organismes bactériens rencontrés dans la population de patients humains, ou dans l'environnement considéré dans son ensemble, par exemple dans l'alimentation des animaux, en médecine vétérinaire, etc.

L'étape suivante de cette étude a alors consisté à réduire le profil des agents antimicrobiens, c'est-à-dire à réduire le nombre de variables à un minimum sans que ce soit au détriment de la concordance des pourcentages. Dans cet effort particulier, on a utilisé divers sous-groupes d'importance variable des 18 agents antimicrobiens initiaux. Pour un groupe particulier de 14 agents antimicrobiens, on a utilisé les 481 organismes mentionnés ci-dessus. Il y a une perte de concordance des pourcentages de moins de 2%. Toutefois, à mesure que le nombre de variables s'abaisse au-dessous de 14, la concordance des pourcentages commence à décroître rapidement. A tous points de vue, lorsqu'on utilise cette voie d'accès particulière, le sous-groupe de 14 agents antimicrobiens se révèle être le plus petit groupe qui donne encore un degré acceptable de concordance. Là encore, dans ce sous-groupe, il n'y a que des agents qui sont utilisés thérapeutiquement.

On a tenté ensuite d'établir un répertoire d'agents doués d'activité antimicrobienne, mais n'entrant pas dans la catégorie classique des antibiotiques ou des composés antimicrobiens thérapeutiques. Dans cette portion des recherches, on a passé en revue plus de 600 composés susceptibles de posséder une activité antibactérienne. La liste des composés considérés comprend des agents chimiques de toutes sortes connus pour présenter un certain spectre antibactérien. Environ 15% des composés passés en revue ont été retenus pour les essais systématiques de détermination de leur sélectivité différentielle en ce qui concerne le spectre antibactérien ; en réalité, on a testé 104 composés contre 20 espèces différentes, y compris la majorité des Enterobacte-riaceae de même que des représentants habituellement isolés des groupes gram-négatifs ne présentant pas de fermentation.

5 Ces composés ont été testés par des études de la concentration inhibitrice minimale en vue de déterminer les concentrations auxquelles l'activité antibactérienne se manifeste pour les divers représentants de chaque groupe impliqué dans l'essai de sélection. On a effectué plus de 10 000 séries d'études de la concen-!„ tration inhibitrice minimale. Les composés qui se sont montrés aptes à différencier des groupes bactériens ont été alors pris en considération en vue de l'analyse ultérieure dans le système réel de calcul.

L'étape initiale en ce sens a consisté à utiliser un petit ]5 nombre de ces composés, de même qu'un choix des agents expérimentés préalablement, pour tester l'aptitude à la discrimination. Douze composés ont été utilisés dans cette section particulière de la recherche et parmi ces composés, il y en avait quatre qui remplaçaient des antibiotiques classiques. Les quatre 20 composés de remplacement comprenaient le Vert Brillant, la Chlorhexidine, la cyclosérine et la trihydroxyacétophénone. On a inclus également le mandélate de méthénamine, agent qui n'entre pas dans les profils classiques de sensibilité aux agents antimicrobiens, mais dont la méthode de la présente invention a 25 révélé le grand intérêt dans le profil de différenciation. 14 des 20 groupes bactériens initiaux, avec 25 ou 24 isolats par groupe, ont ensuite été utilisés pour tester la capacité de séparation de ces groupes ordinairement isolés et assez difficiles à séparer. Là encore, on a inclus délibérément des organismes qui soulèvent 30 des problèmes de séparation, tels que les genres Escherichia, Citrobacter, Enterobacter et Proteus.

En utilisant le groupe d'agents antimicrobiens défini ci-dessus contre ces organismes, on a obtenu une précision de 97,1 % par le programme de calcul, en appliquant les règles du 35 calcul. Les résultats les plus mauvaix ont été obtenus avec Escherichia coli, espèce pour laquelle on n'a identifié correctement que 20 des 24 souches. Trois souches de Citrobacter freundii ont été mal identifiées, de même qu'une souche d'Ente-robacter et deux souches de Proteus vulgaris. Le problème qui 40 apparaît avec Escherichia coli est un problème de séparation de cet organisme du genre Shigella. Parmi les composés qui ont été soumis aux essais de sélection conformément à l'invention, il existe en fait des agents qui sont capables de séparer ces genres particuliers. Si l'on prend ce facteur en considération, la préci-45 sion, dans les schémas d'identification pour ces 14 espèces, doit s'approcher davantage de 98 ou 99%.

Ces études sont fondées sur la détermination de la possibilité d'utilisation d'une croissance bactérienne pouvant être lue sur un appareil, selon qu'elle peut ou non avoir lieu en présence 50 de divers composés chimiques, pour créer un profil d'identification de bactéries. Ce but a été atteint avec succès. Au cours des deux dernières années, un temps considérable a été consacré à l'identification de composés qui puissent être utilisés et à la mise au point d'un programme de calcul qui utilise avec succès les 55 valeurs engendrées par la machine. Pour éviter de gaspiller les efforts dans une étude des possibilités, il a été nécessaire de limiter le nombre des groupes étudiés. On a axé les recherches sur les bactéries gram-négatives dans des études préliminaires effectuées conformément à l'invention, pour diverses raisons. Ml Premièrement, la coloration de Gram est une méthode très rapide et très pratique pour différencier ce groupe d'autres groupes bactériens. Deuxièmement, les représentants de ce groupe sont en général les plus difficiles à identifier au laboratoire microbiologique clinique. Ils constituent la meilleure base „s de comparaison pour le système d'identification proposé. Troisièmement, les bactéries gram-négatives représentent la majorité des identifications qui sont effectuées couramment au laboratoire de microbiologie clinique.

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En résumé, les études ont montré qu'une méthode instrumentale rendue automatique pour tester la sensibilité antimicrobienne peut être utilisée pour effectuer l'identification bactérienne dans le même laps de temps de 3 à 5 heures que celui qui est utilisé pour les tests de sensibilité. Le système d'identification exploite les résultats de sensibilité antimicrobienne et les schémas de croissance établis pour d'autres substances chimi- . ques inhibant ou non la croissance. Un programme de calcul a été établi pour l'analyse de ces résultats selon la méthode statistique basée sur la Fonction Discriminatoire Quadratique. La précision de l'identification pour divers groupements taxono-miques de bactéries est égale ou supérieure à 95 %, comparée aux méthodes biochimiques normales.

On donne ci-après une liste d'agents antimicrobiens efficaces et de concentrations efficaces que l'on peut avantageusement utiliser dans la méthode de la présente invention.

Composé Masse par Gamme de essai ([ig) concentrations efficaces en microgrammes parmi

Acriflavine

7,5

5,0

Acriflavine

30,0

20,0

9-aminoacridine

10,0

6,7

Auramine O

160,0

106,7

Vert brillant

1,5

1,0

Vert brillant

3,0

2,0

Vert brillant

5,0

3,3

Cétrimide

120,0

80,0

Chlorure de cobalt

375,0

250,0

Chlorure cuivrique

375,0

250,0

Cyclosérine

120,0

80,0

Cyclosérine

240,0

160,0

Acide 3,5-dibromosali

cylique

750,0

500,0

Dodécylamine.HCl

18,75

12,5

Dodécylamine.HCl

75,0

50,0

5-fluoruacile

8,0

5,3

Floxuridine

9,0

6,0

Floxuridine

36,0

24,0

Vert Malachite

3,0

2,0

Bleu de méthylène

255,0

170,0

Disulfure d'Omadine

5,5

3,7

Omadine sodée

7,5

5,0

Azoture de sodium

75,0

50,0

Acétate thalleux

150,0

100,0

2',3',4'-trihydroxyacéto-

phénone

375,0

250,0

Bacitracine

18,0 unités 12,0 unités/ml

Carbénicilline

50,0

33,3

Céphalothine

15,0

10,0

Colistine

13,0

8,7

Kanamycine

5,0

3,3

Mandélate de methénamine

1,0

667,0

Acide nalidixique

5,0

3,3

Nitrofurantoïne

15,0

10,0

Novobiocine

30,0

20,0

Polymyxine B

50,0 unités 33,3 unités/ml

Tétracycline

0,5

0,3

Méthode statistique utilisée pour l'identification

L'identification est effectuée de préférence par une méthode statistique à plusieurs variables appelée fonction discriminatoire quadratique. La fonction discriminatoire quadratique est basée sur le modèle normal à plusieurs variables. Deux distributions normales adjacentes à plusieurs variables qui se coupent ont un point d'égale probabilité dans la région de recouvrement. Ce point d'égale probabilité peut être utilisé comme limite pour la classification. Pour classer un individu, il suffit de déterminer de 5 quel côté l'individu se situe par rapport à la limite. La limite d'égale probabilité réduit le risque d'erreur de classification si l'on suppose que les populations sont à peu près du même ordre de grandeur. Si les deux populations sont de grandeur très différentes, la proportion mal identifiée de chacune d'elle est 1() minimisée mais le nombre total d'erreurs d'identification n'est pas minimisé. Dans ce cas, il y a lieu d'effectuer une rectification pour tenir compte de la différence d'importance des populations.

La méthode débute par le calcul des matrices de covariance 15 pour les différents groupes. La formule qui permet le calcul des éléments de la matrice de covariance est la formule normale de covariance donnée ci-après:

n Ì xikxjk - k|xik ixjk

(1)

dans laquelle SXj. est la covariance entre les variables x, et Xj

25 (lorsque i = j, la formule est réduite à celle de la variance de la variable x;) et n est le nombre d'observations faites sur les variables X; et Xj (ce nombre est le même pour Xj et Xj ; il représente le nombre d'individus dans le groupe de données). Ces matrices renferment les variances et les covariances pour les 30 différentes variables dans chaque groupe.

On calcule également les vecteurs moyens pour chaque groupe. Ces vecteurs contiennent les moyennes établies pour les différentes variables dans chaque groupe. Si l'on change l'ensemble des variables que l'on utilise pour la classification, on 35 doit construire un nouveau jeu de matrices. Ces matrices sont construites en utilisant uniquement les valeurs de l'indice de diffusion de la lumière pour les variables impliquées dans le nouvel ensemble.

Pour la classification d'une souche individuelle dont l'un de 40 NG groupes, on calcule la fonction suivante pour chaque groupe:

_ NV _ ^

f(X)i = Pi(2,) 2 IS;I -I/2 e 2 (2)

45

où P; peut être la proportion de l'échantillon dans le groupe i ou la première probabilité du groupe i; NV est le nombre de variables ; ISil est le déterminant de la matrice de covariance pour le groupe i ; qj est la quantité (X — xb S;-1 (X—Xj), dans 50 laquelle X est le vecteur des valeurs des indices de diffusion de la lumière pour l'organisme à identifier, Xi est le vecteur de moyenne pour le i-ième groupe; le signe ' désigne la transposition de la matrice; et S^ 1 est l'inverse de la matrice de covariance pour le i-ième groupe. On peut voir que l'équation 55 (2) sans le paramètre pj indique précisément la fonction de densité de probabilité pour le modèle mormal à plusieurs veriables.

Lorsque cette valeur a été calculée pour tous les groupes, le f,o groupe pour lequel f(X) a la valeur la plus grande est choisi comme groupe d'identification de l'organisme inconnu. Dans la pratique réelle, attendu que la grandeur relative utilisée à des fins de comparaison entre des groupes a plus d'importance que la valeur réelle, le facteur constant impliquant le nombre Jt est 65 exclu des calculs.

Dans l'environnement réel du monde vivant, la plupart des distributions à variables multiples s'écarte de la normale. Heureusement, la méthode basée sur la fonction discriminatoire

7

622 826

quadratique a une grande tolérance. De très bonnes règles de classification peuvent être énoncées pour des populations qui ne s'écartent pas beaucoup de la normale. Pour de plus amples détails sur la normalité en présence de plusieurs variables et les fonctions discriminatoires quadratiques, on pourra consulter Anderson (T.W. Anderson, 1958; John Wiley & Sons, Inc., New York), Grams et collaborateurs (R.R. Grams, E.A. Johnson et E.S. Benson, 1972, «Am. J. Clin. Pathol.» 58:188-200; et R.R. Grams, E.A. Johnson et E.S. Benson, 1972, «Am. J. Clin. Pathol.» 58:201-207) et Michaelis (J. Michaelis, 1973, Academic Press, Inc., New York).

Résultats

On a examiné au total 31 agents antimicrobiens. Du fait que des concentrations multiples de certains agents ont été utilisées, on a examiné un total de 48 variables possibles (tableau I) au cours de ces études. Beaucoup de ces variables ont été exclues parce qu'elles ne donnaient aucune information utilisable pour la différenciation. La plupart des souches de tous les groupes étaient ou bien entièrement sensibles ou bien entièrement résistantes à l'agent antimicrobien à la concentration en question. D'autres variables ont donné une information avec redondance (la même information qu'une autre variable) et on a donc pu les éliminer. Le tableau II montre le sous-ensemble qui s'est révélé être le plus prometteur dans l'ensemble total des variables.

Les agents antimicrobiens ont été testés contre une gamme de 481 isolats bactériens. La composition de cette gamme de bactéries est indiquée sur le tableau III. Ces résultats ont été utilisés pour la construction des matrices qui ont servi à la classification. Lorsque les 481 isolats indiqués sur le tableau III ont été classés conformément aux 18 agents antimicrobiens du tableau II, la concordance avec l'identification à laquelle est parvenu le laboratoire clinique par des méthodes classiques d'identification a été supérieure à 97 %. Ces résultats ressortent du tableau IV. Environ 80% des non-concordances sont le fait d'organismes identifiés dans les genres Citrobacter ou Enterobacter par le laboratoire clinique et dans d'autres genres par le profil de sensibilité. Ces deux genres se sont donc révélés être les plus difficiles à identifier.

Tableau I

Antibiotiques mis à l'épreuve Agent

Ampicilline Bacitracine Carbénicilline Carbénicilline

Céphalothine

Chloramphénicol

Clindamycine

Cloxacilline

Colistine

Doxycycline

Erythromycine Erythromycine Furizolidone Gentamycine

Kanamycine Kanamycine Lincomycine

Mandélate de méthénamine Méthacycline

Poids par essai (jxg) 3,6

18,0(a)

60,0 120,0

15,0 5,0 2,0 1,0 2,0 13,0 0,5 1,6

2,5 15,0 100,0 9,0

6,0 18,0 2,0 l,0(b)

30,0

Méthicilline Nafcilline Acide nalidixique Acide nalidixique 5 Néomycine Néomycine Nitrofurantoïne

Novobiocine n, Novobiocine Oléandomycine Oléandomycine

Pénicilline G 15 Pénicilline G Pénicilline G Polymyxine B

Polymyxine B 2o Polymyxine B Streptomycine Streptomycine Streptomycine Tétracycline 25 Tétracycline Triméthoprime/sulfaméthoxazole

Vancomycine Vancomycine 30 Viomycine Viomycine

(a) Poids exprimés en unités

(b) Poids exprimés en milligrammes

35

Tableau II

Sous-groupe d'antibiotiques Agent

40 Ampicilline Bacitracine

Carbénicilline Carbénicilline 45 Céphalothine Colistine Colistine Erythromycine Furizolidone so Kanamycine Mandélate de méthénamine Acide nalidixique Néomycine Nitrofurantoïne 55 Novobiocine Polymyxine B Streptomycine Tétracycline

(a) Poids exprimés en unités

(b) Poids exprimés en milligrammes Tableau III

Composition de la gamme bactérienne 65 Organisme

CITROB(a)

ENTEROB

5,0 1,0 5,0 15,0 5,0 20,0 15,0

5,0 30,0 6,0 15,0

0,2(a) 2,0(a) 10,0(a) 12,5(a)

50,0(a) 300,0(a) 2,0 10,0 20,0 0,5 1,5 1,25/23,75

10,0 30,0 2,0 10,0

Poids par essai (|xg) 3,6

18,0(a)

50,0 120,0 15,0 2,0 13,0 15,0 100,0 5,0 l,0(b)

5,0 5,0 15,0 30,0 50,0(a)

10,0 0,5

Nombre d'organismes

50 48

622 826

8

ECOLI

75

HEREL

35

KLEB

59

PROTMIR

49

PROTOTH

51

P. morganii

(19)(b)

P. rettgeri

(17)

P. vulgaris

(15)

PSEUDO

62

P. aeruginosa

(35)

P. fluorescens

(15)

P. maltophilia

(12)

SERRAT

52

(a) CITROB, Citrobacter ; ENTEROB, Enterobacter ; 15 ECOLI, Escherichia coli; HEREL, Herellea; KLEB, Klebsiella; PROTMIR, Proteus mirabilis; PROTOTH, Proteus producteur d'indole; PSEUDO, Pseudomonas; SERRAT, Serratia.

(b) Les nombres placés entre parenthèses n'entrent pas dans les totaux des oranismes utilisés dans l'essai. 20

Tableau IV

Affiliation aux groupes d'après le profil de sensibilité et d'après les méthodes classiques — 18 variables (a)

Affiliation aux groupes d'après le profil 25 de sensibilité

Affiliation aux

ffl

E

groupes d'après

CQ

O

OH

b

O

h les méthodes

O

a/

Pi ta

»•—< J

J

lü

m

H

O H

Q

<

05 H

O

u

Pi w

w j

O Pi

O

Pi

W

GO

Di ti

U

IÜ

w

X

w eu eu p-<

Vi

CITROB (b)

45

2

0

1

0

ENTEROB

4

43

1

0

ECOLI

0

1

73

0

HEREL

0

35

0

KLEB

0

59

0

PROTMIR

0

51

0

PROTOTH

0

1

48

0

PSEUDO

0

62

0

SERRAT

0

52

35

40

(a) Voir tableau II. Le pourcentage de concordance entre le profil de sensibilité et les méthodes classiques a été de 97,3 %

(b) Pour les abréviations, voir le tableau III.

Tableau V

Affiliation aux groupes d'après le profil de sensibilité et d'après 5() les méthodes classiques -14 variables (a)

Affiliation aux groupes d'après le profil de sensibilité

Affiliation aux groupes d'après les méthodes O classiques ^

m §

S

z j

o u

M W

J W Pi w X

m w j

Pi

M

S H O

Pi eu g

g §

Oh

O Q D W 00 eu

H 55 <

Pi

Pi «

on

CITROB (b)

ENTEROB

ECOLI

HEREL

KLEB

PROTMIR

PROTOTH

PSEUDO

SERRAT

42 2 1 0 0 0 0 0 0

4 44 1

0

1 0 0

0

1

2 2 72

0 0 0

1 0 0

0 35 0

1 0 57 0 0 0 0

0 0 0 0

0 0 0 0 0

0 51

1 0 0

1 0 0 0 0 0 48

0 Ml

0 0 0 0

0 65

0

0 61 0

1 0 50

0 0 0 0 0 0 0

(a) Les variables comprenaient Fampicilline, la bacitracine, la carbénicilline 50 et 120, la céphalothine, la Colistine 2 et 13, Erythromycine 15, la kanamycine 5, le mandélate de méthénamine, la néomycine 5, la nitrofurantoïne, la novobiocine 30 et la

; tétracycline 0,5. Le pourcentage de concordance avec les méthodes classiques a été égal à 95,6%.

(b) Voir le tableau III pour les abréviations.

En conclusion, cette étude a été entreprise pour déterminer i la possibilité d'utilisation de profils de sensibilité pour l'identification de bactéries. Dans le cadre de cette étude, l'objectif visé a été atteint avec succès ; la validité de cette méthode a été démontrée. Comme on l'a indiqué ci-dessus, pour éviter le gaspillage des efforts dans l'étude des possibilités, il a été nécessaire de limiter le nombre des groupes étudiés. Les recherches ont été axées sur des bactéries gram-négatives pour plusieurs raisons. Premièrement, étant donné que la méthode de coloration de Gram est très rapide et facile à mettre en œuvre, la différenciation de ce groupe peut être effectuée avec une facilité relative. Deuxièmement, étant donné que les représentants de ce groupe sont en général les plus difficiles à identifier, ils constituent le meilleur test pour la méthode d'identification que l'on cherche à établir. Enfin, les bactéries gram-négatives constituent la majorité des organismes habituellement identifiés au laboratoire de microbiologie clinique.

Comme dans le cas de la plupart des études de validité, des problèmes surgissent au cours de ces études. Le principal problème concerne la modification du profil de sensibilité sous l'effet de la résistance acquise. Ce problème n'a pas été rencontré pendant cette étude ; néanmoins, le risque d'erreurs d'identification dues à une telle cause subsiste. La résistance acquise se manifeste du fait que des mutants aptes à résister sont sélectionnés par l'usage répandu d'un agent antimicrobien. Cette résistance peut ensuite être transmise par des facteurs r.

Le cadre de la présente méthode d'identification peut être élargi par l'addition d'autres groupes bactériens. Par exemple, on pourrait ajouter d'autres genres gram-négatifs ainsi que des genres gram-positifs. Il serait également intéressant de pouvoir effectuer aussi une plus grande spéciation au sein des genres. Il s'agit là de domaines qui nécessitent des recherches approfondies. Les travaux portant sur les points mentionnés ci-dessus progressent dans les laboratoires. De très nombreux composés chimiques non antibiotiques sont en cours d'étude en ce qui concerne leur aptitude à différencier des groupes bactériens par inhibition différentielle de la croissance. L'un des critères de choix est que le composé ne soit pas utilisé couramment en clinique, afin de minimiser le risque d'existence d'une résistance acquise. Si des bactéries ne se trouvent pas normalement au contact d'une substance dans leur milieu, la résistance acquise envers cette substance ne risque pas de devenir un problème. On a également plus que doublé le nombre de groupes bactériens qui peuvent être étudiés, soit par l'addition d'autres genres, soit par augmentation de la spéciation.

En résumé, cette étude a démontré que l'identification de bactéries d'après leur sensibilité relative à divers agents antimicrobiens est une méthode réalisable.

Le pupitre 10 de l'instrument a été conçu de manière à faciliter la jonction avec un ordinateur. Il existe un adaptateur en option usine ou installé sur place, qui permet de connecter l'instrument à un ordinateur. Ce dernier renferme la banque de données d'identification des bactéries ainsi que d'autres données utiles et exécute l'identification d'après les analyses statistiques mentionnées ci-dessus des données d'entrée mesurées par le photomètre.

Le fonctionnement de la jonction est automatique. Il suffit que l'opérateur entreprenne un essai de la manière normale et des informations sur les résultats de cet essai sont en même

temps imprimées sur la carte et introduites dans l'ordinateur de l'utilisateur. La fonction de l'ordinateur offre également à l'utilisateur la possibilité d'éliminer les résultats imprimés sur la carte

622 826

et de maintenir l'instrument sur une chambre d'essai déterminée jusqu'à ce que l'ordinateur externe ait terminé le traitement des informations.

C

1 feuille dessins

Claims

622 826

1. Procédé pour l'identification d'une souche de microorganisme dans un échantillon liquide, caractérisé en ce qu'on divise l'échantillon en sous-échantillons, on inocule tous les sous-échantillons simultanément avec un agent inhibiteur de croissance qui est différent pour chacun des sous-échantillons et dont la récation avec le micro-organisme du sous-échantillon fournit des particularités permettant l'identification de la souche, on incube les sous-échantillons pour développer des différences de croissance significatives dans chacun des sous-échantillons, on détermine par lecture photométrique la croissance du micro-organisme dans chacun des sous-échantillons, ces lectures étant effectuées dans une période si courte que la différence de croissance dans les sous-échantillons par rapport à cette période soit pratiquement nulle, et l'on compare les lectures de croissance avec un ensemble de données d'identification de micro-organismes par rapport aux agents inhibiteurs utilisés, identifiant ainsi la souche de micro-organisme contenue dans l'échantillon.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on prévoit un sous-échantillon supplémentaire qu'on maintient exempt d'agent inhibiteur de croissance en vue de l'utiliser comme témoin, et qu'on calcule la relation entre les lectures photométriques des sous-ecchantillons contenant les agents inhibiteurs, et le sous-échantillon témoin, de manière à déterminer les différences relatives entre les actions des divers agents inhibiteurs sur la croissance dans chacun des sous-échantillons, et l'on compare les données ainsi obtenues avec l'ensemble desdites données d'identification.

2

REVENDICATIONS

3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que la comparaison est effectuée à l'aide d'un ordinateur.

4. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'on utilise au moins 14 agents inhibiteurs différents qui sont choisis parmi l'acriflavine, la 9-aminoacridine, l'auramine O le vert brillant, le cétrimide, le chlorure de cobalt, le chlorure cuivrique, la cyclosérine, l'acide 3,5-dibromosalicylique, la chlorhydrate de dodécylamine, le 5-fluoruracile, le floxuridine, le vert malachite, le bleu de méthylène, le disulfure d'omadine, le sel de sodium de l'omadine, l'azoture de sodium, l'acétate thalleux, la 2',3',4'-trihydroxyacétophénone, la bacitracine, la carbénicilline, la céphalothine, la Colistine, la kanamycine, le mandélate de méthanamine, l'acide nalixidique, la nitrofuran-toïne, la novobiocine, la polymyxine B et la tétracycline.

5. Procédé suivant la revendication 4, caractérisé en ce que les sous-échantillons inoculés sont agités en vue de former une suspension uniforme du micro-organisme qui s'y développe.

6. Procédé selon la revendication 4 ou 5, caractérisé en ce que l'on utilise les agents inhibiteurs suivants: l'acriflavine, l'auramine O, le vert brillant, la carbénicilline, la céphalothine, le chlorure de cobalt, la cyclosérine, l'acide 3,5-dibromosalicyIi-que, le chlorhydrate de dodécylamine, le 5-fluoruracil, le vert de malachite, le bleu de méthylène, l'azoture de sodium et l'acétate thalleux.

7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'on utilise les agents inhibiteurs dans les concentrations suivantes entre parenthèses en ng/ml: l'acriflavine (20,0) ; l'auramine O (106,7) ; vert brillant (2,0) ; la carbénicilline (3,3) ; la céphalothine (10,0) ; le chlorure de cobalt (250,0) ; la cyclosérine (80,0) ; l'acide 3,5-dibromosalicylique (500,0) ; le chlorhydrate de dodécylamine (12,5); le 5-fluoruracil (5,3) ; le vert malachite (2,0) ; le bleu de méthylène (170,0) ; l'azoture de sodium (50,0) ; et l'acétate thalleux (100).