Procédé de préparation d'un nouvel antibiotique
La présente invention concerne un procédé d'un nouveau composé chimique présentant une action antibiotique remarquable qui le rattache à la fois aux séries des tétracyclines et des pénicillines.
Ce nouveau composé présente des propriétés caractéristiques, d'une part, en ce qu'il est remarquablement soluble dans l'eau et, d'autre part, en ce qu'il ne présente pratiquement aucune sensibilité à la pénicil- linasse, ce qui assure l'activité de sa portion pénicilline sur des staphylocoques considérés jusqu'ici comme résistant aux pénicillines connues, à savoir plus spé- cialement le Staphylococcus aureus, producteur de pénicillinase.
On sait que, chacune de leur côté, les tétracycli- nes et les pénicil1ines présentent leurs avantages et leurs inconvénients propres, ces derniers limitant dans une large mesure leur emploi.
Ainsi, on sait que la tétracycline et la plupart de ses dérivés sont pratiquement insolubles dans l'eau.
D'autre part, les pénicillines connues sont actuellement sans action sur certains staphylocoques producteurs de pénicillinase.
Enfin, bien qu'on ait déjà pense à associer la tétracycline à certaines pénicillines, le seul composé de ce type, le phénoxyméthylpénicillinate de tétracycli, ne, qui présente une certaine activité sur certains staphylocoques résistant à la'pénicilline, est également pratiquement insoluble dans l'eau, ce qui le rend difficilement utilisable médicalement.
Le produit obtenu selon l'invention ne présente ni l'un ni l'autre de ces inconvénients, de sorte qu'il constitue le premier produit qui soit à la fois soluble dans l'eau, donc d'utilisation thérapeutique avanta gesse, let actif en présence de péniciUinase, c'est -dire actif sur les souches de staphylocoques, même productrices de pénicillinase.
Le composé obtenu selon l'invention est le phén- oxyméthylpénicillmrate de N2 (ou 9, ou 7)-4' (p- hydroxyéthyl)-dibhylènediaminaméthyl) tétracycline, dont une formule vraisemblable est :
EMI1.1
Il convient de noter que l'on n'a pas encore pu déterminer cette formule complète avec certitude, en particulier pour ce qui concerne l'emplacement de la substitution sur le cycle tétracycline, et que ce n'est qu'à titre indicatif que la formule avec liaison en position N est illustrée ci-dessus.
On donnera ci-après en détail les principales propriétés physiques, physico-chimiques et biologiques de ce nouveau composé.
Le procédé selon l'invention est caractérisé en ce qu'on fait réagir, dans un solvant commun, des quantités équimoléculaires de phénoxyméthylpénicilline, de tétracycline base et de N-hydroxyéthyl-N'-hydroxy- méthyldiéthylèncdiamine.
La réaction a lieu de préférence à chaud à une température de l'ordre de 400 C.
Selon la nature du solvant utilisé, on peut isoler le produit par différentes techniques.
Ainsi quand le solvant commun est l'eau, on peut isoler le produit par lyophilisation, tandis que quand le solvant est un solvant organique, tel que le méthan- ol ou l'isopropanol, on peut isoler le produit par précipitation par l'éther et filtration.
On peut envisager diverses variantes de mise en oeuvre de ce procédé.
Selon une première variante, on peut introduire, dans une solution chaude, la N-hydroxyéthyl-N'-hydroxyméthyldiéthylènediamine, le dérivé de pénicil- line et la tétracycline base, individuellement ou en mélange, en une seule fois ou par portions successives.
Selon une seconde variante, on peut préparer la N-hydroxyéthyl-N'-hydroxyméthyldiéthylènediami- ne in situ par réaction de la N- (-hydroxyéthyldi- éthylènediamine avec la formaldéhyde, en introduisant alors, simultanément ou non, les quatre consti- tuants réactionnels.
Le choix de l'une ou l'autre de ces variantes est déterminé par des considérations de commodité et d'efficacité d'isolement et de purification du produit final.
Exemple 1
Dans cet exemple qui illustre la variante préférée consistant à former à l'avance la N-hydroxyéthyl-N' hydroxyméthyldiéthylènediamine, on prépare tout d'abord une solution de 6, 63 g de p-hydroxyéthyldi- éthylènediamine et de 3, 8 g de formaline à 38 /o par chauffage de cas réactifs vers 60-700 C dans 200 cc de méthanol. Après repos pendant une heure, on ajoute à cette solution, à peu près simultanément, 22, 2 g de tétracycline base anhydre et 17, 5 g de phé noxyméthylpénicilline anhydre, et on chauffe le mélange réactionnel au bain d'huile à 400 C pendant 90 minutes. La dissolution complète est obtenue en 30 minutes environ.
On verse alors le mélange réactionnel dans 600 ce d'éthanol en agitant. Il précipite un produit que l'on filtre, lave deux fois à l'éther et sèche sous vide à 400 C pendant 5 heures. Ce produit représente 40 g de phénoxyméthylpénicillinate de ? (ou 9, ou 7)-4' (p-hydroxyéthyl)-diéthylenediaminométhyltétracycli- ne, soit un rendement d'environ 85-90 ouzo ; les proprié- tés de ce produit sont énumérées plus loin.
Exemple 2
Cet exemple illustre une autre variante, consistant à préparer en premier lieu le produit de la réaction de la tétracycline avec les constituants de la diamine, à savoir la N2 (ou 9, ou 7)-4' (ss-hydroxyéthyl)-diéthyl- enediaminoéthyltétracycime, par une réaction classique du type Réaction de Mannich. On fait réagir ensuite ce nouveau dérivé de tétracycline avec la phé noxyméthylpénicilline pour obtenir le produit.
On dissout 58, 6 g de N2 (ou 9, ou 7)-4' (1, 3-hydro- oxyéthyl)-diéthylènediaminométhyltétracycline et 35 g de phénoxyméthylpénicilline dans 300 cc de méthanol en agitant ; on filtre cette solution sur Biichner, puis on reprend le filtrat avec 990 cc d'éther anhydre en agitant fortement, on filtre à nouveau sous pression et on lave le gâteau filtré, deux fois avec 50 cc d'éther anhydre ; on sèche le produit sous vide ; on obtient 84 g d'une poudre blanche jaunâtre présentant également les caractéristiques physico-chimiques indiquées plus loin.
Exemple 3
On dissout les mêmes quantités des mêmes réactifs qu'à 1'exemple 2, dans 500 cc d'eau distillée à 5O C ; on filtre la solution sur Buchner, puis on soumet le filtrat à une lyophilisation à - 40 C ; on obtient un produit lyophilisé présentant les mêmes caractéristiques que celui des exemples précédents.
Dans les trois cas, le produit obtenu finalement se présente sous forme d'une poudre blanche jaunâtre, inodore, un peu amère, très soluble dans l'eau ( > 1, 5 g/cc), soluble dans le méthanol et l'éthanol, insoluble dans l'éther. Le pH d'une solution aqueuse à 2 ouzo est de 5, 6 ; P. F. : 143-155o C (avec décompo sition, non corrigé) ; (a ¯-50, 5 2 (en solution à O/o dans le méthanol).
Analyse : calculée pour : C ; H ; GNôOI4S
C 57, 67 H 6, 02 N 8, 96 S 3, 42
trouvée :
C 56, 41 H 6, 11 N 6, 11 S 3, 36
Calculée Dérivé Dérivé pour les portions de tétracycline de pénicilline (I) (II)
62, 6"/o 37, 4"A,
trouvée : 61, 7% 37,2%
Le titrage de la portion (I) est effectué par iodométrie. Celui de la portion (II), par titrage spectophotométrique, en déterminant E à 356 mu. d'une solution à 10 y/cc dans le HC1 N/10.
Cette solubilité remarquable et le pH de la solution obtenue rendent possible l'administration de ce composé par voie intramusculaire, et même intraveineuse.
Le phénoxyméthylpénicillinate de Ni' (ou 9, ou 7)-4' (-hydroxyéthyl)-diéthylenediaminométhyltétra- cycline obtenu selon l'invention présente d'exceptionnelles caractéristiques antibiotiques, nettement diffé- rentes des caractéristiques des antibiotiques qui le composent.
L'activité la plus élevée est exercée sur les staphy- locoques résistant à la pénicilline. Malgré la'résistance prouvée de ces gemmes à la phénoxyméthylpénicilline, le produit obtenu selon la présente invention exerce une action nettement supérieure à celle de la N2 (ou 9, ou 7)-4' (ss-hydroxyéthyl)-diéthylènediaminométhyl- tétracycline, et naturellement à celle de tous les dérivés connus de la tétracycline.
En effet, il est bactéricide, tandis que la Na (ou 9, ou 7)-4' ((3-hydroxyéthyl)-diéthylènediaminométhyl- tétracycline est seulement baotériostatique.
Sur les germes non résistants à la pénicilline, l'ac- tion est également nettement supérieure à celle de la seule fraction basique.
La mortalité constatée sur des lots de souris blan- ches infectées par des staphylocoques résistants à la pénicilline est nettement plus faible dans les lots trai- tés par le phénoxyméthylpénicillinate de N2 (ou 9, ou 7)-4' (ss-hydroxyéthyl) dióthylènediaminométhyl- tétracycline, que dans les lots'traités par la N2 (ou 9, ou 7)-4' (ss-hydroxyóthyl)-diéthylènediaminométhyl- tétracycline.
Il ressort des spectres xanbibactérienls ci-apfès que la dose minimum inhibitrice (D. M. I.) est remarquablement faible ; il convient, pour évaluer cette dose, de tenir compte du fait que le composé obtenu selon l'invention comportant une portion pénicilline et une portion tétracycline la proportion de chacune de ces portions dans une quantité donnée du produit soumis à l'essai représente la moitié de la quantité de la portion correspondante soumise individuellement à l'essai comparatif.
De même, dans l'appréciation des résultats, il convient de noter que la toxicité du produit résulte uniquement de ta proportion de la portion tétracycline dans le produit, c'est-à-dire que'latoxicité du produit obtenu selon l'invention est d'environ la moitié de celle de la toxicité du poids de tétracyclin* égal au poids du composé soumis à l'essai,
On notera dans le tableau oiaptès, qui indique les doses minima inhibitrices en microgrammes par centimètre cube (y/cc ou A) que l'on a désigné par P le produit selon l'invention,
par T la portion tétra cycline p solubilisée de ce produit et par pmp la portion phénoxyméthylpénicilline .
Spectre antibactérien in vitro
D. M. I. y/cc
Souche T pmp P
Staphylococcus aureus Ox 0, 66 0, 02 0, 03
Sarcina lutea 0, 40 0, 04 0, 06
Streptococcus viridans 0, 40 0, 05 0, 08
Streptococcus Hem. A 0, 40 0, 02 0, 03
Diplococcus pneum. 0, 45 0, 03 0, 05
Nesseria gonorrea 0, 30 0, 01 0, 01
B. subtilis 1 0, 08 0, 13
E. Coli 0 0, 65 1, 00
E. Coli 12 0, 4-0, 38
E.
Coli N 0, 2-0, 25
Staphylococcus aureus 209 PFDA 0, 2 0, 03 0, 05
Staphylococcus aureus pénicillino résitant 62 γ/cc 0, 35 62 0, 25
Staphylococous aureus pénieiNino Tesistatit 60'y/ce 0, 48 60 0, 48
Staphylococcus aureus Silver 2 pénicillino frésistant 6 y/cc 0, 16 6 0, 16
B. Subtilis pénicillino résistant 100 y/ce 0, 24 100 0, 24
Activitéin vitro de P sur différentes souches
Plusieurs méthodes ont été employées : 1) Méthode des dilutions progressives en milieu liquide.
Les germes utilisés sont isolés des malades, ou bien ils appartiennent à la collection de souches du Laboratoire.
Produit examiné : P
Produits de comparaison : T et phénoxyméthylpénicilline.
La lecture des résultats se fait 18 heures après rensemencemont.
a) Première série d'essais :
D. M.. I.
Souches bactériennes
Staph. p. doré res. pen. 100 U. I. y/ce
Staph. p. doré res. pen. 200 U. I. y/cc
Staph. res. pen. E. U. I. y/cc res. tetr. 8 y/ce T Phénoxyméthylpénicilline P 0, 66 y/cc 100 U. I. ou 62 y/cc 0, 50 y/cc 0, 80 y/ce200 U. I. ou 124 y/ce 0, 60 y/ce 8 y/ce3 U. I. ou 4 y/ce0, 8 y/ce
b) Deuxième série d'essais (C. M. I. = concentration minimum inhibitrice).
En employant cette méthode, on a obtenu les résultats suivants en étudiant à la fois la Bactériostase et la Bactéricidie.
2) Méthode des dilutions on carrés. Bacteriostase Bactericide
Colibacille III 1) Résistant à la pénicilline 2) T C. M. I. = 0, 93 y/cc, soit 0, 70 y/cc de tétra
cyc. base 3) P C. M. I. = 0, 93 y/cc, soit 0, 43 y/cc de tétra-
cyc. base 1) Résistant à la pénicilline 2) T ler taux 100 O/o bactéricide = 5, soit 3, 78 γ/cc
de tétrac. base 3) P ler'taux 100 /o bactéricide = 5, soit 2, 36 y/cc
de tétrac. base
Staphylocoque Issoudun 1) Pénicilline : C. M. I. = 0, 46 y/cc 2) T : C. M.
I. = 0, 62 γ/cc, soit 0, 46 γ/cc de tétra
cyc. base 3) P : C. M. I. = 0, 23 y/cc, soit 0, 10 y/cc de titra-
cyc. base, et 0, 09 y/cc de pénic.
1) Pénicilline : ler taux 100 /o = 0, 62 y/cc 2) T : lez taux 100 /o = 2, 5 y/cc, soit 1, 89 y/cc
de tétracyc. base 3) P : ler taux 100 /o = 0, 95 y/cc, soit 0, 44 γ/cc
de tétracyc. base, et 0, 36 y/cc de pénic.
Résultats des mesures bactériologiques
à l'appareil de Warburg
De même, il ressort très clairement des essais effectues avec l'appareil de Warburg, c'est-à-dire : -des courbes de consommation d'oxygène des bac
téries, qui rendent compte de l'activité respira
toire de ces dernières, et de l'étude simultanée ;
-de la prolifération des bactéries, que comparative
ment à la phénoxyméthylpénicilline, à la N (ou
9, ou 7)-4' (-hydroxyéthyl)-diéthylènediSamino-
méthyltétracycline, ainsi qu'à un contrôle qui n'est
soumis à l'action d'aucun antibiotique, le produit
obtenu selon l'invention a une action tout à fait
différente et incomparablement supérieure.
Cette action se trouve illustrée par les graphiques reproduits aux fig. 1 et 2 ci-jointes.
La fig. 1 illustre la variation de la consommation d'oxygène des bactéries, et
la fig. 2 illustre la prolifération de staphylocoques dorés.
Sur les deux jeux de courbes représentés sur les fig. 1 et 2, on a désigné par 1, 2, 3 et 4, les résultats observés dans les quatre cas suivants, respectivement :
Courbe 1 : aucun antibiotique appliqué (contrôle) ;
Courbe 2 : application de phénoxyméthylpénicilline,
à raison de 0, 23 microgramme par cc ;
Courbe 3 : application de N2 (ou 9, ou 7)-4' (P-hy
droxy éthyldiéthylènediaminométhyl tétra
cycline, à raison de 0, 4 miorogramme
par cc.
Courbe4 : application du produit selon l'invention,
à raison de 0, 63 microgr, amme par cc.
On notera que, bien qu'il puisse sembler que les doses appliquées pour l'obtention des courbes 2, 3 et 4 soient différentes, il n'en est rien, car la dose de 0, 63 y/cc de la courbe 4 équivaut à la somme des 0, 23 y/ce de la courbe 2 et des 0, 4 y/ce de la courbe 3.
Les courbes de la fig. 1 sont portées en logarithmes de la quantité, en millimètres cubes d'oxygène consommée par les bactéries en fonction du temps en heures.
Les courbes de la fig. 2 sont portées en logarith- mes du nombre de micro-organismes vivants en fonc- tion du temps en heures. On constate sur la fig. 1 les résultats nettement améliorés du produit obtenu selon l'invention, sur l'inhibition de la respiration du Sta phylococcus Aureus.
De même, la prolifération du Staphylococcus Au- reus est affectée d'une façon spectaculaire par le produit obtenu selon l'invention : en effet, alors que les courbes 1 et 2 indiquent une croissance du nombre de micro-organismes, la courbe 3 indique seulement un nombre constant, c'est-à-dire seulement une bacté riostase. Au contraire, la courbe 4 indique une dimi- nution croissante de ce nombre, c'est-à-dire une bac téricidie. Le composé obtenu selon l'invention est donc bien, comme indique plus haut, non seulement bactériostatique, mais encore bactéricide, ce qui est surprenant quand on considère les propriétés individuelles de ses portions constitutives.
En effet, il est intéressant, en se reportant à la formule développée, indiquée ci-dessus, de remarquer que la portion tétracyoline de cette formule correspond à une substance à action purement bactériostatique, que la portion diaminohétérocyclique seule correspond à un grou pement solubilisant et que la portion pénicilline substituée correspond seule à une substance bactéricide ; alors que la molécule complexe du produit obtenu selon l'invention est entièrement soluble et exerce une action bactéricide sur toutes les bactéries gram+ producteurs de pénicillmase, y compris les staphylo- coques dorés.
C'est précisément dans cotte propriété essentielle que réside l'originalité et l'intérêt du produit obtenu selon l'invention.
Il semble que le comportement dans l'organisme du nouveau composé obtenu selon l'invention peut s'expliquer par ses caractéristiques physiques qui montrent qu'au contraire des sels de la portion tétra- cycline autres que le phénoxymothyl-pénicitlate, ce nouveau composé ne subit qu'une ionisation très fai- ble et très progressive, de sorte que chaque portion de la grande moilécule complexe n'intervient pas indivi- duellement, mais qu'au contraire c'est cette grande molécule qui agit dans son ensemble avec ses propane- tés propres.
Cette théorie peut se justifier, en premier lieu, par la comparaison des points cryoscopiques et des valeurs des fésisdvités de solutions de différenlts sels de la N2 (ou 7, ou 9)-4' (fi-hydroxyéthyl)-diéthylène- diaminomëthyltétracycime :
Point cryoscopique Résistance ( C sur solution aqueuse (108 ohms/cm
Sel du dérivé T 0, 05 M) sur soluttion laqueuse 0, 01 M) citrate 0, 15 0, 35 glutamate 0, 14 0, 51 succinate 0, 13 0, 39 phénoxyméthylpénicillate 0, 09 0, 74
De même, l'application de la formule classique de Raoult, liant l'abaissement du point cryoscopique A à la constante de dissociation K d'un sel de masse moléculaire M en solution aqueuse de concentration c, A=K- donne dans le cas présent M
-0,09 = K # 0, 05
d'où K =-18
Cette valeur de Kest pratiquement celle correspondant aux non-électrolytes, ce qui montre qu'en solu- tion 0,
05 M l'ionisation est pratiquement nulle à 0O C.
Ces résultats sont encore confinés par les mesures conductimétriques effectuées à diverses températures sur des solutions aqueuses à diverses concentrations du composé obtenu selon l'invention, et réunies dans le tableau ci-après :
EMI5.1
<tb> <SEP> C <SEP> M/94 <SEP> M/940 <SEP> M9400 <SEP> M/94000
<tb> <SEP> c <SEP> 0, <SEP> 103 <SEP> 0, <SEP> 32 <SEP> 0, <SEP> 01 <SEP> 0, <SEP> 003
<tb> <SEP> x <SEP> # <SEP> X <SEP> # <SEP> X <SEP> # <SEP> X
<tb> <SEP> 0 C <SEP> 23623, <SEP> 329, <SEP> 6283, <SEP> 6341, <SEP> 28 <SEP> 121
<tb> 20o <SEP> C <SEP> 396 <SEP> 37, <SEP> 5 <SEP> 51 <SEP> 48 <SEP> 6, <SEP> 83 <SEP> 66 <SEP> 2, <SEP> 80 <SEP> 262 <SEP>
<tb> 37 CX <SEP> 563 <SEP> 53,
5 <SEP> 74 <SEP> 70 <SEP> 8,80 <SEP> 83 <SEP> 3,20 <SEP> 302
<tb>
est exprimé
1000
# =
c
On a reporté ces résultats sur la fig. 3, sur laquelle les courbes A, B et C représentent la variation du coefficient # du tableau ci-dessus en fonction de 103#c à des températures respective de 0 C, 20 C et 37 C, Chacune de ces courbes est caractéristique d'une électrolyse très faible.
Bien que ces courbes # = #(c) ne permettent pas d'extrapoler la valeur de ##, on peut conclure qu'7 la concentration c = 10-5, le coeffi cient d'ionisation
I portionacidephénoxyméthylpénicillinique 11 portiondérivéde, tétracycline i A10-; a=-
I composé selon l'invention !.,-.c # est nettement inférieur à 1. Le composé obtenu selon l'invention se comporte donc comme un complexe partiel.
Cette ionisation incomplète et faible du produit obtenu selon l'invention peut certainement, bien que peut être encore imparfaitement, justifier son comportement bactériologique particulier, ainsi que ses clearances rénales nettement abaissées par comparaison à celles de ses constituants. Le terme clearance est utilisé ici avec sa signification médicale classique :
On appelle clearance d'une substance, par exemple l'urée : la quantité (ml) de plasma qui renfermait la quantité (grammes) de substance (urée) éliminée en 1 minute d'activité rénale . (Réf. B. A. Houssa
Physiologie Humaine-p. 1061-Flammarion éd.-1950).