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CH615459A5 - Process for the preparation of a metabolite - Google Patents

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Publication number
CH615459A5
CH615459A5 CH305675A CH305675A CH615459A5 CH 615459 A5 CH615459 A5 CH 615459A5 CH 305675 A CH305675 A CH 305675A CH 305675 A CH305675 A CH 305675A CH 615459 A5 CH615459 A5 CH 615459A5
Authority
CH
Switzerland
Prior art keywords
metabolite
medium
salt
acid
acetone
Prior art date
Application number
CH305675A
Other languages
English (en)
Inventor
Max Kuhn
Hamilton D Dr King
Original Assignee
Sandoz Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sandoz Ag filed Critical Sandoz Ag
Priority to CH305675A priority Critical patent/CH615459A5/de
Priority to DE19762608337 priority patent/DE2608337A1/de
Priority to NL7602396A priority patent/NL7602396A/xx
Priority to GB9314/76A priority patent/GB1541485A/en
Priority to BE164985A priority patent/BE839355A/xx
Priority to JP51025199A priority patent/JPS51112593A/ja
Priority to FR7606825A priority patent/FR2303539A1/fr
Publication of CH615459A5 publication Critical patent/CH615459A5/de

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/16—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing two or more hetero rings
    • C12P17/162—Heterorings having oxygen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. Lasalocid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
    • A23K20/10—Organic substances
    • A23K20/195—Antibiotics

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Description

615459
2
PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung des neuen Metaboliten S 14750/A in freier Form oder in Form eines Salzes, dadurch gekennzeichnet, dass man den Stamm NRRL 8077 der Actino-mycetspecies Streptomyces hygroscopicus (Jansen 1931) Waksman and Henrici, 1948 auf oder in einem Nährmedium züchtet und hierauf den Metaboliten S 14750/A in freier Form oder in Form eines Salzes aus der Fermentationsbrühe, in der das Zellmaterial aufgeschlossen wird, isoliert.
Medium Wachstumseigenschaften
Mycelform
20
30
35
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des neuen Metaboliten S 14750/A in freier Form oder in Form eines Salzes.
Erfindungsgemäss gelangt man zu dem neuen Metaboliten S 14750/A in Form der Säure oder in Form der Salze, indem man den Stamm NRRL 8077 der Actinomycetenspecies Streptomyces hygroscopicus (Jansen 1931) Waksman and Henrici, 1948 auf oder in einem Nährmedium züchtet und den neuen Metaboliten in Form der Säure oder in Form eines Salzes aus der Fermentationsbrühe, in der das Zellmaterial aufgeschlossen wird, isoliert.
Der Metabolit S 14750/A in Form der Säure kann gegebenenfalls auf an sich bekannte Weise in die Salzform übergeführt werden. Als Salze kommen beispielsweise Alkalimetall- und Erdalkalimetallsalze in Frage.
Der oben erwähnte Stamm von Streptomyces hygroscopicus (Jansen 1931 ) Waksman and Henrici, 1948 wurde aus einer in Vergei, Alicante in Spanien gefundenen Erdprobe isoliert und eine Probe davon am 30. Januar 1975 beim United States Department of Agriculture (Northern Research and Development Division), Peoria, Hl., USA, deponiert und steht der Öffentlichkeit unter der Kulturnummer NRRL 8077 zur Verfügung.
Der Stamm NRRL 8077 wächst gut auf organischen und synthetischen Medien. Die Sporenträger sind monopodial (manchmal sympodial) verzweigt mit engen kompakten Spiralen mit 2 bis 5 Windungen. Sie bilden oft dichte Büschel, die ein pseudoverticillates Aussehen haben. Die Sporen sind oval bis elliptisch, 1,0 bis 1,3 Micron lang und 0,8 bis 0,9 Micron breit,
ihre Oberfläche ist warzenartig. Auf einigen, insbesondere organischen Medien wurde ein ausgeprägtes hygroskopisches Verhalten beobachtet, indem beim Feuchtwerden der Sporen durch Exsudate auf Agarkulturen schwarze, glänzende Flecken entstehen.
Anhand des Klassifikationssystems von Waksman (Waksman, The Actinomycetes, Vol. 2,328-334,1961 ) konnte der Stamm NRRL 8077 als Streptomyces hygroscopicus (Jansen 1931) Waksman and Henrici, 1948 identifiziert werden. Die Wachstumseigenschaften des Stammes NRRL 8077 auf normalen biologischen Medien und seine Kohlenstoffassimilation sind in den folgenden Tabellen aufgeführt. 55
Wachstumseigenschaften
45
50
Medium Wachstumseigenschaften
Mycelform
Malz-Hefe Extrakt
Agar Hafer
W: gut, gelb-braun Spira a
LM: grau-beige bis mausgrau 2-5
(G 3 ih)* Windungen
LP: keine
W: gut, ledergelb bis Spira a gelb-braun
Agar
Stärke
Agar
10
Glycerin 15 Asparagin Agar
LM : grau-beige bis mausgrau (G 3 ih)*
LP: keine
W: mittel, farblos bis leicht braun
LM : weiss bis aschgrau (G 5 fe)*
LP: keine
W: mittel, ledergelb bis leicht gelb-braun
LM : weiss bis aschgrau (G 5 fe)*
LP: leicht gelbes Pigment
2-5
Windungen
Spira a 2-5
Windungen
Spira a 2-5
Windungen
W: Wachstum LM: Luftmycel LP: Lösliches Pigment
*: Referenz mit Bezug auf das «Color-wheels System»
Assimilation von Kohlenstoffverbindungen Wachstum Kohlenstoffquelle
Glukose, Arabinose, Sucrose, Xylose, Stärke, Inositol, Mannitol, Fructose Rhamnose, Raffinose, Galactose, Glycerin, Cellobiose, Dextrin, Mannose Cellulose, Salicin, Inulin, Culcitol,
Sorbitol
*** = gutes Wachstum und Verwertung ** = mittleres Wachstum und Verwertung - = kein Wachstum oder Verwertung
Der neue Stamm NRRL 8077 besitzt folgende physiologische Eigenschaften:
Nitratreduktion Stärkehydrolyse Zellulosezersetzung Tyrosinreaktion Milchkoagulation Milchpeptonbildung Gelatineverflüssigung
Melaninbildung positiv positiv negativ negativ negativ stark positiv positiv, schwach gelbes
Pigment negativ eo
65
Die Züchtung des Stammes NRRL 8077 erfolgt durch Anwendung an sich bekannter Methoden und besteht im wesentlichen darin, den genannten Stamm auf einem geeigneten Medium und unter geeigneten Bedingungen zu züchten und anschliessend den im Laufe der Züchtung gebildeten Metaboliten S 14750/A in freier Form oder in Form seiner Salze abzutrennen. Die Züchtung des Stammes NRRL 8077 kann nach jeder aeroben Oberflächenzüchtung oder Immersionszüchtung erfolgen.
Zu Beginn der Züchtung soll der pH-Wert des Fermentationsmediums zwischen 6,8 und 7,3 liegen. Die zur Züchtung optimale Temperatur kann zwischen 25 und 35° liegen. Die Belüftung der Züchtung kann zwischen weiten Grenzwerten schwanken. Die maximale Ausbeute am Metaboliten S 14750/A wird nach 4- bis 7tägiger Züchtung erhalten, wobei diese Zeit
3
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spanne hauptsächlich von dem verwendeten Medium abhängt.
Um eine Verzögerung bei der Produktion des Metaboliten S 14750/A zu vermeiden, wird vorzugsweise die vegetative Form statt der Sporenform des Mikroorganismus für die Inocu-lierung des Produktionsmediums verwendet. Dementsprechend wird zuerst ein vegetatives Inoculum des Mikroorganismus durch Inoculieren einer kleinen Menge eines Kulturmediums mit einer Sporensuspension des Stammes NRRL 8077 erzeugt.
Die Fermentationsmedien sollen hauptsächlich eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, eine assimilierbare Stickstoffquelle und gegebenenfalls Mineralsalze und Wachstumsfaktoren enthalten, wobei alle diese Elemente in Form von gut definierten Produkten oder von komplexen Gemischen, wie man sie in biologischen Produkten verschiedenen Ursprungs antrifft, zugeführt werden können. Medien auf Basis von Glucose eignen sich besonders gut. Weiterhin eignen sich organische und anorganische stickstoffhaltige Verbindungen wie Pepton, Hefeoder Fleischextrakte, Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat, Aminosäuren usw. als Stickstoffquelle.
Spurenelemente, die für ein optimales Wachstum des Organismus, der zur Produktion des Metaboliten S 14750/A verwendet wird, erforderlich sind, sollen ebenfalls in dem Kulturmedium enthalten sein. Solche Spurenelemente kommen gewöhnlich als Verunreinigungen in den anderen Bestandteilen des Mediums in Mengen vor, die für den Wachstumsbedarf des erfindungsgemäss verwendeten Stammes NRRL 8077 genügen.
Die Isolierung des neuen Metaboliten kann nach an sich bekannten Methoden, z. B. auf folgende Weise durchgeführt werden:
Sobald bei der Züchtung eine maximale Menge des Metaboliten S 14750/A produziert worden ist, wird der Mycelanteil in der Kulturbrühe gegebenenfalls aufgeschlossen, z. B. mit einem Ultraturrax, und der Metabolit durch extraktive und/ oder adsorptive Methoden auf an sich bekannte Weise gewonnen. Man kann aber auch zuerst das Mycel aus der Kulturbrühe abzentrifugieren, das Kulturfiltrat und das Mycel nach Auf-schluss separat extrahieren und die Extrakte einzeln oder vereinigt weiterverarbeiten.
Eine Methode, die sich als vorzugsweise geeignet erweist, ist die Trennung der Kulturbrühe in Kulturfiltrat und Mycel durch Zentrifugieren. Das Kulturfiltrat wird anschliessend mit 1 N Natriumhydroxidlösung auf pH 9 gestellt, filtriert und mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, wie z. B. Äthylacetat, 1,2-Dichloräthan, Chloroform, Dichlormethan, Toluol oder Benzol bei 20-30° extrahiert. Der so erhaltene Extrakt wird anschliessend im Vakuum bei niederer Temperatur, vorzugsweise 20-60°, vom Lösungsmittel befreit. Das Mycel wird bei 20-30° mit Methanol und mit Methanol-Was-ser-Gemisch 9 :1 unter Verwendung eines Ultra-Turrax aufgeschlossen und extrahiert. Nach Abzentrifugieren des Zellmaterials und Klarfiltrieren werden die vereinigten Methanolextrakte im Vakuum bei 20-40° auf Wasser eingedampft, wobei eventuell noch Wasser zugegeben wird. Nach Einstellen der wässrigen Phase auf pH 9 wird wiederum mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel wie oben beschrieben extrahiert und die organische Phase eingedampft. Die beiden so erhaltenen rohen Extrakte, die den neuen Metaboliten S 14750/A vorzugsweise als Natriumsalz enthalten, werden nun vereinigt. Zur weiteren Reinigung kann an Sephadex LH-20 mit Methanol und/oder an feinkörnigem Kieselgel Chromatographien werden. Vorzugsweise hat sich die Chromatographie an Kieselgel Merck der Korngrösse 0,2-0,5 mm geeignet. Zur Elution können Chloroform, Chloroform-Aceton oder Chloroform-Methanol-Gemische dienen. Als besonders geeignet hat sich ein Gemisch von Toluol mit 1% Triäthylamin unter Zusatz von steigenden Mengen Aceton (2-50%) erwiesen. Das
Verhältnis Adsorbens zu Rohextrakt kann in den Grenzen von 30-100:1 variiert werden. Der Metabolit kann in den Fraktionen entweder dünnschichtchromatographisch oder durch seine Aktivität gegen Staphylococcus aureus erkannt werden. Das nach der Chromatographie anfallende, bereits recht reine Material liegt als Gemisch von Säure und Natriumsalz vor. Zur Überführung in das reine Natriumsalz werden die reinen Fraktionen in einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, das gegen Basen beständig ist, wie z. B. chlorierte Kohlenwasserstoffe, Kohlenwasserstoffe, Äther, vorzugsweise Chloroform, gelöst und mit wässriger Natriumhydroxidlösung geschüttelt. Das in der organischen Phase gelöste Natriumsalz des Metaboliten S 14750/A wird durch Eindampfen im Vakuum bei 20-40° isoliert und durch Kristallisation gereinigt. Bei der Kristallisation aus Aceton fällt das Kristalla-ceton-haltige Na-Salz von S 14750/A an, aus dem das Kristallösungsmittel durch mehrmaliges Hochziehen mit Benzol im Vakuum bei 20-50° entfernt werden kann. Das so erhaltene reine Na-Salz ist amorph. Zur Herstellung der freien Säure löst man das Na-Salz in einem mit Wässer nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, vorzugsweise Chloroform, Dichlormethan oder 1,2-Dichloräthan, schüttelt mit einer verdünnten wässrigen Lösung einer starken Säure, z. B. HCl, H2SO4, H3PO4 bei 0-20° aus, wäscht anschliessend die starke Säure aus und dampft die organische Phase im Vakuum bei 20-40° ein. Die so erhaltene Säure ist amorph. Die amorphe Säure, das amorphe Na-Salz und das Kristallaceton-haltige Na-Salz des neuen Metaboliten S 14750/A zeigen folgende Eigenschaften:
Säure Na-Salz Na-Salz amorph kristallisiert mit Aceton
Smp. 91-100° 122-128° 160-165°
an0 in Methanol +4,3° +7,2°
in Chloroform -5,5° +15,2°
UV (Methanol) Endabsorp- Endabsorp tion tion
Die elementare Zusammensetzung der Säure ergibt folgende Werte:
C 64,4% H 9,7% 0 26,2%
Das IR-Spektrum der Säure in CH2CI2 ist in Fig. 1 und das IR-Spektrum des amorphen Na-Salzes in CH2CI2 ist in Fig. 2 dargestellt. Das NMR-Spektrum der Säure (100 MHz) in Deuterochloroform mit Tetramethylsilan als internem Standard ist in Fig. 3 dargestellt, das NMR-Spektrum des amorphen Na-Salzes in Fig. 4.
Natriumsalz und Säure sind in organischen Lösungsmitteln wie Toluol, Benzol, Dichlormethan, Chloroform, Essigester, Butylacetat, Äthanol, Methanol gut löslich. In Wasser sind beide Verbindungen nur sehr schwer löslich. Im Dünn-schichtchromatogramm haben Säure und Natriumsalz auf Kieselgelplatten gleiche Rf-Werte. In der Tabelle sind die Rf-Werte auf Kieselgelplatten, Merck, Kieselgel 60, F 254 0,25 mm Schichtdicke, im Vergleich zu einigen anderen Ionophoren dargestellt.
Rf-Werte in Flm
1
2
3
S 14750/A
0,32
0,74
0,55
Nigericin
0,17
0,22
0,35
X-206
0,27
0,71
0,56
A-204
0,36
0,43
0,59
Grisorixin
0,20
0,34
0,33
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
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4
Fliessmittel (Firn) l:Toluol-Aceton(8 :2)+ l%Triäthylamin Fliessmittel (Flm) 2: Chloroform-Äthylacetat(l : 1)
Fliessmittel (Flm) 3: Chloroform-Methanol (95 :5)
Zur Sichtbarmachung der Flecken wird Jod oder eine Lösung von 0,2% Ce(SC>4)2 in 50%iger Schwefelsäure (erwärmen auf 120-130°) verwendet.
Der neue Metabolit S 14750/A in freier Form oder in Form seiner Salze ist für humanmedizinische und veterinärmedizinische Zwecke geeignet.
Der neue Metabolit S 14750/A zeigt in Form der Säure oder seiner Salze, z. B. des Na-Salzes, antibakterielle Wirkung gegen grampositive Organismen und Pilze. In der folgenden Tabelle sind die minimalen Hemmkonzentrationen (MIC-Werte) gegen einige Mikroorganismen angegeben.
Säure
Na-Salz
Staphylococcus aureus
1
0,03
Micrococcus lysodeikticus
0,01
0,01
Helminthosporium sp.
1000
30
Der Metabolit S 14750/A oder seine Salze können für humanmedizinische Zwecke als Arzneimittel allein, und zwar sowohl in reiner Form als auch als Rohkonzentrat oder in den entsprechenden Arzneiformen für topicale, orale, enterale oder parenterale Verabreichung verwendet werden.
Ferner ist der neue Metabolit S 14750/A wirksam gegen verschiedene Coccidienarten und -spezies. Diese Wirksamkeit wird unter experimentellen Bedingungen am Beispiel Eimeria tenella, einem wichtigen Coccidiose-Erreger des Geflügels, aufgezeigt.
Die Untersuchungen erfolgten an Eintagsküken in einem 10 Tage währenden Test. Dabei erhielten die Kükengruppen ein mit Metabolit S 14750/A in verschiedenen Konzentrationen medikiertes Futter und wurden 48 Stunden nach Beginn der Fütterung am 3.Lebenstag mit 200 000 sporulierten Oocysten von E.tenella oral infiziert. Am 7. Tag post infectionem erfolgte der Abbruch des Versuches und die Feststellung der Wirksamkeit unter Berücksichtigung der Kriterien Mortalität, Läsions-grad im Caecum und Gewichtszunahme im Vergleich zu infi-zierten-unbehandelten sowie gesunden-unbehandelten Kontrolltieren.
Es zeigt sich hierbei, dass durch Metabolit S 14750/A in Futterkonzentrationen von mehr als 30 ppm. der Infektionsverlauf von E.tenella im Blinddarm unterbrochen bzw. gehemmt wird, was im Vergleich zu den Kontrolltiergruppen sowohl in der Mortalität und im Läsionsgrad des Blinddarmepithels als auch in einer günstigen Gewichtsentwicklung, die im Bereich von gesunden Küken liegt, zum Ausdruck kommt.
Der neue Metabolit S 14750/A ist gegen Coccidiose-Infek-tionen wirksam, wenn es dem Futter von Küken zugesetzt wird. Mit Mengen von 5 bis 50 g Metabolit S 14750/A pro Tonne Futter werden Infektionen wirksam bekämpft.
Ferner zeigen der Metabolit S 14750/A und seine Salze als Futtermittelzusatz, dass sie bereits in geringer Konzentration beim Wiederkäuer die Futterverwertung verbessern. Diese Wirkung wurde in vitro mit Hilfe eines künstlichen Pansens nachgewiesen. Mit dieser Methode können Substanzen auf eine Inhibierung der Methanogenese und/oder Verschiebung der Fettsäurebildung zugunsten von Propionat untersucht werden. Aus dem Pansen eines Wiederkäuers wird Pansensaft entnommen und bei 39 ° unter ständigem Durchleiten von CO2 durch
Gaze filtriert. Dieser Pansensaft wird anschliessend gemeinsam mit dem vom Tier benützten Futter, das die zu untersuchende Substanz enthält, inkubiert. Nach Beendigung der Inkubationszeit werden aus dem Gasraum 2 Proben entnommen und 5 gaschromatografisch auf Methan und Kohlendioxyd untersucht. Anschliessend wird die flüssige Phase auf ihren Fettsäuregehalt untersucht. Der Vergleich zu einer Probe ohne Substanzzusatz ergibt einen Parameter für die Wirksamkeit. Beispielsweise ergibt schon ein geringer Zusatz eines Metaboliten 10 S 14750/A eine Reduktion bis ca. 95% der Methanproduktion. Bei gleichbleibender Fermentationsrate steigt die Produktion von Propionsäure an, vor allem bei höherem Zusatz an Metabolit S 14750/A.
Der Metabolit S 14750/A und seine Salze können daher als 15 Futtermittelzusatz verwendet werden. Zweckmässigerweise weist das verabreichte Futter einen Gehalt von 1 bis 300 mg Wirkstoff pro kg Futter auf.
Der einfachste Weg zur Verabreichung des neuen Metaboliten S 14750/A und seiner Salze für veterinärmedizinische 20 Zwecke besteht darin, sie dem Futter für die Tiere beizumischen. Sie können aber auch auf anderen Wegen verabreicht werden. Beispielsweise können sie in Tabletten, Tränkmittel, Boluse oder Kapseln eingebracht und so den Tieren dosiert gegeben werden. Die Zubereitung des neuen Metaboliten 25 S 14750/A und seiner Salze in solchen Dosierungsformen kann nach Methoden erfolgen, die auf dem Gebiet der Veterinärpharmazie allgemein bekannt sind.
In den nachfolgenden Beispielen, welche die Ausführung des Verfahrens erläutern, den Umfang der Erfindung aber in 30 keiner Weise einschränken sollen, erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden.
Beispiel 1
Eine gut sporulierende Agarkultur des Stammes 35 NRRL 8077 wird mit 5 ml einer sterilen 0,90% Kochsalzlösung gewaschen, wobei eine trübe Sporensuspension erhalten wird. Einen Milliliter der Sporensuspension verwendet man zur Beimpfung eines Vorkulturmediums folgender Zusammensetzung:
40
Pharmamedia 25 g/1 1
Glucose 25 g/1 j> Medium I
und dest. Wasser ad 11 J
Mit NaOH bzw. H2SO4 auf pH 7 stellen. 45 Das Vorkulturmedium wird in einem Autoklaven bei 120 ° während 20 Minuten sterilisiert. Die Vorkultur wird unter Belüftung während 3 Tagen bei 27 ° inkubiert (Schüttelmaschine 200 U/Min.).
In Erlenmeyer von 500 ml, welche eine Nährlösung folgen-50 der Zusammensetzung enthalten,
55
60
Stärke (löslich
Glycerin
Sojabohnenmehl
Com steep liquor
Kochsalz
Calciumcarbonat und dest. Wasser
Ï 0,0 g/I 5,0 g/1 10,0 g/1 5,0 g/1 3,0 g/1 3,5 g/1 adi 1
Medium II
wird mit einer Vorkultur angeimpft. Die Nährlösung wurde vorgehend auf einen pH von 7,0 bis 7,2 gestellt und bei 120° während 20 Minuten in einem Autoklaven sterilisiert.
Die Fermentationsdauer beträgt 5 Tage unter denselben Bedingungen wie für die Vorkultur.
Die als Ausgangsmaterial verwendete Agarkultur des Stammes NRRL 8077 erhält man, indem man ein Kulturmedium folgender Zusammensetzung:
5
615 459
Glucose Malzextrakt Hefeextrakt Agar(Bacto) und dest. Wasser
4,0 g/1 10,0 g/1 4,0 g/1 20,0 g/1 adi 1
Medium III
mit einer Sporensuspension des Stammes NRRL 8077 beimpft.
Vor der Sterilisation wird das Medium auf pH 8,3-8,6 gestellt (mit NaOH), dann bei 120° sterilisiert (20 Minuten). Danach wird der pH, wenn nötig, auf 6,9-7,3 eingestellt.
10
Beispiel 2
Die Stammkultur lässt man in zwei 300 ml Erlenmeyer, enthaltend je 50 ml des Mediums III, wachsen. Man inkubiert als Standkultur bei 27 ° während 20 Tagen. Zu jeder der beiden is Erlenmeyer werden 100 ml sterile Kochsalzlösung zugefügt und die Agar-Kulturen mit einem Ultra-Turrax zu einem feinen Gemisch vermählen. Die beiden Sporensuspensionen werden dann zusammengefügt und zur Beimpfung von 501 des Mediums I in einem Stahlfermenter verwendet. Diese Vorkul- 20 tur wird 3 Tage bei 270 unter Belüftung (0,5 l/Min./pro 1 Medium) inkubiert, wobei das Medium gerührt wird (200 U/Min.). 501 der Vorkultur werden zur Beimpfung von 5001 des Mediums II in einem Stahlfermentertank verwendet. Man inkubiert während 4 Tagen bei 270 unter Belüftung (0,5 l/Min./pro 1 25 Medium) bei 0,5 Atmosphären Druck, wobei das Medium gerührt wird (130 U/Min.).
480 Liter Kulturbrühe werden zentrifugiert, wobei ca. 4001 Kulturfiltrat und ca. 80 kg Mycel anfallen. Das Kulturfiltrat wird mit 1 N Natriumhydroxidlösung auf pH 9 gestellt und 30 durch Filterhilfsmittel Celite 545 klar filtriert. Das Filtrat wird bei 20° dreimal mit jeweils 500 Liter Äthylacetat extrahiert und die Extrakte mit 100 Liter Wasser gewaschen. Nach Eindampfen der organischen Phase im Vakuum bei 20-40° fallen ca. 320 g roher Extrakt an. Das Mycel wird zuerst mit 100 Liter 35 Methanol, dann zweimal mit je 70 Liter Methanol-Wasser (9:1) während 1 Stunde bei 20-25° extrahiert, wobei die Zellen gleichzeitig mittels eines Ultra-Turrax-Geräts aufgeschlossen werden. Das Zellmaterial wird anschliessend abzentrifugiert und die Lösung durch Celite 545 klar filtriert. Nach Zugabe von 40 100 Liter Wasser zum Filtrat dampft man im Vakuum bei 20-40° auf 50 Liter Volumen ein, stellt mit 1 N Natriumhydroxidlösung auf pH 9 und extrahiert anschliessend sechsmal mit je 40 Liter Äthylacetat. Nach Waschen der organischen Phase mit 20 Liter Wasser dampft man im Vakuum bei 20-40° zur Trockene ein und erhält ca. 160 g Mycelextrakt. Die beiden Extrakte werden vereinigt und in wenig eines Gemisches Toluol-Aceton (98 :2) + 1% Triäthylamin gelöst, auf eine Säule von 20 kg Kieselgel 60 (Merck), Korngrösse 0,2-0,5 mm, 15 cm Säulendurchmesser, aufgetragen. Anschliessend wird mit Toluol-Aceton (98 :2),(95 :5),(9 : l)und(4 :1), wobei jeweils 1% Triäthylamin zugesetzt ist, in Fraktionen à 50 Liter bei einer Durchlaufgeschwindigkeit von 60 Liter pro Stunde eluiert. Die Fraktionen werden im Vakuum bei 20-40° eingedampft und der Rückstand dünnschichtchromatographisch und/oder biologisch (gegen Staphylococcus aureus) auf den Gehalt an S 14750/A geprüft. Die aktiven Fraktionen, ca. 68 g, werden vereinigt und an der40fachen Menge Kieselgel 60, Merck, Korngrösse 0,06-0,2 mm, Chromatographien. Toluol-Aceton (98 :2) + 1% Triäthylamin bis Toluol-Aceton (9 :1)+ 1% Triäthylamin eluiert zuerst vorwiegend inaktive Begleitstoffe. Mit Toluol-Aceton (4 : 1)+ 1% Triäthylamin bis Toluol-Aceton (1 :1)+ 1% Triäthylamin wird der neue Metabolit S 14750/A in stark angereicherter Form als Gemisch von Säure und Na-Salz eluiert. Zur Überführung in das reine Na-Salz löst man 40 g der obigen Fraktion in 500 ml Chloroform, schüttelt dreimal mit jeweils 250 ml 2 N wässriger NaOH-Lösung aus, wäscht die organische Phase zweimal mit je 100 ml Wasser, trocknet über Natriumsulfat und dampft im Vakuum bei 20-40° ein. Das in Form eines hellgelben Rückstandes erhaltene rohe Na-Salz wird aus der l,5fachen Menge Aceton kristallisiert, wobei der Metabolit S 14750/A in Form fast farbloser Acetonhaltiger Kristalle anfällt. Zur Entfernung des Kristallacetons wird im Vakuum mehrmals mit Benzol hochgezogen. Das so erhaltene Na-Salz stellt nach Trocknung im Hochvakuum bei 60° ein fast farbloses amorphes Pulver dar.
Zur Herstellung der Säure werden 2 g Na-Salz in 500 ml Chlorform gelöst und zweimal mit je 200 ml 2 N wässriger Salzsäure ausgeschüttelt. Nach zweimaligem Waschen der organischen Phase mit jeweils 100 ml Wasser wird die organische Phase über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum bei 20-40° eingedampft. Nach Trocknung im Hochvakuum bei 60° erhält man die Säure S 14750/A in Form eines fast farblosen amorphen Pulvers.
2 Blatt Zeichnungen
CH305675A 1975-03-11 1975-03-11 Process for the preparation of a metabolite CH615459A5 (en)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CH305675A CH615459A5 (en) 1975-03-11 1975-03-11 Process for the preparation of a metabolite
DE19762608337 DE2608337A1 (de) 1975-03-11 1976-03-01 Neue organische verbindung, ihre herstellung und verwendung
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