Procédé de dépolymérisation partielle de la dextrane
La présente invention concerne un nouveau procédé de dépolymérisation partielle de la dextrane.
Ce nouveau procédé s'applique en particulier à la production de dextrane à partir de la dextrane native.
La dextrane utilisable en solutions pour injections intraveineuses dans le cas de commotions est actuellement connue sous le nom de dextrane clinique. Une description précise a été établie pour ce matériel clinique par les autorités militaires des Etats-Unis d'Amérique. L'une des conditions requises est en relation avec le poids moléculaire, qui doit être tel que le poids moléculaire des 10 O/o de la matière de poids moléculaire inférieur ne soit pas au-dessous d'environ 25 000, que le poids moléculaire des 10 O/o de la matière de poids moléculaire le plus élevé ne dépasse pas 200000 et que le poids moléculaire moyen soit de l'ordre de 50 000 à 100 000, de préférence compris entre 60 000 et 80000.
Une autre condition concerne la viscosité relative de la solution aqueuse à injecter, qui doit être relativement élevée en comparaison de la concentration donnée de la dextrane, généralement 6 o/o en poids.
Dans la pratique usuelle, la dextrane est obtenue en dépolymérisant partiellement ou d'une manière contrôlée de la dextrane native, utilisant un acide comme agent hydrolisant.
La dextrane native peut être obtenue de plusieurs manières différentes. On peut l'obtenir synthétique ment en incubant un milieu nourrissant comportant de la polysaccharose avec des microorganismes produisant de la dextrane, tels que ceux du type des leuconostoques mésentéroïdes et dextranes L, jusqu'à obtention d'une quantité maximum de dextrane, dans lequel cas la synthèse s'effectue enzématiquement en présence des bactéries, ou bien elle peut être obtenue par culture de microorganismes produisant une enzyme polysaccharose de dextrane, en séparant l'enzyme par filtration de la culture, en introduisant ensuite le produit filtré ou enzyme ainsi isolée dans une solution aqueuse de polysaccharose, et en conservant la masse jusqu'à ce que la dextrane soit synthétiquement obtenue de la polysaccharose, cette synthèse étant effectuée en l'absence de bactéries, débris cellulaires, etc.
Dans chaque procédé, la dextrane native se précipite du milieu de fermentation ou nourrissant par adjonction d'un corps dans lequel la dextrane est insoluble.
Ce produit natif possède un poids moléculaire très élevé, que le calcul place dans l'ordre de millions et ne peut être injecté en toute sécurité. Comme cela a été dit précédemment, la pratique usuelle implique la division de la dextrane native dans une solution acide, afin d'en obtenir des particules présentant le poids moléculaire moyen inférieur recherché.
Selon la présente invention, on chauffe une solution aqueuse acide de la dextrane contenant de 2,5 0/o à 33 t/s O/o du volume d'eau, d'un alcool aliphatique ou d'une cétone, miscibles à l'eau et non solvants de la dextrane, à la température d'ébullition du mélange que forment l'eau et l'alcool aliphatique ou la cétone.
Selon une forme de réalisation du procédé selon l'invention, on utilise comme alcool aliphatique de l'isopropanol, la température de travail étant d'environ 850 C. Selon cette forme d'exécution, la solution aqueuse acide de dextrane native contenant l'isopropanol est chauffée à environ 850 C et maintenue à cette température durant la dépolymérisation, l'alcool semble exercer un effet retardateur ou d'inhibition sur le cours de la dépolymérisation, dont bénéficie la viscosité de la solution aqueuse de dextrane clinique formée. I1 est évident que l'isopropanol agit comme retardateur de la dépolymérisation en dimi nuant l'efficacité de l'acide hydrolyseur par diminution de l'ionisation. Certaines parties de la dextrane native ont un poids moléculaire plus élevé que d'autres.
Une dépolymérisation prématurée des parties de poids moléculaire le plus élevé conduit à une augmentation indésirable de la polydispersité du produit final en solution aqueuse. L'isopropanol prévient évidemment par sélection, au début de la dépolymérisation, une division prématurée des parties de poids moléculaire plus élevé et influence ainsi favorablement la viscosité de la solution aqueuse du produit clinique final, qui présente une monodispersité moléculaire accrue.
On a observé que, si la dépolymérisation est effectuée en chauffant la solution acide contenant l'isopropanol, à environ 850 C (point d'ébullition du mélange eau-isopropanol), jusqu'à ce que la dépolymérisation soit achevée, soit généralement quelques minutes, le 6 0/o de la solution aqueuse obtenue se sépare du reste sous forme de précipité et présente une viscosité plus élevée que la viscosité du 6 O/o de la solution obtenue par dépolymérisation d'une dextrane native similaire dans un milieu acide, mais en l'absence d'alcool. Cette viscosité plus élevée de la solution aqueuse est désirable.
Il semble que cette viscosité accrue du 6 o/o de la solution aqueuse dans les présentes conditions de travail provient du fait que les molécules obtenues par dépolymérisation de la dextrane en présence, par exemple, d'isopropanol, sont quelque peu moins embranchées que les molécules obtenues par dépolymérisation dans les conditions usuelles. Cela provient de ce que l'isopropanol augmente le désembranchement de la dextrane durant la dépolymérisation acide, ce qui produit une molécule plus linéaire, c'est-à-dire qu'une plus grande proportion du couplage structural moléculaire l : 6, se répétant dans la dextrane, peut être divisée si la dépolymérisation est effectuée en présence d'isopropanol.
Quelle que soit l'explication donnée, les solutions aqueuses ont une viscosité plus élevée que les solutions de concentration équivalente obtenues par dépolymérisation de la dextrane dans un milieu acide exempt d'alcool. La solution obtenue par dépolymérisation de la dextrane dans un milieu aqueux ayant une concentration d'isopropanol de 33 1/3 /o du volume d'eau a, par exemple, une viscosité relative de 5,3 à 250 C, tandis que la solution aqueuse obtenue par dépolymérisation de la dextrane en l'absence d'isopropanol a une viscosité relative de 4,3 seulement, à 250 C. La viscosité accrue des solutions obtenues par le procédé selon l'invention est très avantageuse du point de vue clinique.
Il est indiqué de maintenir la température pendant la dépolymérisation pratiquement constante et au point d'ébullition du mélange eau-isopropanol.
Avec apport constant de chaleur, cela est facilité par l'effet réfrigérant provenant de l'évaporation de l'eau et de l'isopropanol. Si l'on veut, l'hydrolyse peut être effectuée avec réfrigérant à reflux.
Lorsque la dépolymérisation s'effectue par charges successives de produit, la même concentration d alcool doit être observée au début de chaque opération, afin que le produit final ait dans chaque cas les mêmes caractéristiques physiques et donne lieu à une solution aqueuse de même viscosité et de même degré de monodispersion moléculaire.
Quoiqu'il soit préférable d'utiliser l'acide sulfurique ou chlorhydrique pour déclencher la dépolymérisation, d'autres acides peuvent être utilisés, par exemple l'acide phosphorique ou des acides organiques, comme l'acide acétique. Le pH du milieu acide aqueux peut être compris entre 1,20 et 1,26.
Il est quelquefois désirable d'ajouter à la solution aqueuse acide de la dextrane contenant l'isopropanol une faible quantité, par exemple de 0,3 à 1 O/o, d'un agent réducteur destiné à empêcher le développement de réactions oxydantes indésirables troublant la solution durant l'hydrolyse. L'acide ascorbique est un agent réducteur souvent employé.
La durée de la dépolymérisation sera en général, dans le cas où l'on effectue la dépolymérisation en présence d'isopropanol à environ 850 C, entre 40 et 50 minutes. A la fin de cette période de chauffage, la dépolymérisation étant terminée, on ajoutera en général immédiatement une solution caustique en quantité et concentration telles que le pH de la solution soit compris entre 6,8 et 7. La solution peut alors être refroidie à la température de 35o C à 45o C, décolorée, déionisée et clarifiée. La décoloration est effectuée de préférence en passant la solution au travers d'une couche de charbon de bois. La déionisation peut être effectuée en passant la solution décolorée au travers d'une couche ou d'une colonne d'un minéral ou d'une résine anionique ou cationique produisant un échange efficace.
La clarification ultérieure sera obtenue en général en faisant passer la solution par une terre d'infusoires.
La dextrane clinique peut être extraite de la solution aqueuse par précipitation fractionnée en utilisant un alcool ou de l'acétone comme précipitant.
On sait que, en additionnant d'une manière répétée des quantités toujours plus grandes de précipitants tels que l'isopropanol à la solution aqueuse, il est possible de précipiter et d'isoler des fractions de poids moléculaires différents. Il est d'usage d'ajouter à la solution comme première dose d'alcool, une quantité suffisante pour précipiter sélectivement la dextrane native, non utilisable pour des besoins cliniques, de séparer le précipité, puis d'ajouter une dose d'alcool suffisante pour précipiter la dextrane clinique, en abandonnant les substances de poids moléculaires inférieurs dans la solution. Cette manière de procéder peut être appliquée à la séparation de la fraction de dextrane clinique contenue dans le produit obtenu selon le présent procédé.
On peut déshydrater la fraction de dextrane clinique en utilisant de l'acétone ou de l'alcool isopropylique, puis la sécher finalement dans le vide à la température de 50O C à 800 C.
Exemple I
A une solution aqueuse à 10 O/o de dextrane, contenant de l'isopropanol dans la proportion de 7 /o du volume d'eau, on ajoute une quantité d'acide chlorhydrique suffisante à amener le pH de la solution à la valeur de 1,04. On échauffe alors la solution lentement jusqu'à approximativement 850 C et la maintient à cette température durant environ 40 à 50 minutes, après quoi on la neutralise, la refroi dit, la décolore, la déionise et la clarifie, ces traitements étant suivis de la précipitation de la fraction clinique de dextrane que l'on recueille, déshydrate et sèche finalement dans le vide.
La solution aqueuse à 6 /o de dextrane clinique obtenue de cette façon présente une viscosité relative de 3,8 à 850 C et se prête très bien à des injections intraveineuses dans le traitement des commotions.
Exemple 2
I1 est identique à l'exemple 1, à l'exception du fait que l'on remplace l'isopropanol par de l'éthanol et que la solution acidifiée est chauffée à 780 C durant 40 à 50 minutes.
Exemple 3
Il est identique à l'exemple 1, à l'exception du fait que l'isopropanol y est employé jusqu'à concurrence de 8 0/o du volume de l'eau présente dans la solution. La solution aqueuse à 6 0/o de dextrane clinique obtenue comme produit final a une viscosité relative d'environ 4 à 850 C.
Exemple 4
Il est identique à l'exemple 1, à l'exception du fait que l'isopropanol est utilisé jusqu'à concurrence de 9 /o en volume de l'eau présente. La solution aqueuse à 6 o/o de dextrane clinique obtenue a une viscosité relative d'environ 4,3 à 850 C.
Exemple 5
Il est identique à l'exemple 1, à l'exception du fait que la solution aqueuse contient de l'isopropanol jusqu'à concurrence de 10 o/o du volume de l'eau présente. Une solution aqueuse à 6 O/o de dextrane clinique finalement obtenue présente une viscosité de 4,8 à 850 C.
Exemple 6
Il est identique à l'exemple 1, à l'exception de la quantité d'isopropanol, dont la solution acide aqueuse contient 20 O/o par rapport au volume d'eau.
Exemple 7
I1 diffère de l'exemple 1, par l'emploi d'éthanol et une température d'hydrolyse de 780 C.
Exemple 8
On substitue du méthanol à l'isopropanol de l'exemple 1 à raison de 10 o/o du volume de l'eau et
I'hydrolyse s'effectue à environ 650 C, sa durée étant un peu plus longue que dans l'exemple 1, soit environ 55 à 60 minutes.
Exemple 9
L'isopropanol de l'exemple 1 est remplacé par du dioxane et l'on élève la température d'hydrolyse à 1000 C, le temps nécessaire à l'obtention de la dégradation voulue étant un peu plus court.
Exemple 10
L'isopropanol de l'exemple 1 est remplacé par de l'acétone et l'hydrolyse effectuée à 560 C durant environ 60 minutes.
L'alcool aliphatique ou la cétone présent durant la dépolymérisation de la dextrane sont des nonsolvants de la dextrane. Dans le présent procédé, la quantité d'alcool aliphatique ou cétone miscible à l'eau, soit de 2,5 O/o à 31 1/3 O/o du volume de l'eau, ne suffit généralement pas à précipiter la dextrane de la solution. De toute façon, on veillera à maintenir la quantité d'alcool ou de cétone utilisée dans les limites indiquées, de façon que la dextrane à hydrolyser reste dans la solution. Avec 33 1/3 o/o d'isopropanol, par exemple, et à une température de travail de 850 C environ, la dextrane reste dans la solution.
La quantité préférée d'alcool ou de cétone sera comprise entre 2,5 et 10 o/o ou mieux entre 7 et 10 O/o du volume de l'eau. Dans ces proportions, l'alcool ou la cétone ne forme pas de mélange azéotropique avec l'eau.
En séparant la dextrane native d'un milieu dans lequel on la produit synthétiquement à partir de la polysaccharose, la précipitation de la dextrane peut être obtenue par des alcools ou des cétones. On préférera généralement utiliser le même alcool ou cétone, mais en quantités ne produisant pas la précipitation durant la dépolymérisation de la dextrane.
Ceci n'est toutefois pas essentiel et l'alcool ou la cétone présent durant la dépolymérisation de la dextrane peut être différent du produit utilisé à précipiter la dextrane native, à condition que le précipitant du produit natif soit aussi complètement que possible éliminé de la masse de dextrane native avant que cette dernière soit dissoute dans la solution aqueuse acide et que soit additionné l'alcool ou la cétone devant être présent durant la dépolymérisation.
En effectuant ladite dépolymérisation de la dextrane en présence d'alcool ou de cétone, à la température d'ébullition du mélange eau-alcool ou eaucétone, on obtient une substance ayant un poids moléculaire de l'ordre de grandeur de celui du plasma sanguin et qui forme des solutions aqueuses d'une viscosité élevée très bien utilisable pour des injections intraveineuses.
Process for partial depolymerization of dextran
The present invention relates to a novel process for the partial depolymerization of dextran.
This new process applies in particular to the production of dextran from native dextran.
Dextran for use in solutions for intravenous injection in concussion is currently known as clinical dextran. A precise description has been established for this clinical material by the military authorities of the United States of America. One of the requirements is in relation to the molecular weight, which should be such that the 10 O / o molecular weight of the lower molecular weight material is not below about 25,000, that the molecular weight of the 10% of the highest molecular weight material does not exceed 200,000 and the average molecular weight is in the range of 50,000 to 100,000, preferably 60,000 to 80,000.
Another condition concerns the relative viscosity of the aqueous solution to be injected, which must be relatively high compared to the given concentration of dextran, generally 6% by weight.
In usual practice, dextran is obtained by partially or in a controlled manner depolymerizing native dextran, using an acid as a hydrolizing agent.
Native dextran can be obtained in several different ways. It can be obtained synthetically by incubating a nourishing medium comprising polysaccharose with dextran-producing microorganisms, such as those of the type of leuconostoques mesenteroids and dextrans L, until a maximum amount of dextran is obtained, in which case the synthesis is carried out enzematically in the presence of bacteria, or it can be obtained by culturing microorganisms producing a polysaccharose dextran enzyme, by separating the enzyme by filtration from the culture, then introducing the filtered product or enzyme thus isolated in an aqueous solution of polysaccharose, and keeping the mass until the dextran is synthetically obtained from polysaccharose, this synthesis being carried out in the absence of bacteria, cell debris, etc.
In each process, native dextran precipitates from the fermentation or nutrient medium by addition of a body in which the dextran is insoluble.
This native product has a very high molecular weight, which the calculation places in the order of millions and cannot be injected in complete safety. As has been said previously, the usual practice involves the division of native dextran in an acid solution, in order to obtain therefrom particles having the desired lower average molecular weight.
According to the present invention, heating an acidic aqueous solution of the dextran containing from 2.5 0 / o to 33 t / s O / o of the volume of water, of an aliphatic alcohol or of a ketone, miscible with l water and non-solvents for dextran, at the boiling point of the mixture formed by water and aliphatic alcohol or ketone.
According to one embodiment of the process according to the invention, isopropanol is used as aliphatic alcohol, the working temperature being about 850 C. According to this embodiment, the acidic aqueous solution of native dextran containing the isopropanol is heated to approximately 850 ° C. and maintained at this temperature during the depolymerization, the alcohol seems to exert a retarding or inhibiting effect on the course of the depolymerization, which benefits the viscosity of the aqueous solution of clinical dextran formed. It is evident that isopropanol acts as a depolymerization retarder by reducing the efficiency of the hydrolyzing acid by reducing the ionization. Some parts of native dextran have a higher molecular weight than others.
Premature depolymerization of the higher molecular weight parts leads to an undesirable increase in the polydispersity of the final product in aqueous solution. Isopropanol obviously prevents by selection, at the onset of depolymerization, a premature division of the higher molecular weight parts and thus favorably influences the viscosity of the aqueous solution of the final clinical product, which exhibits increased molecular monodispersity.
It has been observed that, if the depolymerization is carried out by heating the acidic solution containing the isopropanol, to about 850 C (boiling point of the water-isopropanol mixture), until the depolymerization is complete, which is usually a few minutes , the 6 0 / o of the aqueous solution obtained separates from the remainder in the form of a precipitate and has a higher viscosity than the viscosity of 6 O / o of the solution obtained by depolymerization of a similar native dextran in an acidic medium, but in the absence of alcohol. This higher viscosity of the aqueous solution is desirable.
It seems that this increased viscosity of 6 o / o of the aqueous solution under the present working conditions arises from the fact that the molecules obtained by depolymerization of dextran in the presence, for example, of isopropanol, are somewhat less branched than the molecules. molecules obtained by depolymerization under the usual conditions. This is because isopropanol increases dextran branching during acid depolymerization, resulting in a more linear molecule, i.e. a greater proportion of the 1: 6 molecular structural coupling, repeating in dextran, can be divided if the depolymerization is carried out in the presence of isopropanol.
Regardless of the explanation given, aqueous solutions have a higher viscosity than solutions of equivalent concentration obtained by depolymerizing dextran in an acidic medium free from alcohol. The solution obtained by depolymerizing dextran in an aqueous medium having an isopropanol concentration of 33 1/3 / o of the volume of water has, for example, a relative viscosity of 5.3 at 250 C, while the solution aqueous solution obtained by depolymerization of dextran in the absence of isopropanol has a relative viscosity of only 4.3, at 250 C. The increased viscosity of the solutions obtained by the process according to the invention is very advantageous from the clinical point of view.
It is advisable to maintain the temperature during depolymerization practically constant and at the boiling point of the water-isopropanol mixture.
With constant heat input, this is facilitated by the cooling effect resulting from the evaporation of water and isopropanol. If desired, the hydrolysis can be carried out with reflux condenser.
When the depolymerization is carried out by successive loads of product, the same alcohol concentration must be observed at the start of each operation, so that the final product in each case has the same physical characteristics and gives rise to an aqueous solution of the same viscosity and of the same degree of molecular monodispersion.
While it is preferable to use sulfuric or hydrochloric acid to initiate depolymerization, other acids can be used, for example phosphoric acid or organic acids, such as acetic acid. The pH of the aqueous acidic medium can be between 1.20 and 1.26.
It is sometimes desirable to add to the acidic aqueous solution of dextran containing isopropanol a small amount, for example 0.3 to 1 O / o, of a reducing agent to prevent the development of disturbing undesirable oxidative reactions. solution during hydrolysis. Ascorbic acid is an often used reducing agent.
The duration of the depolymerization will generally be, in the case where the depolymerization is carried out in the presence of isopropanol at approximately 850 ° C., between 40 and 50 minutes. At the end of this heating period, the depolymerization being completed, a caustic solution will generally be immediately added in a quantity and concentration such that the pH of the solution is between 6.8 and 7. The solution can then be cooled at the temperature. temperature 35o C to 45o C, discolored, deionized and clarified. The discoloration is preferably carried out by passing the solution through a layer of charcoal. Deionization can be carried out by passing the decolored solution through a layer or column of an anionic or cationic mineral or resin producing efficient exchange.
Further clarification will usually be obtained by passing the solution through diatomaceous earth.
Clinical dextran can be extracted from aqueous solution by fractional precipitation using alcohol or acetone as the precipitant.
It is known that by repeatedly adding ever greater amounts of precipitants such as isopropanol to the aqueous solution, it is possible to precipitate and isolate fractions of different molecular weights. It is customary to add to the solution as the first dose of alcohol, an amount sufficient to selectively precipitate the native dextran, not usable for clinical purposes, to separate the precipitate, then to add a sufficient dose of alcohol. to precipitate clinical dextran, dropping lower molecular weight substances into solution. This procedure can be applied to the separation of the fraction of clinical dextran contained in the product obtained according to the present process.
The clinical dextran fraction can be dehydrated using acetone or isopropyl alcohol, and then finally dried in vacuum at 50O C to 800 C.
Example I
To a 10 O / o aqueous solution of dextran, containing isopropanol in the proportion of 7 / o of the volume of water, a quantity of hydrochloric acid sufficient to bring the pH of the solution to the value of 1.04. The solution is then slowly heated to approximately 850 ° C and maintained at that temperature for about 40 to 50 minutes, after which it is neutralized, cooled, decolorized, deionized and clarified, these treatments being followed by precipitation of the clinical dextran fraction which is collected, dehydrated and finally dried in vacuum.
The 6% aqueous solution of clinical dextran obtained in this way has a relative viscosity of 3.8 at 850 ° C. and is very suitable for intravenous injections in the treatment of concussions.
Example 2
It is identical to Example 1, except for the fact that the isopropanol is replaced by ethanol and that the acidified solution is heated at 780 C for 40 to 50 minutes.
Example 3
It is identical to Example 1, except that isopropanol is used therein up to 80% of the volume of water present in the solution. The 60% aqueous solution of clinical dextran obtained as the final product has a relative viscosity of about 4 to 850 C.
Example 4
It is identical to Example 1, except for the fact that isopropanol is used up to 9% by volume of the water present. The resulting 6% aqueous solution of clinical dextran has a relative viscosity of about 4.3 at 850 C.
Example 5
It is identical to Example 1, except that the aqueous solution contains isopropanol up to 10% of the volume of water present. A 6% aqueous solution of clinical dextran finally obtained has a viscosity of 4.8 at 850 C.
Example 6
It is identical to Example 1, except for the amount of isopropanol, the aqueous acid solution of which contains 20 O / o relative to the volume of water.
Example 7
It differs from Example 1, by the use of ethanol and a hydrolysis temperature of 780 C.
Example 8
Methanol is substituted for the isopropanol of Example 1 at a rate of 10 o / o of the volume of water and
The hydrolysis is carried out at approximately 650 ° C., its duration being a little longer than in Example 1, ie approximately 55 to 60 minutes.
Example 9
The isopropanol of Example 1 is replaced by dioxane and the hydrolysis temperature is raised to 1000 ° C., the time required to obtain the desired degradation being a little shorter.
Example 10
The isopropanol of Example 1 is replaced by acetone and the hydrolysis carried out at 560 ° C. for approximately 60 minutes.
Aliphatic alcohol or ketone present during the depolymerization of dextran are non-solvents of dextran. In the present process, the amount of aliphatic alcohol or ketone miscible with water, i.e. from 2.5 O / o to 31 1/3 O / o of the volume of water, is generally not sufficient to precipitate the dextran. of the solution. In any case, care will be taken to keep the amount of alcohol or ketone used within the limits indicated, so that the dextran to be hydrolyzed remains in the solution. With 33 1/3 o / o of isopropanol, for example, and at a working temperature of approximately 850 C, the dextran remains in the solution.
The preferred amount of alcohol or ketone will be between 2.5 and 10 o / o or better between 7 and 10 O / o of the volume of water. In these proportions, the alcohol or the ketone does not form an azeotropic mixture with the water.
By separating native dextran from a medium in which it is produced synthetically from polysaccharose, precipitation of dextran can be achieved by alcohols or ketones. It will generally be preferred to use the same alcohol or ketone, but in amounts which do not produce precipitation during the depolymerization of the dextran.
This is not essential, however, and the alcohol or ketone present during the dextran depolymerization may be different from the product used to precipitate native dextran, provided that the precipitant of the native product is removed as completely as possible from the bulk. of native dextran before the latter is dissolved in the acidic aqueous solution and the addition of the alcohol or ketone to be present during the depolymerization.
By carrying out said depolymerization of dextran in the presence of alcohol or ketone, at the boiling point of the water-alcohol or water ketone mixture, a substance is obtained having a molecular weight of the order of magnitude of that of blood plasma and which forms aqueous solutions of high viscosity very well usable for intravenous injections.