Verfahren zur Gewinnung von 6-1Vlethyl-C8,9-ergolen-8-carbonsäure Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von 6-Methyl-A8,9-ergolen-8-carbon- säure der Formel I.
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Erfindungsgemäss erhält man die Verbindung der Formel I durch Züchtung des in vitro der Konidienbil- dung fähigen Pilzstammes NRRL 3080 des Species Claviceps paspali Stevens et Hall in saprophytischer Kultur und anschliessende Isolierung der 6-Methyl- ,/,8@9-ergolen-8-carbonsäure aus dem Kulturfiltrat.
Es ist bekannt, dass verschiedene Stämme des Pil zes Claviceps paspali Stevens et Hall unter geeigneten Kulturbedingungen alkaloidartige Verbindungen zu bil den vermögen, doch handelt es sich hierbei immer um Derivate der Lysergsäure, einer bereits lang bekannten heterocyclischen Carbonsäure, die u. a. einen Bestand teil der natürlichen Mutterkorn-Alkaloide bildet.
Es war daher überraschend, dass es nun gelungen ist, durch Züchtung eines neuen Stammes der Species Claviceps paspali Stevens et Hall eine Carbonsäure mit einer Struktur zu erhalten, wie sie bisher weder in der Natur gefunden wurde noch auch synthetisch oder halbsynthetisch dargestellt wurde.
Dieser Stamm, der aus Sclerotien, die auf dem Grase Paspalum dilatatum in Portugal gewachsen waren, gewonnen werden konnte und von dem Proben beim United States Department of Agriculture (Nort- hern Utitisation Research and Development Division), Peoria/Ill., unter der Nummer NRRL 3080 deponiert wurden, ist im Gegensatz zu allen bisher bekannten Stäm men,
der Species Claviceps paspali Stevens et Hall fähig, die 6-Methyl-Q8,9-er,olen-8-carbonsäure in saprophytischer Kultur als Hauptprodukt zu bilden.
Dieser Stamm der Species Claviceps paspali Ste- vens et Hall ist ferner, dies ebenfalls im Gegensatz zu allen anderen bisher beschriebenen Stämmen dieser Pilzart (siehe z. B. Proc. Roy. Soc. Serials B., 155, 33), in vitro der Konidienbildung fähig. Die Fähigkeit eines Pilzes Konidien zu bilden, ist nämlich für die Ausführung von mikrobiologischen Verfahren in tech nischem Masstab von grosser Bedeutung.
So ist es mit Hilfe von Konidien möglich, Einspor- isolierungen durchzuführen und dadurch zu genetisch einheitlichem Material zu gelangen. Auch lassen sich aus Konidien durch Röntgen- und UV-Bestrahlung, sowie mit Chemikalien sehr viel leichter Mutanten er zeugen und isolieren als aus sterilem Mycel. Ferner können mit Konidien blühende Paspalumpflanzen infi ziert und auf diese Weise auf dem natürlichen Wirt Sclerotien erzeugt werden, welche sich zur Konservie rung des Stammes ausgezeichnet eignen.
Man kann beispielsweise aus diesem haltbaren Material jederzeit frischen Impfstoff gewinnen, wenn die in-vitro-Kultu- ren nach wiederholten Passagen degenerieren. Koni- dien können auch lyophilisiert bzw. nach Gefriertrock nung unbegrenzt gelagert werden, was ebenfalls die Konservierung eines Stammes ermöglicht. Schliesslich aber eignet sich für die Beimpfung einer Nährlösung eine Konidiensuspension am besten, weil die Impf menge am geeignetsten dosiert werden kann und weil sich damit am leichtesten steril arbeiten lässt.
(Ein ste riles Mycel hingegen muss am Anfang in einem Mixer homogenisiert werden).
Aus der erfindungsgemäss gewonnenen 6-Methyl- Q8=9-ergolen-8-carbonsäure kann auf halbsyntheti schem Wege eine Reihe neuer Derivate mit wertvollen pharmakologischen Eigenschaften gewonnen werden. Ausserdem kann man durch ein bestimmtes Ver fahren, das ebenfalls einen Teil der vorliegenden Erfin dung bildet, die 6=Methyl-A1,1-ergolen-8-carbonsäure auf sehr einfache Weise und mit guter Ausbeute in Lysergsäu.re überführen, die als Zwischenprodukt zur Herstellung wertvoller Heilmittel, so z.
B. der klinisch viel verwendeten Oxytocica Ergobasin und Methyler- gobasin und des bisher stärksten Serotoninantagoni- sten, des 1-Methyl-d lysergsäure-(+)-butanolamids-(2'), von grösster Bedeutung ist.
Die Isolierung und Vermehrung des neuen Stammes vom Claviceps paspali Stevens et Hall NRRL 3080 kann z. B. auf folgende Weise geschehen: Aus dem Innern eines Sclerotiums wird ein kleines Gewebestück steril entnommen und auf Bierwürzeagar übertragen.
[Zusammensetzung: 250 ml ungehopfte helle Bier würze (Trockensubstanz 17 (l/o), 18 g Agar-Agar, dest. Wasser ad 1 L (pH 5,2)]. Es entwickelt sich eine kreis runde Kolonie, die nach 14 Tagen bei 24 C einen Durchmesser von 15 mm erreicht. Sie besteht aus einer dem Agar aufliegenden, ca. 1 mm dicken Haut von pseudosclerotialer Struktur und darüber einem Polster von weissem Luftmycel. Ein brauner Farbstoff diffun diert in den Agar hinein.
Es worden keine Konidien gebildet.
Diese Kolonie wird mit einem Spatel in Stücke zer teilt und in ein Reagenzglas mit 12 cm3 des folgenden Agarnährbodens übertragen:
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Bierwürze <SEP> 500 <SEP> ml
<tb> Cornsteep-Solids <SEP> 60 <SEP> g
<tb> Milchsäure <SEP> 1 <SEP> ml
<tb> Salmiaklösung <SEP> bis <SEP> pH <SEP> 4,8
<tb> Agar-Agar <SEP> 20 <SEP> g
<tb> dest. <SEP> Wasser <SEP> ad <SEP> 1 <SEP> L.
Um jedes Impfstück bildet sich eine kleine Kolonie von zunächst weissem, später rotbraunem Mycel. Nach 10 Tagen beginnen sich an den Hyphenspitzen Koni- dien abzuschnüren. Nach 20 Tagen sind genügend Konidien vorhanden, um damit eine wässerige Suspen sion herzustellen, mit welcher 20 Schrägagar-Röhrchen (gleicher Agar wie oben) beimpft werden können. Diese Kulturen werden bei 24 C bebrütet. Die Koni- dien keimen nach 24-36 Stunden.
Nach 6 Tagen ist die Agaroberfläche von einem feinen, weissen Mycel gleichmässig überzogen, nach 10 Tagen ist eine braun graue, feingefurchte Myceldecke gebildet, welche dem Agar eng aufliegt und nur kurze Lufthyphen hat. An diesen werden Konidien abgeschnürt. Nach 12 Tagen entstehen an mehreren Stellen im Mycel Zentren, an welchen kleine Tröpfchen einer rotbraunen Flüssigkeit ausgeschieden werden.
Die Tröpfchen erreichen einen Durchmesser von 1-3 mm und werden bald von sehr zahlreichen Konidien milchig trüb. Nach 16-18 Tagen ist die Konidienbildung praktisch abgeschlossen. Eine Schrägagarkultur in einem Reagenzglas von 2 cm Durchmesser mit 12m1 Agar-Nährboden enthält ca. <B>109</B> Konidien.
Für die Züchtung in Submerskultur wird zunächst eine Vorkultur wie folgt bereitet: Als Medium wird eine 4,5 prozentige wässerige Malzextraktlösung mit pH 5,4 verwendet. Ein Liter dieser Lösung wird in einem 2 L-Erlenmeyerkolben 20 Minuten bei 110 C sterilisiert,
hernach mit 6.10$ Konidien von einer 15 Tage alten Agarkultur beimpft und 3 Tage lang auf einer rotierenden Schüttelma schine bei 24 C inkubiert. Es entsteht eine dichte Kul tur aus feinen Mycelflocken. Die Flocken bestehen aus einem lockeren Knäuel von Hyphen und haben einen Durchmesser von 2-4 mm. Es sind keine Alkaloide nachweisbar.
Zur Herstellung grösserer Mengen Vorkultur wer den Glasfermenter, welche je 10 L desselben Mediums enthalten, mit je<B>6.101</B> Komdien beimpft und 3 Tage bei 23 C unter Belüftung mit 6 L Luft pro Minute und Rühren mit 300 U. p. M. bebrütet. Zur Schaumbe kämpfung wird eine Siliconemulsion verwendet. Die so erhaltenen Fermenterkulturen sind von gleicher Be schaffenheit wie die Schüttelkulturen.
Für die Haupt kultur erwies sich die folgende Nährlösung, die in 1 L destilliertem Wasser
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Sorbit <SEP> 50 <SEP> g
<tb> Bernsteinsäure <SEP> 36 <SEP> g
<tb> KH,PO4 <SEP> 2 <SEP> g
<tb> M9S04 <SEP> 0,3 <SEP> g
<tb> FeS04 <SEP> . <SEP> 7 <SEP> H20 <SEP> 1 <SEP> mg
<tb> ZnS04. <SEP> 7 <SEP> H20 <SEP> 10 <SEP> mg enthält und mit NH40H auf pH 5,4 eingestellt worden ist, als besonders zweckmässig.
Diese Nährlösung wird mit 10 % einer 3 Tage alten Vorkultur beimpft und in Portionen von 100 ml in 500 ml Erlenmeyerkolben auf einer reziprok schütteln den Maschine bei 23 C inkubiert. Andere Kulturen werden in analoger Weise in einem 170 L Nährme dium enthaltenden Fermenter aus rostfreiem Stahl ge züchtet.
Dabei wird mit 170 L Luft pro Minute belüf tet und mit anfänglich 70, später 180 U. p. M. gerührt. Zur Schaumbekämpfung wird eine Siliconemulsion verwendet.
Auf diese Weise entstehen Kulturen aus zahlrei chen, gleichartigen Mycelpartikeln. Diese haben einen Durchmesser von ca. 5 mm und besitzen einen kuge ligen, kompakten Kern von ca. 1 mm Durchmesser aus pseudeparenchymatischem Gewebe. Dieser Kern trägt sternartig angeordnete, ca. 2 mm lange Fortsätze aus parallel gelagerten Hyphen. Am Ende der ca. 10-tägi- gen Kulturdauer ist das Mycel dunkelbraun, und das Filtrat intensiv rotbraun gefärbt. Der pH-Wert verän dert sich nur unwesentlich.
Das auf diese Weise erhaltene Kulturfiltrat hat einen kolorimetrisch bestimmten Gesamtalkaloidgehalt von 620 mg/L, bezogen auf ein Molekulargewicht von 300.
Die papierchromatographisch ermittelte Zusam mensetzung des Alkaloidgemisch@es ist folgendermas sen:
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6-Methyl-A8,9-ergolen-8-carbonsäure
<tb> und <SEP> geringe <SEP> Mengen <SEP> Lysergsäure <SEP> und <SEP> <B>86,511/0</B>
<tb> Isolysergsäure
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Lysergsäureamid <SEP> <B>3,90/0</B>
<tb> Isolysergsäureamid <SEP> <B>3,90/0</B>
<tb> Ergobasin <SEP> <B>1,00/0</B>
<tb> Ergobasinin <SEP> <B>0,50/0</B>
<tb> Clavin-Alkaloide <SEP> 4,
2% Die Isolierung der 6-Methyl-Q8#9-ergolen-8-car- bonsäure .aus dem Kulturfiltrat kann nach verschie- nen Methoden erfolgen. Vorzugsweise wird sie dem Kulturfiltrat durch einen stark sauren Kationenaustau- scher auf der Basis von Sulfonsäureharzen, (z. B.
Dowex 50 oder Amberlite IR 120) entzogen, von die sem durch Behandlung mit verdünntem Ammoniak abgelöst und durch Einengen des Eluates und Einstel len des pH-Wertes der Lösung auf ihren isoelektri- schen Punkt zur Kristallisation gebracht.
Die so gewonnene 6-Methyl-Q8,9-ergolen-8-car- bonsäure kann durch Behandlung mit basischen Rea genzien in Lysergsäure übergeführt werden. Vorteilhaf- terweise kann z. B. eine Lösung der 6-Methyl-Qa,s- ergolen-8-carbonsäure in verdünnter wässeriger Natronlauge einige Zeit auf 100 erhitzt werden, wor auf man die Lösung abkühlt und ihren pH-Wert auf den isoelektrischen Punkt der Lysergsäure einstellt.
Das Kulturfiltrat kann auch direkt auf Lysergsäure aufgearbeitet werden, indem man z. B. nach dem Ein dampfen der Lösung die 6 Methyl-A8,9-ergolen-8-car- bonsäure dem Rückstand durch Extraktion mit einer alkoholischen Ammoniaklösung entzieht, anschliessend durch Erhitzen des Extrakts die 6-Methyl-Q8,9-ergo- len-8-carbonsäure zur Lysergsäure isomerisiert und diese, wie oben beschrieben, aus der Lösung isoliert.
Man kann aber auch nach der Aufarbeitung des Kulturfiltrats durch Ionenaustauscher die ammoniaka- lische Lösung der, 6-Methyl-Q8,9-ergolen-8-carbon- säure direkt oder nach Zugabe von Lauge erhitzen, wobei Isomerisierung zu Lysergsäure eintritt.
In den nachfolgenden Beispielen, welche die Durchführung des Verfahrens erläutern, den Umfang der Erfindung aber in keiner Weise einschränken sol len, erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden; die Schmelzpunkte sind korrigiert.
<I>Beispiel 1</I> 6-Methyl-Q8>9-ergolen-8-carbonsäure 5 L Kulturfiltrat des neuen Stammes von Claviceps paspali Stevens et Hall mit einem kolorimetrisch be stimmten Gesamtgehalt an Ergolin-Derivaten von ca. 500 mg/L (bezogen auf ein Mol.-Gew. von 300) und einem pH-Wert von 5,6 werden durch eine mit Wasser eingeschlämmte Säule von 500 g Amberlite IR 120 (H -Form; Durchmesser der Säule 2,8 cm; Höhe 115 cm) filtriert.
Die Durchlaufgeschwindigkeit beträgt 500 ml/.Std. Nach dem Waschen der Säule mit 1 L Wasser wird die 6-Methyl-A",9=ergolen-8-carbonsäure mit 5-proz. Ammoniak eluiert. Der in Fraktionen von je 500 ml gesammelte Durchlauf wird durch Fluores zenz im UV. und Farbreaktion nach Keller (FeClg-Eis- essig, H,S04 konz.) auf den Gehalt an Ergolin-Deri- vaten geprüft.
Die ersten vier Fraktionen (insgesamt 2 L) dampft man bei 13 mm Torr und 30 Badtempera- tur auf 500 ml ein, stellt die Lösung mit Eisessig auf einen pH-Wert von 5,5, filtriert vom .ausgefallenen Harz (Keller-Farbreaktion negativ) ab, .engt das Filtrat im Vakuum auf ca. 25 ml ein, fügt 20 ml Methanol zu, kocht die Lösung kurz auf und lässt bei 5 einige Std. stehen.
Die auskristallisierte Säure wird nach dem Ab filtrieren mit Wasser und Methanol gewaschen und bei 80 2 Std. im Vakuum getrocknet. Die folgenden sie ben Fraktionen des Ammoniak-Durchlaufs liefern nach der gleichen Aufarbeitung eine weitere Menge kristalli sierter 6-Methyl-Q8,9-ergolen-8-carbonsäure.
Zur Reinigung der rohen Säure werden die kristal lisierten Produkte vereinigt, in 5-proz. alkoholischem Ammoniak gelöst, die Lösung nach Filtration mit 2-n-Essigsäure auf pH 5,5 gestellt, kurz auf dem Was serbad erwärmt, die kristallisierte Säure nach einigen Std. erbfiltriert, mit Wasser und Methanol gewaschen und im Vakuum bei 80 getrocknet. Smp. 243-245 (Zers.); [a]D = -180 (0,1-n . NaOH).
Farbreaktion nach Keller, van Urk und Ehrlich wie bei Lysergsäure; Dünnschichtchromatogramrn auf Kie selgel mit Alkohol/25-proz. Ammoniak (9:1) als Fliess- mittel: Rf-Wert = 0,4 bis 0,45. Der Fleck gibt beim Besprühen mit Ehrlich-Reagens eine blaue Färbung.
UV.-Spektrum: A, 0,1-n NaOH 1 log s = 217,5/4,56; M--X. mss 282/3,79; 292/3,74, Minimum bei<I>252</I> mu. IR.-Spektrum: charakteristische Banden bei 3340, 2275 (breit), 1674 und 1580 cm 71 (in Nujol). <I>Hydrochlorid:
</I> Das aus der oben beschriebenen 6-Methyl-Q8,9-ergolen-8-carbonsäure mit verd. Salz säure hergestellte Hydrochlorid. wurde aus Wasser und verd. Salzsäure umkristallisiert: Smp. 257-259 (Zerr.);
[a]D = -176 (in 0,1-n. HCl). UV.-Spektrum wie bei der 6-Methyl-Qa,9-ergolen-8-carbonsäure. IR.-Spektrum: charakteristische Banden bei 3380, 2600, 1708, 1660 (schwach ) und 1606 (schwach) cm-1 (in. Nujol.) 6-Methyl-,LS,9-ergolen-8-carbonsäure <I>aus dem</I> <I>Hydrochlorid:</I> Die Suspension von 100 mg Hydrochlo rid in 5 ml Wasser wird unter Rühren tropfenweise mit 2-n Natriumhydrogencarbonatlösung versetzt, bis alle Substanz in Lösung gegangen ist.
Hierauf stellt man mit Eiessig den pH-Wert auf 5,5, kocht kurz auf, fil- triert nach einigen Std. die kristallisierte Säure ab, wäscht sie mit Wasser und Methanol und trocknet im Vakuum. bei 80 . Smp. 245-247 (Zers.); [a]D = -208 (0,1-n NaOH), im Dünnschichtchromatogramm auf Kieselgel mit Alkohol/25-proz. Ammoniak (9:1) einheitlich; Rf-Wert = 0,45. Der Fleck zeigt im UV.
praktisch keine Fluoreszenz und gibt beim Besprühen mit Ehrlich-Reagens blaue Färbung. Beispiel <I>2</I> 6-Methyl-Q8>9-ergolen-8-carbonsäure Zur Gewinnung der 6-Methyl-A8,9-ergolen-8-car- bonsäure aus dem Kulturfiltrat des neuen Claviceps paspalum-Stammes verfährt man nach Beispiel 1, ver wendet aber anstelle von Amberlite IR 120 den Katio- nenaustauscher Dowex 50.
Man erhält die kristalli sierte, rohe 6-Methyl-Q11,9-ergolen-8-carbonsäure mit den im Beispiel 1 angegebenen Eigenschaften.
<I>Beispiel 3</I> Lysergsäure 500 mg der nach Beispiel 1 aus dem Kulturfiltrat des neuen Claviceps paspalum-Stammes isolierten rohen, kristallisierten 6-Methyl-Q8,9-ergolen-8-carbon- säure werden in 10 ml 2-n Natronlauge 2 Sbd. auf dem Wasserbad erwärmt, die heisse Lösung mit Aktivkohle behandelt und das Filtrat mit verd. Salzsäure und Eis essig auf einen pH-Wert von 5,5 gestellt.
Nach einigen Std. wird die auskristallisierte Lysergsäure abfiltriert, mit Wasser und Methanol gewaschen und bei 80 im Vakuum getrocknet: Smp. 245-247 (Zers.).
Die so erhaltene Lysergsäure hat alle in der Litera tur für diese Verbindung beschriebenen chemischen und physikalischen Eigenschaften.
<I>Beispiel 4</I> Lysergsäure 101 des wie oben beschrieben erhaltenen Kulturfil trates werden am Wasserbad eingedampft und der Rückstand unter Erwärmen auf ungefähr 50 mit 3 X 500 ml 5 9/o alkoholischer Ammoniaklösurng extra hiert. Der Extrakt wird im Rotationsverdampfer auf die Hälfte des ursprünglichen Volumens eingeengt, die rückbleibende konzentrierte Lösung mit Eisessig auf pH 5,5 gestellt, mit Aktivkohle behandelt und das Fil trat im Vakuum auf ca. 20 ml eingeengt, wobei Kristal- lisation einsetzt.
Man lässt bei 5 einige Stunden ste hen, der Niederschlag wird abfiltriert, mit Wasser und Methanol gewaschen, bei 80 getrocknet und durch Umkristallisieren oder Umfällen gereinigt. Die so er haltene Lysergsäure schmilzt bei 245-247 und hat alle in der Literatur für diese Verbindung beschriebe nen chemischen und physikalischen Eigenschaften.
<I>Beispiel 5</I> Lysergsäure 101 des wie oben beschrieben erhaltenen Kulturfil trates werden unter Rühren während ca. 12 Stunden mit 500 g Amberlite IR 120 (H+-Form) behandelt, man filtriert den Ionenaustauscher ab und verfährt mit dem Filtrat nochmals wie oben beschrieben unter Ver wendung von 250 g desselben Kationenaustauschers. Die Farbreaktion nach Keller einer zur Trockne einge- dampften Probe (5 ml) der nach zweimaliger Behand lung mit dem Austauschcrharz resultierenden Kulturlö sung fällt negativ aus.
Die beiden Portionen des Ionen- austauschers werden jeweils zweimal während 4 Stun den mit der gleichen Gewichtsmenge Wasser verrührt. Man behandelt nun jede Portion des Ionenaustauschers dreimal mit der gleichen Gewichtsmenge einer 5 9/0 wässrigen Ammoniaklösung unter Ausschluss von Kohlendioxyd während 12 Stunden bei 5-10 .
Die ein zelnen Extrakte werden am Wasserbad bei ca. 100 im Rotationsverdampfer auf die Hälfte des ursprünglichen Volumens eingeengt, die Konzentrate mit Eisessig auf pH 5,5 gestellt, eventuell geringe Mengen ausgefallenes Harz abfiltriert und im Vakuum auf 15-20 ml ein geengt und weiter wie in Beispiel 3 beschrieben die Lysergsäure isoliert und gereingt. Statt des hier be nützten Ionenaustauschers können auch andere starke saure Ionenaustauscher wie z. B. Dowex 50 verwendet werden.