Verfahren zur Herstellung eines blutgerinnungshemmenden Mittels.
Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung eines blutgerinnungshemmenden Mittels durch ein Verfahren, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man Chondroitin- schwefelsäure hydrolytisch auf eine Viskositätszahl (Zy) unter 0,25 (Konzentration in gllO0 cm" und Viskositätszahl gemessen in 0, in NaGl-Lösung) abbaut und die erhaltene Verbindung durch Sulfierung in einen Polyschwefelsäureester überführt.
Nach dem neuen Verfahren wird zunächst Chondroitinschwefelsäures beispielsweise aus Knorpel nach der Vorschrift von K. H. Meyer et al. (Helvetica ChimicaActa, Band 31 [1948], Seite 1402) hergestellt, vorzugsweise mit verdünnten Mineralsäuren, zum Beispiel Salzsaure, hydrolytisch abgebaut. Bei diesem Abbau wird vor allem der Polymerisationsgrad verringert, indem die Glukosidbindungen der Monosaccharid-Einheiten gespalten werden; es tritt dabei jedoch auch eine teilweise Desacetylierung und Desulfierung ein, so dass das hydrolytisch abgebaute Produkt nicht mehr als Chondroitinschwefelsäure angesprochen werden kann. Um einen gezielten, reproduzierbaren Abbaugrad zu erhalten, müssen die Abbaureaktionsbedingungen so gewählt werden, dass das Fortschreiten des Abbaues viskosimetrisch verfolgt werden kann.
Dies geschieht beispielsweise dadurch, dass man eine 5% ige wässerige Lösung von Chondroitinschwefelsäure in einem Rührkolben im Thermostaten auf 65" C erhitzt, mit dem zweihunderteten Raumteil konzentrier- ter Salzsäure versetzt und den Abbaugrad laufend durch Viskositätsproben verfolgt.
Nach Erreichen einer relativen Viskosität der Abbaulösung Wrel etwa 2,6 und weniger (je nach dem gewünschten Abbaugrad), wird die Hydrolyse durch Neutralisieren der Reaktionslösung mit Alkali unterbrochen. Die neutralisierte Reaktionslösung kann hierauf durch Dialyse oder eine andere gleich wirkende Operation entsalzt, unter vermindertem Druck auf ein geringes Volumen eingedampft und mit einem Fällungsmittel, wie zum Beispiel Alkohol oder Aceton, ausgefällt und getrocknet werden. Dieses Abbauprodukt besitzt eine Viskositätszahl (Z) zwischen 0,25 und 0,10, wenn die Abbaulösung ein oder zwischen 2,6 und 2,0 hatte.
(Dabei ist die Konzentration in g/100 cm3 angegeben und die Viskositätszahl in einer Lösung von 0,5n NaCl bei 25 C gemessen.)
Die Sulfierung kann nach einer an sich bekannten Methode durchgeführt werden, zum Beispiel in der Weise, dass man das abgebaute Produkt in ein etwa 70" 0 warmes Gemisch von Chlorsulfonsäure und Pyridin unter Rühren einträgt. Dabei ist es von Vorteil, mit der Reaktionstemperatur nicht wesentlich über 80 C zu gehen, da dadurch der Polymerisationsgrad des Endproduktes und damit seine Viskositätszahl beeinflusst werden kann.
Die Sulfierung kann auch mittels SO3, Oleum, usw. und andern organischen Basen als Pyridin, wie beispielsweise Chinolin, a-Picolin usw., durchgeführt werden,
Die Isolierung des sulfierten Produktes geschieht mit Vorteil in der Weise, dass man die abgekühlte Reaktionsmischung mit Eis versetzt und die erhaltene wässerige Lösung mit Alkohol fällt; sodann wird das ausgefällte Pyridinsalz in Wasser gelöst, mit Alkali, zum Beispiel Natronlauge, in das Alkalisalz übergeführt und erneut mit Alkohol gefällt.
Zwecks Reinigung kann das rohe Natriumsalz in ein schwerlösliches Alkaloidsalz, zum Beispiel in das Narcotinsalz, übergeführt werden, indem man die wässerige Lösung des Natriumsalzes mit Narcotinhydrochloridlösung versetzt und das ausgefällte Narcotinsalz durch Filtration isoliert; nach Auswaschen des Niederschlages wird das Nar cotinsalz mittels Soda in das Natriumsalz zurückgeführt und durch Umfällen gereinigt.
Der so erhaltene Polyschwefelsäureester ist ein farbloses bis leicht gefärbtes Pulver, welches sehr gut wasserlöslich ist. Er besitzt eine ausgezeichnete gerinnungshemmende Aktivität in vitro und in vivo, und seine Toxizität ist überraschenderweise nur von der Grössenordnung derjenigen des Heparins. Für Injektionszwecke verwendet man vorzugsweise Lösungen der Alkalisalze der neuen Verbindung.
Beispiel:
100 Gewichtsteile Chondroitinschwefelsäure werden mit Wasser ad 2000 Raumteilen gelöst und im Thermostaten auf 650 C erhitzt.
Dann wird mit 40 Raumteilen konzentrierter Salzsäure versetzt und bei 650 C gerührt. Sobald die relative Viskosität einen Wert von 2,3 erreicht hat, wird die Wärmequelle entfernt und der Abbau durch Neutralisation der Lösung mit Natronlauge unterbrochen.
Sodann wird die Lösung durch 24stündiges Dialysieren gegen laufendes Brunnenwasser entsalzt. Nach Einengen unter vermindertem Druck auf ein Volumen von etwa 400 Raumteilen wird das abgebaute Polysaccharid mit Methanol gefällt und getrocknet. Die Viskositätszahl dieses isolierten Produktes (Zy) beträgt 0,20 (Konzentration in g/100 cm3 und Viskositätszahl gemessen in 0,5n NaCl-Lösung). Dieses Produkt wird sodann in eine Mischung von 665 Raumteilen Pyridin und
160 Raumteilen Chlorsulfonsäure, welche auf 70" C aufgewärmt worden ist, unter Rühren eingetragen. Nun wird die Temperatur der Reaktionsmischung auf 80"C erhöht und 5/4 Stunden bei SO"C und nachher noch 2 Stunden ohne Erwärmen weitergerührt.
Dann wird die Reaktionsmischung mit 350 Gewichtsteilen Eis versetzt, die viskose Lösung durch Cellulose filtriert und mit etwa 8000 Raumteilen Methanol unter Rühren gefällt. Das etwas bräunlich gefärbte Pyridinsalz wird sodann in etwa 500 Raumteilen Wasser aufgenommen, mit Natronlauge auf p, 8-9 eingestellt und das entstandene Na triumsalz durch Eintragen in Methanol erneut gefällt. Die wässerige Lösung des Natriumsalzes wird anschliessend am Rührwerk mit etwa 2500 Raumteilen l0ok,iger Narcotinhydrochloridlösung versetzt abgesaugt, gewaschen und mit etwa 500 Raumteilen Wasser aufgeschlämmt.
Diese Aufschlämmung wird zwecks Überführung ins Natriumsalz mit 10% der Sodalösung etwa 2 Stunden ausgerührt und vom ausgefallenen Nareotin abgesaugt. Das Filtrat wird mit Eisessig neutralisiert, unter vermindertem Druck eingeengt und mit Methanol versetzt. Das dabei ausfallende Produkt zeigt einen Schwefelgehalt von etwa 14%; Zrj = 0,075 (Konzentration in g/100 cm3 und Viskositätszahl gemessen in 0, 5n NaCl-Lösung).
Process for the preparation of an anti-coagulant.
The present invention relates to the production of an anti-coagulant agent by a method which is characterized in that chondroitin sulfuric acid is hydrolytically reduced to a viscosity number (Zy) below 0.25 (concentration in g100 cm "and viscosity number measured in 0, in NaGl solution ) and the compound obtained is converted into a polysulfuric acid ester by sulphonation.
According to the new process, chondroitin sulfuric acid is first extracted from cartilage, for example, according to the instructions of K. H. Meyer et al. (Helvetica ChimicaActa, Volume 31 [1948], page 1402), preferably hydrolytically degraded with dilute mineral acids, for example hydrochloric acid. During this degradation, the degree of polymerisation is reduced, in particular, in that the glucoside bonds of the monosaccharide units are cleaved; however, partial deacetylation and desulfurization also occur, so that the hydrolytically degraded product can no longer be addressed as chondroitin sulfuric acid. In order to obtain a targeted, reproducible degree of degradation, the degradation reaction conditions must be chosen so that the progress of the degradation can be followed viscometrically.
This is done, for example, by heating a 5% aqueous solution of chondroitin sulfuric acid in a stirred flask in the thermostat to 65 ° C., adding two hundredths of concentrated hydrochloric acid and continuously monitoring the degree of degradation by means of viscosity tests.
After a relative viscosity of the degradation solution Wrel of about 2.6 and less (depending on the desired degree of degradation) has been reached, the hydrolysis is interrupted by neutralizing the reaction solution with alkali. The neutralized reaction solution can then be desalted by dialysis or another similar operation, evaporated to a small volume under reduced pressure and precipitated with a precipitant, such as alcohol or acetone, and dried. This degradation product has a viscosity number (Z) between 0.25 and 0.10 when the degradation solution was one or between 2.6 and 2.0.
(The concentration is given in g / 100 cm3 and the viscosity number is measured in a solution of 0.5N NaCl at 25 C.)
The sulfation can be carried out by a method known per se, for example in such a way that the degraded product is introduced into a mixture of chlorosulfonic acid and pyridine at about 70 "0 with stirring to go above 80 C, as this can influence the degree of polymerisation of the end product and thus its viscosity number.
The sulfation can also be carried out using SO3, oleum, etc. and other organic bases than pyridine, such as quinoline, a-picoline, etc.,
The sulfated product is advantageously isolated by adding ice to the cooled reaction mixture and precipitating the resulting aqueous solution with alcohol; The precipitated pyridine salt is then dissolved in water, converted into the alkali salt with an alkali, for example sodium hydroxide solution, and precipitated again with alcohol.
For purification, the crude sodium salt can be converted into a sparingly soluble alkaloid salt, for example the narcotine salt, by adding narcotine hydrochloride solution to the aqueous solution of the sodium salt and isolating the precipitated narcotine salt by filtration; After washing out the precipitate, the narcotine salt is returned to the sodium salt using soda and purified by reprecipitation.
The polysulfuric acid ester obtained in this way is a colorless to slightly colored powder which is very soluble in water. It has excellent anticoagulant activity in vitro and in vivo, and its toxicity is surprisingly only of the order of magnitude of that of heparin. Solutions of the alkali metal salts of the new compound are preferably used for injection purposes.
Example:
100 parts by weight of chondroitin sulfuric acid are dissolved with water ad 2000 parts by volume and heated to 650 ° C. in the thermostat.
Then 40 parts by volume of concentrated hydrochloric acid are added and the mixture is stirred at 650.degree. As soon as the relative viscosity has reached a value of 2.3, the heat source is removed and the degradation is interrupted by neutralizing the solution with sodium hydroxide solution.
The solution is then desalinated by dialysis against running well water for 24 hours. After concentration under reduced pressure to a volume of about 400 parts by volume, the degraded polysaccharide is precipitated with methanol and dried. The viscosity number of this isolated product (Zy) is 0.20 (concentration in g / 100 cm3 and viscosity number measured in 0.5N NaCl solution). This product is then in a mixture of 665 parts by volume of pyridine and
160 parts by volume of chlorosulphonic acid, which has been heated to 70 "C, is added with stirring. The temperature of the reaction mixture is now increased to 80" C and stirred for 5/4 hours at 50 "C and then for a further 2 hours without heating.
Then the reaction mixture is mixed with 350 parts by weight of ice, the viscous solution is filtered through cellulose and precipitated with about 8000 parts by volume of methanol with stirring. The slightly brownish colored pyridine salt is then taken up in about 500 parts by volume of water, adjusted to p, 8-9 with sodium hydroxide solution and the resulting sodium salt is precipitated again by adding it to methanol. The aqueous solution of the sodium salt is then suctioned off, washed and slurried with about 500 parts by volume of water, mixed with about 2500 parts by volume of 10% narcotine hydrochloride solution.
For the purpose of converting this slurry into the sodium salt, it is stirred with 10% of the soda solution for about 2 hours and the precipitated narotine is suctioned off. The filtrate is neutralized with glacial acetic acid, concentrated under reduced pressure and mixed with methanol. The product which precipitates out has a sulfur content of about 14%; Zrj = 0.075 (concentration in g / 100 cm3 and viscosity number measured in 0.5N NaCl solution).