Verfahren zur Herstellung von Tetracyclin Das Hauptpatent betrifft ein Verfahren zur Her stellung von Tetracyclin, bei welchem man in einer Nährlösung eine Tetracyclin produzierende Strepto- myces-Art kultiviert und sodann das so erzeugte Tetracyclin aus der Fermentationslösung abtrennt. Die Abtrennung des Antibiotikums kann nach den Angaben in der Hauptpatentschrift z.
B. derart durch geführt werden, dass es mit wasserunlöslichen orga nischen Lösungsmitteln, wie Butanol oder höheren Ketonen, aus der Fermentatiönslösung extrahiert und aus dem Extrakt durch Zugabe eines niederen Kohlen wasserstoffs ausgefällt wird, oder dass man das Anti biotikum aus der Fermentationslösung an Kieselsäure adsorbiert und daraus durch Eluieren gewinnt.
Die vorliegende Erfindung betrifft nun ein Ver fahren zur Herstellung von Tetracyclin, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man einen Tetracyclin pro duzierenden Streptomyces-Stamm in einer wässerigen, assimilierbaren Stickstoff und Kohlenhydrat enthal tenden Nährlösung submers und unter aeroben Be dingungen kultiviert, und das entstandene Tetracyclin durch Alkalischstellen der Lösung ausfällt bzw. aus der alkalisch gestellten Lösung extrahiert.
Das Tetra- cyclin kann nachträglich gegebenenfalls mit Säure in ein Salz übergeführt werden.
Es empfiehlt sich, der Nährlösung Spuren von bestimmten Schwermetallsalzen zuzusetzen, wie sie in dieser Menge öfters in rohen, natürlichen Nährmedien, wie z. B. Kornpresssaft, gefunden werden. Sofern solche Komponenten in den Nährmedien nicht schon anderweitig enthalten sind, ergibt der Zusatz dieser Salze erhöhte Ausbeuten an Tetracyclin. Hierbei emfiehlt es sich, so viel Mengen, Kupfer und insbe sondere Zink zuzusetzen, dass in den Nährmedien insgesamt mindestens 0,000331/o Mangan als MnC12 - 4H20, 0,
000331/o Kupfer als CUS04 - 5H20 und 0,00033 0/9 Zink als ZnS04 * 7 H20 enthalten sind.
Man kann z. B. die Fermentationslösung auf einen pH-Wert im Bereich von 8 bis und mit 11 einstellen und das hierbei ausfallende Gemisch von Mycelium und Tetracyclin durch Filtration abtrennen. Man kann auch die Fermentationslösung zunächst auf einen pH-Wert unter 3 ansäuern, hierauf kann das Mycel abfiltrieren und schliesslich das Filtrat in der oben beschriebenen Weise weiter behandeln. Zum Alkalischstellen eignet sich jedes Alkali genügender Stärke. Vorzugsweise aber werden Ammoniak und Natriumhydroxyd verwendet.
Als besonders geeignet hat sich der pH-Bereich von 9-10 erwiesen. Für eine allfällige Weiterbehandlung kann das gefällte Tetra cyclin in Lösung gebracht werden, indem man es (gegebenenfalls in Gegenwart des Mycels) mit Säure bei einem PH-Wert unter 3 behandelt oder mit Alkali bei einem PH-Wert über 11. Hierzu eignet sich bei spielsweise Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure und Salpetersäure. Dieselben Säuren eignen sich auch dazu, um den PH-Wert der Fermentationslösung unter 3 einzustellen, wobei sich insbesondere ein pH-Wert von 2,0-2,5 empfiehlt.
Hierbei ist das Tetracyclin als Salz in Lösung und kann durch Filtration vom festen Mycelium abgetrennt werden, bevor die oben beschriebene alkalische Fällungsmethode angewendet wird.
<I>Beispiel 1</I> Eine Fermentationslösung von Streptomyces BL 456667, die im Plattentest gegen S. Aureus un verdünnt den Wert 20,1 mm und dreimal verdünnt den Wert 15,0 mm ergab, wurde mit Natriumhydr- oxyd auf ein pH von 9,25 eingestellt und mit 205 ml n-Butanol extrahiert. Der Butanolextrakt wurde ab getrennt und durch Zugabe von Wasser und Salz- säure auf pH 7,30 eingestellt.
Nach Abdestillieren des Butanols im Vakuum verblieb ein wässeriges Konzen trat von Tetracyclin, das mit Wasser auf 21 ml ver dünnt, den Testwert 18,0 mm ergab und aus dem 93 mg festes Tetracyclin gewonnen wurden. Letzteres zeigte gegen S. Aureus bei einer Konzentration von 1 mg pro ml den Testwert 19,3 mm.
Das Rf-Spektrum dieser Probe von Tetracyclin wurde in der in der Hauptpatentschrift beschriebenen Weise bestimmt, wobei S. Aureus zum Test benützt wurde.
Das Lösungsmittelsystem 7 bestand aus 809/oigem Methanol, welches 2 9/o Piperidin, 2 9/o p-Toluolsulfo- säure und 2 9/o Laurinsäure enthielt. Das Lösungs- mittelsystem 8 bestand aus Pyridin, das 19/o Wasser, 19/o p-Toluolsulfosäure und 1 9/o Laurinsäure enthält. Die Zusammensetzung der übrigen Lösungsmittel systeme A-G ist aus der Hauptpatentschrift ersicht lich.
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Probe <SEP> Lösungsmittelsystem
<tb> A <SEP> B <SEP> C <SEP> D <SEP> E <SEP> F <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> G
<tb> a, <SEP> Rf-Wert <SEP> <B>6,7</B> <SEP> 6,7 <SEP> 4,5 <SEP> 1, <SEP> 2, <SEP> 3 <SEP> 1 <SEP> 10 <SEP> 7 <SEP> 9, <SEP> 10 <SEP> 8
<tb> b, <SEP> R,-Wert <SEP> 6 <SEP> 6,7 <SEP> 4,5 <SEP> 2, <SEP> 3, <SEP> 4 <SEP> 1 <SEP> 10 <SEP> 7 <SEP> <B>9,10</B> <SEP> 7 <I>Beispiel 2</I> Aus Fermentationslösung von Streptomyces BL 567201 wurden verschiedene Fraktionen von Tetra- cyclin in folgender Weise hergestellt:
Zur genannten Fermentationslösung (570-1080 1) wurden 285 bis 532 g Calciumchlorid und 190-4551 feuchtes n-Bu- tanol zugefügt. Der pH-Wert der Lösung, der nach der Fermentation zwischen 4,9 und 5,5 lag, wurde mit 509/oiger Natronlauge (4-10,5 1) auf 8,35 bis 8,8 eingestellt. Nach kräftigem Durchrühren ergab sich eine Emulsion, die durch Filtrieren mit Diatomeenerde abgetrennt wurde.
Die Butanolphase, welche das Tetracyclin enthielt, wurde hiernach ab getrennt (380-465 1) und auf ein Volumen von 2,5-7,01 durch Vakuumdestillation eingeengt, wobei Flüssigkeitstemperaturen unterhalb 38 C und Drucke unter 35 mm eingehalten wurden.
Die Butanolkonzentrate mit einem PH-Wert von ungefähr 7,0 bis 7,5 wurden dreimal mit gleichen Volumina Wasser, dessen pH mit Schwefel- oder Salz säure auf 2,0 eingestellt worden war, extrahiert. Die wässerigen Extrakte wurden vereinigt, mit Salzsäure auf<I>PH</I> 1,5 eingestellt, 1-29/a Aktivkohle darin auf geschlemmt, filtriert und das Filtrat auf ungefähr 1/" seines Volumens durch Vakuumdestillation einge engt. Der PH dieses wässerigen Konzentrates wurde hierauf auf mit Ammoniak ungefähr 6,0 eingestellt, wodurch Tetracyclin ausfiel.
Letzteres wurde abfil- triert. Eine zweite Fraktion Tetracyclin ergab sich in den meisten Fällen, indem das Filtrat erneut auf ungefähr 1/, eingeengt wurde.
Die verschiedenen Tetracyclinfraktionen, die in der oben beschriebenen Weise erhalten worden waren (63 g), wurden vereinigt und in 630 ml Wasser, des sen pH mit Salzsäure auf 1,5 eingestellt worden war, gelöst. Nach Filtrieren dieser Lösung wurden dersel ben 63 g Äthylendiamintetraessigsäure zugegeben.
Hierauf wurde mit Ammoniak der pH-Wert auf 6,0 eingestellt und das ausgefallene Tetracyclin (30 g) abfiltriert, im Vakuum über Phosphorpentoxyd ge trocknet und hierauf zweimal in 120 ml Methanol aufgeschlemmt, wobei 14,5 unlösliches Material ver- blieb, welch letzteres verworfen wurde. Die Methanol lösungen wurden vereinigt und in 400 ml Wasser auf gelöst.
Aus der wässerigen Lösung fiel Tetracyclin beim Stehenlassen über Nacht in einem kalten Raum aus; es wurde abfiltriert und an der Luft getrocknet (8,9 g in zwei Fraktionen).
Dieses Tetracyclin wurde in wässeriger Lösung bei einem pH von 1,5 mit Kohle behandelt, die Lö sung filtriert und das Tetracyclin durch Steigerung des pH-Wertes auf 3,5 mit Ammoniak ausgefällt. Das Tetracyclin (6,9 g) wurde in 34,5 ml Wasser, dessen pH mit Salzsäure auf 1,5 eingestellt worden war, ge löst, die Lösung mit Ammoniak auf pH 3,5 eingestellt und geimpft, worauf das Hydrat der Tetracyclinbase langsam auskristallisierte und durch Filtration abge trennt wurde (6,45 g).
Nach Lufttrocknung ergab die Verbindung einen Schmelzpunkt von ungefähr 171,5 bis 173,5 C. Die Prüfung durch Ultraviolettanalyse ergab einen Gehalt von 89 9/0 (basierend auf 100 9/0 Tetracyclin-hydrochlorid oder 96,4% Tetracyclin-tri- hydrat). Im biologischen Versuch gegen B. subtilis auf Platten beim pH 8,0 ergab sich ein Gehalt von 89,29/o reine Substanz.
Es erwies sich frei von Chlortetra- cyclin und Oxytetracyclin oder anderen Verunreini gungen, wie sich im Versuch mit der Papierstreifen- Chromatographie ergab. Die kristalline Tetracyclin- hydratbase enthielt 19,2 9/a Feuchtigkeit und wurde nach dem Trocknen analysiert.
Hierbei ergab sich:
EMI0002.0097
Berechnet <SEP> für <SEP> CzzH2408N,: <SEP> gefunden:
<tb> C <SEP> 59,45; <SEP> 59,6;
<tb> H <SEP> 5,44; <SEP> 5,45;
<tb> N <SEP> 6,30; <SEP> 6,29. Die Auflösung der kristallisierten Tetracyclinbase in Mineralöl (Nujol) ergibt verschiedene charakte ristische Absorptionsbanden im Infrarot. Darunter befinden sich die folgenden Frequenzen (in cm-')- 3490, 1672, 1607, 1524, 1259, 1222, 1130, 1065, 1040, 990, 963, 948, 932, 861, 838, 803, 786, 741, 739 und 668.
Die kristallisierte Tetracyclinhydratbase (2 g) wurde in 20 ml n-Propanol, welches ungefähr 0,5 ml konzentrierte Salzsäure enthielt, aufgelöst. Nach 30 Minuten Stehenlassen bei Raumtemperatur und 90 Minuten in der Kälte fiel kristallisiertes Tetra- cyclin-hydrochlorid aus, welches abfiltriert wurde (1,5 g). Es zeigte einen Schmelzpunkt von 217 bis 219 C unter Zersetzung.
EMI0003.0007
Analyse:
<tb> berechnet <SEP> für <SEP> C22H2408N2 <SEP> * <SEP> HCL: <SEP> gefunden:
<tb> C <SEP> 54,9; <SEP> 55,0;
<tb> H <SEP> 5,03; <SEP> 5,2;
<tb> N <SEP> 5,83; <SEP> 5,99;
<tb> Cl <SEP> 7,38; <SEP> 7,5.
Eine Lösung dieser Substanz in Mineralöl (Nujol) zeigt verschiedene charakteristische Absorptionsban den im Infrarot. Hierunter befinden sich die folgen den Frequenzen in cm-': 3340, 1678,<B>1623,</B> 1597, 1315, 1248, 1229, 1175, 1140, 1061, 1036, 1002, 964, 949, 864, 823, 796, 781, 743, 719, 692 und 667. <I>Beispiel 3</I> Eine einfache Methode zur Isolierung des Tetra- cyclins aus den Fermentationslösungen ohne Verwen dung grosser Volumina von Lösungsmittel zur Extrak tion besteht im folgenden Verfahren: Die Lösung wird durch Zugabe von Alkali auf pli 9-10 eingestellt und filtriert.
Im Filtrat bleiben weniger als 100 y Tetracyclin pro ml gelöst. Das Filtrat wird verworfen. Die Mischung aus Mycelium und ausgefälltem Tetracyclin, sowie weiteren Bestand teilen der Fermentationslösung, eignet sich in dem Zustand, wie sie anfällt, oder nach dem Trocknen als tierisches Futter oder Futterbeigabe. Das Filtrat, das wenig Tetracyclin, aber grosse Mengen wert voller Futterstoffe (wie z. B.
Proteine, Kohlehydrate, Mineralstoffe, Pigmente und insbesondere den Vitamin B-Komplex, ferner nicht identifizierbare Stimulanzien für das tierische Wachstum) enthält, kann ebenso zu tierischem Futter, insbesondere sol chem pflanzlichen Ursprungs, zugesetzt werden, und zwar vor oder nach seiner Konzentrierung oder Trocknung.
Der Wert solcher tierischer Futter oder Futterbeigaben sowohl aus der Fällung als aus dem Filtrat kann durch Zugabe löslicher Kobaltsalze vor der Fermentation gesteigert werden, wobei ungefähr 0,l-20 Teile Kobaltnitrat pro Million Teile Nähr medium zugegeben werden, ferner durch Zugabe einer das Cyanid-Ion liefernden Substanz, wie eines Alkalicyanids oder eines Alkaliferrocyanids oder von Ferricyanid, in einem Betrag von 0,1-l00 Teile pro Million der Nährlösung.
Das feste Mycelium und das daran adsorbierte Tetracyclin können auch bei niedrigem pH-Wert, z. B. bei PH = 1,5, mit kleinen Volumen wässeriger Säuren, z. B. von Schwefelsäure oder Oxalsäure, extrahiert werden, wobei eine Lösung erhalten wird, die mindestens 3000 y pro ml Tetracyclin enthält.
Dieses Tetracyclin kann isoliert werden, indem man die Säurelösung auf pH 4-10, vorzugsweise auf wenigstens pH 6 einstellt, wobei festes Tetracyclin in Form seiner Base oder als Calciumsalz ausfällt. Es hat eine Wirksamkeit von mindestens 100 y pro mg.
Nach einem andern Verfahren kann man auch die saure Lösung auf PH 9-10 einstellen, mit ungefähr einem Drittel Volumen an n-Butanol extrahieren und den Butanolextrakt auf ungefähr ein zwanzigstel seines Volumens einengen, wobei Tetracyclin in Form der Base oder des Calciumsalzes ausfällt. Seine Wirksam keit beträgt mindestens 200 y pro mg.
Process for the production of tetracycline The main patent relates to a process for the Her position of tetracycline, in which a tetracycline-producing Streptomyces species is cultivated in a nutrient solution and the tetracycline produced in this way is then separated from the fermentation solution. The separation of the antibiotic can according to the information in the main patent z.
B. be carried out in such a way that it is extracted with water-insoluble organic solvents such as butanol or higher ketones from the fermentation solution and is precipitated from the extract by adding a lower hydrocarbon, or that the antibiotic is adsorbed from the fermentation solution on silica and wins from it by eluting.
The present invention relates to a method for the production of tetracycline, which is characterized in that a tetracycline-producing Streptomyces strain is cultivated submerged and under aerobic conditions in an aqueous, assimilable nitrogen and carbohydrate-containing nutrient solution, and the resulting tetracycline precipitates by making the solution alkaline or extracted from the solution made alkaline.
The tetracycline can subsequently be converted into a salt with acid, if necessary.
It is advisable to add traces of certain heavy metal salts to the nutrient solution, as are often found in this amount in raw, natural nutrient media, such as. B. corn juice can be found. Unless such components are otherwise contained in the nutrient media, the addition of these salts results in increased tetracycline yields. It is advisable to add so much copper and especially zinc that in the nutrient media a total of at least 0.000331 / o manganese as MnC12-4H20.0,
000331 / o copper as CUS04 - 5H20 and 0.00033 0/9 zinc as ZnS04 * 7 H20 are included.
You can z. B. adjust the fermentation solution to a pH in the range from 8 to 11 and separate the resulting mixture of mycelium and tetracycline by filtration. You can also first acidify the fermentation solution to a pH value below 3, then the mycelium can be filtered off and finally the filtrate can be treated further in the manner described above. Any alkali of sufficient strength is suitable for making alkaline. However, ammonia and sodium hydroxide are preferably used.
The pH range of 9-10 has proven to be particularly suitable. For any further treatment, the precipitated tetracycline can be dissolved by treating it (if necessary in the presence of the mycelium) with acid at a pH below 3 or with alkali at a pH above 11. This is suitable for example Hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid and nitric acid. The same acids are also suitable for setting the pH of the fermentation solution below 3, a pH of 2.0-2.5 being particularly recommended.
The tetracycline is in solution as a salt and can be separated from the solid mycelium by filtration before the alkaline precipitation method described above is used.
<I> Example 1 </I> A fermentation solution of Streptomyces BL 456667, which in the plate test against S. aureus un diluted gave the value 20.1 mm and three times diluted the value 15.0 mm, was adjusted to pH with sodium hydroxide set of 9.25 and extracted with 205 ml of n-butanol. The butanol extract was separated off and adjusted to pH 7.30 by adding water and hydrochloric acid.
After the butanol had been distilled off in vacuo, an aqueous concentrate of tetracycline remained which, diluted to 21 ml with water, gave the test value 18.0 mm and from which 93 mg of solid tetracycline were obtained. The latter showed a test value of 19.3 mm against S. aureus at a concentration of 1 mg per ml.
The Rf spectrum of this sample of tetracycline was determined in the manner described in the main patent specification, using S. Aureus for the test.
The solvent system 7 consisted of 809% methanol, which contained 2 9 / o piperidine, 2 9 / o p-toluenesulfonic acid and 2 9 / o lauric acid. The solvent system 8 consisted of pyridine, which contains 19 / o water, 19 / o p-toluenesulfonic acid and 19 / o lauric acid. The composition of the other solvent systems A-G is evident from the main patent specification.
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Sample <SEP> solvent system
<tb> A <SEP> B <SEP> C <SEP> D <SEP> E <SEP> F <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> G
<tb> a, <SEP> Rf value <SEP> <B> 6.7 </B> <SEP> 6.7 <SEP> 4.5 <SEP> 1, <SEP> 2, <SEP> 3 <SEP> 1 <SEP> 10 <SEP> 7 <SEP> 9, <SEP> 10 <SEP> 8
<tb> b, <SEP> R, value <SEP> 6 <SEP> 6.7 <SEP> 4.5 <SEP> 2, <SEP> 3, <SEP> 4 <SEP> 1 <SEP> 10 <SEP> 7 <SEP> <B> 9,10 </B> <SEP> 7 <I> Example 2 </I> Different fractions of tetracycline were produced from fermentation solution of Streptomyces BL 567201 in the following way:
285 to 532 g calcium chloride and 190-4551 moist n-butanol were added to the fermentation solution mentioned (570-1080 l). The pH of the solution, which after fermentation was between 4.9 and 5.5, was adjusted to 8.35 to 8.8 with 509% sodium hydroxide solution (4-10.5 liters). After stirring vigorously, an emulsion resulted which was separated off by filtering with diatomaceous earth.
The butanol phase, which contained the tetracycline, was then separated off (380-465 l) and concentrated to a volume of 2.5-7.01 by vacuum distillation, liquid temperatures below 38 ° C. and pressures below 35 mm being maintained.
The butanol concentrates with a pH of approximately 7.0 to 7.5 were extracted three times with equal volumes of water, the pH of which had been adjusted to 2.0 with sulfuric or hydrochloric acid. The aqueous extracts were combined, adjusted to <I> PH </I> 1.5 with hydrochloric acid, 1-29 / a activated charcoal slurried in it, filtered and the filtrate was concentrated to about 1/ "of its volume by vacuum distillation. The pH this aqueous concentrate was then adjusted to approximately 6.0 with ammonia, causing tetracycline to precipitate.
The latter was filtered off. A second fraction of tetracycline was obtained in most cases by re-concentrating the filtrate to about 1/2.
The various tetracycline fractions obtained in the manner described above (63 g) were combined and dissolved in 630 ml of water the pH of which had been adjusted to 1.5 with hydrochloric acid. After filtering this solution, 63 g of ethylenediaminetetraacetic acid were added to the same.
The pH was then adjusted to 6.0 with ammonia and the precipitated tetracycline (30 g) was filtered off, dried in vacuo over phosphorus pentoxide and then suspended twice in 120 ml of methanol, 14.5 insoluble material remaining, the latter was discarded. The methanol solutions were combined and dissolved in 400 ml of water.
Tetracycline precipitated from the aqueous solution on standing overnight in a cold room; it was filtered off and air dried (8.9 g in two fractions).
This tetracycline was treated with carbon in aqueous solution at a pH of 1.5, the solution was filtered and the tetracycline was precipitated with ammonia by increasing the pH to 3.5. The tetracycline (6.9 g) was dissolved in 34.5 ml of water, the pH of which had been adjusted to 1.5 with hydrochloric acid, the solution was adjusted to pH 3.5 with ammonia and inoculated, whereupon the hydrate of the tetracycline base was slowly added crystallized out and separated off by filtration (6.45 g).
After air drying, the compound gave a melting point of approximately 171.5 to 173.5 ° C. Examination by ultraviolet analysis showed a content of 89 9/0 (based on 100 9/0 tetracycline hydrochloride or 96.4% tetracycline trihydrate ). In the biological test against B. subtilis on plates at pH 8.0, the pure substance content was 89.29%.
It was found to be free from chlorotetracycline and oxytetracycline or other impurities, as was shown in the experiment with the paper strip chromatography. The crystalline tetracycline hydrate base contained 19.2% moisture and was analyzed after drying.
This resulted in:
EMI0002.0097
Calculated <SEP> for <SEP> CzzH2408N ,: <SEP> found:
<tb> C <SEP> 59.45; <SEP> 59.6;
<tb> H <SEP> 5.44; <SEP> 5.45;
<tb> N <SEP> 6.30; <SEP> 6.29. The dissolution of the crystallized tetracycline base in mineral oil (Nujol) results in different characteristic absorption bands in the infrared. Below are the following frequencies (in cm - ') - 3490, 1672, 1607, 1524, 1259, 1222, 1130, 1065, 1040, 990, 963, 948, 932, 861, 838, 803, 786, 741, 739 and 668.
The crystallized tetracycline hydrate base (2 g) was dissolved in 20 ml of n-propanol containing approximately 0.5 ml of concentrated hydrochloric acid. After standing at room temperature for 30 minutes and in the cold for 90 minutes, crystallized tetracycline hydrochloride precipitated and was filtered off (1.5 g). It showed a melting point of 217 to 219 C with decomposition.
EMI0003.0007
Analysis:
<tb> calculates <SEP> for <SEP> C22H2408N2 <SEP> * <SEP> HCL: <SEP> found:
<tb> C <SEP> 54.9; <SEP> 55.0;
<tb> H <SEP> 5.03; <SEP> 5.2;
<tb> N <SEP> 5.83; <SEP> 5.99;
<tb> Cl <SEP> 7.38; <SEP> 7.5.
A solution of this substance in mineral oil (Nujol) shows various characteristic absorption bands in the infrared. Below are the following frequencies in cm- ': 3340, 1678, <B> 1623, </B> 1597, 1315, 1248, 1229, 1175, 1140, 1061, 1036, 1002, 964, 949, 864, 823 , 796, 781, 743, 719, 692 and 667. <I> Example 3 </I> A simple method for isolating the tetracycline from the fermentation solutions without using large volumes of solvent for extraction consists in the following process: The Solution is adjusted to pli 9-10 by adding alkali and filtered.
Less than 100 y of tetracycline per ml remain in the filtrate. The filtrate is discarded. The mixture of mycelium and precipitated tetracycline, as well as other constituents of the fermentation solution, is suitable in the state in which it arises or as animal feed or feed additive after drying. The filtrate, which has little tetracycline but large amounts of valuable feed (such as
Proteins, carbohydrates, minerals, pigments and especially the vitamin B complex, furthermore non-identifiable stimulants for animal growth) can also be added to animal feed, especially sol chem of vegetable origin, before or after its concentration or drying .
The value of such animal feed or feed additions, both from the precipitation and from the filtrate, can be increased by adding soluble cobalt salts prior to fermentation, with approximately 0.1-20 parts of cobalt nitrate per million parts of nutrient medium being added, furthermore by adding a cyanide- Ion-supplying substance, such as an alkali cyanide or an alkali ferrocyanide or ferricyanide, in an amount of 0.1-100 parts per million of the nutrient solution.
The solid mycelium and the tetracycline adsorbed thereon can also be used at low pH, e.g. B. at PH = 1.5, with small volumes of aqueous acids, e.g. B. of sulfuric acid or oxalic acid, extracted, a solution is obtained which contains at least 3000 y per ml of tetracycline.
This tetracycline can be isolated by adjusting the acid solution to pH 4-10, preferably to at least pH 6, solid tetracycline precipitating in the form of its base or as the calcium salt. It has an effectiveness of at least 100 y per mg.
Another method is to adjust the acidic solution to pH 9-10, extract it with about a third volume of n-butanol and reduce the butanol extract to about a twentieth of its volume, with tetracycline precipitating in the form of the base or the calcium salt. Its effectiveness is at least 200 y per mg.