Procédé pour la préparation d'un acide aminé
La présente invention a pour objet un procédé pour l'obtention de la L (+)-isoglutamine :
EMI1.1
La L (+)-isoglutamine est un acide aminé amide, dont l'existence dans certaines protéines a été véri- fiée (cf. Kovacs et coll., Experientia, 1955,11,96).
On a montré son utilité comme tampon pour la titration de l'azote aminé au cours de l'étude des peptidases (cf. Melville et coll., Biochem. J., 1935,29, 187). C'est encore l'effet tampon de la L (+)-iso- glutamine qui est mis à profit dans son utilisation pour la préparation de solutions injectables d'auréo- mycine (cf. brevet américain No 2644782). On doit enfin rappeler son utilité dans certains milieux de cultures microbiologiques où elle joue le rôle d'un facteur de croissance (cf. Silverman et coll., J. Bac tériol., 1954,68,98).
Ces nombreuses utilisations rendaient nécessaire l'élaboration d'une synthèse simple et peu onéreuse de la L (+)-isoglutamine et c'est ce que la titulaire a réalisé par la mise en oeuvre du procédé de la présente invention.
On connaît différentes méthodes de synthèse de la L (+)-isoglutamine. Bergmann et Zervas (Ber., 1932,65,1192) font réagir l'ammoniac sur l'an- hydride N-carbobenzyloxyglutamique. Cette préparation implique l'utilisation dangereuse du phosgène pour la préparation du chloroformiate de benzyle qui sert à la carbobenzyloxylation et est un réactif instable et difficile à purifier ; de plus, elle conduit en réalité à un mélange de glutamine et d'isoglutamine.
Kozo-Narita (J. Chem. Soc. Japan, Pure Chem.
Sect., 1953,74,832) obtient, par action de l'alcool, puis de l'hydrazine sur l'anhydride N-carbobenzyloxyglutamique, un mélange de mono et dihydrazide qui conduit, après hydrogénolyse du reste carbobenzyloxy et réduction de la fonction hydrazide par le nickel de Raney, à la L-isoglutamine. Ce procédé présente les inconvénients déjà cités pour la méthode précédente. Le rendement est, de plus, mauvais par suite d'une formation préférentielle de dihydrazide.
Chambers et Carpenter (J. Am. Chem. Soc., 1955,77,1522) ont proposé de remplacer le blocage N-carbobenzyloxy par une protection N-carbop-nitrobenzyloxy. Cette méthode implique toujours l'utilisation du phosgène et présente les mmes incon vénients que les précédentes.
King et coll. (J. Chem. Soc., 1951, p. 243) ont proposé l'action de l'alcool benzylique sur l'anhydride
N-phtaloyl-glutamique. On obtient intermédiairement le y-monoester benzylique, forme en a le chlorure d'acide, amidifie par l'ammoniac, hydrogénolyse l'ester benzylique et élimine la protection phtaloyle.
Cette voie qui comporte 7 stades au départ de l'acide glutamique ne peut s'appliquer à l'obtention d'une forme optiquement active de l'isoglutamine, du fait de diverses racémisations.
Bouthillier et coll. (Can. J. Chem., 1955,33, 1630) font la synthèse de la L-isoglutamine par réac- tion de l'ammoniac sur l'anhydride mixte éthylcarbonique de l'ester y-benzylique de l'acide N-carbo benzyloxy-L-glutamique. Ce procédé comporte les inconvénients déjà énumérés de la carbobenzyloxylation. De plus, l'obtention de l'ester Y-benzylique de l'acide N-carbobenzyloxy-L-glutamique est très malaisée et fournit de très faibles rendements.
Du Vigneaud et coll. (J. Am. Chem. Soc., 1954, 76,3110), traitent le chlorure de l'acide N-tosylpyrrolidonecarboxylique par l'ammoniac, hydrolysent en N-tosyl-L-isoglutamine et éliminent le blocage tosyle par le sodium en ammoniaque liquide. Les inconvénients de ce procédé résident principalement dans ce dernier stade dont la réalisation industrielle est malaisée. On obtient, de plus, un mélange de
L-isoglutamine et de sels minéraux, très difficile à purifier.
Le procédé suivant la présente invention est caractérisé en ce qu'on fait réagir le y-monoester méthylique de l'acide N-trityl-L-glutamique (formule I) avec le dicyclohexylcarbodiimide d'une part et de l'ammoniac d'autre part, qu'on saponifie le
N-trityl-L-isoglutaminate de méthyle (formule II) obtenu en N-trityl-L-isoglutamine (formule III) et qu'on détrityle la N-trityl-L-isoglutamine.
Le cours de la synthèse suivant l'invention est représenté sur la planche annexée.
Le y-monoester méthylique de l'acide N-trityl
L-glutamique se laisse aisément préparer par le procédé décrit dans le brevet N 344714.
Le procédé suivant l'invention n'implique aucun des inconvénients énumérés plus haut et conduit à un rendement global inégalé en mettant en oeuvre des opérations d'une extrme simplicité.
Pour la mise en oeuvre du présent procédé, on peut dissoudre le N-tritylglutamate de y-méthyle (formule I) dans un solvant approprié, traiter la solution par le dicyclohexylcarbodiimide et par l'ammo- niac, acidifier, filtrer et isoler dans le filtrat le
N-trityl-L-isoglutaminate de méthyle (formule II) qu'on saponifie puis détrityle suivant des procédés connus.
Selon un mode d'exécution préféré du procédé de l'invention, on dissout le N-trityl-glutamate de y-méthyle (formule I) dans un solvant non miscible à l'eau, tel que le chlorure de méthylène, traite la solution par le dicyclohexylcarbodiimide et par l'ammoniac, acidifie par l'acide acétique, filtre et isole le N-trityl-L-isoglutaminate de méthyle (formule II) par évaporation à sec de sa solution et reprise du résidu par un solvant tel que l'éther. On saponifie (formule II) par chauffage au sein d'un solvant tel qu'un alcool inférieur, par exemple l'étha- nol, en présence d'un hydroxyde alcalin tel que la soude et isole la N-trityl-L-isoglutamine (formule III) qu'on détrityle enfin par traitement par l'acide acétique dilué,
suivant un procédé connu.
Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter. On peut notamment faire varier la nature des solvants et des réactifs, l'ordre d'introduction de ces derniers, les temps et températures des réactions. Il est aussi possible de faire réagir, à basse température, un équivalent du dicyclohexylcarbodiimide sur le N-trityl-L-glutamate de y-méthyle (formule I), d'isoler l'anhydride bis-(N-trityl-y-mé- thyl-L-glutamique) (formule V) d'où l'on passe ensuite aisément au N-trityl-L-isoglutaminate de méthyle (formule II) par action de l'ammoniac et traitements comme indiqué plus haut.
Les points de fusion instantanée ont été tous déterminés sur le bloc Maquenne.
Exemple 1 a) Obtention du N-trityl-L-isoglutaminate de me-
thyle (I7)
On dissout 8,1 g de N-trityl-L-glutamate de y-méthyle (formule I) (obtenus par le procédé décrit dans le brevet N 344714 par action du chlorure de trityle sur le chlorhydrate du glutamate de dibenzyle, suivie de méthanolyse en présence de méthylate de sodium et d'hydrogénolyse ménagée en présence d'un agent alcalin) dans 50 ce de chlorure de méthylène, sature d'ammoniac, ajoute 0,8 g de Ntrityl-L-glutamate de y-méthyle (formule I) et 4,6 g de dicyclohexylcarbodiimide et abandonne une heure à la température ambiante.
On filtre, fait barboter pendant une minute un très léger courant d'ammoniac, abandonne cinq minutes à la température ambiante et acidifie par 1 cm3 d'acide acétique. On filtre, lave le filtrat avec 20 cm3 d'eau, sèche sur sulfate de sodium et évapore à sec sous vide. On reprend le résidu dans 50 cm3 d'éther et essore pour obtenir 5,5 g de N-trityl-L-isoglutaminate de méthyle. Les eaux mères sont évaporées à sec et le résidu repris dans 20 ce de chlorure de méthylène. On traite par l'ammoniac, ajoute 1,8 g de dicyclohexylcarbodiimide et obtient, après traitement comme indiqué plus haut, 1,2 g de N-trityl-L-isoglutaminate de méthyle (formule II), le rendement global de l'opération étant de 76 %.
Le produit, qui n'a pas encore été décrit dans la littérature, F = environ 1200 C, [a] 2D = + 260 + 1, (c = 1 %, chloroforme), se présente sous forme de petits feuillets incolores, insolubles dans 1'eau, très peu solubles dans l'éther, solubles dans l'alcool, l'acétone et le chloroforme.
Analyse : C., H03N. = 402, 47
Calculé : C 74,60 % H 6,51 % N 6,96 %
Trouvé : C74, 6 % H 6,6 % N7, 0 % b) Saponification du N-trityl-L-isoglutaminate de
méthyle (formule 11)
On dissout, au bain-marie à 45 C, 2,01 g de
N-trityl-L-isoglutaminate de méthyle (formule II) dans 10 d'éthanol à 95 %. On introduit alors lentement 5,2 cm de soude N, chauffe encore 10 minutes au bain-marie, évapore en partie l'alcool sous vide, ajoute 20 cm3 d'eau et termine l'élimination de l'alcool à 40 C sous vide.
On acidifie la solution aqueuse obtenue par 5,5 cm3 d'acide chlorhydrique N en présence de 10 cm de chlorure de méthylène, agite, décante la couche organique qu'on sèche sur sulfate de sodium et évapore à sec sous vide. On reprend dans 20 cm3 d'éther de pétrole, essore et sèche pour obtenir 1,92 g (rendement quantitatif) de N-trityl-L-isoglutamine (formule III), [a] =+35 l, (c==2%, alcool absolu), qu'on utilise directement dans l'opération suivante.
c) Detritylation de la N-trityl-L-isoglutamine (f or-
mule 111)
On mélange 0,5 g de N-trityl-L-isoglutamine (formule III) avec 1 cm3 d'acide acétique et 1 cm d'eau et abandonne le tout pendant 25 minutes à 28fC. On ajoute 2cm3 d'eau, filtre, concentre le filtrat sous vide à 40 C, reprend le résidu dans l'acétone et essore pour obtenir 150 mg (80 %) de
L (+)-isoglutamine (formule IV), [a] SD = + 200 + 1 (c = 1 %, eau).
Anulyse : C, ; HI"O. ; N = 146, 15
Calculé : C 41,09 % H 6,90 % N 19,17 %
Trouvé : C 41, 0 % H 6,9 % N 19, 1 %
Ce produit est identique à un échantillon authentique de L (+)-isoglutamine.
Exemple 2
On dissout 8 g de N-trityl-L-glutamate de y-méthyle (formule I) dans 50 cm3 de chlorure de méthylène, ajoute un équivalent de dicyclohexylcarbodiimide et abandonne à la température de -10#) C pendant une heure. On filtre, évapore à sec sous vide, reprend le résidu dans un minimum de chlorure de méthylène, ajoute du méthanol et distille le chlorure de méthylène pour obtenir, après essorage et avec un rendement de 90%, l'anhydride bis- (N-trityl-y-méthyl-L-glutamique) (formule V),
F = 157 C, [a] 2D = + 520 1 (c =1 %, chloroforme).
Ce produit, qui est nouveau, se présente sous forme de petits prismes incolores, insolubles dans 1'eau et l'éther, très peu solubles dans l'alcool, solubles dans le chloroforme.
Analyse : C,,, HIsO7N2=788, 9
Calculé : C 76, 12 % H 6,13 % N 3,55 %
Trouvé : C 76, 1 % H 6,1 % N 3, 6 %
L'anhydride bis- (N-trityl-y-méthyl-L-glutamique) (formule V) est facilement transformé, par action de l'ammoniac, en N-trityl-L-isoglutaminate de méthyle (formule II) que l'on traite ensuite de la manière décrite dans 1'exemple 1.
Process for the preparation of an amino acid
The present invention relates to a process for obtaining L (+) - isoglutamine:
EMI1.1
L (+) - isoglutamine is an amino acid amide, the existence of which in certain proteins has been verified (cf. Kovacs et al., Experientia, 1955,11,96).
Its utility as a buffer for the titration of amino nitrogen has been shown in the study of peptidases (cf. Melville et al., Biochem. J., 1935,29, 187). It is also the buffering effect of L (+) - isoglutamine which is exploited in its use for the preparation of injectable solutions of aureomycin (cf. United States Patent No. 2644782). Finally, we must recall its usefulness in certain microbiological culture media where it plays the role of a growth factor (cf. Silverman et al., J. Bac teriol., 1954,68,98).
These many uses made it necessary to develop a simple and inexpensive synthesis of L (+) - isoglutamine and this is what the holder has achieved by carrying out the process of the present invention.
Different methods of synthesizing L (+) - isoglutamine are known. Bergmann and Zervas (Ber., 1932,65,1192) react ammonia with N-carbobenzyloxyglutamic anhydride. This preparation involves the dangerous use of phosgene for the preparation of benzyl chloroformate which serves for the carbobenzyloxylation and is an unstable and difficult reagent to purify; moreover, it actually leads to a mixture of glutamine and isoglutamine.
Kozo-Narita (J. Chem. Soc. Japan, Pure Chem.
Sect., 1953,74,832) obtains, by the action of alcohol, then of hydrazine on N-carbobenzyloxyglutamic anhydride, a mixture of mono and dihydrazide which leads, after hydrogenolysis of the carbobenzyloxy residue and reduction of the hydrazide function by Raney nickel, to L-isoglutamine. This method has the drawbacks already mentioned for the previous method. The yield is, moreover, poor due to preferential formation of dihydrazide.
Chambers and Carpenter (J. Am. Chem. Soc., 1955,77,1522) proposed to replace the N-carbobenzyloxy blocking by an N-carbop-nitrobenzyloxy protection. This method still involves the use of phosgene and has the same drawbacks as the previous ones.
King et al. (J. Chem. Soc., 1951, p. 243) have proposed the action of benzyl alcohol on the anhydride
N-phthaloyl-glutamic. Intermediate obtained is the benzylic γ-monoester, α-form of the acid chloride, amidification with ammonia, hydrogenolysis of the benzyl ester and the phthaloyl protection removed.
This route which has 7 stages starting from glutamic acid cannot be applied to obtaining an optically active form of isoglutamine, due to various racemizations.
Bouthillier et al. (Can. J. Chem., 1955,33, 1630) synthesize L-isoglutamine by reacting ammonia with the mixed ethyl carbonic anhydride of the γ-benzyl ester of N-carbo acid benzyloxy-L-glutamic. This process has the already enumerated drawbacks of carbobenzyloxylation. In addition, obtaining the Y-benzyl ester of N-carbobenzyloxy-L-glutamic acid is very difficult and provides very low yields.
Du Vigneaud et al. (J. Am. Chem. Soc., 1954, 76,3110), treat the chloride of N-tosylpyrrolidonecarboxylic acid with ammonia, hydrolyze to N-tosyl-L-isoglutamine and eliminate the tosyl blockade by sodium in liquid ammonia. The drawbacks of this process lie mainly in this last stage, the industrial realization of which is difficult. In addition, a mixture of
L-isoglutamine and mineral salts, very difficult to purify.
The process according to the present invention is characterized in that the γ-methyl monoester of N-trityl-L-glutamic acid (formula I) is reacted with dicyclohexylcarbodiimide on the one hand and with ammonia on the other hand. hand, we saponify the
Methyl N-trityl-L-isoglutaminate (formula II) obtained as N-trityl-L-isoglutamine (formula III) and which detrityl N-trityl-L-isoglutamine.
The course of the synthesis according to the invention is shown on the attached sheet.
N-trityl acid methyl monoester
L-glutamic can easily be prepared by the process described in patent No. 344714.
The method according to the invention does not involve any of the drawbacks enumerated above and leads to an unequaled overall efficiency by implementing extremely simple operations.
For carrying out the present process, the γ-methyl N-tritylglutamate (formula I) can be dissolved in a suitable solvent, the solution treated with dicyclohexylcarbodiimide and with ammonia, acidified, filtered and isolated in the solution. filtrate it
Methyl N-trityl-L-isoglutaminate (formula II) which is saponified and then detritylated according to known methods.
According to a preferred embodiment of the process of the invention, the γ-methyl N-trityl-glutamate (formula I) is dissolved in a solvent immiscible with water, such as methylene chloride, the solution is treated. with dicyclohexylcarbodiimide and with ammonia, acidifies with acetic acid, filters and isolates methyl N-trityl-L-isoglutaminate (formula II) by evaporating its solution to dryness and taking up the residue in a solvent such as l 'ether. It is saponified (formula II) by heating in a solvent such as a lower alcohol, for example ethanol, in the presence of an alkali hydroxide such as sodium hydroxide, and the N-trityl-L-isoglutamine is isolated. (formula III) which is finally detritylated by treatment with dilute acetic acid,
according to a known method.
The following examples illustrate the invention without however limiting it. It is in particular possible to vary the nature of the solvents and the reagents, the order of introduction of the latter, the times and temperatures of the reactions. It is also possible to react, at low temperature, an equivalent of dicyclohexylcarbodiimide with y-methyl N-trityl-L-glutamate (formula I), to isolate bis- (N-trityl-y-mee - Thyl-L-glutamic) (formula V) from which one then passes easily to methyl N-trityl-L-isoglutaminate (formula II) by the action of ammonia and treatments as indicated above.
Instantaneous melting points were all determined on the Maquenne block.
Example 1 a) Obtaining N-trityl-L-isoglutaminate from me-
thyle (I7)
8.1 g of γ-methyl N-trityl-L-glutamate (formula I) (obtained by the process described in patent No. 344714) are dissolved by the action of trityl chloride on the hydrochloride of dibenzyl glutamate, followed by methanolysis in the presence of sodium methoxide and controlled hydrogenolysis in the presence of an alkaline agent) in 50 cc of methylene chloride, saturated with ammonia, add 0.8 g of γ-methyl Ntrityl-L-glutamate (formula I ) and 4.6 g of dicyclohexylcarbodiimide and leave for one hour at room temperature.
Filtered, bubbled a very slight stream of ammonia for one minute, left for five minutes at room temperature and acidified with 1 cm3 of acetic acid. Filtered, the filtrate washed with 20 cm3 of water, dried over sodium sulfate and evaporated to dryness in vacuo. The residue is taken up in 50 cm3 of ether and filtered off to obtain 5.5 g of methyl N-trityl-L-isoglutaminate. The mother liquors are evaporated to dryness and the residue taken up in 20 cc of methylene chloride. Treated with ammonia, 1.8 g of dicyclohexylcarbodiimide is added and, after treatment as indicated above, 1.2 g of methyl N-trityl-L-isoglutaminate (formula II) is obtained, the overall yield of the operation. being 76%.
The product, which has not yet been described in the literature, F = approximately 1200 C, [a] 2D = + 260 + 1, (c = 1%, chloroform), is in the form of small, colorless, insoluble layers. in water, very poorly soluble in ether, soluble in alcohol, acetone and chloroform.
Analysis: C., H03N. = 402, 47
Calculated: C 74.60% H 6.51% N 6.96%
Found: C74, 6% H, 6.6% N7, 0% b) Saponification of N-trityl-L-isoglutaminate from
methyl (formula 11)
Is dissolved in a water bath at 45 C, 2.01 g of
Methyl N-trityl-L-isoglutaminate (formula II) in 95% ethanol. Then slowly introduced 5.2 cm of N sodium hydroxide, heated for another 10 minutes in a water bath, the alcohol partially evaporated under vacuum, 20 cm3 of water added and the elimination of the alcohol at 40 C under vacuum is completed. .
The aqueous solution obtained is acidified with 5.5 cm 3 of N hydrochloric acid in the presence of 10 cm of methylene chloride, stirred, the organic layer decanted, which is dried over sodium sulfate and evaporated to dryness in vacuo. The residue is taken up in 20 cm3 of petroleum ether, filtered off and dried to obtain 1.92 g (quantitative yield) of N-trityl-L-isoglutamine (formula III), [a] = + 35 l, (c == 2 %, absolute alcohol), which is used directly in the following operation.
c) Detritylation of N-trityl-L-isoglutamine (f or-
mule 111)
0.5 g of N-trityl-L-isoglutamine (formula III) is mixed with 1 cm3 of acetic acid and 1 cm of water and the whole is left for 25 minutes at 28 ° C. 2cm3 of water are added, filtered, the filtrate is concentrated under vacuum at 40 C, the residue is taken up in acetone and filtered off to obtain 150 mg (80%) of
L (+) - isoglutamine (formula IV), [a] SD = + 200 + 1 (c = 1%, water).
Anulyse: C,; HI "O .; N = 146.15
Calculated: C 41.09% H 6.90% N 19.17%
Found: C 41.0% H 6.9% N 19.1%
This product is identical to an authentic sample of L (+) - isoglutamine.
Example 2
8 g of γ-methyl N-trityl-L-glutamate (formula I) are dissolved in 50 cm3 of methylene chloride, one equivalent of dicyclohexylcarbodiimide is added and left at a temperature of -10 ° C for one hour. It is filtered, evaporated to dryness under vacuum, the residue is taken up in a minimum of methylene chloride, methanol is added and the methylene chloride is distilled off to obtain, after draining and with a yield of 90%, the bis- (N- anhydride. trityl-y-methyl-L-glutamic) (formula V),
Mp = 157 C, [a] 2D = + 520 1 (c = 1%, chloroform).
This product, which is new, is in the form of small colorless prisms, insoluble in water and ether, very poorly soluble in alcohol, soluble in chloroform.
Analysis: C ,,, HIsO7N2 = 788.9
Calculated: C 76.12% H 6.13% N 3.55%
Found: C 76.1% H 6.1% N 3.6%
Bis- (N-trityl-y-methyl-L-glutamic) anhydride (formula V) is easily converted, by the action of ammonia, into methyl N-trityl-L-isoglutaminate (formula II) as the treatment is then carried out as described in Example 1.