Procédé de préparation de dérivés de l'insuline
 La présente invention a pour objet un procédé de préparation de nouveaux dérivés de l'insuline; c'est-à-dire la   kprolylinsuline,    la di-L-prolylinsuline, la glycylinsuline, la diglycylinsuline et leurs dérivés prolyl- et glycyl- N-protégés.



   On a trouvé que ces nouveaux dérivés ont une durée d'activité plus longue que celle de l'insuline. La cause de ce prolongement de la durée n'est pas tout à fait compris, bien qu'on ait postulé qu'il résulterait d'une plus grande résistance des groupes proline et glycine au clivage par les diverses enzymes, telles que l'aminopeptidase, présentes dans le corps, dont l'effet a pour résultat la digestion plus ou moins rapide des formes d'insuline actuellement disponibles. Cette digestion nécessite des injections assez fréquentes, afin de maintenir le taux d'insuline requis chez les patients diabétiques pour combattre l'hyperglycémie associée à cette maladie.



   On met ainsi à disposition un composé qui limite la nécessité d'injections si fréquentes et ainsi simplifie beaucoup le traitement de la maladie. L'importance de la diminution du nombre des injections nécessaires est évidente et bien reconnue dans le métier. A part les aspects purement pratiques, le danger moindre d'infection dû aux injections fréquentes, administrées habituellement par le patient lui-même, diminue clairement les risques inhérents à un traitement de ce genre. Donc, I'obtention d'une forme d'insuline ayant l'activité prolongée décrite a été l'objet de nombreuses recherches depuis plus de trente ans.



   Parmi les insulines appropriées d'origine animale qu'on peut utiliser comme matières de départ pour la préparation des produits par le procédé selon la présente invention, on peut citer les insulines obtenues à partir du pancréas du porc, du bétail, des baleines, des poissons, etc. On préfère particulièrement l'insuline provenant du pancréas des porcs, communément appelée insuline de porc.



   On prépare ces insulines prolyl- et glycyl-substituées par l'acylation des insulines de ce genre avec des esters actifs de L-proline
N-protégée et de glycine N-protégée tels que le p-nitrophénylester de   tert.-butyloxycarbonyl-L-proline,    ou le p-nitrophénylester de tert.-butyloxycarbonyl-N-glycine. Si on le désire, on peut utiliser d'autres esters actifs de tert.-butyloxycarbonyl-L-proline ou Nglycine, tels que des N-hydroxysuccinylesters, des phénylesters et des phénylesters substitués, par exemple tels que des phénylesters substitués négativement, par exemple des thiophénylesters, des nitrophénylesters, des dinitrophénylesters, des nitrophényl-thio-esters, des cyanophénylesters, des phénylesters halogénés, etc., pour le stade d'acylation.

  Le procédé d'acylation ci-dessus a pour résultat la formation de dérivés de prolyl- ou de glycyl-insuline protégés, les dérivés particuliers dépendent, comme on le verra d'après les exemples, des quantités relatives des réactifs utilisées.



   On peut enlever le groupe protecteur, par exemple le groupe   tert.-butyloxycarbonyle,    pour obtenir le produit final qui est une insuline prolyl- ou glycyl-substituée. De préférence, on enlève le groupe protecteur par un traitement avec l'aide   trifluoro-acétique,    bien qu'on puisse utiliser tout procédé connu dans le métier, par exemple un traitement avec un hydracide (tel que l'acide bromhydrique ou chlorhydrique) dans l'acide acétique, ou d'autres   traite-    ments acides connus.



   Au lieu d'administrer tels quels les produits du procédé selon la présente invention pour le traitement des diabétiques, on peut les utiliser pour la préparation de complexes afin de prolonger encore plus le temps d'action de ces dérivés de prolylinsuline. Ainsi, on peut faire réagir les insulines prolyl- ou glycyl-substituées obtenues par le procédé selon la présente invention avec un sel de zinc, par exemple le chlorure de zinc, de préférence en présence d'un agent tampon tel qu'un acide organique (par exemple l'acide acétique, succinique ou citrique) ou un hydroxyde de métal alcalin, obtenant ainsi une zinc-prolyl- ou glycylinsuline; ou avec un sel de zinc comme ci-dessus plus une protéine alcaline telle que la protamine, I'histone ou la globine, obtenant ainsi des histone- et globin-prolyl ou -glycyl-zinc-insulines.

  La préparation de complexes et de compositions de ce genre est bien connue dans le métier.



   Pour la préparation de compositions, comprenant la prolylou glycylinsuline, acceptables par voie parentérale, on peut utiliser toute méthode parmi celles qui sont bien connues pour la préparation de compositions contenant l'insuline. On peut par exemple dissoudre la prolyl- ou glycylinsuline dans de l'eau stérile à un pH d'environ 2 à environ 4 (de préférence d'environ 2,5 à environ 3,5. La concentration en prolyl- ou glycylinsuline doit être telle qu'on obtient une solution contenant d'environ 40 unités à   envi-    ron 500 unités de prolyl- ou de glycylinsuline par ml de solution finale. Avantageusement, on ajoute un agent de conservation, tel  que le phénol- ou le m-crésol à la solution. de préférence à une concentration d'environ   0,059/o    à environ   0.5 'o    en poids.

  On peut aussi inclure un agent qui rend la solution isotonique, tel que la glycérine, de préférence à une concentration d'environ   0.15%    en poids.



   Pour l'utilisation, habituellement on administre des compositions contenant lesdites insulines par voie sous-cutanée, à des diabétiques en une dose d'environ 0,25   ml    à environ 2   ml    (de préférence environ 1   ml),    ce qui fournit une dose d'environ 20 unités à 1000 unités (de préférence d'environ 250 unités) de prolylinsuline.



  Il est bien entendu que pour le traitement du diabète il n'y a pas de dose  standard  et que dans tout les cas la dose particulière doit être calculée individuellement suivant les besoins de la personne soignée.



   Les exemples suivants illustrent l'invention.



   Exemple 1
La   tert.-blttyloxyrarbonyl-L-prolylinsuline      I t-Boc.-L-prolylinsllline)   
 On dissout   1,2    g (200 moles) d'insuline de porc, provenant de  Novo Industrie   AIS ,    dans 20 ml d'un mélange 1:1 de pyridine et d'eau, et on ajoute une solution de p-nitrophénylester de tert.butyloxycarbonyl-L-proline dans la pyridine (0,2 g, 600 moles/2   ml).    On agite le mélange réactionnel à la température ordinaire à un pH constant (8,5) avec un réglage  pH stat .



  Le mélange réactionnel consomme 2,5 équivalents de base (NaOH 0.25 N) au cours de 2 heures. on arrête alors l'addition.



  On amène le pH du mélange à pH = 5,5 avec 2   ml    d'acide chlorhydrique 6 N et le concentre à sec sous vide à la température ordinaire. On dissout le résidu, qui est une huile, dans 20 ml d'eau, on ajuste le pH à 5,5 et de nouveau concentre à sec sous vide. On me le résidu en suspension dans 50   ml    d'éthanol et décante le liquide surnageant colloïdal du solide. On met le solide en suspension dans 50   ml    d'acétate d'éthyle puis le filtre et le lave avec de l'acétate d'éthyle et le sèche dans un dessiccateur. Le produit, c'est-àdire 1,0 g de solide, est soluble dans une solution diluée de bicarbonate. On hydrolyse un échantillon de cette matière dans de l'acide chlorhydrique 6 N exempt d'ammoniac et mesure quantitativement les amino-acides de l'hydrolysat. Le tableau ci-dessous indique les résultats.



  La   L-prolylinsltline   
 On met en suspension 500 mg de la préparation ci-dessus (t
Boc-L-prolylinsuline) dans 4   ml    d'acide trifluoro-acétique et laisse reposer pendant 20 minutes à la température ordinaire; pendant ce temps la dissolution a lieu. On dilue la solution avec 50 ml d'éther anhydre et traite le précipité insoluble avec deux portions de 50   ml    d'éther anhydre et la filtre. On dissout le solide dans 10   ml    d'eau et le filtre pour enlever la matière insoluble éventuelle. On amène le pH du filtrat de pH = 2 à pH = 5,5 avec de la diéthylamine et laisse reposer à   5 C    pendant une nuit.

  On sépare le précipité par centrifugation et le lave successivement avec 10   ml    d'eau et deux portions de 10   ml    d'éthanol et finalement avec 50   ml    d'acétate d'éthyle, puis le sépare par filtration et le sèche sous vide à la température ordinaire. On obtient 380 mg de produit qui est soluble dans l'acide chlorhydrique 0,01 N et dans une solution de bicarbonate. On analyse quantitativement les amino-acides dans un échantillon hydrolysé dans de l'acide chlorhydrique 6 N exempt d'ammoniac; le tableau ci-dessous indique les résultats.



   Exemple 2
La   di- (      Ferr.-butyloxyearbonyl-L-prolyl)insuline   
 On dissout 1,2 g (200 moles) d'insuline de porc provenant de  Novo Industrie AIS  dans 20   ml    d'un mélange 1:1 de pyridine et d'eau, ajuste le pH à 8,5 avec une solution d'hydroxyde de sodium 0,25 N. puis ajoute une solution de p-nitrophénylester de   tert.-butyloxycarbonyl-L-proline    dans la pyridine (0,4 g, 1,1 moles). On agite le mélange à la température ordinaire et
 maintient le pH à 8.5 par réglage  pH stat . On laisse la réaction
 se poursuivre pendant 5 heures. et pendant ce temps on reprend
 six équivalents de base. On ajuste le pH du mélange réactionnel à
 5,5 avec 2,5   ml    d'acide chlorhydrique 6 N. puis le concentre sous
 vide à la température ordinaire.

  On lave le résidu avec 10   ml    d'eau
 et sépare par filtration la matière insoluble. On la met de nouveau
 en suspension dans 10 ml d'eau et la filtre. On met le produit inso
 luble en suspension dans 50   ml    d'éthanol où la matière forme d'a
 bord des masses compactes gommeuses qui se solidifient lentement sous un liquide surnageant colloïdal. On décante le liquide surnageant et met le résidu solide en suspension dans 50   ml    d'acétate d'éthyle et le filtre et finalement le lave avec ce solvant.   Aprés    séchage dans un dessiccateur à vide. le produit pèse 828 mg. On obtient 75 mg additionnels à partir du liquide surnageant alcoolique. Le produit se dissout lentement dans de l'acide chlorhydrique 0.01 N et facilement dans du bicarbonate dilué.

  Une analyse quantitative des amino-acides de l'hydrolysat d'un échantillon de ce produit donne les résultats indiqués dans le tableau ci-dessous.



  La   di-L-prolylinsldine   
 On met en suspension 500 mg de la di-prolylinsuline protégée ci-dessus dans 4   ml    d'acide trifluoroacétique anhydre pendant
 20 minutes; la dissolution a lieu pendant ce temps. On dilue la solution avec 50   ml    d'éther anhydre et traite le précipité qui s'est formé deux fois avec 50 ml d'éther anhydre. On sépare le solide par filtration et le dissout dans 10   ml    d'eau.

  On filtre la solution pour séparer la matière non dissoute éventuelle. puis traite le filtrat avec de la triéthylamine pour élever le pH de la solution jus   qu'à      55.    Après l'avoir laissé reposer pendant une nuit à   52 C,    on sépare le précipité par centrifugation et le lave successivement avec une portion de 10   ml    d'eau. deux portions de 10   ml    d'éthanol et finalement avec une portion de 50 ml d'acétate d'éthyle, puis le filtre et le sèche dans un dessiccateur à vide. On obtient 400 mg de produit qui est soluble dans l'acide chlorhydrique 0.01 N et dans une solution diluée de bicarbonate.

  On soumet l'hydrolysat d'un échantillon, traité avec de l'acide chlorhydrique 6 N exempt d'ammoniac pendant 16 heures à la température de reflux, à une analyse quantitative des amino-acides; le tableau ci-dessous indique les résultats obtenus.



   Exemple 3
 La tert   ert.-butyloryearbonylglycylinslxline        t-Boc-glycyl-insuline )   
 On dissout 1,2 g (200 moles) d'insuline de porc provenant de  Novo Industrie AiS  dans 20   ml    d'un mélange de parties égales de pyridine et d'eau, et on ajoute à cette solution 180 mg (600 moles) de p-nitrophénylester de tert.-butyloxycarbonyl-N
 glycine dans 2 ml de pyridine. On agite le mélange réactionnel à la température ordinaire à un pH constant de 8,5 jusqu'à ce qu'il ne soit plus nécessaire d'ajouter de base (NaOH 0,25   N)    pour maintenir ce pH. On ajuste alors le pH du mélange réactionnel à 5,5 avec de l'acide chlorhydrique 6 N et le concentre à sec sous vide à la température ordinaire.

  On dissout le résidu, qui est une huile, dans 20   ml    d'eau, et ajuste le pH de la solution obtenue à 5,5 et de nouveau la concentre à sec sous vide à la température ordinaire.

 

  On met le résidu en suspension dans 50 ml d'acétate d'éthanol puis abandonne le liquide surnageant colloïdal. Ensuite on met en suspension le liquide résiduel dans 50   ml    d'acétate d'éthyle puis le filtre et le lave avec de l'acétate d'éthyle et le sèche dans un dessiccateur. Le produit est soluble dans une solution diluée de bicarbonate et il peut former des sels solubles avec d'autres cations, par addition avec précaution à un pH d'environ 7.



  La   glycylinsrdine   
 On met en suspension la préparation ci-dessus, c'est-à-dire la  t-Boc-glycylinsuline  dans de l'acide trifluoro-acètique anhydre à raison de 1   gui 10      mi jusqu'à    ce que la dissolution ait lieu et laisse reposer pendant environ 20 minutes. On dilue la solution avec 100   ml     
 Tableau
 Composition de dérivés d'insuline et d'amino-acide
   t-Boc-L-Prolyl-    L-Prolyl- di-t-Boc-L-Prolyl- di-L-Prolyl
 Insuline insuline insuline insuline insuline
 Amino-acide (porc) (Ex. 1) (Ex. 2) (Ex. 3) (Ex. 4)   Acide aspartique . . . . . 3 3 3 3 3   
Thréonine   - . . .    2 2 2 2 2
Sérine . 3 3 3 3 3
Acide glutamique . . 7 7 7 7 7   Proline t . . . . . . . . 1 2 2 3 3   
Glycine . . . . .

  . 4 4 4 4 4
Alanine . . . . . . 2 2 2 2 2
Cystine . . . . . . 3 3 3 3 3
Valine . . . . . . 4 4 4 4 4
Isoleucine . . . . . . . . 2 2 2 2 2
Leucine . . . . . . . . 4 6 6 6 6
Tyrosine . . . . . . . . 4 4 4 4 4   Phénylalanine . . . . . . . 3 3 3 3 3   
Histidine . . . . . . . . 2 2 2 2 2   
Lysine . . . . . . . . . 1 1 1 1 1
Arginine .. . 1 1 1 1 1   
Ammoniac . . . . . . . 6 6 6 6 6    t-Boc = tert.-butyloxycarbonyle.   



  d'éther anhydre et triture le précipité successivement avec deux portions de 100 ml d'éther anhydre, puis le filtre. On dissout le solide dans 25 ml d'eau et le centrifuge pour séparer la matière non dissoute éventuelle. On décante le liquide surnageant et ajuste le pH à 5,5 avec de la triéthylamine et laisse reposer pendant une nuit à   5" C.    On centrifuge le solide qui se sépare et le lave successivement avec 10 ml d'eau et deux portions de 10 ml d'éthanol et finalement avec de l'acétate d'éthyle, le filtre et le sèche dans un dessiccateur à vide à la température ordinaire. Le produit est soluble dans l'acide chlorhydrique 0,01 N et une solution de bicarbonate.



   Exemple 4
La di-   (tert .-butyloxyearbonylglycyl)    insuline
 On dissout 1,2 g (200 moles) d'insuline de porc provenant de  Novo Industrie A/S  dans 20   ml    d'un mélange 1:1 de pyridine et d'eau et ajuste le pH à 8,5 avec une solution d'hydroxyde de sodium 0,25 N. Pendant qu'on maintient ce pH, avec un réglage  pH stat , en utilisant de l'hydroxyde de sodium 0,25 N, on ajoute une solution pyridinique de 1200 moles de   p-nitrophényles-    ter de tert.-butyloxycarbonylglycine (360 mg/2   ml)    et maintient le pH du mélange à 8,5 jusqu'à ce qu'il ne soit plus nécessaire d'ajouter de la base. La réaction est terminée après 5 heures; pendant ce temps six équivalents de base sont consommés.

  On ajuste le pH du mélange réactionnel à 5,5 avec de l'acide chlorhydrique 6 N et le concentre sous vide à la température ordinaire. On lave alors le résidu deux fois avec 10 ml d'eau et le filtre. On met en suspension le produit insoluble dans 50   ml    d'éthanol et sépare par   déc5nta-    tion la matière solide qui se forme lentement, du liquide surnageant colloïdal. On met le solide en suspension dans 50   ml    d'acétate d'éthyle, le filtre et finalement le lave avec ce solvant. On sèche le produit dans un dessiccateur à vide. Le produit se dissout volontiers dans le bicarbonate et se dissout lentement dans l'acide chlorhydrique 0,01 N.



  La diglycylinsuline
 Pour la préparation de la diglycylinsuline, on dissout la di-(t
Boc-glycyl)insuline décrite dans l'exemple 7 ci-dessus dans l'acide trifluoro-acétique anhydre, à raison de 1 g/10 ml, et laisse reposer pendant environ 20 minutes en solution à la température ordinaire. On dilue alors la solution avec 100   ml    d'éther anhydre et triture le précipité deux fois avec 100 ml d'éther anhydre. On sépare le solide par filtration et le dissout dans 20   ml    d'eau. On sépare par filtration ou centrifugation la matière non dissoute éventuelle et ajuste le pH de la solution limpide à 5,5 avec de la triéthylamine.

  Après avoir laissé reposer pendant une nuit à   5    C, on sépare par centrifugation le solide qui se sépare, et le lave successivement avec 10   ml    d'eau, deux fois 10   ml    d'éthanol et finalement 50   ml    d'acétate d'éthyle, puis le filtre et le sèche dans un dessiccateur à vide. Le produit est soluble dans l'acide chlorhydrique 0,01 N et dans une solution diluée de bicarbonate.



   Exemple 5
A. La   zinc-L-prolylinsuline    de porc cristalline
 On met en suspension 250 mg de L-prolylinsuline, préparée par le procédé de l'exemple 1, dans 12,5   ml    d'eau et la dissout en ajustant le pH à 2,3 par l'addition d'acide chlorhydrique 1 N. On ajoute 1 g de chlorure de sodium et un agent favorisant la filtration ( Hyflo , marque déposée) à la solution. On filtre le précipité qui se forme et le lave avec une solution de chlorure de sodium à 8%. On dissout le précipité dans 25 ml d'eau distillée et ajuste le pH à 7,0 avec de l'hydroxyde de sodium 1 N. On ajoute de l'acétone jusqu'à une concentration finale de   250i0.    On filtre la solution pour enlever une petite quantité d'impuretés, en utilisant  Hyflo  pour faciliter la filtration.

  On ajoute 1,2   ml    de tampon au citrate ayant un pH = 5,4 (préparé à partir de 5 g d'acide citrique dans 10 ml d'eau et 2,5 g d'hydroxyde de sodium dans 5 ml d'eau, dilué  jusqu'à 30 ml avec de l'eau. Finalement on ajoute à la solution filtrée 0,25 ml de solution de chlorure de zinc à   20%    et ajuste le à 6. On racle les parois du ballon et garde le mélange à la température ordinaire jusqu'à ce qu'une partie importante de l'insuline modifiée apparaisse sous forme cristalline. Après quelques jours à 5 C dans un réfrigérateur, la cristallisation est complète. On filtre alors les cristaux de zinc-L-prolylinsuline et les lave avec de l'acétone diluée, finalement avec de l'acétone et les sèche à l'air.



  B. La   zinc-elyeylinsl(line   
 On procède comme   cidessus,    mais en substituant une quantité équivalente de glycylinsuline, préparée par le procédé de l'exemple 3, à la L-prolylinsuline, et   l'on    obtient la zinc-glycylinsuline cristalline.



   Exemple 6
La   proremzine-:inc-L-prolylinsllline   
 Pour la préparation de 500 litres de solution de protamine   zinc-l-prolylinsuIine,    on procède selon l'une des méthodes suivantes:
 On introduit 450 kg d'eau pour injections dans une cuve. On ajoute 8000 g de glycérine. 500   ml    de phénol redistillé (100%) et 500 ml de solution d'acide chlorhydrique I N. On ajoute alors 850 ml de solution de chlorure de zinc (200 mg de zinc par ml) et mélange bien la solution. On ajoute 3400 g de zinc-prolylinsuline et 1000 g de sulfate de protamine et agite le mélange obtenu. On ajoute suffisamment d'acide chlorhydrique 1 N pour obtenir un pH de 2,9-3,0 et dissoudre les solides.

  On ajoute alors suffisamment d'eau pour injections pour que le volume final de la solution soit de 500 litres et stérilise la solution par filtration sous pression et récolte la protamine-zinc-L-prolylinsuline dans des flacons de 20 litres pour l'opération de remplissage.



   b) On introduit 200 litres d'eau pour injections dans une cuve; on ajoute 4000 g de glycérine, 375 g de méta-crésol fraichement distillé, 162,5   ml    de phénol redistillé (100%) et 250   ml    d'acide chlorhydrique I N et mélange la solution obtenue. On ajoute 30   ml    de solution de chlorure de zinc (200 mg de zinc par ml) et mélange à fond le mélange obtenu. On ajoute 1700 g de zinc-Lprolylinsuline et 168 g de sulfate de protamine et agite le mélange
 obtenu. On ajoute suffisamment d'acide chlorhydrique 1 N pour
 amener le pH à 2,7-3,0 et pour dissoudre tous les solides. On ajoute alors suffisamment d'eau pour injections pour que la solution pèse 245 kg et ajuste le pH à 2,7-3,0 avec de l'acide chlorhydrique 1 N.

  On ajoute alors suffisamment d'eau pour injections
 pour que le volume de la solution finale soit de 250 litres et mé
 lange la solution à fond. On stérilise la solution par filtration sous pression.



      REVENDICATION I   
 Procédé de préparation d'un polypeptide choisi parmi la L
 prolylinsuline, la di-L-prolylinsuline, la glycylinsuline. la diglycylinsuline et leurs dérivés prolyl- et glycyl- N-protégés, caractérisé en ce qu'on acyle l'insuline avec un ester actif de L-proline N-pro   tégée    ou de glycine N-protégée.



   SOUS-REVENDICATIONS
 1. Procédé selon la revendication 1. caractérisé en ce qu'on acyle l'insuline avec un ester actif de tert.-butyloxycarbonyl-Lproline pour obtenir la   ten.-butyloxycarbonyl-N-prolylinsuline    ou la   di (tert .-butyloxycarbonyl-L-prolylinsuline.   



   2. Procédé selon la revendication   1.    caractérisé en ce qu'on acyle l'insuline avec un ester actif de   ten.-butyloxycarbonylglycine    pour obtenir la tert.-butyloxycarbonylglycylinsuline ou la di(tert.butyloxycarbonylglycyl)insuline.



   3. Procédé selon la sous-revendication 1. caractérisé en ce qu'on traite la tert.-butyloxycarbonyl-L-prolylinsuline avec un acide pour obtenir la L-prolylinsuline.



   4. Procédé selon la sous-revendication 1, caractérisé en ce qu'on traite la di(tert.-butyloxycarbonyl-L-prolyl)insuline avec un acide pour obtenir la di-L-prolylinsuline.



   5. Procédé selon la sous-revendication 2. caractérisé en ce qu'on traite la tert.-butyloxycarbonylglycylinsuline avec un acide pour obtenir la glycylinsuline.



   6. Procédé selon la sous-revendication 2. caractérisé en ce qu'on traite la   di(tert.-butyloxycarbonyl)glycylinsuline    avec un acide pour obtenir la diglycylinsuline.



   7. Procédé selon la revendication   1.    caractérisé en ce que   l'on    traite l'insuline prolyl- ou glycyl-substituée avec un sel de zinc pour obtenir la zinc-L-prolyl- ou zinc-glycylinsuline.

 

   REVENDICATION   II   
 Utilisation des polypeptides obtenus conformément au procédé selon la revendication I ou selon la revendication I et la sous-revendication 7. pour la préparation de complexes de ces   polype    tides avec une protéine alcaline.



   SOUS-REVENDICATIONS
 8. Utilisation selon la revendication   II.    caractérisée en ce qu'on traite l'insuline prolyl- ou glycyl-substituée avec une protéine alcaline.



   9. Utilisation selon la revendication   II,    caractérisée en ce qu'on traite la   zinc-L-prolyl-    ou la zinc-glycyl-insuline avec une protéine alcaline.

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