Procédé de conservation de substances biologiques et appareil pour la mise en oeuvre de ce procédé La a présente invention concerne la technique de la conservation n à basse température de substances biologiques. Plus particulièrement, l'invention concerne les procédés et les appareils pour le refroidissement rapide, le stockage et le réchauffement rapide de substances biologiques telles que sang, moelle osseuse, autres sus, pensions de cellules et fluides biologiques.
La préservation des substances biologiques contre les altérations en cours de stockage a posé constamment un problème pour les savants. Le problème est particulièrement aigu dans le cas du sang. L'entretien de banques de sang et l'avantage du stockage de sang entier en énormes quantités en vue de son emploi lors de catastrophes crée le besoin impératif d'un procédé pour la conservation prolongée de sang stocké. Aucun procédé ou appareil employé précé- demment ne s'est montré entièrement satisfaisant pour la conservation et le stockage prolongé de lots de 1/2 1 de sang entier transfusable.
Dans le cas du sang, les constituants vivants principaux sont les érythrocytes ou globules rouges du sang. Le problème de la conservation du sang entier est donc fondamentalement lié à la conservation des globules rouges. Les globules rouges ont la forme de plaquettes rondes et contiennent un cytoplasme de type spécial enfermé dans une membrane semi-perméable. Cette membrane assure l'intégrité du contenu protéique et électrolytique du cytoplasme enfermé.
La membrane est duotile mais essentiellement non élastique, et il existe donc un volume critique du globule rouge au-delà duquel la membrane est endommagée. Cette altération de la membrane provoque la libération du constituant porteur d'oxygène des érythrocytes, c'est-à-dire l'hémoglobine, dans le plasma sanguin, où il ne peut pas exercer sa fonction de porteur d'oxygène et d'anhydride carbonique.
La quantité d'hémoglobine libérée par un nombre donné de globules est une mesure de l'efficacité des divers procédés de conservation du sang. Plus la quantité d'hémoglobine libérée est faible, plus le procédé et/ou l'appareil est efficace pour conserver les globules.
Normalement, c'est-à-dire dans le système circulatoire du corps, les globules rouges ont une durée de vie d'environ 100 à 120 jours. Ils se détériorent par contre beaucoup plus rapidement en dehors du corps. L'une des altérations affectant le sang en dehors du corps est le phénomène de la coagulation.
Pour le stockage du sang, il est essentiel d'éviter la coagulation. A cet effet, on ajoute des ions citrate, oxalate ou fluorure qui inhibent les changements chimiques, tels que l'interaction des ions calcium avec certains composants, qui aboutit ordinairement à la coagulation. La coagulation n'est cependant pas la seule difficulté intervenant dans la oonservation du sang.
Le globule rouge a son propre métabolisme d'entretien et ses processus métaboliques se poursuivent en dehors du corps jusqu'à ce que la réserve de sucre sanguin soit épuisée par transformation en acide lactique. A ce moment, les substances et processus qui sont essentiels à la conservation de la structure cellulaire sont épuisés. En outre, le pH du plasma diminue jusqu'à un niveau défavorable, par accumulation d'acide lactique. Dans le sang prélevé, l'équilibre osmotique entre la matière intracellulaire et la ma tière extracellulaire est t rapidement détruit et l'eau du plasma diffuse dans la cellule en provoquant un gonflement anormal et finalement la rupture de la membrane. Ces changements se produisent rapidement à la température ordinaire et aux concentrations courantes de citrate et de glucose.
Ordinairement, pour préserver le sang vis-à-vis des altérations mentionnées ci-dessus, on recueille le sang d'un donneur dans une solution acide de citrate et de dextrose, après quoi on refroidit entre 4 et 60 C. Ce procédé ne permet toutefois qu'environ trois semaines de conservation sûre du sang. A la fin de cette période, les processus de dégradation ont progressé jusqu'à un point auquel l'efficacité fonctionnelle des cellules sanguines a décliné en dessous d'un niveau acceptable. Comme chaque lot doit être remplacé toutes les trois semaines, il s'est avéré impossible de stocker le sang en grande quantité.
D'autres procédés ont été essayés, mais aucun de ceux-ci ne s'est montré apte au stockage en masse à l'échelle industrielle de sang humain entier en lots de 1/4 OU 1/2 1.
Pour stopper les processus de dégradation décrits ci-dessus, une méthode rationnelle consiste à abaisser la température du sang jusqu'à un point où le métabolisme est essentiellement arrêté. Cependant, il faut pour cela que le sang franchisse l'intervalle de température de la congélation. En l'absence d'additifs protecteurs pendant la congélation ou/et le dégel du sang, la membrane cellulaire est endommagée au point que les globules sont hémolysés.
Le sang a été congelé en masse ou en pellicule mince. Pour la congélation en masse, des produits chimiques protecteurs tels que le glycérol ont été employés en concentration atteignant 50 0/, pour protéger les globules rouges vis-à-vis des altérations dues à la cristallisation de la glace. Ces produits chimiques protecteurs doivent être éliminés du sang avant la transfusion, de sorte que ces produits de congélation en masse sont coûteux et prennent beaucoup de temps. En outre, les appareils et les opérations nécessaires pour séparer les produits chimiques protecteurs du sang sont compliqués et coûteux et ne se prêtent pas à la mise en oeuvre par les techniciens des hôpitaux. Us ne conviennent pas non plus au stockage en masse de sang transfusable.
Un autre procédé expérimental précédemment décrit utilise la polyvinylpyrrolidone comme agent protecteur pour la conservation du sang entier (Comptes Rendus des Sciences de la Soc. de Biologie, 149, 875, 1955). Ce procédé implique la congélation du sang avec 35 O/o de polyvinylpyrrolidone par immersion dans un bain de glace sèche. I1 n'a que peu d'intérêt en raison du grand volume de polyvinylpyrrolidone qui doit être employé, ce qui nécessite la séparation des globules rouges et leur remise en suspension dans du plasma neuf, avec risque de coagulation, de destruction physique, etc., des cellules.
On connaît d'autres procédés de congélation de produits alimentaires, de plasma sanguin et substances analogues sous forme de gouttelettes. En particulier, il existe un procédé de congélation de l'extrait de café, consistant à injecter le café dans un bain de trifluorotrichloroéthane et d'hexane normal à basse température (-500C). Dans ce procédé, le café est injecté à la base d'une colonne de bain congelant et monte par différence de densité jusqu'en un point de déchargement. Ce procédé ne convient pas pour la conservation du sang, car les hydrocarbures et les hydrocarbures halogénés provoquent l'hémolyse des globules rouges. En outre, l'injection du sang chaud directement dans un réfrigérant à basse température provoque la congélation du sang dans les buses d'injection et leur colmatage.
L'invention a donc pour but un procédé et un appareil pour le traitement et la conservation de substances biologiques, permettant notamment le stockage de sang entier en volume important pendant de longues durées sans altération sensible des globules rouges, ceux-ci récupérant rapidement leur état normal à la fin du stockage, sans qu'il soit nécessaire d'éliminer les additifs protecteurs après le dégel et avant la transfusion.
L'invention est basée sur la découverte que, lorsque des substances biologiques telles que le sang sont congelées et surrefroidies assez rapidement puis, après un stockage de durée quelconque, sont dégelées assez rapidement, l'intégrité biologique des substances peut être maintenue sans altération sensible.
Malheureusement, les vitesses de congélation et de dégel extrêmement élevées qui sont nécessaires pour éviter l'altération biologique ne peuvent pas être obtenues par les moyens connus, comme par exemple l'immersion d'un récipient de sang dans un bain d'azote liquide. Dans ce procédé connu, le taux de transmission de chaleur entre l'azote liquide et le récipient est de l'ordre de -1360 g.calories/(h)(cm de surface du récipient), jusqu'à ce que la température de la paroi interne du récipient soit abaissée jusqu'à environ-1750C, auquel point le taux de transmission de la chaleur augmente brusquement.
Cependant, le taux initial de transmission de la chaleur est trop faible pour une congélation rapide, par exemple sans réduction notable du pourcentage de récupération des globules rouges. On a trouvé que si le taux de transmission de chaleur est d'au moins 3800 g. oalories/(h) (cm2), et de préférence d'au moins 6520 g.calories/(h)(cm-'), pendant toute la phase de congélation, celle-ci peut être suffisamment rapide pour assurer des pourcentages élevés de récupération des globules rouges, de l'ordre d'au moins 85 O/o.
La présente invention a donc pour objet un procédé de conservation de substances biologiques, dans lequel on dispose ladite substance dans un récipient, on soustrait de la chaleur de la surface externe du récipient par mise en contact du récipient avec un réfrigérant pendant un temps suffisant pour congeler la substance biologique se trouvant dans le récipient, puis on stocke la substance congelée. Ce procédé est caractérisé en ce que l'on soutire la chaleur des parois du récipient à un taux d'au moins 3800 petites calories/(h)(cm2 de surface de récipient).
Cette soustraction de chaleur peut par exemple être effectuée au moyen d'un récipient revêtu d'une mince pellicule isolante, ayant un pouvoir isolant suffisant pour amener la différence de température entre la surface rejetant de la chaleur du solide revêtu et un milieu réfrigérant en ébullition à une valeur à laquelle une transmission de chaleur plus efficace apparaît. Le taux de transmission de chaleur peut être encore amélioré en appliquant une couche de matière pulvérulente sur la mince pellicule isolange mentionnée, qui sert alors de sous-couche.
On admet que la couche de matière pulvérulente augmente encore le taux de transmission de chaleur pour au moins deux raisons: premièrement, la discontinuité de la surface favorise la formation de bulles, et deuxièmement, les parties exposées des particules de la poudre se refroidissent rapidement, de sorte que l'ébullition en régime nucléé s'établit rapidement.
Par exemple, la glycérine convient tout particulière- ment comme matière pour former la mince pellicule isolante et la silice finement divisée s'est montrée particulièrement efficace pour former la couche de matière pulvérulente.
La glycérine est soluble dans l'eau; un procédé très efficace pour dégeler les substances biologiques congelées consiste en la mise en contact des parois du récipient avec de l'eau à une température de préférence inférieure à environ 55O C. La pellicule isolante et la couche pulvérulente sont de préférence enlevées par ce contact. Pour réaliser le dégel rapide qui est nécessaire, le récipient est de préférence construit en un matériau donnant une valeur K/L d'au moins 0,3375 (K = g.cal/(h)(cm)(0C) et L = épaisseur de la paroi en centimètres).
De préférence, on secoue le récipient pendant la congélation rapide et pendant le dégel pour faciliter un flux uniforme de la chaleur dans la substance biologique se trouvant dans le récipient.
Le contact réfrigérant est de préférence maintenu pendant un temps suffisant pour faire franchir à la substance biologique sa région critique de température, après quoi la matière congelée peut être stockée pendant toute la durée désirée. L'expression région critique de tempérakure telle qu'utilisée ici englobe aussi bien la zone de congélation que la zone de surrefroidissement, car l'altération des cellules peut se produire dans les deux zones. Par exemple, dans le cas du sang, la région critique de température est comprise entre le point où les mélanges sanguins sont pratiquement congelés et environ 500 C.
L'invention sera décrite plus particulièrement dans son application à la conservation du sang. I1 est cependant entendu qu'elle convient également à la conservation d'autres substances biologiques telles que la moelle osseuse, le sérum, c'est-à-dire le sang privé des cellules et du fibrinogène, les fractions de plasma sanguin et le liquide céphalo-rachidien. De même, des microorganismes tels que les bactéries
Azotobacter vinelandi, Escherichia coli et Micrococcus pyrogenes, la moisissure Aspergillus niger et la levure Saccharomyces sp. peuvent être ainsi conservés.
Dans le dessin annexé:
La fig. 1 représente une courbe de transmission de chaleur par ébullition, illustrant la relation entre le flux de chaleur et la différence de température entre la surface d'un solide chauffé et celle d'un liquide en ébullition.
La fig. 2 représente une courbe de vitesse de refroidissement pour l'azote liquide, dans laquelle la durée de refroidissement est portée (en ordonnées) en fonction de l'épaisseur de la pellicule isolante de revêtement (en abscisses).
La fig. 3 représente une série de courbes de taux de transmission de chaleur pour diverses épaisseurs d'un type de matière de revêtement.
La fig. 4 représente une série de courbes de taux de transmission de chaleur pour diverses matières isolantes de revêtement.
La fig. 5 représente une courbe illustrant l'amélioration de la transmission de chaleur dans le cas d'un échantillon pourvu d'un revêtement de sucreglycérine.
La fig. 6 représente une série de courbes de refroidissement pour des revêtements sucre-glycérine, montrant l'effet de plusieurs variables dans un intervalle de température de 250 C à -960 C.
La fig. 7 représente une série de courbes de refroidissement pour des revêtements sucre-glycériae, montrant l'effet de plusieurs variables sur un intervalle de température de O à -750 C.
La fig. 8 représente une série de courbes de taux de transmission de chaleur pour des revêtements sucre-glycérine, montrant l'effet des mêmes variables que dans la fig. 7 dans un intervalle de température des750 à0OC.
La fig. 9 est une vue en perspective de haut en bas d'un récipient rectangulaire pour le stockage de substances biologiques conformément à l'invention.
La fig. 10 est une vue en perspective de haut en bas d'un récipient cylindrique pour le stockage de substances biologiques conformément à l'invention.
La fig. 11 est une vue en perspective de haut en bas d'encore un autre récipient pour le stockage de substances biologiques, et
la fig. 12 est une coupe longitudinale du récipient représenté à la fig. 11, prise suivant la ligne 12-12 de la fig. 11.
Les facteurs influençant la conservation de grandes quantités de sang vont maintenant être étudiés en détail.
Milieu anticoagulant
Les milieux particulièrement appropriés sont les solutions standards de citrate-dextrose ou d'héparine.
Ces milieux sont couramment employés pour la con servation du sang humain entier par réfrigération à environ 4 à 60 C.
Additifs protecteurs
Le sang est recueilli dans un mélange d'arLti- coagulant et d'additif protecteur, dans le récipient de congélation, de stockage et de dégel. Le sang peut également être recueilli dans un anticoagulant approprié et l'additif protecteur mélangé ensuite. La congélation et le dégel des globules rouges humains provoquent d'habitude la libération de l'hémoglobine (hémolyse) et la perte de l'intégrité biologique d'une proportion considérable des cellules. Le degré de destruction dépend de la composition du sang utilisé et des conditions physiques du refroidissement et du réchauffement.
Ainsi, un refroidissement rapide jus qu'à des températures très basses et un réchauffement rapide jusqu'à l'état liquide en partant de l'état congelé favorisent un pourcentage élevé de récupération des globules rouges, comme mentionné précédemment. La présence de certains solutés désignés ici additifs protecteurs , en combinaison avec d'autres caractéristiques de l'invention, permet de congeler et de dégeler le sang avec un haut pourcentage de récupération des globules rouges.
La congélation et le dégel de globules rouges humains ont été réalisés avec succès conformément à la présente invention, en présence de divers additifs protecteurs, notamment des sucres et des polymères solubles.
Les additifs diffèrent notablement quant à la mesure dans laquelle ils pénètrent dans les globules ou sont captés par les globules. Certains composés ne pénètrent pas dans les globules, en raison de leur dimension ou de leur structure. Par exemple, les globules rouges sont perméables au glucose mais sont imperméables au lactose et au saccharose. Pour ceux qui pénètrent dans les globules, l'entrée peut se faire par simple diffusion ou par capture active . Cette dernière dépend de systèmes enzymatiques ou de substances porteuses se trouvant dans la membrane cellulaire. Le glycérol pénètre très rapidement alors que le glucose entre plus lentement. En raison de leur grosseur moléculaire et de l'absence de systèmes transporteurs voulus, les di- et tri-saccharides ne pénètrent pas.
Ces différences de perméabilité sont facilement mises en évidence en exposant les globules rouges à des solutions de diverses substances et en analysant directement les concentrations cellulaires ou en mesurant l'augmentation de la concentration intra-cellulaire totale par des méthodes osmotiques.
Dans l'ensemble, les additifs protecteurs peuvent être divisés en quatre classes
a) Sucre à cinq et à six atomes de carbone.
Ceux-ci sont connus comme ayant la faculté de traverser la membrane des globules rouges. Comme exemples de sucres de cette classe, on peut citer le xylose, l'arabinose, le ribose, le glucose, le fructose, la galactose et la mannite. Les concentrations efficaces pour cette classe sont de 0,3 à 0,75 mole/litre.
b) Di- et tri-saccharides. Ceux-ci ne pénètrent pas dans le globule rouge. A titre d'exemple, on peut citer le maltose, le saccharose, le lactose et le raffinose. Les concentrations efficaces sont de 0,075 à 0,3 mole/litre.
c) Polymères à haut poids moléculaire solubles dans l'eau. Comme les sucres de la classe b) ci-dessus, ceux-ci ne pénètrent pas dans les globules rouges.
A titre d'exemple, on peut mentionner le dextran et la polyvinylpyrrolidone. Les concentrations efficaces sont de 6 à 10 o/o en poids. Les concentrations s'expriment plus commodément en pourcentage en poids qu'en concentrations moléculaires en raison du haut poids moléculaire.
d) Mélange d'au moins un représentant des classes a) et b) ci-dessus. Comme exemple d'un tel mélange, on peut citer le mélange de lactose et de glucose. On admet que ces mélanges sont plus efficaces que l'un ou l'autre des additifs pris séparément à leurs concentrations minimum. Cette conclusion s'appuie sur les chiffres du tableau I.
Tableau I
Activité protectrice
de divers sucres
pour ta congélation et le dégel
0/o de récupération
des globules rouges
Concentration du sucre, Température
moles/litre du bain de congélation C -20 -40 -77 -120
Lactose 0,1 7 17 62 45
Lactose 0,2 9 43 72 69
Lactose 0,3 18 49 83 83
Glucose 0,1 2 11 35 45
Glucose 0,2 3 17 51 59
Glucose 0,3 9 29 61 71
Lactose 0,1-Glucose 0,2 13 30 65 69
Lactose 0,1-Glucose 0,4 25 47 76 82
Lactose 0,1-Glucose 0,6 38 42 84 82
Lactose 0,3-Glucose 0,1 44 66 87 85
Lactose 0,3-Glucose 0,2 47 64 86 86
Lactose 0,3-Glucose 0,3 44 73 88 84
La méthode expérimentale ayant conduit aux résultats du tableau I est la suivante:
mélanger des échantillons consistant en quatre volumes de sang
avec une solution de 0,9 /o NaCl et le sucre essayé de manière à obtenir les concentrations en sucre indiquées. Congeler ensuite des échantillons de S ml dans des tubes d'aluminium à parois minces de section transversale elliptique de 4 x 29 mm par immer
sion dans des bains appropriés de méthanol-glace sèche (-200, - 400, -770 C) ou d'isopentane refroidi par l'azote liquide (-1200 C). Le dégel s'effectue par
immersion dans l'eau à 400 C.
Le tableau I montre également que la récupération des globules rouges augmente lorsque les
échantillons sont congelés dans des bains de tempé
rature décroissante.
Revêtements favorisant la transmission de la chaleur
La transmission de chaleur s'effectue soit à l'état de régime d'équilibre, soit à l'état transitoire de nonéquilibre. Dans tous les cas de transmission de chaleur par conduction, convexion et ébullition, un gradient de température doit exister. Lorsque la température reste constante en fonction du temps et de la position, la transmission de chaleur se fait à l'état de régime. Ainsi, lorsqu'un tube chauffé à la vapeur d'eau est immergé dans un bain d'azote liquide en ébullition, la température du tube tombe pendant la période initiale d'immersion puis devient constante et le reste ainsi à l'état de régime, aussi longtemps qu'on laisse la vapeur circuler dans le tube immergé à un débit constant.
La transmission de chaleur à l'état transitoire existe lorsque la température d'un système varie avec le temps et la position. Ainsi, une opération de trempe implique un processus de transmission de chaleur à l'état transitoire. Les températures en différents points de l'échantillon tombent avec des vitesses variables pendant l'opération de trempe.
Comme les taux de transmission de chaleur sont affectés par les variations de température, ces taux varient également.
Lorsqu'un liquide en contact avec un solide chauffé bout à une pression donnée, le taux de transmission de chaleur dépend de la différence de température entre la surface du solide et celle du liquide en ébullition. Cette dépendance conduit à des régimes spécifiques d'ébullition pouvant être représentés graphiquement. La fig. 1 montre la forme générale d'une courbe de transmission de chaleur par ébullition, dans laquelle le flux de chaleur Q/A est porté en ordonnées en fonction de la différence de température AT entre la surface du solide chauffé et le liquide en ébullition, en abscisses. Les coordonnées sont logartthmiques. Lorsque la température de surface du solide en contact avec le liquide augmente au-dessus de la température de saturation du liquide, des bulles de vapeur se forment en des régions spécifiques de la surface (sites de nucléation).
Ces bulles croissent t jusqu'à une grosseur critique, se détachent de la surface et montent dans le liquide. Lorsque la différence de température AT augmente de A à B le long de la courbe, le nombre de sites de nucléation augmente, ainsi que la fréquence de formation des bulles sur chaque site. La turbulence oausée par ces bulles augmente la transmission de chaleur jusqu'à ce que le point B soit atteint. Au point B, appelé point de flux thermique critique, le nombre de points de nucléation est tellement grand que les bulles commencent à interférer les unes avec les autres et il se forme un film de vapeur sur la surface. Dans la région de AT comprise entre B et C, ce film de vapeur est instable et est constamment dissipé et reformé très rapidement.
La faible conductivité thermique du film de vapeur diminue le taux de transmission de chaleur dans cette région. Au point C, le film de vapeur devient stable et isole complète- ment le solide, formant ainsi une barrière relativement calme sur la surface chaude. Au-delà de C, le taux de transmission de chaleur augmente à nouveau, en partie en raison d'effets de radiation et en partie en raison de l'augmentation de la conduotibilité thermique de la vapeur en fonction de la température.
En résumé, les régions peuvent être définies comme suit :
Domaine de AT Régime d'ébullition
A B Nucléé, par points ou local
B C Film instable
C Film stable
Bien que les courbes d'ébullition aient essentiellement la même forme pour tous les liquides, les valeurs associées aux courbes varient fortement.
Pour l'eau à pression atmosphérique le point B correspond approximativement à un AT de 250 C et un flux de chaleur de 89500 g.cal/(h)(cm2), le point C apparaît à un AT d'environ 560 C et le flux de chaleur est d'environ 27200 g.cal/(h)(cm2). Pour l'azote liquide à pression atmosphérique, le point B correspond approximativement à un AT de 30 C et à un flux de chaleur de 7880 g.cal/(h)(cm2) et le point C correspond à un AT de -170 C et un flux de chaleur de 544 g.cal/(h)(cni2). Les différentes régions d'ébullition peuvent être illustrées en considérant une casserole pleine d'eau chauffée sur un fourneau.
L'eau qui se trouve immédiatement voisine de la source de chaleur atteint en premier lieu sa température de saturation, puis est légèrement surchauffée. De petites bulles commencent à se former en des points séparés sur le fond. Ces bulles montent et se condensent dans le liquide plus froid. Comme la chaleur continue à être fournie sur le fond de la casserole, des bulles se forment en des points toujours plus nombreux et la fréquence de formation en chaque point augmente. On se trouve dans la région d'ébullition nucléée. Finalement, on atteint un point où il se forme un tel nombre de bulles qu'elles interfèrent les unes avec les autres et il se forme un film de vapeur instable sur le fond de la casserole.
La croissance explosive et la destruction de ce film apparaît immédiatement à la surface du liquide car des volumes relativement importants de vapeur sont libérés, ce qui cause une forte turbulence, qui fait parfois montes le liquide. C'est là l'ébullition par film instable. Admettons maintenant que le liquide a été évaporé à sec et laissons tomber une petite quantité d'eau sur le fond. il se produit alors le phénomène dît de Leidenfrost > , c'est-à-dire que des globules d'eau dansent sur la surface chaude sans s'évaporer sensiblement. Ce phénomène est dû à la présence d'un film de vapeur surchauffée sous chaque globule d'eau, et ce film fonctionne comme isolant thermique entre la surface chauffante et l'eau. C'est là l'ébullition par film stable.
Dans la présente invention visant la conservation
de masses de sang, la chaleur doit être transmise
à un réfrigérant en ébullition à travers les parois du solide du récipient de stockage du mélange sanguin.
Le taux de transmission de chaleur est plusieurs fois
augmenté par un changement de la différence de température qui place le système dans les régions d'ébullition instable ou nucléée. On voit à la fig. 1
que le type d'ébullition, et par conséquent le taux de transmission de chaleur, peut être modifié par une variation de la différence de température AT entre le liquide en ébullition et la surface avec laquelle il est en contact. Ainsi, une diminution de AT de la valeur correspondant au point C jusqu'à une valeur quelconque comprise entre C et A' conduit à une augmentation du flux de chaleur passant du solide au liquide en ébullition.
Ceci est réalisé en interposant entre un solide et un liquide à son point d'ébullition une matière de conductibilité thermique assez faible pour amener la différence de température AT entre la surface d'ébullition et le liquide à une valeur permettant un taux de transmission de chaleur plus élevé. Le solide est avantageusement un métal et de préférence un métal à haute conductibilité, de manière à réduire la résistance au passage de la chaleur à travers la masse d'une paroi de séparation.
La matière isolante peut être n'importe quelle substance chimiquement et thermiquement stable dans l'intervalle de t
Tableau II (suite)
Durée du
refroidissement
(sec.) 15. Composition caoutchouteuse,
0,39 mm 19 16. Ruban de papier-cache, 0,30 mm 19 17. Ruban de papier-cache, 0,60 mm - 32 18. Ruban de papier-cache, 0,90 mm - 38 19. Toile isolante d'électricien, 0,16 mm 18 20. Toile isolante d'électricien, 0,33 mm 26 21. Toile isolante d'électricien, 0,50 mm 32 22. Vaseline, 0,01 mm - 36 23. Vaseline, 0,025 mm 24 24. Vaseline, 0,05 mm 21 25. Vaseline, 0, 10 mm 14 26.
Vaseline, 0,15 mm 13,5 27. Vaseline, 0,20 mm 14 28. Vaseline, 0,25 mm 16 29. Vaseline, 0,37 mm - 17 30. Vaseline, 0, 45 mm 20 31. Amiante, 0,25 mm 42 32. Amiante, 0,95 mm 64 33. Silicate de sodium, 0,11 mm 33 34. Silicate de sodium, 0,17 mm 30 35. Kaolin, O,llmm 38 36. Plâtre de Paris, 0,19 mm 10
Les expériences ont montré d'une manière concluante que l'emploi de revêtements isolants minces, tels que les films de vaseline auxquels il a été fait allusion, sur les récipients de stockage du sang abrège considérablement les temps de refroidissement et conduit à une meilleure récupération des globules rouges après le dégel du sang.
Par exemple, du sang humain contenant 0,3 mole-litre de lactose comme additif protecteur a été congelé dans les récipients d'aluminium décrits précédemment par immersion dans un bain d'azote liquide à -1960 C. Des épaisseurs croissantes de vaseline ont été déposées sur les récipients, et le pourcentage de récupération des globules rouges a été déterminé après dégel. Le tableau III indique les résultats obtenus.
Tableau III
Epaisseur du revêtement Pourcentage de récupération
de vaseline (mm) des globules rouges
0 65
0,001 69
0,023 73
0,16 78
0,24 82
0,26 82
On a constaté que le taux de transmission de chaleur entre le réfrigérant et les parois du récipient peut être encore augmenté en appliquant une couche de matière pulvérulente sur le mince film isolant La couche de poudre forme une surface discontinue favorisant la formation des bulles, et les parties exposées des particules de poudre se refroidissent rapidement. Ces propriétés augmentent la vitesse d'établissement du régime nucléé d'ébullition. Les propriétés de la poudre qui semblent importantes du point de vue de l'efficacité de la transmission de chaleur sont la grosseur des grains et la distribution des grosseurs de grains.
Lorsque les propriétés physiques des poudres employées sont semblables, et que l'on fait varier la grosseur des particules, l'épaisseur du film isolant doit être un peu plus forte lorsque la grosseur des particules de poudre diminue.
Une poudre d'aérogel de silice ayant une grosseur de particules de 0,04 micron a donné les meilleurs résultats avec une sous-couche de glycérine de 127 microns, alors que des zéolites de métaaluminosilicate cristallines pulvérulentes à propriétés de tamis moléculaire, ayant une grosseur de particules de 2 à 4 microns, ont donné un taux de transmission de chaleur optimum lorsqu'elles ont été appliquées sur un film de glycérine d'environ 102 microns d'épaisseur.
Lorsque la poudre est un conducteur thermique relativement médiocre, comme c'est le cas pour les substances non métalliques illustrées par l'aérogel de silice et les poudres de zéolites mentionnées ci-dessus, les propriétés isolantes contribuent à établir une corrélation de la température de la surface et de la température du liquide en ébullition qui est essentielle à l'ébullition en régime nucléé, et l'épaisseur de la sous-couche isolante doit être relativement plus faible que lorsqu'un bon conducteur thermique, par exemple une poudre de métal, est employé.
En raison de la corrélation entre la grosseur de particules de la poudre et l'épaisseur du film sousjacent, un certain degré d'uniformité des grosseurs de particules de la poudre est nécessaire. En général, les poudres les plus fines sont préférées, et elles sont généralement plus uniformes que les poudres plus grossières.
En dehors de la silice finement divisée telle que l'aérogel de silice ayant des grosseurs d'agglomérats de particules inférieures à environ 0,1 micron et les zéolites cristallines à propriétés de tamis moléculaire des variétés A et X, toutes deux en grosseur d'agglomérats de particules de 2-4 microns, des poudres de sucre ont été utilisées. L'aérogel de silice est préférable au sucre du fait qu'on peut l'obtenir plus facilement dans les grosseurs ultra-fines et l'unes formité qui sont désirées pour la meilleure reprodue- tibilité dans la pratique réelle, car le sucre doit être moulu jusqu'aux ouvertures de mailles correctes afin d'obtenir un revêtement optimum. La zéolite A est décrite dans le brevet des U. S. A. No 2882243 et la zéolite X est décrite dans le brevet des U. S. A.
No 2882244.
Il convient de relever que l'emploi d'une couche de poudre implique une condition supplémentaire à remplir par le film. En effet, la sous-couche doit être formée d'une matière qui accepte et retient la poudre. La glycérine et la polyvinylpyrrolidone ont été toutes deux employées avec succès. La glycérine a été utilisée seule et également diluée avec du méthanol. Parmi d'autres matières pour sous-couche, on peut mentionner les huiles un général et les fluides de silicone. Une sous-couche soluble dans l'eau est préférable pour la conservation du sang car elle s'élimine par lavage pendant le dégel. Chacune des matières mentionnées ci-dessus est soluble dans l'eau ou peut être obtenue sous forme soluble dans l'eau. Par exemple, on trouve de nombreuses huiles détergentes.
Le solvant ou diluant, illustré par le méthanol mentionné ci-dessus, peut également consister en une autre substance. Par exemple, l'éthanol, l'eau ou toute substance n'entravant pas le lavage du film par l'eau peuvent être utilisés. La fonction du diluant est d'ajuster les propriétés du film isolant (a) pour produire un bon film uniforme et adhérent, suivant si l'application est effectuée par pulvérisation, par trempe ou autrement, (b) pour maintenir le film à l'état fluide au moins jusqu'à ce que la poudre ait été ajoutée, et (c) dans certains cas, il agit comme plastifiant et aide à empêcher un séchage et un écaillage pendant le refroidissement.
Le mince film isolant et la couche pulvérulente peuvent être appliqués sur les parois externes du récipient de stockage du sang de toute manière appropriée, par exemple en immergeant le récipient dans une solution contenant la matière isolante. Dans ce cas, l'épaisseur du film isolant peut être réglée en agissant sur la concentration de la solution et sur le nombre de trempages.
Par exemple, le récipient est trempé dans une solution de glycérol et de méthanol contenant au moins 20 O/o de glycérol, retiré et laissé au repos à l'air pendant environ 30 sec. Cette dernière phase de vieillissement permet au film de se stabiliser avant l'application de la couche pulvérulente. Au moins une partie du solvant s'évapore et le film résultant devient plus uniforme, probablement en raison d'une augmentation de la viscosité. I1 est possible que certaines compositions de film souffrent d'un vieillissement trop prolongé, du fait qu'une trop grande perte de solvant pourrait avoir pour conséquence une mauvaise adhérence, avant ou pendant l'opération de congélation. Le vieillissement s'effectue de préférence avant l'adjonction de la poudre au film, bien qu'il puisse être effectué après cette adjonction.
Des expériences ont montré que le coefficient de transmission de chaleur optimum dans la zone de température critique est obtenu lorsqu'une solution glycérol-méthanol à 50 /o est employée, contrairement aux solutions ayant une concentration supérieure ou inférieure, la poudre étant un aérogel de silice e finement divisé. Dans le cas d'un revêtement de sucre, une solution à 22 o/o de glycérol dans le méthanol est préférée. La solution de 50 o/o de gly zéro1 donne une épaisseur de film d'environ 0,13 nun, alors que la solution à 22 oxo de glycérol donne une épaisseur de 0,038 mm.
Comme mentionné, la grosseur préférée des particules de silice est inférieure à 0,1 micron, alors que la grosseur préférée des partioules de sucre correspond à des tamis de 0,221 à 0,107 mm d'ouverture.
Au lieu d'appliquer le mince film isolant par trempe, on peut par exemple l'appliquer par aspersion à la main. La poudre est de préférence projetée à l'aide d'un gaz propulseur sur le film isolant vieilli.
Une série d'essais a été effectuée pour illustrer les avantages des sous-couches de glycérine avec des couches de silice et de sucre finement divisées pour augmenter le taux de transmission de chaleur. Dans ces essais, une sonde de cuivre massif de 4,13 cm de diamètre et 10,2 cm de longueur a été munie d'un thermocouple près de la surface et d'un thermos couple au centre. Un film de glycérine a été appli qué sur la sonde en trempant la sonde dans la solution n de glycérine spécifiée puis en retirant la sonde et en laissant le film se stabiliser pendant 30 60 sec., après quoi la poudre indiquée a été appliquée sur le film par projection.
La sonde ainsi préparée a été plongée dans l'azote liquide et l'allure du refroidissement a été suivie au moyen des deux thermocouples. La durée de refroidisselment est le temps compris entre le moment où le thermocouple externe passe par 00 C et le moment où le thermocouple interne atteint -46 < C. Cet intervalle comprend le domaine des températures critiques pour la congélation du sang. Les résultats suivants ont été obtenus.
(Voir tableau IV, page 9)
Les chiffres figurant dans le tableau IV montrent qu'une épaisseur de film de glycérine de l'ordre de 0,13 mm donne le taux maximum de transmission de chaleur lorsque la matière pulvérulente est la silice finement divisée. D'autre part, un taux de transmission de chaleur maximum a été obtenu avec un revêtement de sucre de grosseur de particules de 0,221-0,107 mm d'ouverture de maille de tamis.
On a conduit une autre série d'essais, qui illustrent clairement l'amélioration supplémentaire de la transmission de chaleur réalisable grâce à la présence d'une couche pulvérulente sur la sous-couche constituée par le film isolant. Pour ces essais, une mince couche de glycérine a été projetée sur un cylindre de cuivre de 4,13 cm de diamètre et 5,1 cm de longueur, puis un excès de sucre en poudre a été ajouté. Le taux de transmission de chaleur obtenu avec le revêtement de sucre a été en moyenne 16 fois supérieur à celui obtenu avec le récipient sans aucun revêtement. Il a fallu 350 sec. pour refroidir le cylindre non revêtu de 250 C à -196 < C dans l'azote liquide. Le même cylindre, pourvu des revêtements de glycérine et de sucre, s'est refroidi en 22 sec.
La fig. 4 montre les taux de transmission de chaleur réalisés avec un tel revêtement, en fonction de la température de l'échantillon. La fig. 5 montre l'amé- lioration de la transmission de chaleur pour diverses températures de l'échantillon. L'amélioration de la transmission de chaleur peut atteindre 35 fois à une température de l'échantillon de -100 < C.
A cette
Tableau IV
Temps de refroidissement Concentration du glycérol Epaisseur du film Poudre
de O à -40 C (sec.) dans le méthanol (mm)
10,5 20% 0,038 Poudre de silice de forme sphérique et
6,8 30 0, 051* de grosseur d'agglomérats de 0,1 micron
7,1 42 /o 0,076 <
5,4 60 % 0,127
6,9 80 O/o 0,203*
6,8 100% 0,431
12,1 22% 0,038 Sucre granulé (90% supérieur à 0,221
mm d'ouverture de maille)
8,1 22 % 0,038 Sucre granulé (moulu grossièrement dans
un mortier avec un pilon)
7,0 22 /o 0,038 > 0,221 mm d'ouverture de maille
5,7 22 /o 0,038 0,221-0,
107 mm d'ouverture de maille
6,2 22% 0,038 0,107-0,046 mm d'ouverture de maille
8,0 22 % 0,038 sucre en poudre (de confiseur) * Interpolé. température, le taux de transmission de chaleur de l'échantillon sans revêtement est très faible, soit envi ron 544 g.cal/(h)(cm2). Il ressort clairement des fig.
4 et 5 que des vitesses de congélation supérieures peuvent être obtenues avec des revêtements de gly cerine-sucre.
On a procédé à des expériences pour déterminer si les propriétés de transmission de chaleur des revê tements de glycérine-poudre de sucre sont reproductibles, et on a mis au point une combinaison optimum Je revêtement pour le présent procédé de congélation wn masse du sang. A cet effet, on a étudié les variables suivantes 1) L'épaisseur du revêtement de glycérine-sucre en
poudre.
2) Le poids du revêtement de glycérine-sucre en
poudre.
3) La grosseur de particules, exprimée en ouverture
de maille, de la poudre de sucre utilisée dans le
revêtement.
4) L'âge du revêtement de glycérine-poudre de
sucre.
La fig. 6 montre le temps nécessaire pour refroidir le cylindre de cuivre mentionné de 25 C C à -196 < C, en fonction des quatre variables mentionnées cidessus. Les quatre courbes présentent de larges paliers sur lesquels les durées de refroidissement sont constantes, ce qui tend à indiquer que les propriétés de transmission de chaleur des revêtements sont faciliement reproductibles dans les régions plates des courbes. Cependant, dans les opérations de congélation du sang, le taux de transmission de chaleur est plus important pendant la descente jusqu'à environ -500 C que le taux de transmission de chaleur global. La fig. 7 montre les taux de transmission de chaleur dans l'intervalle de 00 C à -75 < C en fonction des mêmes quatre variables mentionnées cidessus.
Là également, les courbes présentent des paliers relativement larges, ce qui indique que les taux de transmission de chaleur sont reproductibles dans des conditions de revêtement relativement variables.
Le taux de transmission de chaleur au-dessus de -500 C au cours du dégel du sang congelé est également important car, dans cet intervalle de température, les globules rouges peuvent être endommagés aussi bien pendant le dégel que pendant la congélation. La fig. 8 montre les taux de transmission de chaleur des cylindres avec revêtement pendant leur réchauffement dans un courant d'eau constant, en fonction des quatre variables. L'examen de la fig. 8 révèle que les taux de transmission de chsleur ne sont pas influencés par-ces variables dans l'intervalle de température de -75 C à 00 C, ce qui est très avantageux pour la reproductibilité de la phase de dégel du sang.
Les matières employées pour le revêtement sont non toxiques, bon marché et très répandues. Le revêtement ne gêne ni la collecte ni la transfusion du sang, si le récipient est pourvu de son revêtement après la collecte du sang. Le revêtement de glycé rine-sucre se dissout facilement dans l'eau pendant le dégel, et ne gêne donc pas l'administration du sang à un patient.
Réfrigérant
Pour convenir à la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, le réfrigérant doit bien entendu être assez froid pour congeler la substance biologi que. Dans le cas du sang, cela signifie que le réfrigérant doit avoir une température inférieure à environ -120 < C pour assurer un taux de récupération convenable des globules rouges.
L'azote liquide est le réfrigérant préféré en raison de ses avantages, qui sont une relative inertie, la sécurité d'emploi, et le coût relativement modeste.
Il a en outre un point d'ébullition extrêmement bas de -196 < C à pression atmosphérique. Comme il est bien connu, l'azote liquide peut être obtenu par distillation de l'air. Cependant, d'autres réfrigérants sont également utilisables, notamment l'air liquide (conte- nant la proportion normale d'azote), l'hélium liquide, le néon liquide, l'argon liquide et le krypton liquide.
L'azote liquide et les autres réfrigérants liquides à bas point d'ébullition sont des liquides saturés à pression atmosphérique, et entrent violemment en ébullition lorsqu'un objet chaud tel qu'un récipient de conservation du sang y est plongé. La transmis- sion de chaleur dépend de la différence de température AT entre le fluide et l'objet chaud, comme mentionné précédemment. Aux très hautes valeurs de AT, il se forme un film de vapeur autour du récipient chaud, qui a pour effet une très mauvaise transmission de chaleur. Ce film de vapeur devient de moins en moins stable lorsque la valeur de AT décroît et la transmission de chaleur s'améliore. La transmission de chaleur est maximum pour une valeur de AT d'environ 30 C (pour l'azote liquide), puis elle re tombe lorsque la valeur de AT tend vers zéro.
Tenant compte de cette relation entre la transmission de chaleur et AT, il semble qu'au taux de transmission de chaleur exagérément faible serait atteint lorsqu'un récipient contenant du sang à 250 C est brusquement plongé dans de l'azote liquide à -196 < C. Cependant, l'application des revêtements décrits ci-dessus sur les parois externes du récipient permet un refroidissement très rapide de la surface en contact avec l'azote liquide et conduit à une valeur de AT se rapprochant de 3O C.
Pour dégeler un récipient de sang congelé, il est nécessaire de franchir de nouveau aussi vite que possible la région des températures critiques allant de -50 < C à la fusion. Malheureusement, on se trouve en présence d'une limitation supplémentaire du fait que le sang est rapidement et irréversiblement altéré aux températures supérieures à 50 C. C. Par conséquent, la température du fluide utilisé pour exercer la fonction du dégel ne doit pas être sensiblement supérieure à cette valeur. L'eau est le milieu dégelant préféré, mais d'autres méthodes peuvent également être envisagées, telles que le dégel à l'aide d'énergie radioélectrique.
La cause réelle de l'altération des globules rouges dans la région critique des températures n'est pas connue, mais elle peut être due à (1) la croissance continue des cristaux de glace, et/ou (2) l'augmen- tation de la concentration d'électrolyte ou de sel lorsque l'eau sort de la solution par congélation.
Cela étant, il ne devrait pas être nécessaire de considérer le temps nécessaire pour soutirer la chaleur de fusion de la totalité du sang, mais seulement de sa dernière portion. On a procédé à des expériences pour étudier l'influence du temps pendant lequel le sang séjourne dans l'intervalle de température de -10 C à - 50 < C sur la récupération des globules rouges. A cet effet, on a introduit un thermocouple au centre de la masse de sang et on a secoué le récipient au cours de la congélation et au cours du dégel.
Les résultats indiquent qu'avec un additif protecteur consistant en 0,3 mole/litre (10,7 O/o) de lactose, il est nécessaire que le sang franchisse cette zone de température en moins de 15 sec., tant pendant la congélation que pendant le dégel, pour obtenir une récupération d'au moins 85 % des globules rouges.
Si ce temps est abaissé à 10 sec. ou moins, une récupération de 90 O/o est réalisable. Avec 5 % de glucose et 7¸% de lactose comme additifs protecteurs, un temps global de moins de 40 sec. devrait donner une récupération de 85 % et on devrait avoir une récupération de 9O0/o des globules rouges en 25 sec.
N'importe quelle méthode pratique de mise en contact des fluides d'échange de chaleur avec les parois du récipient de conservation du sang peut être employée, bien que dans les essais décrits plus haut, le contact ait été obtenu simplement en immergeant le récipient dans un bain du fluide. Dans une autre
Tableau V
Temps s'écoulant pendant que le thermocouple central franchit la zone de température de-IO0C à-500C
Température du bain Amplitude Pendant la congélation Pendant le dégel Temps total Oio de récupération
de dégel OC (cm) (sec.) (sec.) (sec.) des globules rouges
45 O 4 > 30 > 34 61
45 3,2 4 21 25 61
45 6,4 4 15,5 19,5 79
45 10,2 4 15,0 19,0 83
55 0 4 20,4 24,4 66
55 3,2 4 21,2 25,2 84
55 6,4 4 13,0 17,0 86,5
55 10,2 4 6,4 10,
4 90,5 méthode, par circulation de fluide, le réfrigérant et/ou le fluide dégelant peut être forcé au travers des parois du récipient, avec pour avantage possible un taux plus élevé de transmission de chaleur que celui obtenu par le système à immersion. Comme autre variante, les fluides échangeurs de chaleur peuvent être projetés contre les surfaces du récipient, et des expériences avec l'azote liquide ont montré des avantages considérables du point de vue de la transmission de chaleur par rapport à la simple immersion, ce qui est probablement dû à l'action de balayage du jet qui inhibe la formation d'un film continu de vapeur.
Récipients
On a trouvé que des améliorations substantielles des pourcentages de récupération des globules rouges sont réalisables dans certaines circonstances lorsque le récipient de conservation du sang est secoué pendant la congélation et pendant le dégel. Ceci provient probablement de ce que, grâce à la mise en circulation du sang en cours de fusion ou en cours de congélation, l'efficacité de la transmission de chaleur est améliorée par rapport à un récipient fixe dans lequel la chaleur doit être transmise du centre à la périphérie et de la périphérie au centre du sang stocké, à travers le sang environnant en contact avec les parois du récipient.
Les raisons de ce phénomène peuvent être comprises en examinant les mécanismes de la congélation et du dégel. Sitôt que le récipient froid est mis en contact avec de l'eau chaude, il se forme une couche de sang dégelé au voisinage de la paroi du récipient. Cette couche a une conductivité thermique égale à un tiers de celle de la glace et une conductivité bien inférieure à celle de la paroi du récipient, de sorte qu'elle ralentit immédiatement la transmission de la chaleur provenant du récipient. En agitant la couche de liquide, la transmission de chaleur entre celle-ci et la surface glacée du sang congelé qui reste est améliorée. Ainsi, si le récipient est secoué pendant le dégel, il se produit entre le liquide et la glace un mouvement relatif qui améliore la transmission de chaleur à travers le film liquide.
Des expériences ont montré que l'agitation du récipient pendant le dégel ne donne aucun avantage sensible si l'épaisseur de la masse de sang ne dépasse pas 6 mm. Par contre, si cette épaisseur est de l'ordre de 10 mm ou plus, l'agitation du récipient donne un net avantage pendant le dégel. Des expériences ont également montré que lorsque l'épaisseur de la masse de sang est de 17 mm ou plus, l'agitation du récipient pendant la congélation peut donner une amélioration de la récupération des globules rouges de 1 ou 2 %. Avec un récipient de 33 mm, cette amélioration peut être de l'ordre de 20 à 25 %.
On a procédé à une série d'essais qui illustrent clairement l'amélioration résultant d'une telle agitation pendant le dégel. Dans ces essais, un revêtement de glycérine-sucre a été appliqué sur un récipient et le sang, contenant 0,3 mole/litre de lactose comme Tableau VI
Conditions de refroidissement Conditions de réchauffement % de récupération des globules rouges
Amplitude Temps Amplitude Temps Epaisseur de la masse de sang (mm)
Forme du récipient Revêtement Méthode cm sec.
Méthode cm sec. 6 14 17 33
Cylindrique, 0,9 mm d'épaisseur de paroi Néant Immersion - - Immersion - - 83 47 -
Cylindrique, 0,9 mm d'épaisseur de paroi Polyvinyl- Immersion - - Immersion - - 89 70 - pyrrolidone méthanol
Cylindrique, 0,9 mm d'épaisseur de paroi Sucre-glycérol Immersion - - Immersion - - 81,5 81,5 81
Cylindrique, 0,9 mm d'épaisseur de paroi Sucre-glycérol Immersion - - Agitation 6,4 45 - 88* 93
Cylindrique, 0,9 mm d'épaisseur de paroi Sucre-glycérol Immersion - - Agitation 10,2 45 - 92* 93 72,5
Cylindrique, 0,9 mm d'épaisseur de paroi Sucre-glycérol Agitation 10,2 60 Agitation 10,2 45 - - - 89
Cylindrique, 0,9 mm d'épaisseur de paroi Sucre-glycérol Agitation 10,2 45 Agitation 6,4 30 - 92 -
Rectangulaire, 1 mm d'épaisseur de paroi Sucre-glycérol Immersion - - Agitation 6,4 45 14 19 33 - 59
Rectangulaire, 1 mm d'épaisseur de paroi Silice-glycérol Agitation 6,
4 30 Agitation 6,4 30 84 83
Rectangulaire, 1 mm d'épaisseur de paroi Silice-glycérol Agitation 10,2 45 Agitation 6,4 45 - 89
Rectangulaire, 1 mm d'épaisseur de paroi Silice-glycérol Agitation 10,2 45 Agitation 10,2 45 - 87,5
Rectangulaire, 1 mm d'épaisseur de paroi Silice-glycérol Agitation 10,2 45 Agitation 10,2 60 - - 89 * Durée d'agitation : 30 secondes. additif protecteur, a été congelé dans le récipient de stockage par immersion dans un bain d'azote liquide.
Le sang a été ensuite dégelé par immersion dans un bain d'eau à la température indiquée. Le récipient a été secoué mécaniquement, et l'amplitude notée dans le tableau V ciessous correspond à la distance réelle entre l'élongation maximum d'oscillation dans une direction et l'élongation maximum d'oscillation dans l'autre direction. La fréquence de l'agitation a été maintenue constante à 188 cycles/min.
Le tableau V illustre l'amélioration de la récupération des globules rouges due à l'agitation du récipient pendant le dégel. De même, des récupérations supérieures des globules rouges sont réalisables en secouant pendant la congélation. Ceci ressort clairement d'une autre série d'essais dans lesquels des revêtements variés ont été appliqués sur des récipients de conservation du sang ayant des formes cylindriques et rectangulaires. Dans tous les cas, le réfrigérant était l'azote liquide, l'additif protecteur était 0,3 mole/litre de lactose, la température du bain de dégel était de 450 C et la fréquence d'agitation de 186 cycles/min. Les épaisseurs de la masse de sang ont été variées dans ces essais, dont les données sont rassemblées dans le tableau VI.
(Voir page 11)
On a effectué encore une série d'essais pour étudier l'effet du rapport du volume du sang au volume du récipient. Dans ces essais, un revêtement de glycérine-sucre a été appliqué sur des récipients de 35 cc et les échantillons de sang ont été introduits dans les récipients avec 0,15 mole/litre de lactose comme additif protecteur. Le milieu de congélation était l'azote liquide à -196 < C et le milieu de dégel était de l'eau à 45O C, I'amplitude d'agitation pendant le dégel étant de 10,2 cm pendant 30 sec. Les résultats de ces essais sont les suivants.
(Voir tableau
VII.)
Les chiffes du tableau ci-dessous montrent que si l'échantillon occupe une trop grande partie du volume disponible, le degré de turbulence interne est diminué pour n'importe quelle amplitude de secouage, ce qui abaisse les pourcentages de récupération des globules rouges. L'avantage d'un faible taux de remplissage est toutefois compensé par des considérations d'espace et de facilité de transport, et un volume de mélange sanguin occupant environ 60 /o de la ment avantageux, car il peut être stocké avec le coefficient d'emballage le plus élevé (le plus faible espace vide) parmi plusieurs configurations possibles, ce qui permet une économie dans l'installation de stockage. Cette configuration se prête également à une fabrication économique.
La possibilité d'utiliser le récipient de la fig. 9 est fonction de l'épaisseur de C. Un récipient de grandeur normale pour le présent procédé doit être capable de contenir environ 500 cc de sang en plus de l'additif protecteur.
Si l'on admet que l'additif protecteur occupe 10 % du volume du sang, et qu'on ménage 10 % d'espace libre pour tenir compte de la dilatation de la glace pendant la congélation, la capacité totale doit être de 600-650 cc. Bien entendu, il est désirable que le récipient soit aussi petit que possible, ce qui signifie que l'épaisseur C doit être aussi grande que possible, cependant dans une mesure compatible avec des pourcentages acceptables de récupération des globules rouges.
Si la congélation est effectuée par simple immersion dans l'azote liquide en utilisant les revêtements de glycérine-sucre, et si le dégel est effectué par immersion dans l'eau chaude, l'épaisseur C ne peut probablement pas dépasser environ 6 mm car avec les épaisseurs supérieures la résistance interne à la transmission de chaleur serait trop grande pour un refroidissement et un réchauffement suffisamment rapides. Une telle valeur de l'épaisseur C conduit à des dimensions d'environ 40 cm pour la largeur A et la hauteur B. Cependant, comme mentionné, il est préférable de secouer le récipient pendant la congélation et pendant le dégel.
Dans ces conditions, C est de préférence supérieur à 10 mm. I1 est également préférable que seulement 60 /o de la capa- cité du récipient soit occupé par le mélange conte- nant le sang. Ceci nécessite une capacité du récipient d'environ 900 cc.
I1 s'est avéré que des récupérations satisfaisantes des globules rouges peuvent être réalisées avec un récipient rectangulaire ayant une épaisseur C de 19 mm. I1 peut même être possible d'employer des récipients rectangulaires ayant des épaisseurs supé rieurs.
Un récipient cylindrique tel que représenté à la fig. 10 pourrait également convenir pour la conservation du sang conformément à l'invention. Là également, dans le cas de l'agitation du récipient pendant la congélation et le dégel, comme on le préfère, le diamètre D du récipient doit être supérieur à 10 mm et inférieur à 33 mm. Une capacité totale de 900 cc est désirable.
Une autre configuration pratique du récipient est représentée dans les fig. 11 et 12. Ce récipient, com prend une enveloppe semi-cylindrique 52 fermée aux deux extrémités par des plaques 53 et 54. Ces plaques présentent de multiples ouvertures 55 espacées uniformément, et chaque ouverture est sur le e même axe longitudinal qu'une ouverture correspondante dans la plaque opposée. Les ouvertures correspondantes cognuniquent l'une avec l'autre par un tube 56 scellé à chaque extrémité aux parois des ouvertures des plaques.
Les tubes 56 traversent longitu finalement l'enveloppe 52 et forment des passages pour la circulation des fluides de réfrigération et de réchauffement, comme montré dans la fig. 12. Le mélange sanguin est introduit et retiré par les conduits d'entrée et de sortie 50 et 51 traversant la plane que supérieure 53.
Le fluide échangeur de chaleur peut être continuellement forcé dans les tubes 56, ou le récipient peut être immergé dans un bain de réfrigérant de manière à tirer parti du phénomène de siphon thermique . Ce phénomène se produit lorsqu'un tube est introduit verticalement dans luln liquide en ébullition. Lorsque le liquide pénètre par la base du tube, il est partiellement vaporisé par les parois chaudes du tube. La vapeur se dilate dans le liquide et agit comme un piston sur le liquide en le chassant à grande vitesse vers le haut du tube.
L'ensemble des avantages du procédé selon l'invention ressort du tableau VIII, qui rassemble des résultats obtenus au cours d'une série d'essais comprenant les divers aspects de l'invention.
Method for preserving biological substances and apparatus for carrying out this method The present invention relates to the technique of preserving biological substances at low temperature. More particularly, the invention relates to methods and apparatuses for the rapid cooling, storage and heating of biological substances such as blood, bone marrow, other substances, cell repositories and biological fluids.
The preservation of biological substances against deterioration during storage has been a constant problem for scientists. The problem is particularly acute in the case of blood. The maintenance of blood banks and the advantage of storing whole blood in enormous quantities for use in disasters creates the overwhelming need for a method for the prolonged preservation of stored blood. No method or apparatus previously employed has been found to be fully satisfactory for the preservation and prolonged storage of 1/2 L lots of transfusable whole blood.
In the case of blood, the main living constituents are erythrocytes or red blood cells. The problem of preserving whole blood is therefore fundamentally linked to the preservation of red blood cells. Red blood cells are shaped like round platelets and contain a special type of cytoplasm enclosed in a semi-permeable membrane. This membrane ensures the integrity of the protein and electrolyte content of the enclosed cytoplasm.
The membrane is duotile but essentially inelastic, and therefore there is a critical volume of the red blood cell beyond which the membrane is damaged. This alteration of the membrane causes the release of the oxygen-carrying component of erythrocytes, i.e. hemoglobin, into the blood plasma, where it cannot perform its function of carrying oxygen and anhydride. carbonic.
The amount of hemoglobin released by a given number of blood cells is a measure of the effectiveness of various methods of preserving blood. The lower the amount of hemoglobin released, the more effective the method and / or apparatus is at conserving blood cells.
Normally, that is, in the circulatory system of the body, red blood cells have a lifespan of about 100 to 120 days. On the other hand, they deteriorate much more quickly outside the body. One of the alterations affecting the blood outside the body is the phenomenon of coagulation.
For the storage of blood, it is essential to avoid coagulation. For this purpose, citrate, oxalate or fluoride ions are added which inhibit chemical changes, such as the interaction of calcium ions with certain components, which usually results in coagulation. Coagulation is not, however, the only difficulty involved in the preservation of blood.
The red blood cell has its own maintenance metabolism and its metabolic processes continue outside the body until the blood sugar stores are depleted by conversion to lactic acid. At this time, substances and processes which are essential for the preservation of cell structure are exhausted. In addition, the pH of the plasma decreases to an unfavorable level, by accumulation of lactic acid. In the blood collected, the osmotic balance between intracellular and extracellular matter is rapidly destroyed and the water in the plasma diffuses into the cell causing abnormal swelling and ultimately rupture of the membrane. These changes occur rapidly at room temperature and at common citrate and glucose concentrations.
Usually, to preserve the blood from the above-mentioned alterations, the blood of a donor is collected in an acid solution of citrate and dextrose, after which it is cooled to between 4 and 60 C. This process does not allow however, only about three weeks of safe storage of blood. At the end of this period, the degradation processes have progressed to a point at which the functional efficiency of blood cells has declined below an acceptable level. As each batch must be replaced every three weeks, it has proved impossible to store blood in large quantities.
Other methods have been tried, but none of these have been shown to be suitable for mass storage on an industrial scale of whole human blood in 1/4 or 1/2-liter batches.
To stop the degradation processes described above, a rational method is to lower the temperature of the blood to a point where the metabolism is essentially stopped. However, this requires the blood to cross the temperature range of freezing. In the absence of protective additives during freezing and / or thawing of blood, the cell membrane is damaged to the point that the blood cells are hemolyzed.
The blood was frozen en masse or in thin film. For bulk freezing, protective chemicals such as glycerol have been used in concentrations up to 50%, to protect the red blood cells against damage due to ice crystallization. These protective chemicals must be removed from the blood before transfusion, so these bulk freezes are expensive and time consuming. In addition, the apparatus and operations required to separate protective chemicals from blood are complicated and expensive, and do not lend themselves to operation by technicians in hospitals. They are also not suitable for bulk storage of transfusable blood.
Another experimental method previously described uses polyvinylpyrrolidone as a protective agent for the preservation of whole blood (Comptes Rendus des Sciences de la Soc. De Biologie, 149, 875, 1955). This process involves freezing the blood with 35% polyvinylpyrrolidone by immersion in a dry ice bath. It is of little interest because of the large volume of polyvinylpyrrolidone that must be used, which requires the separation of red blood cells and their resuspension in new plasma, with the risk of coagulation, physical destruction, etc. , cells.
Other methods of freezing food products, blood plasma and the like in the form of droplets are known. In particular, there is a process for freezing the coffee extract, consisting in injecting the coffee into a bath of trifluorotrichloroethane and normal hexane at low temperature (-500C). In this process, the coffee is injected at the base of a freezing bath column and rises by density difference to an unloading point. This process is not suitable for the preservation of blood, since hydrocarbons and halogenated hydrocarbons cause hemolysis of red blood cells. In addition, injecting the hot blood directly into a low temperature refrigerant causes the blood to freeze in the injection nozzles and become clogged.
The object of the invention is therefore a method and an apparatus for the treatment and preservation of biological substances, allowing in particular the storage of whole blood in large volume for long periods without appreciable deterioration of the red blood cells, the latter rapidly recovering their state. normal at the end of storage, without the need to remove protective additives after thawing and before transfusion.
The invention is based on the discovery that when biological substances such as blood are frozen and supercooled quickly enough and then, after storage for any length of time, thawed fairly quickly, the biological integrity of the substances can be maintained without substantial alteration. .
Unfortunately, the extremely high freezing and thawing rates which are necessary to avoid biological damage cannot be achieved by known means, such as, for example, immersing a container of blood in a bath of liquid nitrogen. In this known method, the rate of heat transmission between the liquid nitrogen and the container is of the order of -1360 g. Calories / (h) (cm of surface area of the container), until the temperature of the inner wall of the container is lowered to about-1750C, at which point the rate of heat transmission increases sharply.
However, the initial rate of heat transmission is too low for rapid freezing, for example without noticeable reduction in the percentage of red blood cell recovery. It has been found that if the heat transfer rate is at least 3800 g. oalories / (h) (cm2), and preferably at least 6520 g.calories / (h) (cm- '), throughout the freezing phase, the latter can be sufficiently rapid to ensure high percentages of recovery of red blood cells, of the order of at least 85 O / o.
The present invention therefore relates to a method for preserving biological substances, in which said substance is placed in a container, heat is subtracted from the outer surface of the container by bringing the container into contact with a refrigerant for a time sufficient to freeze the biological substance in the container, then store the frozen substance. This process is characterized by removing heat from the walls of the vessel at a rate of at least 3800 small calories / (h) (cm2 of vessel surface area).
This heat subtraction can for example be carried out by means of a container coated with a thin insulating film, having sufficient insulating power to bring the temperature difference between the heat-rejecting surface of the coated solid and a boiling refrigerant medium. at a value at which more efficient heat transfer occurs. The heat transfer rate can be further improved by applying a layer of powder material on the mentioned insulating thin film, which then serves as an undercoat.
It is believed that the powdery material layer further increases the rate of heat transmission for at least two reasons: firstly, the discontinuity of the surface promotes bubble formation, and secondly, the exposed parts of the powder particles cool rapidly, so that boiling in a nucleated regime is established rapidly.
For example, glycerin is particularly suitable as a material for forming the insulating thin film, and finely divided silica has been found to be particularly effective in forming the powder material layer.
Glycerin is soluble in water; a very effective method of thawing frozen biological substances consists of bringing the walls of the container into contact with water at a temperature preferably below about 55O C. The insulating film and the powder layer are preferably removed by this contact . To achieve the rapid thawing that is necessary, the container is preferably constructed of a material giving a K / L value of at least 0.3375 (K = g.cal/(h)(cm)(0C) and L = wall thickness in centimeters).
Preferably, the container is shaken during rapid freezing and during thawing to facilitate a uniform flow of heat into the biological material in the container.
The cooling contact is preferably maintained for a time sufficient to pass the biological substance through its critical temperature region, after which the frozen material can be stored for any desired time. The term critical temperature region as used herein encompasses both the freezing zone and the supercooling zone, since cell damage can occur in both zones. For example, in the case of blood, the critical temperature region is between the point where the blood mixtures are nearly frozen and around 500 C.
The invention will be described more particularly in its application to the preservation of blood. However, it is understood that it is also suitable for the preservation of other biological substances such as bone marrow, serum, i.e. blood deprived of cells and fibrinogen, blood plasma fractions and fluid. cerebrospinal. Likewise, microorganisms such as bacteria
Azotobacter vinelandi, Escherichia coli and Micrococcus pyrogenes, the mold Aspergillus niger and the yeast Saccharomyces sp. can thus be preserved.
In the attached drawing:
Fig. 1 shows a boiling heat transfer curve, illustrating the relationship between heat flow and the temperature difference between the surface area of a heated solid and that of a boiling liquid.
Fig. 2 shows a cooling rate curve for liquid nitrogen, in which the cooling time is plotted (on the ordinate) as a function of the thickness of the insulating coating film (on the abscissa).
Fig. 3 shows a series of heat transfer rate curves for various thicknesses of a type of coating material.
Fig. 4 shows a series of heat transfer rate curves for various coating insulating materials.
Fig. 5 is a curve illustrating the improvement in heat transmission in the case of a sample provided with a coating of sucreglycerin.
Fig. 6 shows a series of cooling curves for sugar-glycerin coatings, showing the effect of several variables in a temperature range of 250 C to -960 C.
Fig. 7 represents a series of cooling curves for sugar-glyceria coatings, showing the effect of several variables on a temperature range from 0 to -750 C.
Fig. 8 shows a series of heat transfer rate curves for sugar-glycerin coatings, showing the effect of the same variables as in fig. 7 in a temperature range of 750 to 0OC.
Fig. 9 is a perspective view from top to bottom of a rectangular container for the storage of biological substances in accordance with the invention.
Fig. 10 is a perspective view from top to bottom of a cylindrical container for the storage of biological substances in accordance with the invention.
Fig. 11 is a perspective view from top to bottom of yet another container for the storage of biological substances, and
fig. 12 is a longitudinal section of the container shown in FIG. 11, taken along line 12-12 of FIG. 11.
Factors influencing the storage of large amounts of blood will now be studied in detail.
Anticoagulant medium
Particularly suitable media are standard solutions of citrate-dextrose or heparin.
These media are commonly used for the storage of whole human blood by refrigeration at about 4 to 60 C.
Protective additives
The blood is collected in a mixture of arlticoagulant and protective additive, in the freezing, storage and thawing vessel. The blood can also be collected in an appropriate anticoagulant and the protective additive then mixed. Freezing and thawing of human red blood cells usually results in the release of hemoglobin (hemolysis) and the loss of biological integrity of a considerable proportion of cells. The degree of destruction depends on the composition of the blood used and the physical conditions of cooling and warming.
Thus, rapid cooling to very low temperatures and rapid heating to the liquid state from the frozen state promotes a high percentage of red blood cell recovery, as mentioned previously. The presence of certain solutes designated here as protective additives, in combination with other characteristics of the invention, makes it possible to freeze and thaw the blood with a high percentage of red blood cell recovery.
Freezing and thawing of human red blood cells has been carried out successfully in accordance with the present invention in the presence of various protective additives, including sugars and soluble polymers.
The additives differ markedly in the extent to which they penetrate into the blood cells or are taken up by the blood cells. Some compounds do not enter blood cells, due to their size or structure. For example, red blood cells are permeable to glucose but are impermeable to lactose and sucrose. For those which penetrate into the globules, the entry can be done by simple diffusion or by active capture. The latter depends on enzymatic systems or carrier substances found in the cell membrane. Glycerol enters very quickly while glucose enters more slowly. Due to their molecular size and the lack of desired transporter systems, di- and tri-saccharides do not penetrate.
These differences in permeability are easily demonstrated by exposing red blood cells to solutions of various substances and directly analyzing cell concentrations or by measuring the increase in total intracellular concentration by osmotic methods.
Overall, protective additives can be divided into four classes
a) Sugar with five and six carbon atoms.
These are known to have the ability to cross the membrane of red blood cells. As examples of sugars of this class, there may be mentioned xylose, arabinose, ribose, glucose, fructose, galactose and mannite. The effective concentrations for this class are 0.3 to 0.75 moles / liter.
b) Di- and tri-saccharides. These do not enter the red blood cell. By way of example, mention may be made of maltose, sucrose, lactose and raffinose. Effective concentrations are 0.075 to 0.3 moles / liter.
c) Water soluble high molecular weight polymers. Like the sugars in class b) above, these do not enter red blood cells.
By way of example, there may be mentioned dextran and polyvinylpyrrolidone. Effective concentrations are 6-10% by weight. Concentrations are more conveniently expressed as percent by weight than in molecular concentrations due to the high molecular weight.
d) Mixture of at least one representative of classes a) and b) above. As an example of such a mixture, there may be mentioned the mixture of lactose and glucose. It is believed that these mixtures are more effective than either of the additives taken separately at their minimum concentrations. This conclusion is based on the figures in Table I.
Table I
Protective activity
various sugars
for your freezing and thawing
0 / o recovery
red blood cells
Sugar concentration, Temperature
moles / liter of freezing bath C -20 -40 -77 -120
Lactose 0.1 7 17 62 45
Lactose 0.2 9 43 72 69
Lactose 0.3 18 49 83 83
Glucose 0.1 2 11 35 45
Glucose 0.2 3 17 51 59
Glucose 0.3 9 29 61 71
Lactose 0.1-Glucose 0.2 13 30 65 69
Lactose 0.1-Glucose 0.4 25 47 76 82
Lactose 0.1-Glucose 0.6 38 42 84 82
Lactose 0.3-Glucose 0.1 44 66 87 85
Lactose 0.3-Glucose 0.2 47 64 86 86
Lactose 0.3-Glucose 0.3 44 73 88 84
The experimental method which led to the results of Table I is as follows:
mix samples consisting of four volumes of blood
with a 0.9 / o NaCl solution and the sugar tested so as to obtain the indicated sugar concentrations. Then freeze S ml samples in thin-walled aluminum tubes of 4 x 29 mm elliptical cross section by immer
Zion in suitable methanol-dry ice baths (-200, -400, -770 C) or isopentane cooled with liquid nitrogen (-1200 C). Thawing is carried out by
immersion in water at 400 C.
Table I also shows that the recovery of red blood cells increases when the
samples are frozen in temperature baths
decreasing erasure.
Coatings promoting heat transmission
The heat transmission takes place either in the state of equilibrium, or in the transient state of unbalance. In all cases of heat transmission by conduction, convection and boiling, a temperature gradient must exist. When the temperature remains constant as a function of time and position, the heat transfer takes place in the steady state. Thus, when a tube heated with water vapor is immersed in a bath of boiling liquid nitrogen, the temperature of the tube falls during the initial period of immersion and then becomes constant and so remains in the steady state. , as long as the steam is allowed to circulate in the submerged tube at a constant rate.
Transient heat transfer occurs when the temperature of a system varies with time and position. Thus, a quenching operation involves a process of heat transfer in a transient state. The temperatures at different points of the sample fall with varying rates during the quenching operation.
As heat transmission rates are affected by temperature variations, these rates also vary.
When a liquid in contact with a heated solid boils at a given pressure, the rate of heat transmission depends on the temperature difference between the surface of the solid and that of the boiling liquid. This dependence leads to specific boiling regimes which can be represented graphically. Fig. 1 shows the general form of a heat transfer curve by boiling, in which the heat flow Q / A is plotted on the ordinate as a function of the temperature difference AT between the surface of the heated solid and the boiling liquid, in abscissa. The coordinates are logartthmic. As the surface temperature of the solid in contact with the liquid increases above the saturation temperature of the liquid, vapor bubbles form at specific regions of the surface (nucleation sites).
These bubbles grow t to a critical size, break away from the surface, and rise into the liquid. As the temperature difference AT increases from A to B along the curve, the number of nucleation sites increases, as does the frequency of bubble formation at each site. The turbulence caused by these bubbles increases the heat transmission until point B is reached. At point B, called the critical heat flow point, the number of nucleation points is so large that the bubbles start to interfere with each other and a vapor film forms on the surface. In the region of AT between B and C, this vapor film is unstable and is constantly dissipated and reformed very quickly.
The low thermal conductivity of the vapor film decreases the rate of heat transfer in this region. At point C, the vapor film becomes stable and completely isolates the solid, thus forming a relatively quiet barrier on the hot surface. Beyond C, the rate of heat transfer increases again, partly due to radiation effects and partly due to the increase in thermal conducibility of steam as a function of temperature.
In summary, regions can be defined as follows:
AT range Boiling regime
A B Nucleated, point or local
B C Unstable film
C Stable film
Although the boiling curves have essentially the same shape for all liquids, the values associated with the curves vary widely.
For water at atmospheric pressure point B corresponds approximately to an AT of 250 C and a heat flux of 89500 g.cal/(h)(cm2), point C appears at an AT of around 560 C and the heat flux is approximately 27200 g.cal/(h)(cm2). For liquid nitrogen at atmospheric pressure, point B corresponds approximately to an AT of 30 C and a heat flux of 7880 g.cal/(h)(cm2) and point C corresponds to an AT of -170 C and a heat flux of 544 g.cal/(h)(cni2). The different boiling regions can be illustrated by considering a pot full of water heated on a stove.
The water which is immediately adjacent to the heat source first reaches its saturation temperature, then is slightly superheated. Small bubbles start to form at separate points on the bottom. These bubbles rise and condense in the cooler liquid. As heat continues to be supplied to the bottom of the pan, bubbles form at more and more points and the frequency of formation at each point increases. We are in the nucleated boiling region. Eventually, a point is reached where so many bubbles form that they interfere with each other and an unstable vapor film forms on the bottom of the pan.
The explosive growth and destruction of this film immediately appears on the surface of the liquid as relatively large volumes of vapor are released, causing strong turbulence, which sometimes causes the liquid to rise. This is unstable film boiling. Now let's assume that the liquid has been evaporated to dryness and drop a small amount of water on the bottom. the so-called Leidenfrost phenomenon then takes place, that is to say that globules of water dance on the hot surface without noticeably evaporating. This phenomenon is due to the presence of a film of superheated vapor under each water globule, and this film functions as thermal insulator between the heating surface and the water. This is stable film boiling.
In the present invention for the preservation
masses of blood, heat must be transmitted
to a boiling coolant through the solid walls of the blood mixture storage vessel.
The heat transmission rate is many times
increased by a change in temperature difference which places the system in regions of unstable or nucleated boiling. We see in fig. 1
that the type of boiling, and therefore the rate of heat transfer, can be changed by varying the temperature difference AT between the boiling liquid and the surface with which it is in contact. Thus, a decrease in AT from the value corresponding to point C to any value between C and A ′ leads to an increase in the heat flow passing from the solid to the boiling liquid.
This is achieved by interposing between a solid and a liquid at its boiling point a material of thermal conductivity low enough to bring the temperature difference AT between the boiling surface and the liquid to a value allowing a rate of heat transmission. higher. The solid is advantageously a metal and preferably a metal of high conductivity, so as to reduce the resistance to the passage of heat through the mass of a partition wall.
The insulating material can be any chemically and thermally stable substance within the range of t
Table II (continued)
Duration of
cooling
(sec.) 15. Rubbery composition,
0.39 mm 19 16. Masking tape, 0.30 mm 19 17. Masking tape, 0.60 mm - 32 18. Masking tape, 0.90 mm - 38 19. Insulating fabric electrician's wire, 0.16 mm 18 20. Electrician's insulating canvas, 0.33 mm 26 21. Electrician's insulating canvas, 0.50 mm 32 22. Vaseline, 0.01 mm - 36 23. Vaseline, 0.025 mm 24 24. Vaseline, 0.05 mm 21 25. Vaseline, 0.10 mm 14 26.
Vaseline, 0.15 mm 13.5 27. Vaseline, 0.20 mm 14 28. Vaseline, 0.25 mm 16 29. Vaseline, 0.37 mm - 17 30. Vaseline, 0.45 mm 20 31. Asbestos, 0.25 mm 42 32. Asbestos, 0.95 mm 64 33. Sodium silicate, 0.11 mm 33 34. Sodium silicate, 0.17 mm 30 35. Kaolin, O, llmm 38 36. Plaster of Paris, 0.19 mm 10
Experiments have conclusively shown that the use of thin insulating coatings, such as the alluded petroleum jelly films, on blood storage vessels considerably shortens cooling times and leads to better recovery. red blood cells after the blood thaws.
For example, human blood containing 0.3 mole-liter of lactose as a protective additive was frozen in the aluminum containers described above by immersion in a bath of liquid nitrogen at -1960 C. Increasing thicknesses of petroleum jelly were. deposited on the containers, and the percentage of red blood cell recovery was determined after thawing. Table III shows the results obtained.
Table III
Coating thickness Percentage of recovery
vaseline (mm) red blood cells
0 65
0.001 69
0.023 73
0.16 78
0.24 82
0.26 82
It has been found that the rate of heat transmission between the coolant and the walls of the vessel can be further increased by applying a layer of powder material on the thin insulating film.The layer of powder forms a discontinuous surface favoring the formation of bubbles, and the exposed parts of the powder particles cool rapidly. These properties increase the rate of establishment of the nucleated boiling regime. The properties of the powder which appear to be important from the standpoint of heat transfer efficiency are grain size and grain size distribution.
When the physical properties of the powders used are similar, and the size of the particles is varied, the thickness of the insulating film should be a little greater as the size of the powder particles decreases.
Silica airgel powder having a particle size of 0.04 microns gave the best results with a glycerin undercoat of 127 microns, while powdery crystalline metaaluminosilicate zeolites with molecular sieve properties, having a size particles of 2 to 4 microns, gave an optimum heat transfer rate when applied to a film of glycerin approximately 102 microns thick.
When the powder is a relatively poor thermal conductor, as is the case with the non-metallic substances exemplified by silica airgel and zeolite powders mentioned above, the insulating properties help to correlate the temperature of the powder. the area and temperature of the boiling liquid which is essential for boiling in a nucleated regime, and the thickness of the insulating underlayer should be relatively thinner than when a good thermal conductor, for example a metal powder , is employed.
Because of the correlation between the particle size of the powder and the thickness of the underlying film, some degree of uniformity of the particle sizes of the powder is necessary. In general, the finer powders are preferred, and they are generally more uniform than the coarser powders.
Apart from finely divided silica such as silica airgel having particle sizes of agglomerates less than about 0.1 microns and crystalline zeolites with molecular sieve properties of varieties A and X, both in size of Agglomerates of 2-4 micron particles, sugar powders were used. Silica airgel is preferable to sugar because it can be more easily obtained in the ultra-fine sizes and shape which are desired for the best reproducibility in actual practice, since the sugar must be ground to the correct mesh openings for optimum coating. Zeolite A is described in US Pat. No. 2882,243 and zeolite X is described in US Pat.
No 2882244.
It should be noted that the use of a layer of powder implies an additional condition to be fulfilled by the film. Indeed, the underlayer must be formed of a material which accepts and retains the powder. Both glycerin and polyvinylpyrrolidone have been used with success. Glycerin was used alone and also diluted with methanol. Among other underlay materials, there may be mentioned general oils and silicone fluids. A water soluble undercoat is preferable for blood preservation as it is washed off during thawing. Each of the materials mentioned above is soluble in water or can be obtained in a form soluble in water. For example, there are many detergent oils.
The solvent or diluent, exemplified by the methanol mentioned above, can also consist of another substance. For example, ethanol, water or any substance which does not hinder washing of the film by water can be used. The function of the thinner is to adjust the properties of the insulating film (a) to produce a good, uniform and adherent film, depending on whether the application is by spraying, quenching or otherwise, (b) to maintain the film at the fluid state at least until the powder has been added, and (c) in some cases it acts as a plasticizer and helps prevent drying and flaking during cooling.
The thin insulating film and the powder layer can be applied to the outer walls of the blood storage container in any suitable manner, for example by immersing the container in a solution containing the insulating material. In this case, the thickness of the insulating film can be adjusted by acting on the concentration of the solution and on the number of soaks.
For example, the container is soaked in a solution of glycerol and methanol containing at least 20% of glycerol, removed and left to stand in air for about 30 sec. This last aging phase allows the film to stabilize before the application of the powder layer. At least part of the solvent evaporates and the resulting film becomes more uniform, possibly due to an increase in viscosity. It is possible that some film compositions suffer from too prolonged aging, as too much loss of solvent could result in poor adhesion, before or during the freezing operation. Aging is preferably carried out before the addition of the powder to the film, although it can be carried out after this addition.
Experiments have shown that the optimum heat transfer coefficient in the critical temperature zone is obtained when a 50 / o glycerol-methanol solution is used, unlike solutions having a higher or lower concentration, the powder being an airgel of finely divided silica. In the case of a sugar coating, a 22% solution of glycerol in methanol is preferred. The 50% solution of zero gly1 gives a film thickness of about 0.13 nun, while the 22 oxo solution of glycerol gives a thickness of 0.038 mm.
As mentioned, the preferred silica particle size is less than 0.1 micron, while the preferred particle size of sugar corresponds to sieves with 0.221 to 0.107 mm opening.
Instead of applying the thin insulating film by quenching, it can for example be applied by hand spraying. The powder is preferably sprayed with the aid of a propellant gas on the aged insulating film.
A series of tests were performed to illustrate the benefits of glycerin underlays with finely divided silica and sugar layers to increase the rate of heat transfer. In these tests, a solid copper probe 4.13 cm in diameter and 10.2 cm in length was fitted with a thermocouple near the surface and a thermos couple in the center. A film of glycerin was applied to the probe by dipping the probe in the specified glycerin solution then removing the probe and allowing the film to stabilize for 30 to 60 sec, after which the indicated powder was applied to the probe. film by projection.
The probe thus prepared was immersed in liquid nitrogen and the rate of cooling was followed by means of the two thermocouples. The cool-down time is the time from when the external thermocouple passes 00 C until the internal thermocouple reaches -46 <C. This interval includes the critical temperature range for freezing blood. The following results were obtained.
(See table IV, page 9)
The figures in Table IV show that a glycerin film thickness of the order of 0.13 mm gives the maximum rate of heat transfer when the powder material is finely divided silica. On the other hand, a maximum heat transmission rate was obtained with a sugar coating of particle size 0.221-0.107 mm sieve mesh opening.
Another series of tests was carried out, which clearly illustrate the further improvement in heat transmission achievable by virtue of the presence of a powder layer on the underlayer formed by the insulating film. For these tests, a thin layer of glycerin was sprayed onto a copper cylinder 4.13 cm in diameter and 5.1 cm in length, then excess powdered sugar was added. The heat transfer rate obtained with the sugar coating was on average 16 times that obtained with the container without any coating. It took 350 sec. to cool the uncoated cylinder from 250 C to -196 <C in liquid nitrogen. The same cylinder, with the glycerin and sugar coatings, cooled in 22 sec.
Fig. 4 shows the heat transmission rates achieved with such a coating, as a function of the temperature of the sample. Fig. 5 shows the improvement in heat transfer for various sample temperatures. The improvement in heat transmission can reach 35 times at a sample temperature of -100 <C.
At this
Table IV
Cooling time Glycerol concentration Film thickness Powder
from O to -40 C (sec.) in methanol (mm)
10.5 20% 0.038 Spherical shaped silica powder and
6.8 30 0.051 * agglomerate size 0.1 micron
7.1 42 / o 0.076 <
5.4 60% 0.127
6.9 80 O / o 0.203 *
6.8 100% 0.431
12.1 22% 0.038 Granulated sugar (90% greater than 0.221
mm mesh opening)
8.1 22% 0.038 Granulated sugar (coarsely ground in
a mortar with a pestle)
7.0 22 / o 0.038> 0.221 mm mesh opening
5.7 22 / o 0.038 0.221-0,
107 mm mesh opening
6.2 22% 0.038 0.107-0.046 mm mesh opening
8.0 22% 0.038 powdered sugar (confectioner's) * Interpolated. temperature, the heat transfer rate of the uncoated sample is very low, around 544 g.cal/(h)(cm2). It is clear from figs.
4 and 5 that higher freezing rates can be obtained with gly cerine-sugar coatings.
Experiments have been carried out to determine whether the heat transfer properties of glycerin-sugar powder coatings are reproducible, and an optimum combination of coating has been developed for the present method of mass freezing blood. For this purpose, the following variables were studied 1) The thickness of the glycerin-sugar coating in
powder.
2) The weight of the glycerin-sugar coating in
powder.
3) The particle size, expressed in opening
mesh, sugar powder used in the
coating.
4) The age of the glycerin-powder coating
sugar.
Fig. 6 shows the time required to cool the mentioned copper cylinder from 25 ° C to -196 <C, depending on the four variables mentioned above. All four curves show wide steps over which the cooling times are constant, which suggests that the heat transfer properties of the coatings are easily reproducible in the flat regions of the curves. However, in blood freezing operations, the rate of heat transmission is greater during descent to about -500 C than the overall heat transmission rate. Fig. 7 shows the heat transfer rates in the range of 00 C to -75 <C as a function of the same four variables mentioned above.
Again, the curves show relatively wide steps, indicating that the heat transfer rates are reproducible under relatively variable coating conditions.
The rate of heat transmission above -500 C during thawing of frozen blood is also important because in this temperature range red blood cells can be damaged both during thawing and during freezing. Fig. 8 shows the heat transfer rates of coated cylinders as they heat up in a constant stream of water, as a function of the four variables. Examination of fig. 8 reveals that the rates of transmission of chsleur are not influenced by these variables in the temperature range of -75 C to 00 C, which is very advantageous for the reproducibility of the thawing phase of the blood.
The materials used for the coating are non-toxic, inexpensive and widely available. The coating does not interfere with the collection or transfusion of blood, if the container is provided with its coating after collection of blood. The glycerin-sugar coating readily dissolves in water during thawing, and therefore does not interfere with the delivery of blood to a patient.
Refrigerant
To be suitable for carrying out the process according to the invention, the coolant must of course be cold enough to freeze the biological substance. In the case of blood, this means that the coolant must have a temperature below about -120 <C to ensure a proper rate of red blood cell recovery.
Liquid nitrogen is the preferred refrigerant because of its advantages, which are relative inertia, safety of use, and relatively low cost.
It further has an extremely low boiling point of -196 ° C at atmospheric pressure. As is well known, liquid nitrogen can be obtained by distillation of air. However, other refrigerants can also be used, including liquid air (containing the normal proportion of nitrogen), liquid helium, liquid neon, liquid argon and liquid krypton.
Liquid nitrogen and other low boiling point liquid refrigerants are saturated liquids at atmospheric pressure, and boil violently when a hot object such as a blood container is immersed in it. The heat transmission depends on the temperature difference AT between the fluid and the hot object, as mentioned previously. At very high values of AT, a vapor film forms around the hot container, which results in very poor heat transmission. This vapor film becomes less and less stable as the value of AT decreases and the heat transmission improves. The heat transfer is maximum for an AT value of about 30 C (for liquid nitrogen), then it falls again when the value of AT approaches zero.
Taking into account this relationship between heat transmission and AT, it appears that an exaggeratedly low rate of heat transmission would be achieved when a vessel containing blood at 250 C is suddenly immersed in liquid nitrogen at -196 < C. However, the application of the coatings described above to the external walls of the container allows very rapid cooling of the surface in contact with liquid nitrogen and leads to an AT value approaching 3O C.
To thaw a frozen blood vessel, it is necessary to cross again as quickly as possible the critical temperature region from -50 <C to fusion. Unfortunately, there is a further limitation that the blood is rapidly and irreversibly altered at temperatures above 50 ° C. Therefore, the temperature of the fluid used to perform the thawing function should not be significantly higher than this. value. Water is the preferred thawing medium, but other methods can also be considered, such as thawing using radio energy.
The actual cause of the alteration of red blood cells in the critical temperature region is not known, but it may be due to (1) the continued growth of ice crystals, and / or (2) the increase of the electrolyte or salt concentration when water comes out of solution by freezing.
However, it should not be necessary to consider the time required to extract the heat of fusion from all of the blood, but only from its last portion. Experiments have been carried out to study the influence of the time during which the blood stays in the temperature range of -10 C to -50 <C on the recovery of red blood cells. For this purpose, a thermocouple was introduced into the center of the blood mass and the container was shaken during freezing and during thawing.
The results indicate that with a protective additive consisting of 0.3 mole / liter (10.7 O / o) of lactose, it is necessary for the blood to cross this temperature zone in less than 15 sec., Both during freezing. than during thawing, to achieve at least 85% red blood cell recovery.
If this time is lowered to 10 sec. or less, a recovery of 90 O / o is achievable. With 5% glucose and 7¸% lactose as protective additives, an overall time of less than 40 sec. should give a recovery of 85% and one should have a recovery of 9O0 / o red blood cells in 25 sec.
Any convenient method of contacting the heat exchange fluids with the walls of the blood storage container can be employed, although in the tests described above contact was obtained by simply immersing the container in. a bath of the fluid. In an other
Table V
Time elapsing while the central thermocouple crosses the temperature range of -IO0C to -500C
Bath temperature Amplitude During freezing During thawing Total recovery time Oio
Thaw OC (cm) (sec.) (sec.) (sec.) of red blood cells
45 O 4> 30> 34 61
45 3.2 4 21 25 61
45 6.4 4 15.5 19.5 79
45 10.2 4 15.0 19.0 83
55 0 4 20.4 24.4 66
55 3.2 4 21.2 25.2 84
55 6.4 4 13.0 17.0 86.5
55 10.2 4 6.4 10,
4 90.5 method, by fluid circulation, the refrigerant and / or thawing fluid can be forced through the walls of the vessel, with the possible advantage of a higher rate of heat transmission than that obtained by the immersion system. As a further variation, the heat exchange fluids can be sprayed against the surfaces of the vessel, and experiments with liquid nitrogen have shown considerable advantages from the point of view of heat transmission over simple immersion, which is probably due to the sweeping action of the jet which inhibits the formation of a continuous vapor film.
Containers
It has been found that substantial improvements in red blood cell recovery percentages are achievable under certain circumstances when the blood storage container is shaken during freezing and during thawing. This is probably due to the fact that, thanks to the circulation of the blood being melted or in the process of freezing, the efficiency of heat transmission is improved compared to a fixed vessel in which the heat must be transmitted from the center. at the periphery and from the periphery to the center of the stored blood, through the surrounding blood in contact with the walls of the container.
The reasons for this phenomenon can be understood by examining the mechanisms of freezing and thawing. As soon as the cold container is brought into contact with hot water, a layer of thawed blood forms near the wall of the container. This layer has a thermal conductivity one-third that of ice and a much lower conductivity than the wall of the container, so it immediately slows down the transmission of heat from the container. By agitating the liquid layer, the heat transmission between it and the icy surface of the frozen blood that remains is improved. Thus, if the container is shaken during thawing, there is a relative movement between the liquid and the ice which improves the heat transmission through the liquid film.
Experiments have shown that agitation of the container during thawing gives no appreciable advantage if the thickness of the mass of blood does not exceed 6 mm. On the other hand, if this thickness is of the order of 10 mm or more, the agitation of the container gives a clear advantage during the thawing. Experiments have also shown that when the thickness of the blood mass is 17mm or more, shaking the container during freezing can give an improvement in red blood cell recovery of 1 or 2%. With a 33 mm container, this improvement can be of the order of 20 to 25%.
A series of tests were performed which clearly illustrate the improvement resulting from such agitation during the thaw. In these tests, a glycerin-sugar coating was applied to a vessel and blood, containing 0.3 mole / liter of lactose as Table VI
Cooling conditions Heating conditions% of red blood cell recovery
Amplitude Time Amplitude Time Thickness of blood mass (mm)
Shape of container Coating Method cm sec.
Method cm sec. 6 14 17 33
Cylindrical, 0.9 mm wall thickness None Immersion - - Immersion - - 83 47 -
Cylindrical, 0.9mm wall thickness Polyvinyl- Immersion - - Immersion - - 89 70 - pyrrolidone methanol
Cylindrical, 0.9 mm wall thickness Sugar-glycerol Immersion - - Immersion - - 81.5 81.5 81
Cylindrical, 0.9 mm wall thickness Sugar-glycerol Immersion - - Stirring 6.4 45 - 88 * 93
Cylindrical, 0.9 mm wall thickness Sugar-glycerol Immersion - - Stirring 10.2 45 - 92 * 93 72.5
Cylindrical, 0.9 mm wall thickness Sugar-glycerol Agitation 10.2 60 Agitation 10.2 45 - - - 89
Cylindrical, 0.9 mm wall thickness Sugar-glycerol Stirring 10.2 45 Stirring 6.4 30 - 92 -
Rectangular, 1 mm wall thickness Sugar-glycerol Immersion - - Agitation 6.4 45 14 19 33 - 59
Rectangular, 1 mm wall thickness Silica-glycerol Agitation 6,
4 30 Agitation 6.4 30 84 83
Rectangular, 1 mm wall thickness Silica-glycerol Stirring 10.2 45 Stirring 6.4 45 - 89
Rectangular, 1 mm wall thickness Silica-glycerol Stirring 10.2 45 Stirring 10.2 45 - 87.5
Rectangular, 1 mm wall thickness Silica-glycerol Stirring 10.2 45 Stirring 10.2 60 - - 89 * Stirring time: 30 seconds. protective additive, was frozen in the storage container by immersion in a bath of liquid nitrogen.
The blood was then thawed by immersion in a water bath at the indicated temperature. The container was shaken mechanically, and the amplitude noted in Table V below corresponds to the actual distance between the maximum swing elongation in one direction and the maximum swing elongation in the other direction. The frequency of agitation was kept constant at 188 cycles / min.
Table V illustrates the improvement in red blood cell recovery due to agitation of the vessel during thawing. Likewise, superior red blood cell recoveries are achievable by shaking during freezing. This is evident from another series of tests in which various coatings were applied to blood storage containers having cylindrical and rectangular shapes. In all cases, the refrigerant was liquid nitrogen, the protective additive was 0.3 mole / liter of lactose, the temperature of the thawing bath was 450 C and the stirring frequency was 186 cycles / min. The thicknesses of the blood mass were varied in these tests, the data of which are collated in Table VI.
(See page 11)
A further series of tests were carried out to investigate the effect of the ratio of the volume of blood to the volume of the container. In these tests, a glycerin-sugar coating was applied to 35 cc containers and blood samples were added to the containers with 0.15 mole / liter of lactose as a protective additive. The freezing medium was liquid nitrogen at -196 ° C and the thawing medium was water at 45O C, the amplitude of stirring during thawing being 10.2 cm for 30 sec. The results of these tests are as follows.
(See table
VII.)
The figures in the table below show that if the sample occupies too much of the available volume, the degree of internal turbulence is decreased for any amplitude of shaking, which lowers the percentages of red blood cell recovery. The advantage of a low filling rate is however outweighed by considerations of space and ease of transport, and a volume of blood mixture occupying about 60 / o of the ment advantageous, as it can be stored with the coefficient d. 'highest packaging (lowest empty space) among several possible configurations, which allows savings in the storage installation. This configuration also lends itself to economical manufacture.
The possibility of using the container of FIG. 9 is a function of the thickness of C. A normal size container for the present method should be capable of holding about 500 cc of blood in addition to the protective additive.
Assuming that the protective additive occupies 10% of the volume of the blood, and that 10% of free space is left to take account of the expansion of the ice during freezing, the total capacity should be 600- 650 cc. Of course, it is desirable that the container be as small as possible, which means that the thickness C should be as large as possible, however to an extent compatible with acceptable percentages of red blood cell recovery.
If freezing is done by simple immersion in liquid nitrogen using glycerin-sugar coatings, and thawing is done by immersion in hot water, the thickness C probably cannot exceed about 6 mm because with at greater thicknesses the internal resistance to heat transmission would be too great for sufficiently rapid cooling and heating. Such a value of the thickness C leads to dimensions of about 40 cm for the width A and the height B. However, as mentioned, it is preferable to shake the container during freezing and during thawing.
Under these conditions, C is preferably greater than 10 mm. It is also preferable that only 60% of the capacity of the container is occupied by the mixture containing the blood. This requires a container capacity of about 900 cc.
It has been found that satisfactory red blood cell recoveries can be achieved with a rectangular vessel having a thickness C of 19 mm. It may even be possible to use rectangular containers having greater thicknesses.
A cylindrical container as shown in FIG. 10 could also be suitable for the preservation of blood according to the invention. Again, in the case of agitation of the container during freezing and thawing, as is preferred, the diameter D of the container should be greater than 10 mm and less than 33 mm. A total capacity of 900 cc is desirable.
Another practical configuration of the container is shown in Figs. 11 and 12. This container, comprising a semi-cylindrical envelope 52 closed at both ends by plates 53 and 54. These plates have multiple openings 55 evenly spaced apart, and each opening is on the same longitudinal axis as an opening. corresponding in the opposite plate. The corresponding openings connect with each other by a tube 56 sealed at each end to the walls of the openings of the plates.
The tubes 56 finally pass through the casing 52 and form passages for the circulation of refrigeration and heating fluids, as shown in FIG. 12. The blood mixture is introduced and withdrawn through the inlet and outlet conduits 50 and 51 crossing the upper plane 53.
The heat exchange fluid can be continuously forced into the tubes 56, or the container can be immersed in a refrigerant bath so as to take advantage of the thermal siphon phenomenon. This phenomenon occurs when a tube is introduced vertically into the boiling liquid. As the liquid enters through the base of the tube, it is partially vaporized through the hot walls of the tube. The vapor expands in the liquid and acts like a piston on the liquid, pushing it at high speed up the tube.
All the advantages of the process according to the invention appear from Table VIII, which gathers the results obtained during a series of tests comprising the various aspects of the invention.