Verfahren zur Herstellung von Polyschwefelsäureestern von Polygalakturonsäuremethylestern. Es ist bekannt, dass durch Sulfatierung von Pektinen, welohe als Methylester von Polygalakturonsäuren mit verschiedenem Ver- esterungsgrad auf'gefasst werden,
saure Poly- schwefelsäureester mit heparinähnlichen bio logischen Eigenschaften gewonnen werden können. Die Herstellung dieser Polyschwefel säureester erfolgte bisher ausschliesslich durch Behandlung von Pektin oder von Abbaupro dukten des Pektins mit Chlorsulfonsäure in Pyridin, wobei Reaktionstemperaturen um l00 zur Anwendung kamen. Es wurden dabei Verbindungen erhalten, welche die Blutgerin nung in vitra und in vivo hemmen, jedoch eine erhebliche Toxizität besitzen.
Insbeson dere steht ihre Schockwirkung einer klini schen Anwendung als Antikoagulantia, und Antithrombotica iin Wege. Nur durch Anwen dung umständlicher Reinigungs- und Frak- tionierimgamethoden konnten Produkte ge wonnen werden, die in beschränktem Ausmass eine thera,peiitische Verwendung fanden.
Es musste dabei eine besondere Mühe und Sorg falt auf die vollständige Abtrennung des äusserst giftigen. Pyridins verwendet werden, welches durch den hochmolekularen sauren Polyschwefelsäureester nicht nur unter Salz- Bildung, sondern auch adsorptiv gebunden wird.
Ausserdem tritt bei der Sulfatierung mit Chlorsulfonsäure in Pyridin eine teilweise Umwandlung der C.arbomethoxygruppen der Polygalakturonsäuremethylester in freie Carb- oxylgruppen ein, welche sich auf die Ver träglichkeit der derart gewonnenen Polyschwe- felsäureester bzw. ihrer ixn Organismus ent stehenden Abbauprodukte. ungünstig auswirkt.
Gegenstand vorliegenden Patentes ist ein Verfahren zur Herstellung von Polyschwefel- säureestern von Polygalaktüronsäuremethyl- estern. (Pektin. und Abbauprodukte desselben.) durch Sulfatieriing von Pölygalaktüronsäure- xriethylestern mittels Chlorsulfonsäure, wel ches dadurch gekennzeichnet ist, dass man die Sulfatierung bei niedriger -Temperatur in Formamid,
vorzugsweise mit einem vorher be= reiteten Gemisch von Chlorsulfonsäure und Formamid, durchführt. Auf diese Weise er hält man von schädlichen Verunreinig Lingen weitgehend freie Sulfatierungsprodukte mit einem hohen Gehalt an Methoxylgrnppen. Beim Eintragen von Pektin oder einem Ab- Bauprodukt von Pektin in ein Gemisch von Chlorsulfonsäure und
Formamid von geeig neter Zusammensetzung tritt bei Zimuertem- peratur in wenigen Stunden eine weitgehende Veresternng ein, wobei direkt ein Produkt mit einem Schwefelgehalt von 12 1/a -Lind mehr entsteht.
Das zur Sulfatierung einer gegebenen Pektinmenge verwendete Quantum an. Chlor- sulfonsäur.e sowie das IVIisehungsverhältnis von Chlorsulfonsäure zu Formamid sind für die Reaktionsgeschwindigkeit,
für - die Aus beute an wirksamer Substanz und .für die Toxizität derselben von Bedeutung. Zur Sul- fatierung von 1 g Pektin oder Pektinabbau produkten können. Gemische von 1-3 em3 Chlorsulfonsäure mit 10-20 em3 Formamid verwendet werden.
Bei einer Reaktionstempe= ratur von Z0-25 erwiesen sich pro g Pektin bzw. Pektinabbauprodukt Mischungen von 1,9-2,5 em3 Chlorsulfonsäure und 12-16 em3 Formamid als optimal.
Die Isolierung des Reaktionsproduktes kann in einfacher Weise, z. B. durch Ein giessen des Reaktionsgemisches in Alkohol und Abfiltrieren des Niederschlags vorgenommen. werden. Man erreicht dabei bereits eine sehr weitgehende Abtrennung der übrigen Bestand teile des Reaktionsgemisches. Weitere Bemü hungen zum Zwecke der Entfernung von adsorptiv gebundenen Begleitstoffen erübri gen sieh, weil diese in den in Frage kommen den geringen Mengeh für die Toxizität des Reaktionsproduktes bedeutungslos sind.
Durch Umsetzung mit Natriumearbonat oder Na- triumbicarbonat können die Natriumsalze der sauren Polygalakturonsäuremethylester-poly- schwefelsäureester in einfacher Weise gewon nen werden. Der Methoxylgehalt der,Reak- tionsprodukte entspricht demjenigen der Aus- gangsstoffe.
Die Verwendung von Abbauprodukten des Pektins 'als Ausgangsstoffe ist unter anderem deshalb von Interesse, weil die daraus erhält lichen sauren Polyschwefelsäureester im Ge gensatz zu den aus Pektin hergestellten auch in .höherer Konzentration nichtviskose Wässe- rige Lösungen ergeben, weshalb diese sauren Polyschwefelsäureester in viel konzentrierte rer Lösung injizierbar sind.
Die Vorteile des neuen schonenden Sulfatierimgsverfahrens können bei seiner Anwendung auf Abbaupro dukte des Pektins naturgemäss nur dann voll zur Geltung kommen, wenn .bei der Gewin nung dieser Abbauprodukte nicht bereits eine beträchtliche Senkung des Gehaltes an Methoxylgmuppen, d. h.
Spaltung von Carbo- methoxygruppen, eingetreten ist, der Abbau des Pektins muss .also durch geeignete Ver- suchsbedingungen so gelenkt werden, dass eine Herabsetzung der Kettenlänge des Pektin moleküls -unter völliger Erhaltung der Carbo- methoxygruppen erfolgt.
Bei der Einwirkung käuflicher Pektinlasepräparate auf Pektin. er folgt im allgemeinen sowohl Aufspaltung der Polysaceharidkette als auch rasche Versei- Jung der Carbomethoxygruppen, so dass als Endprodukt die uriveresterte Galakturonsäure entsteht. Dies ist vermutlich darauf zurück zuführen, dass die Pektinasen stets mit.
Pektasen, d. h. mit die Carbomethoxygrnippen spaltenden Fermenten verunreinigt sind und nur sehr schwer von diesen abgetrennt werden können.
Die Aufspaltung der Pektinkette erfolgt. unter völliger Schonung der Carbomethoxy- gruppen, wenn man das Enzympräparat wäh rend einer relativ kurzen Zeitspanne in niedri ger Konzentration bei einem pH-Wert von 1,5 bis 3,0 auf das Pektin einwirken lässt. Unter diesen Bedingungen zeigt die Pektinase hohe Aktivität, während die Pektase praktisch in aktiv ist.
Durch Fällung aus dem Reaktions- gemisch mittels Alkohol können Abbaupro dukte gewonnen werden, die sieh als Aus gangsmaterialien zur Herstellung saurer Poly- schwefelsäureester von hoher gesinnungshem mender Wirkung und niedriger Toxizität eig_ nen. Die wässerigen Lösungen dieser Poly schwefelsäureester besitzen eine niedrige Vis kosität, so dass sie in Konzentrationen von 10 0/ <B>0</B> und mehr noch sehr dünnflüssig und gut injizierbar sind.
Eine Aufspaltung :der Pektinkette -unter ähnlichen Versuchsbedingungen kann auch nach der Sulfatierung der hoehmolekulareri PolygalakturonsäuTemethylestervorgenommen werden. Es bilden sich :auch so weniger hoch molekulare Polysehwefelsäureester mit starker blutgerinnungshemmender Wirksamkeit und geringer Toxizität, deren wässerige Lösungen zugleich eine niedrige Viskosität besitzen.
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung. Teile bedeuten darin Gewichts teile; diese verhalten sich zu Volumteilen wie g zu em3. Die Temperaturen sind in Centi- graden angegeben.
<I>Beispiel 1:</I> 50 Teile Citruspektin mit einem Methoxyl- gehalt von 6,79 /a werden mit 1 Teil Pectinol 100 D (Handelspektinase, Rohm & Haas, Phi ladelphia) gut gemischt, darauf mit 500 Vol, Teilen 0,4n-Essigsäure bei Zimmertemperatur (23 ) angerührt und während einer Stunde geschüttelt.
Hierauf erhitzt man zur Zerstö rung der Pektinase. ,Sobald die Temperatur von 60 erreicht ist, wird durch Zugabe von 10 Teilen Natriumacetat und 480 Volumteilen n-Natronlauge auf einen pH-Wert von 6 ein gestellt, auf 80 bis 90 weiter erhitzt und nach Zusatz von 5 g Aktivkohle durch Kieselgur filtriert. Zum Filtrat gibt man das doppelte Volumen Methanol und filtriert den Nieder schlag ab, Nach dem Waschen mit Methanol und Äther wird im Vakuum getrocknet, wo bei man 31 Teile eines nahezu farblosen Pul vers erhält.
5 Teile dieses Pektinabbauproduktes wer den in 25 Volumteilen Formamid gelöst imd bei 10 in ein Gemisch von 45 Vohunteilen Formamid und 11 Volumteilen Chlorsulfon- säure eingetragen. Unter gutem Rühren hält man während 6 Stunden die Temperatur auf 20 und giesst dann das Gemisch in 400 Volum- teile Methanol.
Der sich bildende farblose Niederschlag wird abfiltriert, zuerst mit Me thanol, dann mit Äther gewaschen und an schliessend in 140 Teilen 0,5n-Natriumbicarbo- natlösung gelöst. Nun wird im Vakuum bei 14 mm Hg eingedampft, bis an Hand der Nesslerreaktion festgestellt werden kann, dass alles Ammoniak ausgetrieben ist.
Dann neu- tralisiert man durch Zusatz von 23 Teilen 2n-Essigsäure und erhitzt nach Zugabe von 6 Teilen Kieselgur kurze Zeit auf dem Was serbad. Nach dem Filtrieren kann der saure Polysehwefelsäureester durch Mischen des Filtrates mit dem 5fachen Volumen Methanol als Natriumsalz ausgefällt werden. Die Fäl- lung wird abfiltriert; zuerst mit " Methanol, ,dann mit Äther gewaschen und im Vakuum getrocknet.
Man erhält dabei 6 Teile einer in Wasser sehr leicht löslichen, farblosen Sub- stanz mit einem Methoxylgehalt von 3,96% und einem Schwefelgehalt von 12,5 %-.
<I>Beispiel 2:</I> 5 Teile Citruspektin werden in 20 Volum- teilen Formamid gelöst bzw. suspendiert und bei 15 rasch in ein Gemisch von 10,5 Volum teilen Chlorsulfonsäure und 50 Volumteilen Formamid eingetragen. Hierauf wird das Ge misch während 5 Stunden bei 22 .gerührt.
Dann giesst man es in 500 Volumteile Methanol und filtriert den entstandenen Niederschlag ab, wäscht ihn mit Methanol und Äther und löst ihn darauf in 170 Volumteilen 0,4n Natriumbicarbonatlösung:
Unter Zugabe von wenigen Tropfen Oktylalkohol wird nun das Ammoniak durch Vakuumdestillation voll ständig entfernt. Dann stellt man die Lösung mittels Essigsäure auf pH 6 ein, erhitzt nach Zugabe von 6 Teilen Kiesel.gur zum ,Sied-n und filtriert heiss. Durch Eingiessen des Fil trates in das 5fache Volumen Methanol fällt man den Polyschwefelsäureester des Pektins aus, filtriert ihn ab, wäscht ihn zunächst mit Alkohol, dann mit Äther und trocknet im Vakuum.
Process for the preparation of polysulfuric acid esters of polygalacturonic acid methyl esters. It is known that sulphation of pectins, which are understood as methyl esters of polygalacturonic acids with different degrees of esterification,
acid polysulfuric acid esters with heparin-like biological properties can be obtained. The production of these polysulfuric acid esters has hitherto been carried out exclusively by treating pectin or degradation products of pectin with chlorosulfonic acid in pyridine, reaction temperatures around 100 being used. Compounds were obtained which inhibit blood clotting in vitra and in vivo, but have considerable toxicity.
In particular, their shock effect stands in the way of clinical use as anticoagulants and antithrombotics. Only through the use of cumbersome cleaning and fractionation methods could products be obtained that were of limited use in therapy.
Special effort and care had to be taken to ensure that the extremely toxic material was completely separated. Pyridins can be used, which is bound by the high molecular weight acid polysulfuric acid ester not only with salt formation, but also adsorptively.
In addition, the sulfation with chlorosulfonic acid in pyridine results in a partial conversion of the carbomethoxy groups of the polygalacturonic acid methyl ester into free carboxyl groups, which affects the compatibility of the polysulfuric acid esters obtained in this way or their degradation products. has an unfavorable effect.
The subject of the present patent is a process for the production of polysulfuric acid esters of polygalacturonic acid methyl esters. (Pectin. And degradation products of the same.) By sulfating polygalacturonic acid xriethyl esters using chlorosulfonic acid, which is characterized in that sulfation is carried out at a low temperature in formamide,
preferably with a previously prepared mixture of chlorosulfonic acid and formamide. In this way, sulfation products with a high content of methoxyl groups are largely free from harmful contaminants. When adding pectin or a breakdown product of pectin to a mixture of chlorosulfonic acid and
Formamide of a suitable composition, at room temperature, undergoes extensive esterification within a few hours, resulting in a product with a sulfur content of 12 1 / a more.
The amount used to sulphate a given amount of pectin. Chlorosulphonic acids and the ratio of chlorosulphonic acid to formamide are important for the reaction rate,
for - the yield of active substance and .for the toxicity of the same of importance. To sulphate 1 g of pectin or pectin degradation products. Mixtures of 1-3 cubic meters of chlorosulfonic acid with 10-20 cubic meters of formamide can be used.
At a reaction temperature of Z0-25, mixtures of 1.9-2.5 cubic meters of chlorosulfonic acid and 12-16 cubic meters of formamide per g of pectin or pectin degradation product were found to be optimal.
The isolation of the reaction product can be carried out in a simple manner, for. B. made by pouring the reaction mixture into alcohol and filtering off the precipitate. will. A very extensive separation of the remaining constituent parts of the reaction mixture is achieved. Further efforts for the purpose of removing adsorptively bound accompanying substances see, because these are insignificant for the toxicity of the reaction product in the small amount in question.
By reacting with sodium carbonate or sodium bicarbonate, the sodium salts of the acid methyl polygalacturonate polysulfuric acid esters can be obtained in a simple manner. The methoxyl content of the reaction products corresponds to that of the starting materials.
The use of pectin degradation products as starting materials is of interest, among other things, because the acidic polysulphuric acid esters obtained from them, in contrast to those made from pectin, also result in non-viscous aqueous solutions in higher concentrations, which is why these acidic polysulphuric acid esters are much concentrated rer solution are injectable.
The advantages of the new gentle sulfation process can naturally only come into their own when it is applied to degradation products of pectin, if the extraction of these degradation products does not already result in a considerable reduction in the methoxyl group content, i.e. H.
Splitting of carbomethoxy groups has occurred, the degradation of the pectin must be controlled by suitable test conditions in such a way that the chain length of the pectin molecule is reduced while the carbomethoxy groups are completely preserved.
In the event of the action of commercially available pectin laser preparations on pectin. it generally follows both splitting of the polysacharide chain and rapid versification of the carbomethoxy groups, so that the urine-esterified galacturonic acid is formed as the end product. This is probably due to the fact that the pectinases are always with.
Pectases, d. H. are contaminated with the ferments which break down carbomethoxy groups and are very difficult to separate from them.
The pectin chain is split up. with complete sparing of the carbomethoxy groups, if the enzyme preparation is allowed to act on the pectin for a relatively short period of time in a low concentration at a pH value of 1.5 to 3.0. Under these conditions the pectinase shows high activity, while the pectase is practically inactive.
By precipitation from the reaction mixture by means of alcohol, degradation products can be obtained, which are suitable as starting materials for the production of acidic polysulfuric acid esters with a high anticoagulant effect and low toxicity. The aqueous solutions of these poly sulfuric acid esters have a low viscosity, so that they are very thin and easy to inject in concentrations of 10 0 / <B> 0 </B> and more.
A split: the pectin chain - under similar test conditions, can also be carried out after sulfation of the high molecular weight polygalacturonic acid methyl esters. The result is: even less high-molecular polysulfuric acid esters with strong anti-coagulant effectiveness and low toxicity, the aqueous solutions of which also have a low viscosity.
The following examples illustrate the invention. Parts mean parts by weight; these are related to parts of volume like g to em3. The temperatures are given in centigrade.
<I> Example 1: </I> 50 parts of citrus pectin with a methoxyl content of 6.79 / a are mixed well with 1 part of Pectinol 100 D (commercial spectinase, Rohm & Haas, Philadelphia), then with 500 parts by volume 0.4N acetic acid at room temperature (23) and shaken for one hour.
This is then heated to destroy the pectinase. As soon as the temperature of 60 is reached, 10 parts of sodium acetate and 480 parts by volume of n-sodium hydroxide are added to a pH of 6, the mixture is heated to 80 to 90 and, after addition of 5 g of activated carbon, filtered through kieselguhr. Twice the volume of methanol is added to the filtrate and the precipitate is filtered off. After washing with methanol and ether, drying is carried out in vacuo, where 31 parts of an almost colorless powder are obtained.
5 parts of this pectin degradation product are dissolved in 25 parts by volume of formamide and added at 10 to a mixture of 45 parts by volume of formamide and 11 parts by volume of chlorosulfonic acid. The temperature is maintained at 20 for 6 hours with thorough stirring and the mixture is then poured into 400 parts by volume of methanol.
The colorless precipitate that forms is filtered off, washed first with methanol, then with ether and then dissolved in 140 parts of 0.5N sodium bicarbonate solution. It is then evaporated in vacuo at 14 mm Hg until it can be determined from the Nessler reaction that all the ammonia has been expelled.
It is then neutralized by adding 23 parts of 2N acetic acid and, after adding 6 parts of diatomaceous earth, heated for a short time on the water bath. After filtration, the acidic polysulfuric acid ester can be precipitated as the sodium salt by mixing the filtrate with 5 times the volume of methanol. The precipitate is filtered off; washed first with "methanol," then with ether and dried in vacuo.
This gives 6 parts of a colorless substance which is very easily soluble in water and has a methoxyl content of 3.96% and a sulfur content of 12.5%.
<I> Example 2: </I> 5 parts of citrus pectin are dissolved or suspended in 20 parts by volume of formamide and rapidly added at 15 to a mixture of 10.5 parts by volume of chlorosulfonic acid and 50 parts by volume of formamide. The mixture is then stirred at 22 for 5 hours.
It is then poured into 500 parts by volume of methanol and the precipitate formed is filtered off, washed with methanol and ether and then dissolved in 170 parts by volume of 0.4N sodium bicarbonate solution:
With the addition of a few drops of octyl alcohol, the ammonia is now completely removed by vacuum distillation. The solution is then adjusted to pH 6 using acetic acid, heated to boiling point after adding 6 parts of kiesel.gur and filtered hot. The polysulfuric acid ester of pectin is precipitated by pouring the filtrate into 5 times the volume of methanol, filtered off, washed first with alcohol, then with ether and dried in vacuo.