Procédé de préparation de stéroïdes 11p-hydroxylés L'invention est relative à un procédé pour convertir un stéroïde non substitué en position 11 en dérivé 11(3-hydroxylé de ce stéroïde à l'aide de cultures choisies de micro-organismes.
La préparation de composés stéroïdes hydroxylés à la position 11 du noyau est très désirable et il est souvent difficile d'en obtenir la synthèse. Certains composés biologiquement actifs, notamment le composé F de Kendall (17a-hydroxy-corticostérone) et le composé E de Kendall (17a-hydroxy-11-déhydro-cortico- stérone) appartiennent à ce groupe de com posés.
Le composé S de Reichstein (17a-hydroxy- 11-désoxy-corticostérone) peut être préparé suivant certaines méthodes connues en partant de matières initiales facilement disponibles, tel les que des stérols de fèves de soja et d'autres substances de ce genre. La conversion dudit composé S de Reichstein en composé F de Ken dall est une application importante du procédé selon l'invention ; elle peut se faire plus aisé ment et d'une manière relativement économi que, comparativement aux méthodes chimi ques.
D'autres méthodes ont été proposées pour convertir ledit composé S en composé F à l'aide de micro-organismes différents de ceux décrits ci-dessous et utilisés pour le procédé faisant l'objet de l'invention. Dans le brevet suisse No 322066, on a décrit, à cet effet, l'uti lisation de certains micro-organismes du genre Curvularia. Dans le brevet USA No 2602769, accordé le 8 juillet 1952, on propose l'usage du Cunninghamella blakesleena, et dans le Journal of the American Chemical Society (Vol. 74, p.
2381, 1952) on cite, à cet effet, l'usage du Streptomyces fradiae.
On a découvert maintenant qu'on peut convertir un stéroïde non substitué en position 11 en dérivé 11(3-hydroxylé de ce stéroïde si l'on met le stéroïde en contact avec des enzy mes oxydantes produites par un micro-orga nisme Pycnosporium, espèce QM <I>703,</I> ou ses mutantes.
Le genre Pycnosporium est de l'or dre des Sphaeropsidales qui appartient à la classe des Fungi Imperfecti. On peut se pro curer l'organisme particulier, qui s'est montré comme étant extrêmement avantageux, auprès du Philadelphia Quartermaster Corps, Dépôt de l'armée américaine, sous le numéro de culture QM <I>703.</I> Il est à noter que l'on peut utiliser non seulement les organismes qui cor respondent exactement à la description du QM <I>703,
</I> mais également les espèces mutantes de ces organismes.
On a découvert, en mettant en contact un composé stéroïde non substitué en position 11 avec des cultures vivantes de Pycnosporium de l'espèce QM <I>703</I> ou avec des extraits appro priés ou des mycèles de cet organisme, que le composé stéroïde est converti en un dérivé 11P-hydroxylé de ce stéroïde. La réaction con vient particulièrement bien à la conversion du composé S ou de ses mono- ou di-esters (par exemple le di-acétate ou le 17- ou 21-mono- acétate) en composé F.
En général, la réaction doit se faire dans des conditions d'aérobiose. Si l'organisme est cultivé dans des solutions nutritives et si le substratum du stéroïde est ajouté au début de la croissance du micro organisme ou après que la croissance a débuté, on obtient une conversion rapide du stéroïde en un dérivé 11 [3-hydroxylé de ce stéroïde.
Une variété de stéroïdes peut être utilisée comme matière initiale pour le procédé selon l'invention. Ces composés peuvent comporter des substituants en diverses positions du noyau tels que des chaînes latérales en position 17 et des groupements céto ou hydroxyle, ou des groupements hydroxyle protégés en position 3. Des doubles liaisons peuvent être présentes dans le noyau, par exemple en position 3 (4) ou 5 (6).
Le rendement en dérivé 11(3-hy- droxylé obtenu par le procédé varie jusqu'à un certain degré avec la nature du stéroïde utilisé, avec les conditions choisies pour la réaction, telles que la température, la durée, le<I>pH,</I> le milieu nutritif et le moment auquel le composé est ajouté au milieu. Toutefois, ces diverses conditions peuvent être réglées et les conditions optima peuvent être déterminées, pour un sté roïde donné, par un minimum d'essais usuels.
La fermentation sous des conditions d'aéro biose à une température d'environ 25-30o pen dant au moins un jour environ après l'addition du stéroïde, et l'usage d'un milieu fournissant des hydrates de carbone, des matières favo risant la croissance, une source d'azote et des sels inorganiques, sont particulièrement favo rables.
Les produits obtenus par le procédé peu vent être analysés aisément, par exemple à l'aide des méthodes utilisant du papier chroma- tographique. Cette analyse permet l'étude de la variation des conditions sur une petite échelle puisque des échantillons très petits des produits peuvent être analysés de la manière en question. Des méthodes de ce genre sont déjà connues et des détails à leur sujet sont indiqués dans le brevet USA No 2602769, dont il est question plus haut, et dans un article de Shull et autres publié dans la revue des Archives of Bioehemistry, Vol. 37; p. 186, 1952.
Diverses matières peuvent faire partie du milieu nutritif utilisé pour la culture de l'espèce Pycnosporium dont on se sert pour le procédé. Les matières nutritives comprennent les hy drates de carbone, tels que le glucose, le sac charose, le maltose et d'autres sucres et ami dons. Des matières industrielles, connues comme contenant des substances nutritives tel les que la farine de soja, la farine d'arachides, les liqueurs de macération de maïs et d'autres substances de ce genre, peuvent également être utilisées avec avantage. Divers sels, y compris des nitrates, des sulfates et des phosphates, ainsi que des composés métalliques, tels que des composés du potassium, du sodium et du magnésium, peuvent être utilisés pour former des constituants supplémentaires du milieu.
En général, on préfère que la fermentation ait lieu à une température d'environ 24 à 30 . La crois sance du micro-organisme se fait généralement en un à trois jours. Comme indiqué plus haut, le stéroïde peut être ajouté quand la fermenta tion débute ou il peut être ajouté après que la croissance a nettement commencé, par exem ple après 16 à 24 heures. Suivant une variante, on peut enlever le mycélium formé pendant la croissance du micro-organisme dans le milieu nutritif, on peut le laver à l'eau, si on le désire, ou le remettre en suspension dans de l'eau con tenant le stéroïde. Une agitation de ce mélange en présence d'air donne lieu à la formation du stéroïde hydroxylé désiré.
Les 11 [3-hydroxy-stéroïdes fôrmés confor mément à l'invention peuvent être isolés par plusieurs méthodes différentes. La méthode la plus avantageuse est l'extraction du mélange de fermentation contenant le produit à l'aide de certains solvants non miscibles à l'eau. Parti- culièrement utiles sont les hydrocarbures infé rieurs halogénés, tels que le chloroforme, le chlorure de méthylène, le chlorure d'éthylène, etc.
D'autres solvants non miscibles à l'eau, tels que des alcools aliphatiques comme le butanol, le pentanol, etc., des cétones telles que la mé- thyl-isobutyl-cétone, et des esters tels que l'acé tate de butyle, peuvent être utilisés à cet effet. Les extraits obtenus de cette manière peuvent être concentrés jusqu'à siccité pour obtenir un produit brut solide. Toutefois, dans de nom breux cas, il peut être désirable de purifier da vantage ce produit, par exemple par recristalli- sation hors d'un solvant approprié, tels que des hydrocarbures halogénés inférieurs, des alcools inférieurs et des esters.
Suivant une variante, le produit peut être soumis à une purification par des méthodes telles que la chromatographie. L'usage des colonnes contenant un gel de silice traité avec un alcool inférieur, tel que l'éthanol (l'usage d'un gramme d'éthanol par gramme de gel de silice convient très bien) est particuliè rement efficace. Le produit peut être amené sur une colonne chromatographique, en solution dans un hydrocarbure aliphatique halogéné in férieur et la colonne peut ensuite être dévelop pée avec des quantités additionnelles du même solvant ou d'un solvant similaire contenant une proportion minime, par exemple de 1 à 5 0/0, d'un alcool aliphatique inférieur (méthanol ou éthanol).
On constate souvent qu'une partie de la matière initiale n'est pas convertie pendant le procédé usuel. Cette partie peut être récu pérée hors de la colonne et peut être utilisée dans d'autres préparations. Le produit peut ensuite être obtenu en le lavant avec un solvant, tel qu'indiqué plus haut, en choisissant des fractions appropriées, par une analyse à l'aide de papier chromatographique. La concentration des solutions du produit procure un produit purifié solide, généralement à l'état cristallisé et avec une grande pureté. Certains sous- produits peuvent être formés par la réaction et ceux-ci peuvent être séparés par la méthode de chromatographie sur colonne.
Ces sous-pro duits contiennent parfois certains autres com posés plus fortement oxydés. En général, des rendements d'au moins 25 % environ ou plus élevés peuvent être obtenus, pour le produit hydroxylé désiré, à l'aide du procédé faisant l'objet de l'invention.
<I>Exemple 1</I> Une culture du micro-organisme de l'es pèce Pycnosporium QM <I>703</I> a été cultivée dans des éprouvettes sur un milieu de culture à base d'agar. L'organisme est séparé, par rinçage, de la souche d'agar dans des conditions stériles et est cultivé dans un milieu stérile ayant la com position suivante extrait de malt . . . . . . . 5 % saccharose . . . . . . . . 1 nitrate de sodium. . . . . . . 0,2 chlorure de potassium . . . . .
0,05 sulfate de magnésium heptahydraté . 0,05 sulfate ferreux heptahydraté . . . 0,05 diphosphate acide de potassium . . 0,1 eau distillée, le<I>pH</I> du mélange est réglé à 7,0 avec du KOH.
Des portions de 100 ml de ce milieu sont versées dans des flacons de 300 ml. Le contenu d'un flacon, après une croissance de 7 jours, est ajouté à deux litres d'un milieu stérile ayant la composition suivante saccharose . . . . . . . . 1% tryptone Difco . . . . . . . 1 nitrate de sodium . . . . . . 0,2 biphosphate acide de potassium . 0,1 sulfate de magnésium heptahydraté. 0,05 chlorure de potassium . . . . 0,05 sulfate ferreux heptahydraté . . .
0,001 le<I>pH</I> de ce mélange est réglé à 7,0 à l'aide d'acide sulfurique.
On ajoute 0,25 % de carbonate de calcium avant que le mélange soit stérilisé.
Au milieu inoculé on ajoute 0,5 g de composé S dissous dans 20 ml d'éthanol à 95 %. Le mélange est ensuite aéré avec un débit d'environ 1 volume d'air par volume de solution et par minute, à environ 28(l, pendant 24 heures. Un agitateur mécanique, fonctionnant à environ 1500 t/min., travaille dans la cuve de fermentation. La fer mentation est poursuivie pendant 24 heures.
L'ensemble du bouillon de fermentation et du mycélium est sorti de la cuve et est extrait trois fois avec un tiers en volume de chlorure de méthylène. Les phases organiques sont mé langées, filtrées et concentrées sous vide jusqu'à avoir un volume de quelques millilitres.
La so lution est amenée sur une colonne contenant du gel de silice préparé en traitant du gel de silice anhydre avec un millilitre d'éthanol à 95 % par gramme de matière solide. La co- lonne de gel de silice, contenant les stéroïdes,
est développée à l'aide d'une solution de trois volumes d'éthanol à 95 % dans 97 volumes de chlorure de méthylène. Des portions de la ma tière, prélevées dans la colonne, sont analysées à des intervalles réguliers par chromatographie sur papier. La première fraction, fournie par la colonne, est un peu du composé S récupéré. Une solution de cette fraction est concentrée jusqu'à ce qu'on obtienne le composé S à l'état solide pour être utilisé à nouveau. Dans les fractions suivantes, on trouve le produit cor respondant au composé F.
Des matières addi tionnelles, qui peuvent être plus fortement oxy dées ou qui sont oxydées à une position diffé rente, sont également formées au cours de la fermentation et sont séparées par purification chromatographique. On obtient un rendement d'environ 27 % en composé F cristallisé, par concentration des produits sélectionnés, fournis par la colonne, et par évaporation jusqu'à sic cité.
Le produit peut être recristallisé dans de l'acétate d'éthyle ou d'autres solvants appro priés et ses propriétés sont identiques aux échantillons normalisés du composé F.
<I>Exemple 2</I> Une culture de l'espèce Pycnosporium QM <I>703</I> est ajoutée à une portion stérile de 100 ml du milieu suivant dans un flacon à 300 ml saccharose . . . . . . . . 1% tryptone Difco . . . . . . . 1 nitrate de sodium . . . . . . 0,2 biphosphate acide de potassium . 0,1 sulfate de magnésium heptahydraté. 0,05 chlorure de potassium . . . . 0,05 sulfate ferreux heptahydraté . . 0,001 Au flacon, on ajoute 50 mg de progesté rone.
Le mélange de fermentation est agité à une température de 280 dans des conditions stériles pendant 7 jours. Le mélange est sorti du flacon et est extrait trois fois avec un demi- volume de dichlorure d'éthylène chauffé à 70(). Les couches de solvant sont mélangées et concentrées sous vide jusqu'à siccité. Les ma tières solides résiduelles sont dissoutes dans un petit volume d'éthanol et un échantillon de cette matière est soumis à la chromatographie sur papier. Cette analyse montre la présence de 11(3-hydroxy-progestérone et celle d'un peu de progestérone n'ayant pas réagi et d'autres pro duits oxydés.
<I>Exemple 3</I> L'expérience décrite dans l'exemple 2 est répétée en utilisant 50 mg de désoxycortico- stérone à la place de la progestérone. Le pro duit obtenu est soumis à la chromatographie sur papier qui montre que la matière initiale a été hydroxylée à la position 11 pour former la corticostérone.
Process for the preparation of 11p-hydroxylated steroids The invention relates to a process for converting an unsubstituted steroid in position 11 into an 11 (3-hydroxylated derivative of this steroid using selected cultures of microorganisms.
The preparation of hydroxylated steroid compounds at the 11-ring position is very desirable and often difficult to synthesize. Certain biologically active compounds, notably Kendall's compound F (17α-hydroxy-corticosterone) and Kendall's compound E (17a-hydroxy-11-dehydro-corticosterone) belong to this group of compounds.
Reichstein's compound S (17α-hydroxy-11-deoxy-corticosterone) can be prepared according to certain known methods starting from readily available starting materials, such as soybean sterols and the like. The conversion of said compound S of Reichstein into compound F of Ken dall is an important application of the process according to the invention; it can be done more easily and in a relatively economical manner, compared to chemical methods.
Other methods have been proposed for converting said compound S into compound F using microorganisms different from those described below and used for the process forming the subject of the invention. In Swiss patent No. 322066, the use of certain microorganisms of the genus Curvularia has been described for this purpose. In US Patent No. 2602769, granted July 8, 1952, the use of Cunninghamella blakesleena is proposed, and in the Journal of the American Chemical Society (Vol. 74, p.
2381, 1952), the use of Streptomyces fradiae is cited for this purpose.
It has now been discovered that an unsubstituted steroid at position 11 can be converted to an 11 (3-hydroxylated derivative of this steroid) if the steroid is contacted with oxidative enzymes produced by a microorganism Pycnosporium, species QM <I> 703, </I> or its mutants.
The genus Pycnosporium is the gold of the Sphaeropsidales which belongs to the class of the Fungi Imperfecti. The particular organization, which has been shown to be extremely beneficial, can be obtained from the Philadelphia Quartermaster Corps, US Army Depot, under crop number QM <I> 703. </I> It is note that we can use not only the organisms which correspond exactly to the description of QM <I> 703,
</I> but also the mutant species of these organisms.
It has been found, by contacting an unsubstituted steroid compound in position 11 with live cultures of Pycnosporium of the species QM <I> 703 </I> or with appropriate extracts or myceles of this organism, that the steroid compound is converted to an 11P-hydroxy derivative of this steroid. The reaction is particularly suited to the conversion of compound S or its mono- or di-esters (for example di-acetate or 17- or 21-mono-acetate) into compound F.
In general, the reaction should take place under aerobic conditions. If the organism is grown in nutrient solutions and the steroid substrate is added at the start of the growth of the microorganism or after growth has started, rapid conversion of the steroid to an 11 [3-hydroxy derivative of this steroid.
A variety of steroids can be used as the starting material for the process according to the invention. These compounds can have substituents in various positions of the ring such as side chains in position 17 and keto or hydroxyl groups, or protected hydroxyl groups in position 3. Double bonds can be present in the ring, for example in position 3. (4) or 5 (6).
The yield of 11 (3-hydroxylated derivative obtained by the process varies to a certain degree with the nature of the steroid used, with the conditions chosen for the reaction, such as temperature, time, pH. The nutrient medium and the time at which the compound is added to the medium, however, these various conditions can be controlled and the optimum conditions can be determined, for a given steroid, by a minimum of usual tests.
Fermentation under aero-biotic conditions at a temperature of about 25-30o for at least about a day after addition of the steroid, and the use of a medium providing carbohydrates, favorable materials. growth, a source of nitrogen and inorganic salts, are particularly favorable.
The products obtained by the process can be easily analyzed, for example by methods using chroma-graph paper. This analysis allows the study of varying conditions on a small scale since very small samples of the products can be analyzed in the manner in question. Methods of this kind are already known and details thereon are given in US Patent No. 2602769, referred to above, and in an article by Shull et al published in the journal Archives of Bioehemistry, Vol. 37; p. 186, 1952.
A variety of materials can be part of the nutrient medium used for the cultivation of the Pycnosporium species used for the process. Nutrients include carbohydrates, such as glucose, charose sac, maltose, and other sugars and gifts. Industrial materials known to contain nutrients such as soy flour, peanut flour, corn maceration liquors and the like can also be used with advantage. Various salts, including nitrates, sulfates and phosphates, as well as metal compounds, such as potassium, sodium and magnesium compounds, can be used to form additional constituents of the medium.
In general, it is preferred that the fermentation take place at a temperature of about 24 to 30. The growth of the microorganism usually takes one to three days. As indicated above, the steroid can be added when fermentation begins or it can be added after growth has clearly started, for example after 16-24 hours. Alternatively, the mycelium formed during the growth of the microorganism can be removed in the nutrient medium, washed with water, if desired, or resuspended in water containing the steroid. . Stirring of this mixture in the presence of air results in the formation of the desired hydroxylated steroid.
The 11 [3-hydroxy-steroids formed according to the invention can be isolated by several different methods. The most advantageous method is the extraction of the fermentation mixture containing the product using certain water-immiscible solvents. Particularly useful are lower halogenated hydrocarbons, such as chloroform, methylene chloride, ethylene chloride, etc.
Other water-immiscible solvents, such as aliphatic alcohols such as butanol, pentanol, etc., ketones such as methyl-isobutyl-ketone, and esters such as butyl acetate , can be used for this purpose. The extracts obtained in this way can be concentrated to dryness to obtain a solid crude product. However, in many cases it may be desirable to further purify this product, for example by recrystallization from a suitable solvent, such as lower halogenated hydrocarbons, lower alcohols and esters.
Alternatively, the product can be subjected to purification by methods such as chromatography. The use of columns containing a silica gel treated with a lower alcohol, such as ethanol (the use of one gram of ethanol per gram of silica gel is very suitable) is particularly effective. The product can be fed onto a chromatographic column, in solution in a lower halogenated aliphatic hydrocarbon and the column can then be developed with additional quantities of the same or a similar solvent containing a minimal proportion, for example from 1 to 5%, of a lower aliphatic alcohol (methanol or ethanol).
It is often found that part of the initial material is not converted during the usual process. This part can be collected from the column and can be used in other preparations. The product can then be obtained by washing it with a solvent, as indicated above, choosing appropriate fractions, by analysis using chromatographic paper. Concentration of the product solutions provides a solid purified product, generally in a crystalline state and in high purity. Some by-products can be formed by the reaction and these can be separated by the method of column chromatography.
These by-products sometimes contain certain other more strongly oxidized compounds. In general, yields of at least about 25% or higher can be obtained for the desired hydroxylated product using the process object of the invention.
<I> Example 1 </I> A culture of the microorganism of the species Pycnosporium QM <I> 703 </I> was grown in test tubes on an agar-based culture medium. The organism is rinsed out from the agar strain under sterile conditions and is cultured in a sterile medium having the following composition extracted from malt. . . . . . . 5% sucrose. . . . . . . . 1 sodium nitrate. . . . . . . 0.2 potassium chloride. . . . .
0.05 magnesium sulfate heptahydrate. 0.05 ferrous sulfate heptahydrate. . . 0.05 potassium acid diphosphate. . 0.1 distilled water, the <I> pH </I> of the mixture is adjusted to 7.0 with KOH.
100 ml portions of this medium are poured into 300 ml flasks. The contents of one vial, after growing for 7 days, are added to two liters of sterile medium having the following composition sucrose. . . . . . . . 1% tryptone Difco. . . . . . . 1 sodium nitrate. . . . . . 0.2 potassium acid biphosphate. 0.1 magnesium sulfate heptahydrate. 0.05 potassium chloride. . . . 0.05 ferrous sulfate heptahydrate. . .
0.001 the <I> pH </I> of this mixture is adjusted to 7.0 using sulfuric acid.
0.25% calcium carbonate is added before the mixture is sterilized.
0.5 g of compound S dissolved in 20 ml of 95% ethanol is added to the inoculated medium. The mixture is then aerated with a flow rate of about 1 volume of air per volume of solution per minute, at about 28 (l, for 24 hours. A mechanical stirrer, operating at about 1500 rpm., Works in the chamber. fermentation tank The fermentation is continued for 24 hours.
All the fermentation broth and mycelium are taken out of the tank and are extracted three times with one third by volume of methylene chloride. The organic phases are mixed, filtered and concentrated under vacuum until they have a volume of a few milliliters.
The solution is taken to a column containing silica gel prepared by treating anhydrous silica gel with one milliliter of 95% ethanol per gram of solid material. The silica gel column, containing the steroids,
is developed using a solution of three volumes of 95% ethanol in 97 volumes of methylene chloride. Portions of the material, taken from the column, are analyzed at regular intervals by paper chromatography. The first fraction, supplied by the column, is some of the recovered compound S. A solution of this fraction is concentrated until the compound S is obtained in the solid state to be used again. In the following fractions, the product corresponding to the compound F.
Additional materials, which may be more strongly oxidized or which are oxidized at a different position, are also formed during fermentation and are separated by chromatographic purification. A yield of approximately 27% of crystallized compound F is obtained by concentration of the selected products, supplied by the column, and by evaporation to dryness.
The product can be recrystallized from ethyl acetate or other suitable solvents and its properties are identical to the standardized samples of compound F.
<I> Example 2 </I> A culture of the species Pycnosporium QM <I> 703 </I> is added to a sterile 100 ml portion of the following medium in a 300 ml sucrose flask. . . . . . . . 1% tryptone Difco. . . . . . . 1 sodium nitrate. . . . . . 0.2 potassium acid biphosphate. 0.1 magnesium sulfate heptahydrate. 0.05 potassium chloride. . . . 0.05 ferrous sulfate heptahydrate. . 0.001 To the vial, 50 mg of progestin rone is added.
The fermentation mixture is stirred at a temperature of 280 under sterile conditions for 7 days. The mixture is taken out of the flask and is extracted three times with half a volume of ethylene dichloride heated to 70 (). The solvent layers are mixed and concentrated under vacuum to dryness. Residual solids are dissolved in a small volume of ethanol and a sample of this material is subjected to paper chromatography. This analysis shows the presence of 11 (3-hydroxy-progesterone and that of some unreacted progesterone and other oxidized products.
<I> Example 3 </I> The experiment described in Example 2 is repeated using 50 mg of deoxycortico-sterone in place of progesterone. The product obtained is subjected to paper chromatography which shows that the starting material has been hydroxylated at position 11 to form corticosterone.