Verfahren zur Herstellung neuer Dekapeptide Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung neuer Dekapeptide der Formel L-Seryl- L-tyrosyl-Irseryl-L-methionyl-L-glutaminyl (oder Ir glutamyl)-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryp- tophyl-glycin.
Die neuen Verbindungen haben die Wirkung des natürlichen Melanocyten-stimulierenden Hypophysen- hormons (MSH-Wirkung). Vor allem aber weisen sie eine die Abscheidung des adrenocorticotropen Hormons (ACTH) aus der Antehypophyse stimu- lierende Wirkung (Corticotropin Releasing Factor- = CRF Wirkung)
auf und können dementsprechend als Heilmittel verwendet werden. Ferner können sie als Zwischenprodukte zur Herstellung von Heil mitteln, die eine längere Kette von Aminosäuren auf- weisen wie des Melanocyten-stimuherenden Hormons und des ACTH, verwendet werden.
Die neuen Peptide können .nach den für die Peptidherstellung bekannten Methoden erhalten wer den, wobei die Aminosäuren in der erwähnten Rei henfolge einzeln oder nach vorheriger Bildung klei nerer Peptideinheiten verknüpft werden.
Das erfin d ungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man die Aminosäuren L-Serin, L-Tyrosin, L- Serin, L-Methionin, L-Glutamin(oder L=Glutamin- säure), L-Histidi'n, L-Phenylalanin, Arginin,
L- Tryptophan und Gl'ycin in der angegebenen Reihen folge unter intermediärem Schutz von Amino- bzw. Carboxylgruppen miteinander vereinigt. In den Fig. 1 und 2 sind Ausführungsformen des Verfahrens dar gestellt.
EMI0001.0060
EMI0002.0001
BOC bedeutet eine tert.-Butyloxycarbonylgruppe; 0R eine Estergruppe.
EMI0002.0006
Die an der Reaktion nicht beteiligten, freien, funktionellen Gruppen werden zweckmässigerweise geschützt, insbesondere mittels durch Hydrolyse oder Reduktion leicht abspaltbarer Reste, die Carboxyl- gruppe vorzugsweise durch Veresterung, z.
B@. mit Methanol, Benzylalkohol, p-Nitrobenzylalkohol, die Aminogruppe beispielsweise durch Einführung des Tosyl-, Tritylrestes oder der Carbobenzoxygruppe oder farbiger Schutzgruppen, wie der p-Phenylazo- benzyloxy-carbonylgruppe und der p-(p =Methoxy- phenylazo)-benzyloxy-carbonylgruppe (MZ)@,
oder insbesondere des tert.-Butyloxycarbonylrestes. Zum Schutz der Aminogruppe in der Guanidogruppierung des Argini@ns ist die Nitrogruppe geeignet; die ge nannte Aminogruppe des Arginins muss aber bei der Reaktion nicht notwendig geschützt werden.
Die Umwandlung einer geschützten NH2-Gruppe in eine freie Gruppe sowie die ü'berführung einer funktionell abgewandelten Carboxylgruppe in eine freie Carboxylgruppe im Verlaufe des Verfahrens zur Herstellung der Dekapeptide und Zwischenpro dukte kann nach an sich bekannten Methoden durch Behandlung mit hydrolysierenden bzw. reduzierenden Mitteln erfolgen. Je nach der Arbeitsweise erhält man die neuen Verbindungen in Form von Basen oder ihren Salzen.
Aus den Salzen können in an sich bekannter Weise die Basen gewonnen werden. Von letzteren wie derum lassen sich durch Umsetzung mit Säuren Salze gewinnen.
Die verfahrensgemäss erhaltenen Dekapeptide können in Form von pharmazeutischen Präparaten Verwendung finden. Diese enthalten die Peptide z. B. in Mischung mit einem für die enterale oder par- enterale Applikation geeigneten pharmazeutischen organischen oder anorganischen Trägermaterial.
In den nachfolgenden Beispielen sind die Tem peraturen in Celsiusgraden angegeben. Für die Papierchromatographie wurden die folgenden Sy steme benützt: System 43 - terc. Amylalkohol : Isopropanol : Was ser = 100: 40: 55, System 45 = sek. Butanol : 3 % Ammoniak = 100:44, System 5-0 = tert. Amyl'alkohol : Isopropanol : Tri- äthylamin : Veronal :
Wasser = 100: 40:<B>0,8:</B> 1,8 g r: 50, System 54 = sek. Butanol : Isopropanol : Mono chloressigsäure : Wasser = <B>70:</B> 10 : 3 gr : 40. <I>Beispiel 1</I> t-Butyloxycarbonyl-L-serin-methylester Eine Lösung von 19 g (0,16 Mol), L-Serin- methylester (frisch hergestellt aus 25g Ester-hydro- chlorid) in 75 cm3 trockenem Pyridin wird mit 42,8 g (0,3 Mol)
t-Butyloxycarbonylazid versetzt und 24 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Die schwach gelb gefärbte Reaktionslösung wird im Vakuum bei 3,0 auf ein kleines Volumen einge engt, mit Essigester versetzt und die Essigester lösung unter Eiskühlung mehrmals mit 1n Salz säure, 1n Natriümnydrogencarbonat-Lösung und Wasser gewaschen, getrocknet und im Vakuum ein gedampft.
Der erhaltene Sirup liefert nach mehr maliger Extraktion mit Petroläther (Entfernung von überschüssigem t-Butyloxycarbonylazid) 27 g<B>(77%)</B> t-Butyloxycarbonyl-L-serin methylester als Öl, das direkt weiter umgesetzt wird.
<I>Beispiel 2</I> t-Butyloxycarbonyl-L-serin-hydrazid 27 g roher t-Butyloxycarbonyl4L-serinmethyl- ester werden in 200 cm3 Methanol gelöst und mit 20 cm3 Hyd'razinhydrat versetzt.
Nach 24 Stunden wird die Lösung im Vakuum bei maximal 30 eingedampft und der erhaltene Sirup zur Entfernung von überschüssigem Hydrazin über Nacht im Hoch vakuum über konzentrierte Schwefelsäure gehalten. Der feste Rückstand wird mit Essigester verrieben, das isolierte kri's'talline Material bei 0,01 mm über Schwefelsäure von Spuren HydTazin befreit und aus Essigester umkristallisiert: 23,3 g (86 %);
F. 112 bis 114 ; [a] D - 9-,4 1 (c = 4,06, in Methanol). <I>Beispiel 3</I> t-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosyl-L-serin- methylester a) ausgehend von t-Butyloxycarbonyl-L-serin- hydrazid 11 g (50 mMol) t-Butyloxycarbonyl-L-serin- hydrazid werden rasch in 100 em3 auf -l0 vorge kühlte 1 n Salzsäure (enthaltend 10g Natriumchlorid zur Gefrierpunktserniedrigung)
gelöst und mit einer auf -10 gekühlten Lösung von 4,2 g (60 mMol) Natriumnitrit in 15 cm3 Wasser versetzt. Nach 5 Minuten wird das als Öl ausgesch'iede'ne t-Bufiyloxy- carbonyl-L-serin-azid zweimal mit je 150 cm3 Essig ester (auf -10 vorgekühlt) extrahiert, die Essig esterlösung mit kalter 1n Natriumhydrogencarbonat Lösung und Eiswasser gewaschen,
kurz über Magne- siumsulfat bei 0 getrocknet und im Vakuum bei maximum 20 auf etwa 50 cm3 eingeengt.
Die Lösung des Azids wird bei 0 mit 14 g (50 mMol) frisch hergestelltem L-Tyrosyl=L-serin methylester (vgl. Boissonnas, Helv. 41, 1852<B>[1958];
</B> Skeggs, J. Exp. Med. <I>108,</I> 283 [1958]) in 50 cm3 trockenem Tetrahydrofuran versetzt und 48 Stunden bei +5 stehengelassen.
Anschliessend wird die Reaktionslösung zur Entfernung von Tetrahydro- furan im Vakuum auf ein kleines Volumen einge- engt, mit Essigester verdünnt und bei 0 mit wenig 1n Salzsäure, Natriumhydrogencarbonat-Lösung und Wasser gewaschen (in einigen Ansätzen schied sich ein Teil des Reaktionsprodukts während dem Wa schen aus und wurde abfiltriert),
getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der Rückstand liefert beim Verreiben finit Äther 14,7 g<B>(63%)</B> amorphe Sub stanz, welche für die folgende 1Tberführung in das Hydrazid genügend reiht ist.
Zweimaliges Umkristalläsieren aus wenig Aceton ergibt den reinen kristallinem t Butyloxycarbonyl-L- seryl-L-tyrosyl-L-serin-methylester: F. 124 bis 127 ; [a]D - 23,6 111 c = 1,95 in Methanol); schwer löslich in Äther, Benzol, Chloroform; löslich in hei ssem Essigester und heissem Wasser (beim Kühlen Nadeln, F. 97-105 , Hydrat).
Die Abspaltung der t-Butyloxycarbonylgruppe mittels Salzsäure in Essigester oder Trifluoressig- säure ergibt papierchromatographisch reinen L- Seryl L-tyrosyl-L-serin-methylester.
Der als Ausgangsmaterial verwendete L-Tyrosyl- L-serin-methylester wird wie folgt hergestellt: 16 g (50 mMol) L-Tyrosyl-L-serin-methylester- hydrochlorid [St. Guttmann und R.
A. Boissonnas, Helv. Chim. Acta 41, 18'52 (1958)] werden ih 50 cm3 Essigester suspendiert und bei 0 mit 12 cm3 einer 5n Lösung von Ammoniak in Metha nol während 15 Minuten verrührt; nach Zugabe von weiteren 50 cm3 Essigester wird das ausgeschiedene Ämmoniumchlorid abfiltriert und das Filtrat im Vakuum vorsichtig eingedampft.
Der ölige Rück stand ergibt nach mehrmaligem Verreiben mit Äther 14 g freien Ester, direkt in den oben beschriebenen Ansatz eingesetzt wird;
amorphes Pulver, schwer lös- lich in Essigester (löslich in Gegenwart von <B>10%</B> Methanol), leicht löslich in Tetrahydrofuran und Acetonitril'. b) ausgehend von L-Seryl-L-tyrosyl-L-serin- methylester 2,0 g (4 mMol) Carbobenzoxy-L-seryl-L-tyrosyl- L-serinmethylester [K. Hofmann et al., J. Am.
Chem. Soc. 79, 1636 (1957); St. Guttmann und R. A. Boissonnas, Helv. Chim. Acta 41, 1892 (1958l werden in 40 cm3 Methanol gelöst und in Gegenwart von 1 g Palladiumkohle (1-0%ig) bei Zimmertemperatur und Normaldruck hydriert, wobei das gebildete Kohlendioxyd in Natronlauge absorbiert wird.
Nach Aufnahme der berechneten Menge Was serstoff (20 Minuten). ist die Hydrierung beendigt und die vom Katalysator abfilbrierte Lösung wird im Vakuum eingedampft. Beim Verreiben des Rück standes mit Acetonitril kristallisiert der L-Seryl-L- tyrosyl-L-serin-methylester in Form von feinen Na- dein:
1,21 g (82 %); F. 155-158 ; nach Umkristalli- sieren aus Wasser oder wenig Alkohol: F. 158-160 ; [a]D + 4,6 1 (c = 3,91 in Methanol), + 11,5 1 (c = 2,00 in 0, 1n Salzsäure in Methanol'); Literaturwert für Hydrochlorid: + 10,2 (c = 2,6 in Methanol). Die Substanz ist papierchromatographisch einheitlich.
Eine Lösung von 369 mg (1 mMol) L-Seryl-L- tyrosyl-L-serin-methylester in 2 cm3 trockenem Pyri- din wird mit 239 mg (1 mMol) t-Butyloxycarbonyl- p-nitrophenol versetzt und über Nacht bei 20 stehen gelassen.
Die Reaktionslösung wird im Vakuum vor sichtig eingedampft, der Rückstand in Essigester auf genommen und wie unter a) weiter aufgearbeitet; Rohprodukt nach Verreiben mit Äther: 295 mg (63,',o); nach Umkristalli'sieren aus Aceton: 233 mg (50 %), F. 123-126 ; [a]D <B>-23,11</B> 1 (c = 2,04 in Methanol).
Bei Verwendung von 0,3'6 g (2,5 mMol) t- Butyloxycarbonylazid an Stelle von t Butyloxycar- bonyl-p-nitrophenol werden 305 mg (69 %) Rohpro dukt respektive 245 mg (52 %) reine Substanz er halten.
<I>Beispiel 4</I> t-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosyl-L serin- hydrazid Eine Lösung von 14 g (30 mMol) rohem t Butyl- oxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosyl-Irserin-methylester in 100 cm3 Methanol wird mit 5 cm3 Hydrazinhydrat versetzt und bei Zimmertemperatur stehengelassen.
Nach kurzer Zeit beginnt die Abscheidung von amorphem Hydrazid, das nach 6 Stunden abfiltriert, mit Methanol gewaschen und zur Entfernung von Spuren Hydrazin über Nacht bei 0,01 mm über konzentrierter Schwefelsäure getrocknet wird: 11,8 g, F. 173-176 .
Durch Umkristallisieren aus Wasser wird das Hydrazid-monohydrat in Form von filzigen Nadeln vom F. 184-187 (nach Sintern bei 150 ) erhalten; [a]D-3,4 1 (c = 1,76 in Dimethyl- formamid), -24,9 1 (c = 2,18 in Eisessigwas- ser 1 : 1), -9 1 (c = 2,01 in Pyrid'in).
Bei Verwendung von reinem Ausgangsmaterial beträgt die Ausbeute an umkristallisiertem Hydrazid 75 %.
<I>Beispiel 5</I> <I>t-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-</I> tnethionyl-L-glutaminyl-L-histidyl-L-phenylalanyl- L-arginyl-L-tryptophyl-glycin-acetat 487 mg (1 mMol) BOC-Seryl-tyrosyl-serin-hydra- zid:
1 Kristallwasser werden rasch in 3 cm3 auf -10 vorgekühlter 1n Salzsäure (enthaltend <B>10%</B> Natriumchlorid zur Gefrierpunktserniedri'gung) ge löst und tropfenweise mit 0,24 cm3 (1,2 Äq.) einer ebenfalls vorgekühlten 5n wässrigen Natriumnitrit Lösung versetzt.
Das gebildete Azid scheidet sich sofort als dichter käsiger Niederschlag aus. Man überschichtet die Reaktionslösung mit 5 cm3 auf -10 gekühltem Essigester und löst 5 Minuten bei -10 reagieren.
Dann extrahiert man zweimal mit 10 cm3 Essigester. Die vereinigten Essigesterphasen werden mit 1 cm3 gesättigter Natriumbicarbonatlösung geschüttelt, dreimal mit 1 cm3 Eiswasser gewaschen und kurz bei 0 über Magnesiumsulfat getrocknet.
Den Es sigester dampft man im Vakuum bei Zimmertempera tur auf ein kleines Volumen (2 cm3) ein und nimmt den siTupösen Rückstand in 4 cm3 auf -10 gekühltem Dimet'hylformamid auf. (Nach vollständigem Ein engen des Essigesters kristallisiert das Azid bei 0 ; F. = (50 ) 135-15,0 ; aus Äther unter teilweiser Zersetzung.
Gleichzeitig löst man unter leichtem Erwärmen 520 mg (0,5 mMol) L-Methionyl-L-glutaminyl-L- histidyl4L-phenylalanyl-L-arginyl L-tryptophyl@glycin- acetat (vgl'. G.
Nr. 2269',/61-Case 4497/1-4) 7,5 cm3 Dimethylformamid, kühlt auf Zimmertemperatur ab, gibt -0,76 cm3 einer 10 % igen Lösung von Triäthyl- amin in Dimethylformamid (0,55 mMol) dazu und versetzt die auf -10 gekühlte Lösung mit der frisch bereiteten Azidlösung.
Man lässt 2 Tage bei 0 reagieren, kühlt wie derum auf -10 ab und neutralisiert mit 0,275 cm3 1n Salzsäure. Das rohe Reaktionsprodukt wird durch Zugabe von viel Essigester ausgefällt, filtriert und im Hochvakuum über Phosphorpentoxyd getrocknet. Die Ausbeute ist 720 mg rohes Butyloxycarbonyl- dekapept'idacetat, das im Papierchromatogramm nur noch ungefähr 5 % einer langsamer wandernden,
paulipositiven Substanz anzeigt.
Das Analysenpräparat schmilzt nach einmaligem Kristallisieren aus Methanol bei 202 unter Zer setzung. Die Acetylbestimmung zeigt nur noch 1/2 Mol Essigsäure als Acetat, auf Arginin bezogen.
Die Rf-Werte in den Systemen 43; 45 und 54 sind 0,69, 0,60 und 0,72.
<I>Beispiel 6</I> <I>L-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-</I> gdcttaminyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl- L-tryptophyl-L-glycin-acetat 125 mg BOC-Dekapeptid werden mit 1,5 ml was- serfreier Trifluoressigsäure während 1 Stunde bei Zimmertemperatur stehengelassen. Die Trifluoressg- säure dampft man im Vakuum bei 40 ab und zer kratzt den sirupösen Rückstand wiederholt mit viel absolutend Äther.
Das Trifluoracetat des Deka- peptides erhält man dabei als leicht rosa gefärbtes Pulver.
Die getrocknete Verbindung wird in 1 ml Wasser gelöst und mit weiteren 30 ml Wasser durch eine Ionenaustauschersäule IR-4B (Acetatform) ge waschen.
Nach dem Verdampfen des Wassers nimmt man den glasigen Rückstand in wenig Methanol auf und fällt das Dekapept'id mit Aceton aus. Man erhält 100 mg Seryl - tyrosyl - seryl - methionyl - gutaminyl- bi'stidyl-phenylalanyl-arginyl tryptophyl-glycin acetat. F. 192-194 .
Im Papierchromatogramm zeigt das Dekapeptid in den Systemen 45, 50 und 54 die folgenden Rf- Werte: 0,51; 0,47 bzw. ü,58. Im Test nach Saffran und Schally zeigt es eine starke CRF Aktivität.
<I>Beispiel 7</I> t-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosyl-L-seryl- L-methionin-methylester Eine Lösung von L-Butyl'oxycarbonyl-L-seryl- L-tyrosyl-L-serin-acid, frisch hergestellt aus 2,44 g (5 mMol) t-Butyloxycarbonyl-L- seryl -Ir tyrosyl-L serin-hydrazid-monohydrat gemäss Beispiel 6 in 30 ml Essigester wird mit 1,53 g (10 ml)
frisch destilliertem L-Methionin methylester versetzt und 48 Stunden bei 0 stehengel@assen. Das als Gallerte ausgeschiedene Reaktionsprodukt wird abfiltriert und mit Essigester und Äther gewaschen: 1,89, g;
aus dem Filtrat werden nach üblicher Aufarbeitung weitere 0,25 g Substanz gewonnen (total 2,14, g = 21 no. Umfällen aus Essigester ergibt 1,57 g (52%) amor phen t-Butyloxycarbonyl-L - seryl-L - tyrosyl L-seryl- L-met'hionin-methylester mit unscharfem Schmelz punkt bei etwa 115-125 ; [a]n -29-,8 1 (c = 2,12 in Methanol).
<I>Beispiel 8</I> t-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosyl-L-seryl- L-methionin-hydrazid 0,90 g (1,5 mMol)- t-Butyloxycarbonyl-L-seryl- L-tyrosyl-L-seryl-L-methionin-methylester werden in 10 ml Methanol gelöst und mit 0,25 ml Hydrazin- hydrat versetzt. Nach 18 Stunden wird das ausge schiedene amorphe Hydrazid, abfiltriert und mit Me thanol gewaschen: 0,81 g (90 %), F. 185-188 (Sintern bei l78 ).
Das Rohprodukt wird zur Entfernung von Spuren Hydrazin mit Wasser verrieben und darauf aus Methanol umgefällt: 0,75 g (83 %), F. 191-193 ; [a] D -36,7 1 (c = 2,02 in Wasser-Methanol 1 :1).
<I>Beispiel 9</I> y-t-Butyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl- L-arginyl-L-tryptophyl-glycin 975 mg (0,9 mMol) Carbobenzoxy-(y-t-butyl)-L- glutamyl'-L-histidyl-Irphenylalanyl nitro - L - arginyl - L-tryptophyl-glycin (G.
Nr. 13 641/60 - Case 4587/ 1-4) werden in 100 cm3 9-Oprozentiger Essigsäure in Gegenwart von 400 mg 1-0 % Pd/Kohle-Katalysator während 17 Stunden bei Normaldruck und Zimmer- temperatur in einer Wasserstoffatmosphäre geschüt telt.
Die vom Katalysator befreite Lösung dampft man im Vakuum bei 40 zur Trockene ein und fällt den Verdampfungsrückstand einmal aus Metha- nol/Äther um. Nach dem Trocknen im Hochvakuum erhält man 845 mg Hexapeptid-y-tert.-butylester.
Im U. V.-Spektrum zeigt es Amax 290 m,u <I>a</I> = 4800 Amax 280 my s = 5800 Amax <I>274</I> mg s = 5700 In der Hochspannungselektrophorese wandert das Peptidderivat bei 3000 Volt und pH 1,9, während 1 Stunde 14,5 cm, und gibt mit Pauly-,
Ehrlich- und Sakaguchi-Reagens sowie mit Ninhydrin eine posi tive Reaktion.
<I>Beispiel 10</I> <I>t-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-</I> L-methionyl-(y-t-butyl)-L-glutamyl-L-histidyl- L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin 3310 mg (0,55 mMol) t-Butyloxycarbonyl=L-seryl- L-tyrosyl-L-seryl-L-me'thionin hydrazid werden in 3,5 cm3 auf -10 gekühltem Dimethylformamid ge löst und bei dieser Temperatur 1,
5 cm3 1n Salz säure zugetropft. Nach 2-3 Minuten trägt man lang sam 0,6 cm3 auf 0 gekühlte 1N Natriumnitrit- 1'ösung ein und lässt 3 Minuten bei -5 bis -10 re agieren.
Hierauf versetzt man die Reaktionslösung mit 25 cm3 Eiswasser. Das Azid fällt dabei nicht aus. Durch intensives Kratzen mit einem Glasstab an der Gefässwand scheidet sich .das Azid als feiner kristal liner Niederschlag aus. Die Kristallisation ist etwa nach 20-3,Ominütigem Stehen bei 0 beendet.
Man filtriert durch eine Glasfilternutsche, wäscht den Filterrückstand zuerst mit eiskalter 0,5N Natrium- bicarbonatlösung bis zur alkalischen Reaktion und zum Schluss mit Eiswasser .neutral. Das Azid wird im Exsikkator währen 21/2 Stunden lyophyl getrocknet.
Ausbeute: 275 mg (82 % der Theorie), F. = 98 bis 102 (Zersetzung).
Die 275 mg (0,45 mMol) Azid trägt man sofort unter Rühren in die auf -10 gekühlte Lösung von 400, mg (0,45 mMol) y-t-Butyl-L-glutamyl-L- histidyi-L-phenylalanyl-L-aaginyl L - tryptophyl - gly ein in 15 cm3 Dimethylformamid enthaltend 0,50 mMol Triäthyl'amin ein.
Man lässt 20 Stunden bei 0 reagieren, versetzt anschliessend die Reaktionslösung mit 0,2 cm3 Eis essig und fällt hierauf mit viel Essigester das rohe BOC-Dekapeptid aus. Ausbeute: 580 mg (89 F. = 192-193 (Zersetzung).
Das rohe Peptidderivat aus 3,0 cm3 90prozentigem Methanol umkristallisiert ergibt 450, mg reines BOC- Dekapeptid, F. = 203 (Zersetzung).
Im Papierchromatogramm in den Systemen 43 und 45 zeigt das BOC-Dekapeptid die folgenden Rf-Werte 43/0,74 und 450,70.
Wird das BOC-Dekapeptid mit wasserfreier Tri- fluoressigsäure gespalten, so erhält man das freie Dekapeptid, das in der Hochspannungselektrophorese bei 3000 Volt und pH 1,9 in einer Stunde 12,5 cm wandert.
Process for the production of new decapeptides The subject of the invention is a process for the production of new decapeptides of the formula L-Seryl-L-tyrosyl-Irseryl-L-methionyl-L-glutaminyl (or Ir glutamyl) -L-histidyl-L-phenylalanyl-L- arginyl-L-tryptophyl-glycine.
The new compounds have the effect of the natural melanocyte-stimulating pituitary hormone (MSH effect). Above all, however, they have a stimulating effect on the secretion of adrenocorticotropic hormone (ACTH) from the ante-pituitary gland (corticotropin releasing factor = CRF effect)
and can accordingly be used as remedies. Furthermore, they can be used as intermediate products for the production of medicinal products which have a longer chain of amino acids, such as the melanocyte-stimulating hormone and ACTH.
The new peptides can be obtained by the methods known for peptide production, the amino acids being linked in the order mentioned individually or after prior formation of smaller peptide units.
The method according to the invention is characterized in that the amino acids L-serine, L-tyrosine, L-serine, L-methionine, L-glutamine (or L = glutamic acid), L-histidine, L-phenylalanine , Arginine,
L-tryptophan and gl'ycin combined with one another in the given order with intermediate protection of amino or carboxyl groups. In Figs. 1 and 2, embodiments of the method are provided.
EMI0001.0060
EMI0002.0001
BOC means a tert-butyloxycarbonyl group; 0R is an ester group.
EMI0002.0006
The free, functional groups not involved in the reaction are expediently protected, in particular by means of radicals which can be easily split off by hydrolysis or reduction, the carboxyl group preferably by esterification, e.g.
B @. with methanol, benzyl alcohol, p-nitrobenzyl alcohol, the amino group, for example by introducing the tosyl, trityl radical or the carbobenzoxy group or colored protective groups, such as the p-phenylazobenzyloxycarbonyl group and the p- (p = methoxyphenylazo) -benzyloxycarbonyl group (MZ) @,
or in particular the tert-butyloxycarbonyl radical. The nitro group is suitable for protecting the amino group in the guanido grouping of the Argini @ n; However, the said amino group of arginine does not necessarily have to be protected during the reaction.
The conversion of a protected NH2 group into a free group and the transfer of a functionally modified carboxyl group into a free carboxyl group in the course of the process for the preparation of the decapeptides and intermediates can be carried out by methods known per se by treatment with hydrolyzing or reducing agents . Depending on the procedure, the new compounds are obtained in the form of bases or their salts.
The bases can be obtained from the salts in a manner known per se. From the latter, in turn, salts can be obtained by reacting with acids.
The decapeptides obtained according to the method can be used in the form of pharmaceutical preparations. These contain the peptides z. B. in a mixture with a pharmaceutical, organic or inorganic carrier material suitable for enteral or parenteral application.
In the following examples, the temperatures are given in degrees Celsius. The following systems were used for paper chromatography: System 43 - terc. Amyl alcohol: isopropanol: water = 100: 40: 55, system 45 = sec. Butanol: 3% ammonia = 100: 44, system 5-0 = tert. Amyl alcohol: isopropanol: triethylamine: veronal:
Water = 100: 40: <B> 0.8: </B> 1.8 g r: 50, system 54 = sec. Butanol: isopropanol: monochloroacetic acid: water = <B> 70: </B> 10: 3 gr: 40. <I> Example 1 </I> t-butyloxycarbonyl-L-serine methyl ester A solution of 19 g (0 , 16 mol), L-serine methyl ester (freshly prepared from 25g ester hydrochloride) in 75 cm3 dry pyridine is added with 42.8 g (0.3 mol)
t-Butyloxycarbonylazid added and left to stand for 24 hours at room temperature. The pale yellow colored reaction solution is concentrated in vacuo at 3.0 to a small volume, ethyl acetate is added and the ethyl acetate solution is washed several times with 1N hydrochloric acid, 1N sodium hydrogen carbonate solution and water, while cooling with ice, dried and evaporated in vacuo.
After several extractions with petroleum ether (removal of excess t-butyloxycarbonylazide), the syrup obtained gives 27 g (77%) of t-butyloxycarbonyl-L-serine methyl ester as an oil, which is further reacted directly.
<I> Example 2 </I> t-Butyloxycarbonyl-L-serine hydrazide 27 g of crude t-butyloxycarbonyl4L-serine methyl ester are dissolved in 200 cm3 of methanol and mixed with 20 cm3 of hydrazine hydrate.
After 24 hours, the solution is evaporated in vacuo at a maximum of 30 and the syrup obtained is kept overnight in high vacuum over concentrated sulfuric acid to remove excess hydrazine. The solid residue is triturated with ethyl acetate, the isolated kri's'talline material is freed from traces of HydTazine at 0.01 mm above sulfuric acid and recrystallized from ethyl acetate: 23.3 g (86%);
F. 112 to 114; [a] D-9-.4 1 (c = 4.06, in methanol). <I> Example 3 </I> t-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosyl-L-serine methyl ester a) Starting from t-butyloxycarbonyl-L-serine hydrazide, 11 g (50 mmol) of t-butyloxycarbonyl-L -serine hydrazide are quickly dissolved in 100 em3 to -l0 pre-cooled 1N hydrochloric acid (containing 10g sodium chloride to lower the freezing point)
dissolved and mixed with a solution, cooled to -10, of 4.2 g (60 mmol) sodium nitrite in 15 cm3 water. After 5 minutes, the t-bufiyloxycarbonyl-L-serine azide precipitated as oil is extracted twice with 150 cm3 of ethyl acetate each time (pre-cooled to -10), the ethyl acetate solution is washed with cold 1N sodium hydrogen carbonate solution and ice water,
briefly dried over magnesium sulphate at 0 and concentrated in vacuo at a maximum of 20 to about 50 cm3.
The solution of the azide is at 0 with 14 g (50 mmol) of freshly prepared L-tyrosyl = L-serine methyl ester (see. Boissonnas, Helv. 41, 1852 [1958];
</B> Skeggs, J. Exp. Med. <I> 108, </I> 283 [1958]) in 50 cm3 of dry tetrahydrofuran and left to stand for 48 hours at +5.
The reaction solution is then concentrated to a small volume in vacuo to remove tetrahydrofuran, diluted with ethyl acetate and washed at 0 with a little 1N hydrochloric acid, sodium hydrogen carbonate solution and water (in some approaches part of the reaction product separated during the wa and was filtered off),
dried and evaporated in vacuo. Upon trituration of finite ether, the residue yields 14.7 g (63%) of amorphous substance, which is sufficient for the subsequent conversion into the hydrazide.
Twice recrystallization from a little acetone gives the pure crystalline t-butyloxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosyl-L-serine methyl ester: mp 124 to 127; [a] D - 23.6 111 c = 1.95 in methanol); sparingly soluble in ether, benzene, chloroform; soluble in hot ethyl acetate and hot water (needles when cooling, F. 97-105, hydrate).
The splitting off of the t-butyloxycarbonyl group by means of hydrochloric acid in ethyl acetate or trifluoroacetic acid gives pure L-seryl L-tyrosyl-L-serine methyl ester according to paper chromatography.
The L-tyrosyl-L-serine methyl ester used as starting material is prepared as follows: 16 g (50 mmol) of L-tyrosyl-L-serine methyl ester hydrochloride [St. Guttmann and R.
A. Boissonnas, Helv. Chim. Acta 41, 18'52 (1958)] are suspended in 50 cm3 of ethyl acetate and stirred at 0 with 12 cm3 of a 5N solution of ammonia in methanol for 15 minutes; after adding a further 50 cm3 of ethyl acetate, the precipitated ammonium chloride is filtered off and the filtrate is carefully evaporated in vacuo.
The oily residue results after repeated trituration with ether 14 g of free ester, used directly in the approach described above;
amorphous powder, sparingly soluble in ethyl acetate (soluble in the presence of <B> 10% </B> methanol), easily soluble in tetrahydrofuran and acetonitrile '. b) starting from L-seryl-L-tyrosyl-L-serine methyl ester 2.0 g (4 mmol) carbobenzoxy-L-seryl-L-tyrosyl-L-serine methyl ester [K. Hofmann et al., J. Am.
Chem. Soc. 79: 1636 (1957); St. Guttmann and R. A. Boissonnas, Helv. Chim. Acta 41, 1892 (1958l are dissolved in 40 cm3 of methanol and hydrogenated in the presence of 1 g of palladium carbon (1-0%) at room temperature and normal pressure, the carbon dioxide formed being absorbed in sodium hydroxide solution.
After recording the calculated amount of hydrogen (20 minutes). when the hydrogenation has ended and the solution filtered off from the catalyst is evaporated in vacuo. When the residue is rubbed with acetonitrile, the L-seryl-L-tyrosyl-L-serine methyl ester crystallizes in the form of fine sodium:
1.21 g (82%); F. 155-158; after recrystallization from water or a little alcohol: mp 158-160; [a] D + 4.6 1 (c = 3.91 in methanol), + 11.5 1 (c = 2.00 in 0.1N hydrochloric acid in methanol '); Literature value for hydrochloride: + 10.2 (c = 2.6 in methanol). The substance is uniform according to paper chromatography.
A solution of 369 mg (1 mmol) of L-seryl-L-tyrosyl-L-serine methyl ester in 2 cm3 of dry pyridine is mixed with 239 mg (1 mmol) of t-butyloxycarbonyl-p-nitrophenol and overnight at 20 ditched.
The reaction solution is carefully evaporated in vacuo, the residue is taken up in ethyl acetate and further worked up as under a); Crude product after trituration with ether: 295 mg (63, ', o); after recrystallization from acetone: 233 mg (50%), mp 123-126; [a] D -23.11 1 (c = 2.04 in methanol).
If 0.36 g (2.5 mmol) of t-butyloxycarbonylazide are used instead of t-butyloxycarbonyl-p-nitrophenol, 305 mg (69%) of the crude product or 245 mg (52%) of the pure substance are obtained.
<I> Example 4 </I> t-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosyl-L-serine hydrazide A solution of 14 g (30 mmol) of crude t-butyloxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosyl-irserine methyl ester in 100 cm3 methanol is mixed with 5 cm3 hydrazine hydrate and left to stand at room temperature.
After a short time, amorphous hydrazide begins to separate, which is filtered off after 6 hours, washed with methanol and dried overnight at 0.01 mm over concentrated sulfuric acid to remove traces of hydrazine: 11.8 g, mp 173-176.
By recrystallization from water, the hydrazide monohydrate is obtained in the form of felt-like needles of F. 184-187 (after sintering at 150); [a] D-3.4 1 (c = 1.76 in dimethylformamide), -24.9 1 (c = 2.18 in glacial acetic water 1: 1), -9 1 (c = 2.01 in pyrid'in).
When using pure starting material, the yield of recrystallized hydrazide is 75%.
<I> Example 5 </I> <I> t-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L- </I> tnethionyl-L-glutaminyl-L-histidyl-L-phenylalanyl- L- arginyl-L-tryptophyl-glycine-acetate 487 mg (1 mmol) BOC-seryl-tyrosyl-serine-hydrazide:
1 water of crystallization is quickly dissolved in 3 cm3 to -10 pre-cooled 1N hydrochloric acid (containing <B> 10% </B> sodium chloride to lower the freezing point) and added dropwise with 0.24 cm3 (1.2 eq.) Of a likewise pre-cooled 5N aqueous sodium nitrite solution added.
The azide formed separates out immediately as a thick, cheesy precipitate. The reaction solution is covered with a layer of 5 cm3 of cooled ethyl acetate and dissolved for 5 minutes at -10.
Then it is extracted twice with 10 cm3 of ethyl acetate. The combined ethyl acetate phases are shaken with 1 cm3 of saturated sodium bicarbonate solution, washed three times with 1 cm3 of ice water and dried briefly at 0 over magnesium sulfate.
The ethyl acetate is evaporated to a small volume (2 cm3) in vacuo at room temperature, and the siTupous residue is taken up in 4 cm3 of cooled dimethylformamide. (After the ethyl acetate is completely concentrated, the azide crystallizes at 0; F. = (50) 135-15.0; from ether with partial decomposition.
At the same time, 520 mg (0.5 mmol) of L-methionyl-L-glutaminyl-L-histidyl4L-phenylalanyl-L-arginyl L-tryptophyl @ glycine acetate (cf. 'G. G.
No. 2269 ', / 61-Case 4497 / 1-4) 7.5 cm3 dimethylformamide, cools down to room temperature, add -0.76 cm3 of a 10% solution of triethylamine in dimethylformamide (0.55 mmol) and mixes the solution, cooled to -10, with the freshly prepared azide solution.
The mixture is left to react for 2 days at 0, cooled again to -10 and neutralized with 0.275 cm3 of 1N hydrochloric acid. The crude reaction product is precipitated by adding a large amount of ethyl acetate, filtered and dried over phosphorus pentoxide in a high vacuum. The yield is 720 mg of crude butyloxycarbonyl dekapept'idacetat, which in the paper chromatogram is only about 5% of a slower moving,
indicating pauli positive substance.
After a single crystallization from methanol, the analysis preparation melts at 202 with decomposition. The acetyl determination shows only 1/2 mole of acetic acid as acetate, based on arginine.
The Rf values in the systems 43; 45 and 54 are 0.69, 0.60 and 0.72.
<I> Example 6 </I> <I> L-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L- </I> gdcttaminyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L- tryptophyl-L-glycine acetate 125 mg of BOC decapeptide are left to stand with 1.5 ml of anhydrous trifluoroacetic acid for 1 hour at room temperature. The trifluoroacetic acid is evaporated in vacuo at 40 and the syrupy residue is repeatedly scratched with plenty of absolute ether.
The trifluoroacetate of the decapeptide is obtained as a slightly pink powder.
The dried compound is dissolved in 1 ml of water and washed with a further 30 ml of water through an ion exchange column IR-4B (acetate form).
After the water has evaporated, the glassy residue is taken up in a little methanol and the decapeptide is precipitated with acetone. 100 mg of seryl-tyrosyl-seryl-methionyl-gutaminyl-bi'stidyl-phenylalanyl-arginyl tryptophyl-glycine acetate are obtained. F. 192-194.
In the paper chromatogram, the decapeptide in systems 45, 50 and 54 shows the following Rf values: 0.51; 0.47 or about 58. In the Saffran and Schally test, it shows strong CRF activity.
<I> Example 7 </I> t-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionine-methyl ester A solution of L-butyl'oxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosyl-L-serine -acid, freshly prepared from 2.44 g (5 mmol) of t-butyloxycarbonyl-L-seryl -Ir tyrosyl-L serine hydrazide monohydrate according to Example 6 in 30 ml of ethyl acetate is mixed with 1.53 g (10 ml)
Freshly distilled L-methionine methyl ester was added and left to stand at 0 for 48 hours. The reaction product precipitated as jelly is filtered off and washed with ethyl acetate and ether: 1.89 g;
After the usual work-up, a further 0.25 g of substance are obtained from the filtrate (total 2.14, g = 21 no. Reprecipitation from ethyl acetate gives 1.57 g (52%) of amorphous t-butyloxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosyl L-seryl-L-met'hionine methyl ester with an indistinct melting point at about 115-125; [a] n -29-.8 1 (c = 2.12 in methanol).
<I> Example 8 </I> t-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionine hydrazide 0.90 g (1.5 mmol) - t-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L -tyrosyl-L-seryl-L-methionine methyl ester are dissolved in 10 ml of methanol and mixed with 0.25 ml of hydrazine hydrate. After 18 hours, the separated amorphous hydrazide is filtered off and washed with methanol: 0.81 g (90%), F. 185-188 (sintering at 178).
The crude product is triturated with water to remove traces of hydrazine and then reprecipitated from methanol: 0.75 g (83%), mp 191-193; [a] D -36.7 1 (c = 2.02 in water-methanol 1: 1).
<I> Example 9 </I> yt-Butyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycine 975 mg (0.9 mmol) carbobenzoxy- (yt-butyl) - L-glutamyl'-L-histidyl-Irphenylalanyl nitro - L - arginyl - L-tryptophyl-glycine (G.
No. 13 641/60 - Case 4587 / 1-4) are shaken in 100 cm3 of 9% acetic acid in the presence of 400 mg of 1-0% Pd / carbon catalyst for 17 hours at normal pressure and room temperature in a hydrogen atmosphere .
The solution freed from the catalyst is evaporated to dryness in vacuo at 40 and the evaporation residue is precipitated once from methanol / ether. After drying in a high vacuum, 845 mg of hexapeptide-y-tert-butyl ester are obtained.
In the UV spectrum it shows Amax 290 m, u <I> a </I> = 4800 Amax 280 my s = 5800 Amax <I> 274 </I> mg s = 5700 In high-voltage electrophoresis, the peptide derivative migrates at 3000 volts and pH 1.9, for 1 hour 14.5 cm, and gives with Pauly,
Ehrlich and Sakaguchi reagent as well as ninhydrin gave a positive reaction.
<I> Example 10 </I> <I> t-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosyl-L-seryl- </I> L-methionyl- (yt-butyl) -L-glutamyl-L-histidyl- L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycine 3310 mg (0.55 mmol) of t-butyloxycarbonyl = L-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionine hydrazide are added in 3.5 cm3 -10 chilled dimethylformamide dissolved and at this temperature 1,
5 cm3 of 1N hydrochloric acid were added dropwise. After 2-3 minutes, slowly add 0.6 cm3 of 1N sodium nitrite solution cooled to 0 and let react for 3 minutes at -5 to -10.
25 cm3 of ice water are then added to the reaction solution. The azide does not precipitate. Intensive scratching with a glass rod on the vessel wall separates the azide as a fine crystalline precipitate. Crystallization is complete after about 20-3.0 minutes of standing at 0.
It is filtered through a glass suction filter, the filter residue is first washed with ice-cold 0.5N sodium bicarbonate solution until it has an alkaline reaction and finally with ice water .neutral. The azide is lyophilized in a desiccator for 21/2 hours.
Yield: 275 mg (82% of theory), m.p. = 98 to 102 (decomposition).
The 275 mg (0.45 mmol) azide is immediately carried with stirring into the solution of 400 mg (0.45 mmol) yt-butyl-L-glutamyl-L-histidyi-L-phenylalanyl-L- cooled to -10 aaginyl L - tryptophyl - gly a in 15 cm3 of dimethylformamide containing 0.50 mmol of triethylamine.
The reaction mixture is left to react for 20 hours at 0, 0.2 cm3 of glacial vinegar is then added to the reaction solution, and the crude BOC decapeptide is then precipitated with a large amount of ethyl acetate. Yield: 580 mg (89 F. = 192-193 (decomposition).
The crude peptide derivative, recrystallized from 3.0 cm3 of 90 percent methanol, gives 450 mg of pure BOC decapeptide, F. = 203 (decomposition).
In the paper chromatogram in systems 43 and 45, the BOC decapeptide shows the following Rf values 43 / 0.74 and 450.70.
If the BOC decapeptide is cleaved with anhydrous trifluoroacetic acid, the free decapeptide is obtained, which migrates 12.5 cm in one hour in high-voltage electrophoresis at 3000 volts and pH 1.9.