Procédé de préparation d'un dipeptide
La présente invention a pour objet un procédé pour la préparation d'un dipeptide, terme intermédiaire de la synthèse de l'ocytocine, hormone nonapeptidique, dont la formule de constitution suivante :
EMI1.1
a été démontrée par Du Vigneaud et collaborateurs, J. Am. Chem. Soc., 1954, 76, 3115.
Le dipeptide dont le procédé de préparation fait l'objet de la présente invention est un diester de l'acide N-trityl-glutamyl-aspartique de formule VII dont la préparation figure au schéma annexé et sera décrite plus loin.
Comme le montre la formule VII, il s'agit de (N-trityl-^z-alcoyl)-glutamyl-aspartate de p-alcoyle.
Ce composé se prête aisément à la préparation de la glutaminyl-asparagine de formule B suivante :
EMI1.2
par simple ammonolyse suivie de détritylation, ou peut être employé à la synthèse de différents autres glutaminyl-asparaginyl-peptides. Il suffit pour cela de le faire réagir par son carboxyle libre en présence de dicyclohexylcarbodiimide sur un ester benzylique d'aminoacide ou de peptide-selon le procédé décrit dans le brevet suisse No 343407 de la titulaire. L'hydrogénolyse, suivie d'ammonolyse et de détritylation conduit au glutaminyl-asparaginylpeptide.
Selon le procédé faisant l'objet de la présente invention, on fait réagir, en présence d'une base tertiaire, du chlorure de trityle avec l'aspartate de dibenzyle, on soumet à l'alcoolyse à froid, en présence d'un alcoolate d'un métal alcalin et d'un solvant, le N-trityl-L-aspartate de dibenzyle obtenu, on isole l'ester d'a-benzyle et 13-alcoyle de l'acide Ntrityl-L-aspartique que l'on détrityle, on condense le
L-aspartate d'a-benzyle et-alcoyle avec un N-tritylglutamate de y-alcoyle, et on soumet le (N-trityl-y- alcoyl)-glutamyl-L-aspartate d'a-benzyle et (3-alcoyle à l'hydrogénolyse.
Il a été trouvé que le N-trityl-aspartate de dibenzyle de formule II peut subir une alcoolyse préfé- rentielle en p, en présence d'un alcoolate d'un métal alcalin à condition d'opérer en présence d'un solvant comme par exemple le dioxane et à une température généralement comprise entre 10 et 25 C, les conditions usuelles d'alcoolyse conduisant par contre au dialcoylester par remplacement simultané des deux benzyles. Il suffit ensuite de détrityler l'ester mixte de formule III par l'action de l'acide acétique chaud ou de l'acétone chlorhydrique ou d'acide chlorhydrique gazeux en chloroforme pour obtenir l'aspartate mixte de formule IV.
La préparation d'un N-trityl-L-glutamate de-y- alcoyle par hydrogénolyse préférentielle d'un diester mixte de l'acide N-tritylglutamique a été décrite dans le brevet suisse No 344714.
Comme on le voit, le procédé selon l'invention permet d'accéder à un N-trityl-7-alcoyl-glutamyl- aspartate de p-alcoyle par une succession d'opérations faciles à réaliser et ne nécessitant pas, pour l'élimination du groupe trityle protecteur de la fonction amine de l'acide glutamique, l'intervention du sodium dans l'ammoniaque liquide, comme c'est le cas lorsqu'on la protège par tosylation.
Dans l'exemple qui suit, on peut utiliser un autre alcool inférieur pour l'alcoolyse que celui indiqué ou changer la nature du solvant. On peut, de même utiliser d'autres carbodiimides disubstitués comme agents de condensation. La succession des opérations figure sur le schéma annexé. Les points de fusion sont des points de fusion instantanée, déterminés sur bloc de Maquenne.
Exemple
Préparation du N-trityl-L-aspartate de dibenzyle de
formule II
97 g de p-toluène-sulfonate de L-aspartate de dibenzyle sont agités avec 2 volumes de chloroforme.
On ajoute de la soude de façon à se trouver en milieu légèrement alcalin à la phénolphtaléine. On décante la couche chloroformique, épuise la couche aqueuse au chloroforme et lave les extraits chloroformiques à l'eau. On sèche sur sulfate de magnésium et concentre légèrement la solution chloroformique. Après refroidissement, on ajoute 30 cm3 de triéthylamine et 60 g de chlorure de trityle et abandonne quelques heures. On ajoute de l'eau, décante, lave la solution chloroformique à l'eau, sèche sur sulfate de soude et évapore à sec. Le résidu est cristallisé en éthanol.
On obtient 103 g de N-trityl-L-aspartate de dibenzyle de formule II, F. = 101-1020C. Une deuxième cristallisation élève le point de fusion à 104-105 C, [a] ==+7, 5 l (c=2o/o, chloroforme). Le produit est soluble dans l'acétone, le benzène, le chloroforme et l'éther, très peu soluble dans l'alcool, insoluble dans l'eau, les acides et alcalis dilués aqueux.
Analyse : C37H3304N=555, 64
Calculé : C 79, 97 /o H 5, 99 /o N 2, 52 /o
Trouvé : 80, 0 zozo 6, 0 /o 2, 6 ouzo
Ce composé n'est pas décrit.
L'aspartate de dibenzyle de formule I employé comme matière première peut être obtenu de la manière suivante :
On prépare le chlorhydrate de ce composé à partir de son p-toluène-sulfonate accessible par estérification azéotropique de l'acide L-aspartique par l'alcool benzylique en présence d'acide p-toluène- sulfonique.
23, 6 g d'acide L-aspartique et 42 g d'acide p toluène-sulfonique monohydraté sont dissous dans 160 cm3 d'alcool benzylique à chaud. On ajoute 300 cm3 de tétrachlorure de carbone et fait bouillir en laissant distiller le mélange tétrachlorure de carbone-eau et en remplaçant le solvant au fur et à mesure de sa distillation. Lorsque le tétrachlorure de carbone se distille plus trouble, on évapore à sec, délite le p-toluène-sulfonate de L-aspartate de dibenzyle à l'éther, filtre et sèche. Le rendement est de 96 g (soit 99 /o de la théorie), F==154"C, [a] = + 8, 25o + 1 (c = 2 /o, chloroforme).
Ce composé est nouveau.
Pour passer du p-toluene-sulfonate au chlorhydrate de L-aspartate de dibenzyle, on l'agite avec 3 volumes d'eau glacée et une molécule de soude concentrée et extrait à l'Úther. La solution éthérée de l'ester libre est séchée sur sulfate de magnésium que l'on élimine par filtration. On fait passer dans la solution éthérée anhydre un courant d'acide chlorhydrique gazeux. Le chlorhydrate du L-aspartate de dibenzyle cristallise. Après lavage à l'éther, essorage et séchage, on obtient le composé avec un rendement de 80% par rapport à l'acide aspartique.
Ce chlorhydrate se présente sous forme d'aiguilles solubles dans le chloroforme, l'eau, les acides ou alcalis dilués aqueux, peu solubles dans l'alcool et l'acétone, insolubles dans l'Úther. F. = 123-124 C, [a] 2D =-2 + 1 (c = 2 /o, chloroforme).
Analyse : Ct8HW ONC1 = 349, 805
Calculé : C 61, 80 /o H 5, 76 /o O 18, 29 /o N 4, 0 /o
Cl 10, 14 /o
Trouvé : C61, 7 /o H5, 8 /o O 18, 5 /o N4, 0 /o
Cl 10, 3 /o
Ce composé n'est pas décrit dans la littérature.
Préparation du N-trityl-L-aspartate de p-methyle et
a-benzyle de formule 111
11, 1 g de N-trityl-L-aspartate de dibenzyle décrit dans l'exemple 2 sont dissous dans 60 cl ; de dioxane, on ajoute 100 cm3 de méthanol et 0, 8 crrfl d'une solution normale de méthylate de sodium dans le méthanol. Après une nuit d'abandon à la tempé- rature ambiante, on neutralise le méthylate de sodium par quelques gouttes d'acide acétique et évapore à sec. Le résidu est constitué par le composé de formule III suffisamment pur pour être détritylé directement.
Préparation du L-aspartate de p-méthyle et a-benzyle de formule IV
Le composé de formule III est repris par le chloroforme et la solution chloroformique est saturée par un courant d'acide chlorhydrique gazeux. On évapore le chloroforme sous vide et triture le chlorhydrate de formule IV à l'éther, essore et sèche. On obtient 5, 4 g de chlorhydrate de l'ester mixte de formule IV que l'on recristallise en acétate d'éthyle. Le produit se présente en aiguilles incolores, [a] D =-23 + 1 (c=4 /0, eau). Il est soluble en acétone, chloroforme, alcool ainsi que dans l'eau, les acides et alcalis dilués, insoluble dans le benzène et l'éther.
Analyse : C12HrQ4NCI=273, 7
Calcule : C 52,65% H 5,89% O 23,38% N 5,12%
Cl 12, 95 O/o
Trouve :C 52,5% H5,9% O 23,9% N 5,0%
Cl 13, 20/o
Prparation d u (N-trityl-^z-méthyl)-L-glutamyl-L-
aspartate de ss-méthyle et d'a-bes2zyle de for
mule VI
6 g de chlorhydrate de L-aspartate de p-méthyle et a-benzoyle sont dissous dans 10 cm :
3 de chlorure de méthylène, on ajoute 2, 2 cm3 de diéthylamine puis 20 cin d'éther pour précipiter complètement le chlorhydrate de diéthylamine que l'on essore et lave à l'éther. La solution de l'ester libre est évaporée à sec puis reprise dans 20 cm3 de chlorure de méthylène.
A la solution de l'ester ainsi obtenue, on ajoute 5 g de dicyclohexyl-carbodiimide, refroidit à 00 C et ajoute 8, 1 g de N-trityl-glutamate de monométhyle (Bull. Soc. Chim., 1956, p. 99), sous agitation. On laisse remonter à la température ambiante et abandonne une nuit. On ajoute alors 1 cm. s d'acide acé- tique, essore la dicyclohexylurée que l'on lave au chlorure de méthylène. La solution du produit dans le chlorure de méthylène est lavée successivement à l'acide chlorhydrique, à l'eau et au bicarbonate de soude. On sèche sur sulfate de sodium, filtre et Úvapore à sec et obtient le triester VI brut avec un rendement quantitatif.
Preparation du (N-trityl-y-methyl)-L-glutamyl-L-
aspartate de ss-méthyle de formule VII
Le triester de formule VI est repris dans 50 cm ; d'alcool à 95 ouzo On ajoute 2, 8 cm3 de triéthylamine et hydrogène en présence de 2 g de noir palladié selon les procédés habituels. L'hydrogénation terminée, on essore le catalyseur, lave à 1'alcool et Úvapore le filtrat. Le résidu est constitué par le diester acide de formule VII brut que l'on purifie le plus facilement sous forme de sel de diéthylamine. Pour cela, l'ester brut est repris par l'acétate d'éthyle, débarrassé de la triéthylamine par lavage à 1'eau et à l'acide chlorhydrique.
On sèche sur sulfate de soude et ajoute 2 cm3 de diéthylamine. On évapore à sec et ajoute de l'éther. Le sel de diéthylamine du diester acide de formule VII cristallise. Après avoir glacé, essoré et lavé à l'éther, on obtient 9, 3 g de sel sec.
La concentration des eaux mères fournit un deuxième jet portant le rendement global à 9, 7 g soit un rendement de 80 ouzo par rapport au N-trityl-glutamate de y-monométhyle, F. = 130-1350 C (peu net), [a] 20
= 0 1 (c=2 /o, eau). Le composé de formule
VII se présente en prismes, retenant 1/4 de molécule d'eau de cristallisation, solubles dans l'eau, l'acétone, F alcool, le chloroforme, peu solubles dans le benzène, insolubles dans l'Úther.
Analyse: C34H43O7N3 1/4H2O = 610, 20
Calculé : C66,92% H7,18% O 19,01% N 6,89%
Trouvé : 66, 9"/. 7, 1 O/o 18, 7 ouzo 6, 9 /o
Par ammonolyse suivie de détritylation, il fournit la glutaminyl-asparagine ayant les constantes de la littérature (J. M. Swan et V. Du Vigneaud, J. Am.
Chem. Soc., 1954, 76, 3110).
Process for preparing a dipeptide
The present invention relates to a process for the preparation of a dipeptide, an intermediate term in the synthesis of oxytocin, a nonapeptide hormone, of which the following constitutional formula:
EMI1.1
has been demonstrated by Du Vigneaud et al, J. Am. Chem. Soc., 1954, 76, 3115.
The dipeptide, the preparation process of which is the subject of the present invention, is a diester of N-trityl-glutamyl-aspartic acid of formula VII, the preparation of which appears in the attached diagram and will be described below.
As shown by Formula VII, it is p-alkyl (N-trityl- β-alkyl) -glutamyl-aspartate.
This compound easily lends itself to the preparation of the glutaminyl-asparagine of the following formula B:
EMI1.2
by simple ammonolysis followed by detritylation, or can be used in the synthesis of various other glutaminyl-asparaginyl-peptides. It suffices for this to react with its free carboxyl in the presence of dicyclohexylcarbodiimide on a benzyl ester of amino acid or peptide-according to the process described in Swiss patent No. 343407 of the holder. Hydrogenolysis, followed by ammonolysis and detritylation leads to glutaminyl-asparaginylpeptide.
According to the process forming the subject of the present invention, reacting, in the presence of a tertiary base, trityl chloride with dibenzyl aspartate, it is subjected to cold alcoholysis, in the presence of an alcoholate of an alkali metal and of a solvent, the obtained dibenzyl N-trityl-L-aspartate, the α-benzyl and 13-alkyl ester of Ntrityl-L-aspartic acid is isolated and detrityle, we condense it
Α-Benzyl and -alkyl L-aspartate with γ-alkyl N-tritylglutamate, and (N-trityl-y-alkyl) -glutamyl-L-aspartate α-benzyl and (3-alkyl) is subjected to hydrogenolysis.
It has been found that dibenzyl N-trityl-aspartate of formula II can undergo preferential p-alcoholysis in the presence of an alkali metal alkoxide provided it is operated in the presence of a solvent such as by example dioxane and at a temperature generally between 10 and 25 ° C., the usual alcoholysis conditions leading on the other hand to the dialkoyl ester by simultaneous replacement of the two benzyls. It is then sufficient to detritylate the mixed ester of formula III by the action of hot acetic acid or hydrochloric acetone or gaseous hydrochloric acid to form chloroform to obtain the mixed aspartate of formula IV.
The preparation of γ-alkyl N-trityl-L-glutamate by preferential hydrogenolysis of a mixed diester of N-tritylglutamic acid has been described in Swiss Patent No. 344714.
As can be seen, the process according to the invention makes it possible to access a p-alkyl N-trityl-7-alkyl-glutamyl-aspartate by a succession of operations that are easy to perform and do not require, for the elimination of the trityl group protecting the amine function of glutamic acid, the intervention of sodium in liquid ammonia, as is the case when it is protected by tosylation.
In the example which follows, one can use another lower alcohol for the alcoholysis than that indicated or change the nature of the solvent. It is also possible to use other disubstituted carbodiimides as condensing agents. The sequence of operations is shown in the attached diagram. The melting points are instantaneous melting points, determined on a Maquenne block.
Example
Preparation of dibenzyl N-trityl-L-aspartate
formula II
97 g of dibenzyl L-aspartate p-toluenesulphonate are stirred with 2 volumes of chloroform.
Soda is added so as to be in a slightly alkaline medium with phenolphthalein. The chloroform layer is decanted, the aqueous layer is exhausted with chloroform and the chloroform extracts are washed with water. It is dried over magnesium sulfate and the chloroform solution is slightly concentrated. After cooling, 30 cm3 of triethylamine and 60 g of trityl chloride are added and leave for a few hours. Water is added, decanted, the chloroform solution washed with water, dried over sodium sulfate and evaporated to dryness. The residue is crystallized from ethanol.
103 g of dibenzyl N-trityl-L-aspartate of formula II, F. = 101-1020C are obtained. A second crystallization raises the melting point to 104-105 C, [a] == + 7.5 l (c = 2o / o, chloroform). The product is soluble in acetone, benzene, chloroform and ether, very slightly soluble in alcohol, insoluble in water, dilute aqueous acids and alkalis.
Analysis: C37H3304N = 555.64
Calculated: C 79, 97 / o H 5, 99 / o N 2, 52 / o
Found: 80.0 zozo 6, 0 / o 2, 6 ouzo
This compound is not described.
Dibenzyl aspartate of formula I used as a raw material can be obtained as follows:
The hydrochloride of this compound is prepared from its p-toluenesulphonate accessible by azeotropic esterification of L-aspartic acid with benzyl alcohol in the presence of p-toluenesulphonic acid.
23.6 g of L-aspartic acid and 42 g of p-toluenesulphonic acid monohydrate are dissolved in 160 cm3 of benzyl alcohol under heat. 300 cm3 of carbon tetrachloride are added and the mixture is boiled, leaving the carbon tetrachloride-water mixture to distill off and replacing the solvent as it is distilled. When the carbon tetrachloride distills more cloudy, it is evaporated to dryness, the dibenzyl L-aspartate p-toluenesulphonate is separated off with ether, filtered and dried. The yield is 96 g (or 99 / o of theory), F == 154 "C, [a] = + 8, 25o + 1 (c = 2 / o, chloroform).
This compound is new.
To change from p-toluene-sulfonate to dibenzyl L-aspartate hydrochloride, it is stirred with 3 volumes of ice water and one molecule of concentrated soda and extracted with Úther. The ethereal solution of the free ester is dried over magnesium sulfate which is removed by filtration. A stream of gaseous hydrochloric acid is passed through the anhydrous ethereal solution. Dibenzyl L-aspartate hydrochloride crystallizes. After washing with ether, draining and drying, the compound is obtained with a yield of 80% relative to the aspartic acid.
This hydrochloride is in the form of needles soluble in chloroform, water, dilute aqueous acids or alkalis, sparingly soluble in alcohol and acetone, insoluble in dansther. F. = 123-124 C, [a] 2D = -2 + 1 (c = 2 / o, chloroform).
Analysis: Ct8HW ONC1 = 349, 805
Calculated: C 61, 80 / o H 5, 76 / o O 18, 29 / o N 4, 0 / o
Cl 10, 14 / o
Found: C61.7 / o H5.8 / o O 18.5 / o N4.0 / o
Cl 10, 3 / o
This compound is not described in the literature.
Preparation of p-methyl N-trityl-L-aspartate and
a-benzyl of formula 111
11.1 g of dibenzyl N-trityl-L-aspartate described in Example 2 are dissolved in 60 cl; of dioxane, 100 cm3 of methanol and 0.8 cm3 of a normal solution of sodium methoxide in methanol are added. After standing overnight at room temperature, the sodium methoxide is neutralized with a few drops of acetic acid and evaporated to dryness. The residue consists of the compound of formula III sufficiently pure to be directly detritylated.
Preparation of p-methyl and α-benzyl L-aspartate of formula IV
The compound of formula III is taken up in chloroform and the chloroform solution is saturated with a stream of gaseous hydrochloric acid. The chloroform is evaporated off under vacuum and the hydrochloride of formula IV triturated with ether, filtered off and dried. 5.4 g of hydrochloride of the mixed ester of formula IV is obtained which is recrystallized from ethyl acetate. The product appears in colorless needles, [a] D = -23 + 1 (c = 4/0, water). It is soluble in acetone, chloroform, alcohol as well as in water, dilute acids and alkalis, insoluble in benzene and ether.
Analysis: C12HrQ4NCI = 273.7
Calculates: C 52.65% H 5.89% O 23.38% N 5.12%
Cl 12.95 O / o
Finds: C 52.5% H5.9% O 23.9% N 5.0%
Cl 13, 20 / o
Preparation of u (N-trityl- ^ z-methyl) -L-glutamyl-L-
for ss-methyl a-bes2zyl aspartate
mule VI
6 g of p-methyl and α-benzoyl L-aspartate hydrochloride are dissolved in 10 cm:
3 of methylene chloride, 2.2 cm3 of diethylamine and then 20 cin of ether are added to completely precipitate the diethylamine hydrochloride which is filtered off and washed with ether. The solution of the free ester is evaporated to dryness and then taken up in 20 cm3 of methylene chloride.
To the solution of the ester thus obtained, 5 g of dicyclohexylcarbodiimide are added, cooled to 00 ° C. and 8.1 g of monomethyl N-trityl-glutamate (Bull. Soc. Chim., 1956, p. 99) added. ), with stirring. Allowed to return to room temperature and left overnight. Then 1 cm is added. s of acetic acid, the dicyclohexylurea is filtered off and washed with methylene chloride. The solution of the product in methylene chloride is washed successively with hydrochloric acid, water and sodium bicarbonate. It is dried over sodium sulphate, filtered and evaporated to dryness to obtain the crude triester VI in quantitative yield.
Preparation of (N-trityl-y-methyl) -L-glutamyl-L-
ss-methyl aspartate of formula VII
The triester of formula VI is taken up in 50 cm; of 95 ouzo alcohol 2.8 cm3 of triethylamine and hydrogen are added in the presence of 2 g of palladium black according to the usual methods. When the hydrogenation is completed, the catalyst is filtered off, washed with alcohol and the filtrate evaporated. The residue consists of the crude acid diester of formula VII which is most easily purified in the form of the diethylamine salt. For this, the crude ester is taken up in ethyl acetate, freed from triethylamine by washing with water and hydrochloric acid.
Dried over sodium sulphate and added 2 cm3 of diethylamine. It is evaporated to dryness and ether is added. The diethylamine salt of the acidic diester of formula VII crystallizes. After having frozen, drained and washed with ether, 9.3 g of dry salt are obtained.
The concentration of the mother liquors provides a second spray bringing the overall yield to 9.7 g, ie a yield of 80 ouzo relative to the γ-monomethyl N-trityl-glutamate, F. = 130-1350 C (not very clear), [ a] 20
= 0 1 (c = 2 / o, water). The compound of formula
VII is presented in prisms, retaining 1/4 of a molecule of water of crystallization, soluble in water, acetone, alcohol, chloroform, sparingly soluble in benzene, insoluble in Úther.
Analysis: C34H43O7N3 1 / 4H2O = 610.20
Calculated: C66.92% H7.18% O 19.01% N 6.89%
Found: 66.9 "/. 7, 1 O / o 18, 7 ouzo 6, 9 / o
By ammonolysis followed by detritylation, it provides glutaminyl-asparagine having the constants of the literature (J. M. Swan and V. Du Vigneaud, J. Am.
Chem. Soc., 1954, 76, 3110).