Die Erfindung betrifft die Gewinnung einer neuen Anhydro4-carbamoyl-5-hydroxy-1 .ribofuranosylimidazolium.Ver- bindung die sich zur Verwendung als Therapeutikum zur Unterdrückung von Immunreaktionen bei Organtransplantationen verwenden lässt.
Es sind bereits Verbindungen bekannt, die antivirale Wirkung haben, als Antimetabolit-Chemotherapeutika Verwendung finden können und/oder als Therapeutika zur Unterdrückung von Immunreaktionen bei Organtransplantationen zu dienen vermögen. Dazu gehören beispielsweise Virazol (I-P-Ribofuranosyl-l ,2,4-triazol-3-carboxamid), Pyrazomycin (3[5Ribofuranosyl4.hydroxypyrazol-5[3]-carboxamid), Cytosin-arabinosid (Iss-D-Arabino-furanosylcytosin) und Azathioprin (Imuran, 61( 1-Methyl.4.nitroimidazol-5-y -thioIpurin). Ins besondere in jüngster Zeit besteht ein wachsender Bedarf an wirksamen Immunreaktionen bei Organtransplantationen unterdrückenden Mitteln. Es wurde insbesondere Imuran häu fig bei solchen Operationen gegeben.
Die relativ hohe Toxizi tät der bekannten Mittel macht es jedoch unmöglich, sie fortlaufend zu verabreichen.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Gewinnung einer Anhydro4-carbamoyl-5-hydroxy-1 -ribo- furanosylimidazolium-Verbindung zu schaffen, die vergleichsweise geringe Toxizität hat und unbedenklich auch länger als Therapeutikum zur Unterdrückung von Immunreaktionen bei Organtransplantationen eingesetzt werden kann.
Zur Lösung dieser Aufgabe dient nach der Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung der Verbindung der Formel
EMI1.1
wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass Eupenicillium brefeldianum NRRL 5734 in einem Kulturmedium gezüchtet und daraus die Anhydro4-carbamoyl-5-hydroxy-1-ri bofuranosylimidazolium-Verbindung isoliert wird.
Es wurde überraschend gefunden, dass es sich bei der neuen vorstehend näher bezeichneten Verbindung der angegebenen Strukturformel um ein Mittel handelt, das antivirale Wirksamkeit besitzt und als Mittel zur Unterdrückung von Immunreaktionen eingesetzt werden kann, und zwar auch über längere Zeiten, ohne dass toxische Nebenwirkungen auf- treten.
Zur Gewinnung der neuen Verbindung wird in dem mikrobiologischen Verfahren der Mikroorganimus Eupenicillium brefeldianum verwendet, der erwähnt wird z. B. von A. C. Stolk, Persoonia 4, 391 (1967), und K. B. Raper A Manual of the Penicillia Seite 141(1949). Dieser Mikroorganismus ist hinterlegt in Japan beim Institute for Microbial Industry and Technology, Agency of Industrial Science & Tech nology, unter FERM-P 1104, und in den V. St A. beim United States Department of Agriculture, Northern Marketing and Nutrition Research Division unter NRRL 5734.
Das Verfahren arbeitet mit einer üblichen Züchtung des Mikroorganismus Eupenicillium brefeldianum NRRL 5734.
Dabei kann man feste oder flüssige Nährböden verwenden; für Produktionen im technischen Massstab wird bevorzugt das Submers-Verfahren benutzt, bei dem die Mikroorganismen in der gesamten Nährlösung verteilt unter Belüftung kul tiviert werden.
Als Züchtungsmedium kann ein für die Kultivierung von Mikroorganismen übliches Nährsubstrat eingesetzt werden.
Dabei können als Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff beispielsweise Glukose, Saccharose, Laktose, Maltose, Stärke, Dextrin, Melassen, Glycerin und dergleichen eingesetzt werden. Als Quelle für assimilierbaren Stickstoff können zweckmässig Kronweichwasser, Sojabohnenpulver, Baumwollsaatpulver, Weizenkleie, Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Caseinhydrolysat, Ammoniumsalz, Nitrat und dergleichen benutzt werden. Es können weiterhin, sofern erforderlich, Salze, wie beispielsweise Magnesium-, Calcium-, Kalium-, Natrium-, Zink-Eisen (II)- oder (lII)-Salze, Phosphate, Manganate, zugesetzt werden.
Die Temperatur, bei der gezüchtet wird, kann angepasst dem Wachstum der Mikroorganismen und der Produktion der neuen Verbindung, vorteilhaft zwischen 26 bis 30 C variiert werden. Die Züchtungsdauer hängt von den speziell gewählten Bedingungen ab und liegt vorzugsweise bei 40 bis 70 Stunden, und wenn die höchste Produktionsgeschwindig- keit der neuen Verbindung erreicht ist, sollte der Züchtungsvorgang zweckmässig abgebrochen werden.
Die neue Verbindung befindet sich in dem flüssigen Filtrat; der Myceliakuchen enthält diese Substanz nicht. Da die neue Verbindung eine in Wasser lösliche Substanz ist, die sich in den meisten organischen Lösungsmitteln nur schwer und speziell in mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmitteln praktisch gar nicht lösen lässt, ist es nicht möglich, dass die neue Verbindung aus dem Filtrat durch Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel isoliert wird.
Daher macht man für die Isolierung zweckmässig Gebrauch von der schwach sauren Natur der neuen Verbindung oder deren Unlöslichkeit in organischen Lösungsmitteln. Da die Verbindung eine schwache antimikrobielle Aktivität hat, lässt sie sich mittels des üblichen Plattentests unter Verwendung von Candida albicans als Testorganismus nachweisen.
Ein Beispiel für einen Isolier- und Reinigungsvorgang bei der Gewinnung der neuen Verbindung ist die folgende Arbeitsweise: Das aus der Züchtung von Eupenicillium brefeldianum NRRL 5734 (FERM-P Nr. 1104) gewonnene Filtrat wird auf pH 9,0 eingestellt und dann durch ein stark basisches Anionenaustauscherharz vom Hydroxy-Typ, beispielsweise Amberlite lRA-41 1 (Handelsbezeichnung der Firma Röhm & Haas Co., V.St.A.) hindurchgeleitet; die neue Verbindung wird daran absorbiert. Anschliessend wird mit 2 /Oiger wässriger Essigsäure eluiert und vorteilhaft wird das Eluat nochmals mit stark basischem Anionenaustauscherharz behandelt und eluiert. Das Eluat wird im Vakuum eingedampft, bis ein öliger Rückstand verbleibt.
Diesem wird Methanol und Azeton zugesetzt und der dabei anfallende feste Kuchen wird pulverisiert, wobei ein grau-weisses Pulver gewonnen wird. Man löst dieses Pulver in einer geringen Menge an Wasser und unterwirft es der Säulenchromatographie, wobei als stationäre Phase Silicagel benutzt wird. Die dabei erhaltenen violetten aktiven Fraktionen werden im Vakuum getrocknet. Das Pulver wird in Wasser gelöst, danach mit Schwefelwasserstoff-Gas gesättigt und so die Chelatkomplexe bildenden Metalle abgetrennt. Danach kann gewünschtenfalls noch weiter gereinigt und dazu die pulverförmige rohe neue Verbindung in 0,1 Mol Pyridin-Essigsäure-Pufferlösung gelöst und die Lösung durch eine Säule aus DEAE-Sephadex A-25 (Handelsbezeichnung für vernetztes Diäthylaminoäthyldextran-Gel, Produkt der Firma Pharmacia Co., Schweden) geleitet werden.
Aus dem die aktive Fraktion enthaltenden Eluat wird durch Zugabe von Methanol die neue Verbindung in Form von weissen Kristallen auskristallisiert.
Die physico-chemischen Eigenschaften der neuen Verbindung sind folgende: 1. Elementaranalyse: Gefunden: C: 41,70%, H: 5,060/0, N: 16,210/o, 0: 37,030/o 2. Molekulargewicht und Molekularformel: Gefunden: 265 (durch Titration) Theoretisch: 259,22 als CgH3N306 3. Schmelzpunkt: < 200 "C (Zersetzung, unter Braunwerden) 4. Optische Drehung: [(X]D = -35" (C = 0,8, H20) 5. Ultraviolett-Absorptionsspektrum (in H2O): Xm3x: 245 mit,E m = 250 Ämax: 279 mli, E1 cm = 580 6.
Infrarot-Absorptionsspektrum (in KBr tablettiert): Absorptionsbanden bei 3420, 3130, 2925, 2770, 1625, 1540, 1445, 1300, 1260, 1195, 1030,1100, 1080, 1055, 980, 873, 829, 770, 740, 725, 560 cm-l.
7. Farbreaktionen: Positiv: Ferrichlorid, Molisch, Kaliumpermanganat, Pauli und Ehrlich.
Negativ: Tolens, Fehling, Dragendorf, Leidon-Smith, Isatin, Sakaguchi und Ninhydrin.
8. Löslichkeit: Leicht löslich: Wasser etwas löslich: Methanol schwer löslich: Äthanol, unlöslich: übliche organische Lösungsmittel.
9. pKa: schwach sauer (pKa 6,75).
10. Färbung: weisse Kristalle 11. Stabilität: wird bei pH 2-9 bei 60 "C während 30 Minuten nicht inaktiviert.
Die chemische Struktur der neuen Verbindung wird in Übereinstimmung mit der Röntgen-Analyse in Form der oben angegebenen Formel (I) wiedergegeben. Dabei sind selbstverständlich auch sonstige theoretisch glaubwürdige Strukturen für diese Verbindung mit eingeschlossen.
Die biologischen Eigenschaften der neuen Verbindung sind die folgenden: 1. Toxizität: 1) Akute Toxizität: > 1 g/kg (i.p. Mäuse) Es wurden die länger als eine Woche überlebenden Tiere festgestellt, nachdem die Substanz intraperitoneal 4 Tage lang in einer Menge von 500 mg/kg je Tag gegeben worden war.
2) Blutuntersuchung bei kontinuierlicher Verabreichung: Die Ergebnisse der Blutuntersuchung sind in Tabelle 1 veranschaulicht. Es wurden die neue Verbindung und zu Vergleichszwecken Imuran Mäusen 8 Tage lang verabreicht.
Tabelle 1
Leucocyten- Erythrocyten- Hämoglobin
Zahl Zahl g/dl mm3 mm3
Kontroli- 5200 924 x 10 8,7 Test 7400 917 x 10 9,2 4700 821 > < x 10 10 9,4 neue Verbindung 5900 981 x 10 11,0
100 mg/kg 4900 877 x 10 10,1 je Tag 6600 793 x 10 8,8
Imuran 1900 620 x 10 7,0
100 mg/kg 1800 758 x 10 6,8 je Tag 2600 640 x 10 7,2
Aus Tabelle 1 ist zu ersehen, dass bei Imuran-Gaben die
Leucocyten-Zahl ganz erheblich abnimmt; auch die Erythro cyten-Zahl ist vermindert. Bei Gaben der neuen Verbindung sind diese Werte gegenüber der Kontrollprobe praktisch nicht verändert.
2. Antimikrobielle Aktivität:
Die neue Verbindung hat keine antibakterielle Aktivität, sie weist jedoch eine schwache Inhibitoraktivität gegen Can dida Arbicans auf.
3. Wirksamkeit zur Unterdrückung von Immunreaktio nen:
1) bei kontinuierlicher Gabe von der neuen Verbindung über
4 Tage: 4 x 108 Zellen roter Blutkörperchen (nachstehend als SRBC [shesp red blood cells] bezeichnet) wurden drei aus je 10 männlichen Mäusen des Stammes ddY bestehenden Gruppen intravenös injiziert. Danach wurde an die Mäuse aus 2 der Gruppen von der neuen Verbindung der einen Gruppe 50 mg/kg je Tag und der anderen Gruppe 100 mg/kg je Tag 4 Tage lang intraperitoneal verabreicht.
Der Hämolysin-Titer und die auf Milz Platten bildenden Zellen wurden an den 4 Tagen nach SRBC-Immunität bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 veranschaulicht.
Tabelle 2
Hämolysin-Titer Platten bildende
Zellen/Milz Kontroll-Test 40 31,4 x 104 neue Verbindung (50 mg/kg/Tag) 10 7,6 x 104 neue Verbindung (100 mg/kg/Tag) > 5 1,8 x 104
Wie in Tabelle 2 ersichtlich, lässt sich die Wirkung zur Unterdrückung von Immunreaktionen bei den mit der neuen Verbindung behandelten Tieren deutlich beobachten. Bei einer 4 Tage währenden Verabreichung von 50 mg/kg je Tag wurde bereits eine hervorragende Wirkung erzielt, und bei Gaben von 100 mg/kg je Tag wurde die Anzahl der Platten bildenden Zellen auf Milz auf eine Grössenordnung von 1/20 heruntergedrückt.
2) Wirkung einer einmaligen Gabe von der neuen Verbindung: Es wurde SRBC Mäusen intravenös injiziert. Gleichzeitig bzw. am 1., 2. und 3. Tag nach der SRBC-lnjektion wurden 200 mg/kg der neuen Verbindung interperitoneal verabreicht. Am 4. Tag wurden der Hämolysin-Titer und die Platten bildenden Zellen geprüft. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 veranschaulicht.
Tabelle 3
Kontroll- Gabe von
Test der neuen Verbindung (200 mg/kg) am
0. Tag 1. Tag 2. Tag 3. Tag Hämolysin- 40 40 40 10 20 Titer Platten bil- 31,4 31,8 33,1 11,2 18,2 dende Zellen auf Milz (X 104)
Man erkennt aus Tabelle 3, dass wenn die neue Verbindung mit oder am ersten Tag nach der SRBC-Injektion verabreicht worden war, die Immunreaktionen unterdrückende Wirkung gering ist. Die besten Ergebnisse für die Immunreaktionen unterdrückende Wirkung beobachtet man dann, wenn die neue Verbindung am zweiten Tag nach der SRBC-Injektion verabreicht wird; und auch bei Verabreichung der Verbindung am dritten Tag nach der SRBC-Injektion erkennt man noch die, allerdings etwas schwächer gewordene unterdrückende Wirkung.
3) Wirkung auf Thymus-unabhängige Antigen-Bildung: Als Ergebnis von unter Verwendung von E. coli Endotoxin durchgeführten Experimenten wurde festgestellt, dass die neue Verbindung die Thymus-unabhängige Antigenbildung nicht inhibiert.
4) Wirkungen auf sekundäre Resistenz: SRBC (4 x 108) wurden 4 Gruppen von je 10 Mäusen intraperitoneal injiziert. 21 Tage später wurden den Mäusen aus drei dieser Gruppen erneut 4 x 108 SRBC intravenös injiziert, und gleichzeitig wurden intraperitoneal 3 Tage lang einmal täglich einer Gruppe 100 mg/kg je Tag der neuen Verbindung und einer Gruppe 100 mg/kg je Tag an Imuran verabreicht.
3 Tage nach der zweiten SRBC-Injektion wurden Hämolysin Titer und Anzahl der Platten bildenden Zellen in Milz bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 veranschaulicht.
Tabelle 4
Hämo- Platten lysin- bildende
Titer Zellen/Milz Kontroll- Sekundäre 40 15,3 x 104 Test Immunität
Keine sekundäre
Immunität (nur primäre Immunität) 5 0,19 x 104 Test mit der neuen Verbindung (100 mg/kg) 5 3,1 x 104 Imuran-Test (100 mg/kg) 20 8,3 x 104
Die Ergebnisse zeigen, dass die neue Verbindung auch gegen sekundäre Resistenz wirksam ist, während Imuran nur eine sehr schwache Wirkung dafür zeigt.
Wie zuvor veranschaulicht, besitzt die neue Verbindung eine wesentlich stärkere Wirkung zur Unterdrückung von Immunreaktionen, verglichen mit Imuran, und zwar nicht nur gegen primäre Resistenz sondern auch gegen sekundäre Resistenz. Diese Tatsache zeigt den besonderen technischen Fortschritt, der mit dem erfindungsgemässen chemischen Stoff erreicht wird, insbesondere im Hinblick auf die klinische Anwendung, denn die Antigen-Stimulation geht nach erfolgter Organtransplantation ständig weiten
4. Wirkung gegen Viren-Vermehrung 1) Es wurde die Wirkung der neuen Verbindung auf die Vermehrung von Herpes simplex Virus, Polio Virus, einem Hämagglutination bewirkenden Virus aus Japan und Vaccinia Virus untersucht, und es wurden, ausgenommen gegenüber Vaccinia Virus, keine inhibierenden Wirkungen beobachtet.
Es wurden primäre Mäuseembryo-Zellen in einem die neue Verbindung enthaltendem Medium gezüchtet und nach 24 Stunden wurde mit 100 TCID (Tissue Culture Infectious Dose 500/0) an Virus beimpft. Die Prüfung wurde 72 Stunden später durchgeführt, die Ergebnisse sind in Tabelle 5 veranschaulicht.
Tabelle 5 neue
Verbindung 100 20 4 0,8 0,16 Kontroll (/ml) Test Cytopathi- -- -- - -- + +++ scher Effekt
2) Wirkung auf Influenza-Virus-lnfektion: Es wurden für diese Untersuchung HVJ (Hämagglutination bewirkender Virus aus Japan) - freie Mäuse des ddY-Stammes mit einem Gewicht von 14 bis 16 g eingesetzt. Der infizierende Virus,
Influenza A2 Kuramoto Stamm (H2N2), wird zunächst in der Allantoishöhle eines Bruteis vermehrt. Anschliessend wird
1/250 ml an Virus-Flüssigkeit je Maus unter Verwendung eines Dampf-Inhalators (µDER Allantoishöhle eines Bruteis vermehrt. Anschliessend wird
1/250 ml an Virus-Flüssigkeit je Maus unter Verwendung eines Dampf-Ivaponephrine Type nebulizer) nasal appliziert. Der Kompressor des Inhalators wird so eingestellt, dass 10 ml Virusflüssigkeit in 30 Minuten gesprüht wird.
Die neue Verbindung und Imuran werden zweimal, jeweils 3 bzw. 1 Stunde vor der Virusinfektion und zweimal, jeweils 1 bzw. 3 Stunden nach der Infektion gegeben und dann anschliessend noch 5 Tage lang zweimal täglich intraperitoneal verabreicht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 wiedergegeben.
Tabelle 6 neue Imuran Kontroll-Test
Verbindung Dosis (mg/kg) 25 5 25 5 Salzlösung Anzahl der 10 10 10 10 40 behandelten Mäuse Üeberlebende/ Behandelte 8/10 7/10 10/10 6/10 4/40
Wie zuvor veranschaulicht ist die neue Verbindung gegen experimentelle Influenza-Virus-Infektion bei Mäusen wirksam und hat im wesentlichen den gleichen Heileffekt wie Imuran. 90% der Mäuse starben am 15. Tag nach der In fektion, jedoch nur 20% in den Fällen, in denen 25 mg/kg und 30% in den Fällen, in denen 5 mg/kg verabreicht wor den waren. Die antivirale Aktivität der neuen Verbindung be ruht darauf, dass es nicht wirksam ist für die Virusvermeh rung sondern die durch Influenza-Virus verursachte cellulare
Immunität unterdrückt.
5. Antitumor-Aktivität:
Die neue Verbindung hat eine schwache Antitumoraktivität für Ehrlich-Aszites-Tumos und Leukemia L-1210 bei Mäusen.
In den folgenden Beispielen werden die erfindungsge mässe Substanz und deren Wirkung noch weiter veranschau licht.
Beispiel 1
100 ml eines aus 2% Glukose, 10% Kartoffelextrakt (ge wonnen aus 300 g Kartoffelschnitzel und 1 Liter Wasser, die
1 Stunde lang gekocht worden waren), 0,5% Baumwollsaat pulver, 0,5% KH2PO4 und 0,25% MgSO4 7H2O bestehenden
Mediums (pH 6,5) wurden in einen 500 ml Kolben gegeben und 15 Minuten lang bei 120 "C sterilisiert. Dieses Medium wurde mit Sporen von Eupenicillium brefeldianum NRRL
5734 (FERM-P Nr. 1104) beimpft und bei 26 "C und Rotation mit 300 UpM unter Schütteln gezüchtet. Nach 48 Stunden wurde das gezüchtete Medium auf 20 Liter des wie oben be schriebenen Mediums in einem 30 1 fassenden Fermentier trog übertragen und unter Rühren mit 300 UpM und Belüf ten mit 20 m/Min. bei 26 "C 49 Stunden lang kultiviert.
Das so gewonnene gezüchtete Medium wurde zu 200 1 eines zuvor sterilisierten Mediums (pH 6,5), bestehend aus 2% Glukose, 1% Pepton, 1% 0/o Kornweichflüssigkeit, 0,2%
KH2PO4, 0,1% MgSO4 - 7 H2O und 0,1% Antischaummittel in einem 300 Liter fassenden Fermentationstank aus Edelstahl gegeben und unter Rühren mit 350 UpM und Belüften mit 200 1/Min. 55 Stunden lang bei 26 "C gezüchtet.
Die Brühe wurde durch Zugabe von 500/obiger wässriger Natriumhydroxidlösung auf pH 9,0 eingestellt und filtriert, und es wurden 1701 an klarem Filtrat gewonnen.
Dieses Filtrat wurde durch eine Säule (15 cm Durchmesser) aus 20 1 Amberlite IRA-41 1 (OH-Typ) mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 300 ml/Min. geleitet, und dabei wurde das Material absorbiert; anschliessend wurde mit 50 1 Wasser gewaschen. Dann wurde mit 20/obiger wässeriger Essig säure eluiert und dabei in Fraktionen von je 5 1 Eluat aufgeteilt Durch Prüfung mit Candida albicans als Testorganismus wurden die Fraktionen Nr. 7 bis 9 als aktive Fraktionen ermittelt.
Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt, der pH-Wert wurde mit 500/obiger wässriger Natriumhydroxidlösung auf 9,6 eingestellt. dann wurde durch eine Säule (Durchmesser 7,5 cm) aus 4 1 Amberlite IRA411 (OH-Typ) geleitet, mit Wasser gewaschen, danach mit 20/obiger wässriger Essigsäure eluiert und Fraktionen aus je 500 ml aufgefangen. Es wurde festgestellt, dabs die Fraktionen Nr. 13 bis 18 die aktiven Fraktionen waren. Diese wurden zusammengegeben und im Vakuum bis auf 200 ml eines öligen Rückstandes konzentriert. Der Rückstand wurde mit 400 ml Methanol und 200 ml Azeton gut vermischt; dabei entstand eine Ausfällung, die durch 10 Minuten langes Zentrifugieren mit 3000 UpM abgeschieden wurde.
Die abgeschiedene Substanz wurde mit Azeton gewaschen und im Vakuum getrocknet, und es wurden 50 g an roher neuer Verbindung (Reinheit 10%) als grau-weisses Pulver gewonnen.
Beispiel 2
Pulver der rohen neuen Verbindung, wie es gemäss Beispiel 1 gewonnen worden war, wurde in einer geringen Menge Wasser gelöst und in einem Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol : Essigsäure : Wasser (10 : :1 : 2) suspendiert und auf eine aus 50 ml Silicagel (60 bis 80 mesh) bestehende Säule (Durchmesser 4,0 cm), die mit dem genannten Lösungsmittelgemisch beladen war, aufgegeben, und dann wurde mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch entwickelt. Das Eluat wurde in Fraktionen von je 100 ml aufgeteilt, und es wurde festgestellt, dass die Fraktionen 5 bis 7, die violette Färbung zeigten, die aktiven Fraktionen waren. Diese aktiven Fraktionen wurden zusammengegeben und im Vakuum getrocknet, und es wurden 14,3 g eines dunkel-violetten Pulvers (Reinheit 260/o) gewonnen.
Das Pulver wurde in 100 ml Wasser gelöst und mit Schwefelwasserstoffgas gesättigt, und dabei wurden die Chelatkomplexe bildenden Metalle als Sulfide abgetrennt. Das getrocknete Material wurde in 10 ml eines 0,1 Mol Pyridin-Essigsäure-Puffers (pH 6,0) gelöst und auf eine Säule aus 400 ml DEAE-Sephadex A-25 (Durchmesser der Säule 2 cm), beladen mit dem gleichen Puffer, aufgegeben.
Das Eluat wurde in Fraktionen von je 10 ml unterteilt, und es wurde gefunden, dass die Fraktionen 70 bis 135 Aktivität aufwiesen. Diese Fraktionen wurden zusammengegeben und im Vakuum zur Trockene eingedampft, und es wurden 1,8 g eines weissen Pulvers (Reinheit 90%) gewonnen. Nach Umkristallisation aus heissem Methanol konnten 1,1 g an Kristallen der neuen Verbindung (Reinheit 1000/o) gewonnen werden.
The invention relates to the production of a new anhydro4-carbamoyl-5-hydroxy-1 .ribofuranosylimidazolium.Ver- compound which can be used as a therapeutic agent for suppressing immune reactions in organ transplants.
Compounds are already known which have an antiviral effect, can be used as antimetabolite chemotherapeutic agents and / or are capable of serving as therapeutic agents for suppressing immune reactions in organ transplants. These include, for example, Virazol (IP-ribofuranosyl-l, 2,4-triazol-3-carboxamide), pyrazomycin (3 [5Ribofuranosyl4.hydroxypyrazol-5 [3] -carboxamide), cytosine arabinoside (Iss-D-arabino-furanosylcytosine) and azathioprine (Imuran, 61 (1-methyl.4.nitroimidazol-5-y-thioIpurine). In particular, recently there is a growing need for effective immune responses suppressing agents in organ transplantation. Imuran in particular has been given frequently in such operations.
However, the relatively high Toxizi ity of the known agents makes it impossible to administer them continuously.
The invention is based on the object of creating a method for obtaining an anhydro4-carbamoyl-5-hydroxy-1-ribofuranosylimidazolium compound which has comparatively low toxicity and which can safely be used for longer as a therapeutic agent for suppressing immune reactions in organ transplants .
According to the invention, a process for obtaining the compound of the formula is used to achieve this object
EMI1.1
the method being characterized in that Eupenicillium brefeldianum NRRL 5734 is grown in a culture medium and the anhydro4-carbamoyl-5-hydroxy-1-ribofuranosylimidazolium compound is isolated therefrom.
It has surprisingly been found that the new compound of the structural formula given is an agent which has antiviral activity and can be used as an agent for suppressing immune reactions, even over long periods of time, without toxic side effects - to step.
To obtain the new compound, the microorganism Eupenicillium brefeldianum is used in the microbiological process, which is mentioned e.g. B. von A. C. Stolk, Persoonia 4, 391 (1967), and K. B. Raper A Manual of the Penicillia page 141 (1949). This microorganism is deposited in Japan at the Institute for Microbial Industry and Technology, Agency of Industrial Science & Technology, under FERM-P 1104, and in the V. St A. at the United States Department of Agriculture, Northern Marketing and Nutrition Research Division under NRRL 5734.
The method works with a conventional cultivation of the microorganism Eupenicillium brefeldianum NRRL 5734.
You can use solid or liquid culture media; For productions on a technical scale, the submerged method is preferably used, in which the microorganisms are spread throughout the nutrient solution with aeration.
A nutrient substrate customary for the cultivation of microorganisms can be used as the cultivation medium.
Glucose, sucrose, lactose, maltose, starch, dextrin, molasses, glycerol and the like can be used as a source of assimilable carbon. Crown soft water, soybean powder, cottonseed powder, wheat bran, peptone, meat extract, yeast extract, casein hydrolyzate, ammonium salt, nitrate and the like can expediently be used as a source of assimilable nitrogen. If necessary, salts such as magnesium, calcium, potassium, sodium, zinc-iron (II) or (III) salts, phosphates, manganates can also be added.
The temperature at which it is grown can be varied, advantageously between 26 to 30 ° C., depending on the growth of the microorganisms and the production of the new compound. The cultivation time depends on the specially chosen conditions and is preferably 40 to 70 hours, and when the highest production speed of the new compound is reached, the cultivation process should expediently be terminated.
The new compound is in the liquid filtrate; the mycelia cake does not contain this substance. Since the new compound is a substance which is soluble in water and which is difficult to dissolve in most organic solvents and practically impossible to dissolve in water-immiscible organic solvents, it is not possible to extract the new compound from the filtrate with an organic solvent is isolated.
It is therefore advisable to use the weakly acidic nature of the new compound or its insolubility in organic solvents for isolation. Since the compound has weak antimicrobial activity, it can be detected by the usual plate test using Candida albicans as the test organism.
An example of an isolation and purification process in the production of the new compound is the following procedure: The filtrate obtained from the cultivation of Eupenicillium brefeldianum NRRL 5734 (FERM-P No. 1104) is adjusted to pH 9.0 and then by a strong hydroxyl type basic anion exchange resin, for example Amberlite IRA-41 1 (trade name of Rohm & Haas Co., V.St.A.) passed therethrough; the new compound is absorbed on it. It is then eluted with 2 / O aqueous acetic acid and the eluate is advantageously treated again with strongly basic anion exchange resin and eluted. The eluate is evaporated in vacuo until an oily residue remains.
Methanol and acetone are added to this and the resulting solid cake is pulverized, a gray-white powder being obtained. This powder is dissolved in a small amount of water and subjected to column chromatography using silica gel as the stationary phase. The violet active fractions obtained are dried in vacuo. The powder is dissolved in water, then saturated with hydrogen sulfide gas and the metals which form chelate complexes are separated off. Thereafter, if desired, further cleaning can be done and the powdery crude new compound is dissolved in 0.1 mol of pyridine-acetic acid buffer solution and the solution is passed through a column of DEAE-Sephadex A-25 (trade name for crosslinked diethylaminoethyldextran gel, product of Pharmacia Co. ., Sweden).
The new compound in the form of white crystals is crystallized from the eluate containing the active fraction by adding methanol.
The physico-chemical properties of the new compound are as follows: 1. Elemental analysis: Found: C: 41.70%, H: 5.060 / 0, N: 16.210 / o, 0: 37.030 / o 2. Molecular weight and molecular formula: Found: 265 (by titration) Theoretical: 259.22 as CgH3N306 3. Melting point: <200 "C (decomposition, turning brown) 4. Optical rotation: [(X] D = -35" (C = 0.8, H20) 5. Ultraviolet absorption spectrum (in H2O): Xm3x: 245 with, E m = 250 Ämax: 279 mli, E1 cm = 580 6.
Infrared absorption spectrum (tabletted in KBr): absorption bands at 3420, 3130, 2925, 2770, 1625, 1540, 1445, 1300, 1260, 1195, 1030, 1100, 1080, 1055, 980, 873, 829, 770, 740, 725 , 560 cm-l.
7. Color reactions: Positive: ferric chloride, Molisch, potassium permanganate, Pauli and Ehrlich.
Negative: Tolens, Fehling, Dragendorf, Leidon-Smith, Isatin, Sakaguchi and Ninhydrin.
8. Solubility: Easily soluble: slightly soluble in water: methanol poorly soluble: ethanol, insoluble: common organic solvents.
9. pKa: weakly acidic (pKa 6.75).
10. Color: white crystals 11. Stability: is not inactivated at pH 2-9 at 60 "C for 30 minutes.
The chemical structure of the new compound is shown in accordance with the X-ray analysis in the form of the above formula (I). Of course, other theoretically credible structures for this connection are also included.
The biological properties of the new compound are as follows: 1. Toxicity: 1) Acute toxicity:> 1 g / kg (ip mice) The animals surviving longer than one week were found after the substance was administered intraperitoneally for 4 days in an amount of 500 mg / kg per day was given.
2) Continuous administration blood test: The results of the blood test are shown in Table 1. The new compound and, for comparison, Imuran mice were administered for 8 days.
Table 1
Leucocyte-erythrocyte-hemoglobin
Number number g / dl mm3 mm3
Control- 5200 924 x 10 8.7 test 7400 917 x 10 9.2 4700 821> <x 10 10 9.4 new connection 5900 981 x 10 11.0
100 mg / kg 4900 877 x 10 10.1 per day 6600 793 x 10 8.8
Imuran 1900 620 x 10 7.0
100 mg / kg 1800 758 x 10 6.8 per day 2600 640 x 10 7.2
From Table 1 it can be seen that when Imuran is administered the
Leucocyte count decreases considerably; the number of erythrocytes is also reduced. When the new compound was administered, these values were practically unchanged compared to the control sample.
2. Antimicrobial activity:
The new compound has no antibacterial activity, but it has weak inhibitory activity against Can dida Arbicans.
3. Effectiveness for suppressing immune reactions:
1) with continuous administration of the new compound over
4 days: 4 × 10 8 cells of red blood cells (hereinafter referred to as SRBC [shesp red blood cells]) were intravenously injected into three groups, each consisting of 10 male mice of the strain ddY. Thereafter, the mice from 2 of the groups were intraperitoneally administered with the new compound of one group at 50 mg / kg per day and the other group with 100 mg / kg per day for 4 days.
The hemolysin titer and the cells forming on spleen plates were determined on the 4 days following SRBC immunity. The results are shown in Table 2.
Table 2
Hemolysin titer plates forming
Cells / spleen control test 40 31.4 x 104 new compound (50 mg / kg / day) 10 7.6 x 104 new compound (100 mg / kg / day)> 5 1.8 x 104
As can be seen in Table 2, the effect of suppressing immune reactions can be clearly observed in the animals treated with the new compound. With administration of 50 mg / kg per day for 4 days, an excellent effect was already achieved, and with administration of 100 mg / kg per day the number of plate-forming cells on the spleen was reduced to a magnitude of 1/20.
2) Effect of a single dose of the new compound: SRBC mice were injected intravenously. At the same time or on the 1st, 2nd and 3rd day after the SRBC injection, 200 mg / kg of the new compound were administered interperitoneally. On the 4th day, the hemolysin titer and the cells forming the plates were checked. The results are shown in Table 3.
Table 3
Control administration of
Test of the new compound (200 mg / kg) on
0th day 1st day 2nd day 3rd day Hemolysin 40 40 40 10 20 Titer plates form 31.4 31.8 33.1 11.2 18.2 cells on spleen (X 104)
It can be seen from Table 3 that when the new compound was administered with or on the first day after the SRBC injection, the immune suppressive effect is small. The best results for the immune suppressive effect are observed when the new compound is administered on the second day after the SRBC injection; and even when the compound is administered on the third day after the SRBC injection, the suppressive effect, which has become somewhat weaker, can still be seen.
3) Effect on thymus-independent antigen production: As a result of experiments using E. coli endotoxin, it was found that the new compound does not inhibit thymus-independent antigen production.
4) Effects on secondary resistance: SRBC (4 x 108) were injected intraperitoneally into 4 groups of 10 mice each. 21 days later, the mice from three of these groups were again injected 4 x 10 8 SRBC intravenously, and at the same time intraperitoneally for 3 days one group was administered 100 mg / kg per day of the new compound and one group 100 mg / kg per day of Imuran .
3 days after the second SRBC injection, the hemolysin titer and number of plate-forming cells in the spleen were determined. The results are shown in Table 4.
Table 4
Hemo- plates lysin-forming
Titer cells / spleen control secondary 40 15.3 x 104 test immunity
No secondary
Immunity (primary immunity only) 5 0.19 x 104 test with the new compound (100 mg / kg) 5 3.1 x 104 Imuran test (100 mg / kg) 20 8.3 x 104
The results show that the new compound is also effective against secondary resistance, while Imuran shows only a very weak effect on it.
As illustrated above, the new compound has a much stronger effect of suppressing immune responses compared to Imuran, not only against primary resistance but also against secondary resistance. This fact shows the particular technical progress that is achieved with the chemical substance according to the invention, in particular with regard to clinical application, because the antigen stimulation continues to widen after organ transplantation
4. Action against virus replication 1) The action of the new compound on the replication of herpes simplex virus, polio virus, a hemagglutination-causing virus from Japan and vaccinia virus was examined, and no inhibitory effects were found except for vaccinia virus observed.
Primary mouse embryo cells were cultured in a medium containing the new compound and, after 24 hours, 100 TCID (Tissue Culture Infectious Dose 500/0) were inoculated with virus. The test was performed 72 hours later, and the results are shown in Table 5.
Table 5 new
Compound 100 20 4 0.8 0.16 Control (/ ml) test Cytopathic - - - - + +++ shear effect
2) Effect on influenza virus infection: HVJ (hemagglutination causing virus from Japan) - free mice of the ddY strain weighing 14 to 16 g were used for this study. The infecting virus
Influenza A2 Kuramoto strain (H2N2) is first propagated in the allantoic cavity of a brood egg. Then
1/250 ml of virus fluid per mouse using a steam inhaler (µDER the allantoic cavity of a brood egg is increased
1/250 ml of virus fluid per mouse is applied nasally using a steam ivaponephrine type nebulizer). The compressor of the inhaler is set so that 10 ml of virus fluid is sprayed in 30 minutes.
The new compound and Imuran are given twice, in each case 3 and 1 hour before the virus infection and twice, in each case 1 and 3 hours after the infection, and then administered intraperitoneally twice a day for a further 5 days. The results are shown in Table 6.
Table 6 new Imuran control test
Compound Dose (mg / kg) 25 5 25 5 Saline Number of 10 10 10 10 40 Treated Mice Survivors / Treated 8/10 7/10 10/10 6/10 4/40
As previously illustrated, the new compound is effective against experimental influenza virus infection in mice and has essentially the same curative effect as Imuran. 90% of the mice died on the 15th day after the infection, but only 20% in the cases in which 25 mg / kg and 30% in the cases in which 5 mg / kg were administered. The antiviral activity of the new compound is based on the fact that it is not effective for virus replication but for cellular growth caused by the influenza virus
Suppressed immunity.
5. Antitumor activity:
The new compound has weak antitumor activity for Ehrlich ascites tumors and leukemia L-1210 in mice.
In the following examples, the substance according to the invention and its effect are illustrated even further.
example 1
100 ml of one made from 2% glucose, 10% potato extract (obtained from 300 g of potato pulp and 1 liter of water, the
1 hour), 0.5% cottonseed powder, 0.5% KH2PO4 and 0.25% MgSO4 7H2O
Medium (pH 6.5) were placed in a 500 ml flask and sterilized for 15 minutes at 120 ° C. This medium was mixed with spores of Eupenicillium brefeldianum NRRL
5734 (FERM-P No. 1104) and cultured at 26 "C and rotation at 300 rpm with shaking. After 48 hours, the cultured medium was transferred to 20 liters of the medium described above in a 30 l fermenter trough and under Stirring at 300 rpm and aeration at 20 m / min., Cultivated at 26 ° C. for 49 hours.
The cultivated medium obtained in this way became 200 l of a previously sterilized medium (pH 6.5), consisting of 2% glucose, 1% peptone, 1% 0 / o grain soft liquid, 0.2%
KH2PO4, 0.1% MgSO4 - 7 H2O and 0.1% antifoam agent are placed in a 300 liter fermentation tank made of stainless steel and stirred at 350 rpm and aeration at 200 rpm. Grown at 26 "C for 55 hours.
The broth was adjusted to pH 9.0 by the addition of 500% aqueous sodium hydroxide solution and filtered, and 1701 of clear filtrate were obtained.
This filtrate was passed through a column (15 cm in diameter) of 20 1 of Amberlite IRA-41 1 (OH type) at a flow rate of 300 ml / min. passed and the material was absorbed; it was then washed with 50 l of water. Then it was eluted with 20% aqueous acetic acid and divided into fractions of 5 1 each. Fractions 7 to 9 were determined as active fractions by testing with Candida albicans as the test organism.
The active fractions were collected, the pH was adjusted to 9.6 with 500 / above aqueous sodium hydroxide solution. it was then passed through a column (diameter 7.5 cm) of 4 1 Amberlite IRA411 (OH type), washed with water, then eluted with 20% aqueous acetic acid and fractions of 500 ml each were collected. It was found that fraction Nos. 13 to 18 were the active fractions. These were combined and concentrated in vacuo to 200 ml of an oily residue. The residue was mixed well with 400 ml of methanol and 200 ml of acetone; this produced a precipitate which was separated out by centrifugation at 3000 rpm for 10 minutes.
The deposited substance was washed with acetone and dried in vacuo, and 50 g of crude new compound (purity 10%) were obtained as a gray-white powder.
Example 2
Powder of the crude new compound, as obtained according to Example 1, was dissolved in a small amount of water and suspended in a mixed solvent of n-butanol: acetic acid: water (10:: 1: 2) and placed on a 50 ml silica gel (60 to 80 mesh) existing column (diameter 4.0 cm) loaded with the above mixed solvent was applied, and then developed with the same mixed solvent. The eluate was divided into fractions of 100 ml each, and it was found that fractions 5 to 7 which showed purple color were the active fractions. These active fractions were pooled and dried in vacuo, and 14.3 g of a dark purple powder (purity 260 / o) were recovered.
The powder was dissolved in 100 ml of water and saturated with hydrogen sulfide gas, thereby separating the chelating complex metals as sulfides. The dried material was dissolved in 10 ml of a 0.1 mol pyridine-acetic acid buffer (pH 6.0) and applied to a column of 400 ml DEAE-Sephadex A-25 (column diameter 2 cm), loaded with the same buffer , given up.
The eluate was divided into fractions of 10 ml each, and the fractions 70 to 135 were found to have activity. These fractions were combined and evaporated to dryness in vacuo, and 1.8 g of a white powder (purity 90%) were obtained. After recrystallization from hot methanol, 1.1 g of crystals of the new compound (purity 1000 / o) could be obtained.