Verfahren zur Gewinnung von BCG-Kulturen
Gegenstand der Erfindung ist ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von BCG-Kulturen. Das abgeschwächte Mycobacterium tuberculosis var. BCG (Bac.
CalmetteGuerin) wird als Lebendvaccine zur Immuni- sierung gegen Tuberculose verwendet. Auch BCG-Zellextrakte weisen eine gewisse immunisierende Wirkung auf. Für die Herstellung der Vaccine und Zellextrakte in grossem Massstab sollten entsprechend grosse, einheitliche und lebensfähige Teilmengen zur Verfügung stehen. Das war aber bisher nicht der Fall. BCG ist hinsichtlich der Züchtung sehr empfindlich. Es gelang bisher nicht, BCG in technischem Massstab in den üblichen Fermentern aus rostfreiem Stahl unter Belüftung und Rühren herzustl- len, da BCG unter diesen Bedingungen nicht oder nur sehr langsam wuchs.
Es wurde nun gefunden, dass die Zusammensetzung der Nährlösung, speziell hinsichtlich der Kohlenstoffquellen und des Zusatzes von oberflächenaktiven Stoffen, sowie im allgemeinen auch geringe Belüftung und Rührung für die Züchtung von BCG in technischem Massstab von ausschlaggebender Bedeutung sind.
Es zeigte sich, dass die Kombination von Glycerin als Kohlenstoff- und Energiequelle mit Netzmitteln vom Tween -Typ d. 5. Anhydride mehrwertiger Alkohole, deren freie Hydroxylgruppen zum Teil mit langkettigen Fettsäuren verestert, zum Teil mit Polyäthylenoxyd ver- äthert sind (s. The Merck Index, 7. Aufl. 1960, S. 970), insbesondere mit Tween 80 (Pdyoxyäffiylensorbitan- monooleat), optimales Wachstum des BCG in Fermentern ermöglicht.
Das Verfahren gemäss der Erfindung ist daher dadurch gekennzeichnet, dass man die Züchtung von BCG in einem Fermenter unter Verwendung einer Nährlösung, die Glycerin als Kohlenstoff- und Energiequelle sowie als Netzmittel cyclische Anhydride mehrwertiger Alkohole, deren freie Hydroxylgruppen zum Teil mit langkettigen Fettsäuren verestert und zum Teil mit Polyäthylenoxyd veräthert sind, enthält, durchführt.
Die Anteile e der beiden Komponenten Glycerin und Netzmittel hängen von den übrigen Nährlösungsbestand teilen ab. Glycerin wird in der Regel in Konzentrationen von 20-100 g/l Nährlösung, das Netzmittel in der Regel in solchen von 1-20 g/l beigefügt. Die übrigen Nähr lösungsb. standteile, Stickstoffquellen, Salze, Spurenelemente, entsprechen im allgemeinen den in der Literatur für die Züchtung von BCG angegebenen Medien. Die Belüftung soll in der Regel schwach sein, ungefähr 0,1 bis 0,5 Vol. Luft pro Vol. Nährlösung pro Minute. Auch die Rührung soll in der Regel niednig gehalten werden, beispielsweise bei etwa 50-100 Umdrehungen pro Minute.
Die Inkubafionstemperatur in den Fermentern beträgt vorzugsweise 37 C. Zur Beimpfung der Fermenter dienen z. B. 6-9 Tage alte, bei 370 C inkubierte Schüttelkulturen; man beimpft z. B. mit 2-5 Vol.% Schüttelkultur.
Das Wachstum der Kultur wird im allgemeinen turbidimetrisch verfolgt, z.B. indem die Lichtabsorption bei 655 m, u in einem photoelektrischen Kolorimeter ge messen en wird. Man erntet z. B. bei einer optischen Dichte von 2-10, entsprechend etwa 1-5 g Zelltrockengewicht pro Liter Kulturlösung. Diese Dichte ist nach 5-15 Tagen erreicht. Für die Propagation in höhere Fermenterstufen (scale up) verwendet man Kulturen mit einer optischen Dichte von 1-3, wie sie nach etwa 4- bis 6tägiger Inkubation erhalten wird.
Wenn die gewünschte Dichte erreicht ist, werden beispielsweise die Bakterien von der Nährlösung durch Zentnifugieren abgetrennt. Sie können zwecks Herstellung von BCG-Vaccine gefriergetrocknet oder zur Gewinnung von Zellextrakten aufgearbeitet werden.
Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen beschrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.
Beispiel I
In einen 50-Liter-Fermenter (der in der Antibiotika Produktion üblichen Bauweise) mit Luftverteiler, Rührer und Temperaturregulator werden 30 Liter Nährlösung ,eingefüllt, welche pro Liter folgende Zusammensetzung hat:
Glycerin 75,0 g Tween 80 2,0 g
Albuminlösung 5 % ig 50,0 ml
L-Asparagin 2,0 g
Bacto-Casiton 1,0 g
Kaliumphosphat, prim. 1,0 g
Natriumphosphat, sek., 12 HssO 2,5 g Ferriammoniumcitrat 10,0 mg
Magnesiumsulfat, 7 H2O 10,0 mg
Calciumchlorid, 6 HZO 0,5 mg
Zinksulfat, 7 H2O 0,1 mg
Kupfersulfat, 5 H2.O 0,1 mg deionisiertes Wasser ad 1000 ml
Die Nährlösung wird vor dem Einfüllen, ohne Zusatz der Albuminlösung, 20 Min.
bei 1200 und 1,2 atü autoklaviert, dann die an zwei aufeinander folgenden Tagen je 2 Std. bei 560 inaktivierte, durch ein Seitzfilter filtrierte Albuminlösung hinzugegeben. Man beimpft den Eermenter mit 900 ml einer 9 Tage alten, in 500 ml Erlenmeyerkolben mit je 100 ml Nährlösung auf einer rotierenden Schüttelmaschine gezogenen BCG-Kultur, die eine optische Dichte von 0,3-0,4 (Messung bei 655 me) aufweist (die Nährlösung der Erlenmeyerkolben entspricht der obigen, enthält jedoch statt 50 ml Albuminlösung pro Liter 100 ml und kein Glycerin und Tween). Die Züchtung erfolgt bei 370, bei einem Luftumsatz von 0,25 Vol. pro Vol. Nährlösung pro Minute und unter Rühren mit einem 6blätterigen Turbinenrührer mit 50 Umdrehungen pro Minute.
Nach 10 Tagen weist die Kulturlösung eine optische Dichte von 4,40 (bei 655 mop), d. h. ein Zelltrockengewicht von etwa 2,2 g pro Liter Kulturlösung, auf.
Verwendet man unter sonst gleichen Bedingungen eine Nährlösung, welche statt des Glycerins 75 g Glucose enthält, so ist die optische Dichte nach 10 Tagen 0,13; bei einer Nährlösung ohne Glycerin und mit nur 0,5 g Tween , jedoch mit 100 statt 50 ml Albuminlösung pro Liter ist die optische Dichte nach 10 Tagen 0,02.
Beispiel 2
Unter den in Beispiel 1 angegebenen Bedingungen wird in einem 50-Liter-Fermenter eine BCG-Kultur in 30 Liter einer Nährlösung gezüchtet, die pro Liter folgende Zusammensetzung hat:
Glycerin 50,0 g Tween 80 15,0 g
Natriumacetat 1,0 g
L-Asparagin 2,0 g
Bacto Casiton 1,0 g
Hefeextrakt Difco 3,0 g
Kaliumphosphat, prim. 1,0 g
Natriumphosphat, sek., 12 HrO 2,5 g
Ferriammoniumcitrat 10 mg
Magnesiumsulfat, 7 ff2O 10 mg
Calciumchlorid, 6 H.2O 0,5 g
Zinksulfat, 7 HO 0,1 mg
Kupfersulfat, 5 H2O 0,1 mg deionisiertes Wasser ad 1000 ml
Die Lösung wird 20 Min. bei 1200 und 1,2 atü autoklaviert.
Nach 10 Tagen weist die Kulturlösung eine opti sche Dichte von 5,65 (bei 655 m, u) auf, entsprechend etwa 2,8 g Zelltrockengewicht pro Liter.
Verwendet man eine Nährlösung, die statt Glycerin und Tween 10,0 g Glucose und 15,0 g Triton (WR 1339) enthält, so ist die optische Dichte nach 10 Tagen 0,27.
Beispiel 3
Man beimpft 50-Liter-Fermenter, welche 30 Liter der in Beispiel 2 genannten Nährlösung enthalten, mit 900 ml einer Schüttielkultur, die in Erlenmeyerkolben wie in Beispiel 1 beschrieben aber in einer Nährlösung von der ion Beispiel 2 angegebenen Zusammensetzung gezogen wurde. Nach 4- bis 6tägiger Inkubation der Fermenter werden je 15 Liter der Kulturlösung in 500-Liter-Fermenter mit 300 Liter Nährlösung üb, tragen. Die 500-Liter-Fermenter entsprechen im Bau den 50-Liter-Fermentern. Die Züchtung erfolgt bei 370, bei einer Belüftung von 0,1 bis 0,5 Vol. Luft pro Vol.
Nährlösung pro Minute und unter Rühren mit 100 Umdrehungen pro Minute. Nach 7tägiger Inkubation beträgt die optische Dichte 4-6, entsprechend 24 g Zelltrockengewicht pro Liter Kufturlösung. Die Ausbeute kann durch Verlängerung der Züchtungsdauer noch wesentlich erhöht werden.
Process for obtaining BCG cultures
The invention relates to an improved method for producing BCG cultures. The attenuated Mycobacterium tuberculosis var.BCG (Bac.
CalmetteGuerin) is used as a live vaccine for immunization against tuberculosis. BCG cell extracts also have a certain immunizing effect. For the production of vaccines and cell extracts on a large scale, correspondingly large, uniform and viable partial quantities should be available. But that has not been the case so far. BCG is very sensitive to breeding. So far it has not been possible to produce BCG on an industrial scale in the usual fermenters made of stainless steel with aeration and stirring, since BCG did not grow or only grew very slowly under these conditions.
It has now been found that the composition of the nutrient solution, especially with regard to the carbon sources and the addition of surface-active substances, as well as generally low aeration and agitation are of decisive importance for the cultivation of BCG on an industrial scale.
It was found that the combination of glycerine as a carbon and energy source with wetting agents of the Tween type d. 5. Anhydrides of polyhydric alcohols, the free hydroxyl groups of which are partly esterified with long-chain fatty acids and partly etherified with polyethylene oxide (see The Merck Index, 7th edition 1960, p. 970), in particular with Tween 80 (Pdyoxyäffiylensorbitan- monooleate ), enables optimal BCG growth in fermenters.
The method according to the invention is therefore characterized in that the cultivation of BCG in a fermenter using a nutrient solution, the glycerol as a carbon and energy source and as a wetting agent cyclic anhydrides of polyhydric alcohols, whose free hydroxyl groups are partly esterified with long-chain fatty acids and Part etherified with polyethylene oxide, contains, carries out.
The proportions e of the two components glycerine and wetting agent depend on the remaining nutrient solution constituents share. Glycerin is usually added in concentrations of 20-100 g / l nutrient solution, the wetting agent usually in concentrations of 1-20 g / l. The remaining nutrient solution. Components, nitrogen sources, salts, trace elements, generally correspond to the media specified in the literature for the cultivation of BCG. The ventilation should generally be weak, approximately 0.1 to 0.5 vol. Air per vol. Nutrient solution per minute. The agitation should also be kept low as a rule, for example at about 50-100 revolutions per minute.
The incubation temperature in the fermenters is preferably 37 C. For inoculating the fermenters, for. B. 6-9 day old shaking cultures incubated at 370 C; one inoculates z. B. with 2-5% by volume shaking culture.
The growth of the culture is generally followed turbidimetrically, e.g. by measuring the light absorption at 655 m u in a photoelectric colorimeter. One harvests z. B. at an optical density of 2-10, corresponding to about 1-5 g cell dry weight per liter of culture solution. This density is reached after 5-15 days. For propagation in higher fermenter stages (scale up), cultures with an optical density of 1-3, as obtained after incubation for about 4-6 days, are used.
When the desired density is reached, the bacteria are separated from the nutrient solution by centrifugation, for example. They can be freeze-dried for the production of BCG vaccines or processed to obtain cell extracts.
The invention is described in the following examples. The temperatures are given in degrees Celsius.
Example I.
30 liters of nutrient solution are filled into a 50-liter fermenter (the usual construction in antibiotics production) with an air distributor, stirrer and temperature regulator, which has the following composition per liter:
Glycerin 75.0 g Tween 80 2.0 g
Albumin solution 5% 50.0 ml
L-asparagine 2.0 g
Bacto-Casiton 1.0 g
Potassium phosphate, prim. 1.0 g
Sodium phosphate, sec., 12 HssO 2.5 g ferric ammonium citrate 10.0 mg
Magnesium sulfate, 7 H2O 10.0 mg
Calcium chloride, 6 HZO 0.5 mg
Zinc sulfate, 7 H2O 0.1 mg
Copper sulfate, 5 H2.O 0.1 mg deionized water ad 1000 ml
Before adding the nutrient solution, without adding the albumin solution for 20 min.
Autoclaved at 1200 and 1.2 atmospheres, then the albumin solution, which had been inactivated for 2 hours at 560 for 2 hours and filtered through a Seitz filter, was added. The eermenter is inoculated with 900 ml of a 9-day-old BCG culture grown in 500 ml Erlenmeyer flasks with 100 ml nutrient solution each on a rotating shaking machine, which has an optical density of 0.3-0.4 (measurement at 655 me) ( the nutrient solution of the Erlenmeyer flask corresponds to the above, but contains 100 ml instead of 50 ml albumin solution per liter and no glycerine and Tween). The cultivation takes place at 370, with an air turnover of 0.25 vol. Per vol. Nutrient solution per minute and with stirring with a 6-blade turbine stirrer at 50 revolutions per minute.
After 10 days the culture solution has an optical density of 4.40 (at 655 mop), i.e. H. a dry cell weight of about 2.2 g per liter of culture solution.
If, under otherwise identical conditions, a nutrient solution is used which contains 75 g of glucose instead of glycerine, the optical density after 10 days is 0.13; with a nutrient solution without glycerine and with only 0.5 g Tween, but with 100 instead of 50 ml albumin solution per liter, the optical density after 10 days is 0.02.
Example 2
Under the conditions specified in Example 1, a BCG culture is grown in a 50-liter fermenter in 30 liters of a nutrient solution which has the following composition per liter:
Glycerin 50.0 g Tween 80 15.0 g
Sodium acetate 1.0 g
L-asparagine 2.0 g
Bacto Casiton 1.0 g
Difco yeast extract 3.0 g
Potassium phosphate, prim. 1.0 g
Sodium phosphate, sec., 12 HrO 2.5 g
Ferriammonium Citrate 10 mg
Magnesium sulfate, 7 ff2O 10 mg
Calcium chloride, 6 H.2O 0.5 g
Zinc sulfate, 7 HO 0.1 mg
Copper sulfate, 5 H2O 0.1 mg deionized water ad 1000 ml
The solution is autoclaved for 20 minutes at 1200 and 1.2 atmospheres.
After 10 days, the culture solution has an optical density of 5.65 (at 655 m, u), corresponding to about 2.8 g dry cell weight per liter.
If a nutrient solution is used which contains 10.0 g glucose and 15.0 g Triton (WR 1339) instead of glycerine and Tween, the optical density after 10 days is 0.27.
Example 3
50 liter fermenters containing 30 liters of the nutrient solution mentioned in Example 2 are inoculated with 900 ml of a Schüttiel culture which was grown in Erlenmeyer flasks as described in Example 1 but in a nutrient solution of the composition given in Example 2. After incubating the fermenters for 4 to 6 days, 15 liters of the culture solution are transferred to 500 liter fermenters with 300 liters of nutrient solution. The construction of the 500 liter fermenter corresponds to the 50 liter fermenter. Cultivation takes place at 370, with an aeration of 0.1-0.5 vol. Air per vol.
Nutrient solution per minute and with stirring at 100 revolutions per minute. After 7 days of incubation, the optical density is 4-6, corresponding to 24 g of dry cells per liter of Kuftur solution. The yield can be increased significantly by extending the cultivation time.