CA2449273A1 - Sur-expression d'une lipoxygenase dans les plantes et diminution de la sensibilite des plantes aux maladies et aux agressions par des organismes pathogenes - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne des procédés pour diminuer la sensibilité des plantes aux maladies et aux agressions par des organismes pathogènes. Les procédés selon l'invention consistent à sur-exprimer une lipoxygénase inductible dans les plantes afin d'améliorer leur réponse aux maladies et aux pathogènes. L'invention a également pour objet des cassettes d'expression pour la sur-expression des lipoxygénases dans les plantes ainsi que des plantes transformées.

Description

2 PCT/FR02/01943 Sur-expression d'une lipoxygénase dans les plantes et diminution de la sensibilité des plantes aux maladies et aux agressions par des organismes pathogènes La présente invention concerne des procédés pour diminuer la sensibilité des plantes aux maladies et aux attaques par des organismes pathogènes. Les procédés selon l'invention consistent à sur-exprimer une lipoxygénase dans les plantes pour diminuer leur sensibilité
aux maladies et aux agressions. L'invention a également pour objet des cassettes d'expression, des vecteurs et des plantes transformées mis en oeuvre dans les procédés selon (invention.
Les lipoxygénases (LOXs) sont des enzymes ubiquitaires chez les plantes supérieures et les mammifères. Elles catalysent la dioxygénation d'acides gras polyinsaturés contenant un motif (Z,Z)-1,4-pentadiène. Chez les végétaux, les substrats de l'enzyme sont l'acide linoléique (C18:2) et linolénique (C18:3), deux constituants majeurs des membranes cellulaires. Ces acides gras polyinsaturés sont généralement complexés sous forme de phosphoglycérolipides membranaires et ne sont accessibles aux LOXs qu'après action d'une phospholipase de type A2 ou d'acyl hydrolases lipolytiques. Des travaux récents suggèrent cependant que certaines LOXs pourraient, dans certaines circonstances, oxyder des acides gras estérifiés et des lipides membrana.ires (1-4). L'acide arachidonique, qui n'est pas détectable chez les végétaux, mais fait partie des constituants membranaires chez les Oomycètes, est également un substrat pour les LOXs végétales (5).
Les LOXs sont classées selon la position du carbone sur lequel est insëré
préférentiellement l'oxygène moléculaire. Chez les végétaux, on distingue des 13-LOXs et des 9-LOXs; une méme enzyme peut cependant utiliser l'une ou l'autre position, indifféremment ou bien avec une préférence pour une position. Cette spécificité peut être modifiée en fonction des conditions de pH et de concentration en Oa du milieu (4). La spécificité de position d'une LOX n'est pas directement prévisible d'après sa séquence primaire, même si certains éléments structuraux reliés à cette propriété sont maintenant connus (6, 7).
Les produits formés dans la réaction sont des hydroperoxydes d'acides gras, très réactifs et susceptibles de causer, via des réactions radicalaires, la dégradation des constituants majeurs de la cellule (lipides, protéines, acides nucléiques) (8). Les hydroperoxydes d'acides gras sont rapidement convertis en une série de composés possédant des activités biologiques diverses. Tous les produits dérivés d'acides gras polyinsaturés via une oxygénation sont collectivement nommés oxylipines.

Les LOXs de plantes ont été associées à des processus physiologiques variés, sur la base de profils d'expression des gènes et d'activité enzymatique. Ainsi, il a été proposé que des LOXs soient impliquées dans la régulation de la maturation des graines, de la germination, de la maturation des fruits, de la sénescence des feuilles et des fleurs. La participation précise des LOXs à ces processus reste cependant à déterminer.
Un rôle important est également attribué aux LOXs dans les réponses aux stress, en particulier la blessure, et les attaques parasitaires (4, 5, 9). Une forte induction de l'expression de gènes LOX est ainsi mesurée dans de nombreuses plantes monocotylédones ou dicotylédones lors de leur interaction avec des bactéries, des virus ou des champignons, ainsi qu'après blessure mécanique ou causée par des insectes sur les feuilles.
Cette diversité dans les fonctions biologiques pourrait être assurée du fait de la présence de différentes isoenzymes, présentant des mécanismes de régulation ainsi que des localisations tissulaires et subcellulaires très variés, selon les espèces et les isoformes considérées (5). A cela s'ajoute la diversité des oxylipines générées à partir des produits de la LOX, qui est modulée en fonction du type d'hydroperoxyde formé et de la nature des enzymes qui les métabolisent.
Les hydroperoxydes d'acides gras génërés par la LOX sont en effet convertis suivant plusieurs voies enzymatiques distinctes (4). La voie de l'hydroperoxyde lyase (HPL) catalyse le clivage de 13- ou 9-hydroperoxydes d'acides gras pour aboutir à la synthèse d'aldéhydes volatils en C6 ou en C9 et d'acides à chaîne courte, en C12- ou en C9, comme l'acide 12-oxo-trans-9-dodécénoïque, précurseur de l'acide traumatique. Les aldéhydes en C6 jouent un rôle important dans la fragrance des plantes mais certains comme le trahs-2-hexenal ont aussi des propriétés anti-microbiennes (10). Récemment, il a étë
montré que le t~a~s-2-hexenal pouvait aussi agir comme molécule-signal permettant l' activation de gènes de défense (11). L'acide traumatique appelé aussi hormone de blessure aurait un rôle dans la cicatrisation des tissus en favorisant les divisions cellulaires aux sites de blessures (5).
Une deuxième voie enzymatique impliquée dans la métabolisation des hydroperoxydes d'acides gras produits par la LOX concerne l'allène oxyde synthase (AOS).
Cette enzyme catalyse la déshydratation de l' acide 13-hydroperoxylinolénique et forme un allène oxyde qui est le précurseur de l'acide jasmonique. L'acide jasmonique est une molécule-clé des mécanismes de signalisation de la plante permettant l'activation de nombreux gènes de défense (12) parmi lesquels les gènes codant pour des inhibiteurs de protéases, actifs contre les insectes, et aussi de nombreuses protéines PR (chitinase, défensine, thionine, glucanase).
Le rôle des jasmonates comme molécule-signal a été récemment souligné par diverses

3 expériences montrant que des mutants d'A~abidopsis ou de tomate affectés dans la biosynthèse de ces molécules ou leur perception, présentaient une déficience dans l'induction de gènes de défense (13), une plus grande sensibilité à des organismes normalement non-pathogènes pour les plantes sauvages (14) ou une résistance réduite contre des insectes (15). Une troisième voie enzymatique de conversion des hydxoperoxydes concerne la formation de divinylethers d'acides gras. Ces composés, qui peuvent étre formés à partir de 13- ou de 9-hydroperoxydes ont été isolés de divers végétaux. La première divinylether synthase (DES) a été récemment clonée chez la tomate (16). Les divinylether d'acides gras produits à partir de 9-hydroperoxydes, l'acide colnéléique et l'acide colnélénique, présentent des propriétés antifongiques, notamment vis-à-vis de Phytophthora infestans (17).
D'autres modifications des produits de la réaction catalysée par la LOX
concernent des époxydations par des époxygenases et peroxygénases. Cette voie métabolique permet la synthèse de molécules à activité antimicrobienne et pourrait intervenir dans la synthèse de monomères de cutine qui outre leur fonction structurale peuvent aussi induire l' activité de gènes de défense (18).
Les hydroperoxydes d'acides gras produits par la LOX peuvent enfin générer la formation de radicaux libres intervenant dans des mécanismes de dégradation des membranes liés à la mort cellulaire (5).
L'ensemble de ces données montre donc que l'activité initiale de la LOX est essentielle pour la synthèse d'un ensemble de molécules, dont certaines présentent des activités antimicrobiennes ou sont impliquées dans la signalisation conduisant à la défense.
L'activité LOX augmente notablement chez le tabac en réponse à des éliciteurs (19, 20). L'isolement d'un clone d'ADN complémentaire de LOX, nommé pTL-J2 (21), a permis la caractérisation du gène de tabac correspondant, appelé LOXl. Des expériences d'hybridation ADN/ARN (hybridation de type northern) ont montré que LOXl, s'exprime dans des cellules de tabac en culture consécutivement à l'application d'éliciteur et dans des plantes de tabac inoculées par l'oomycète Phytophthora pa~asitica hicotia~tae, Pph (22).
Les transcrits correspondant à ce gène ne sont pas détectables chez des plantes saines ou des cellules non traitées. Une étude biochimique montre que in vitro la LOX de cellules de tabac élicitées permet la production de 9- et 13-hydroperoxydes d'acide gras avec une insertion préférentielle de l'oxygène moléculaire en position 9 (20).
Consécutivement à l'inoculation racinaire de tabac par Ppn, une forte induction de l'expression du gène est mesurée. Dans le cas d'une interaction incompatible (plante

4 résistante/race du microorganisme avirulente), on mesure une induction précoce de l'activité
du gène, avec un maximum d'accumulation de transcrits à 24 heures (22).
L'induction du gène est plus tardive et de plus faible amplitude dans le cas d'une interaction compatible (plante sensible/race virulente), comme cela a également été observé dans d'autres modèles de type gène-pour-gène, comme les interactions entre la tomate et Pseudomouas syringae (23), le riz et Maghaporthe grisea (24), et la pomme de terre et Phytophthora ihfestahs (25).
L'expression du gène LOXI n'est pas détectée dans les tissus des plantes de tabac saines à
l' exception des plantes en floraison pour lesquelles des transcrits LOX sont détectés en faible quantité dans les pétales et les sépales, et des jeunes germinations (22, 26). Dans ce dernier cas, une expression transitoire du gène LOXI est détectée entre les deuxième et quatrième jours après le début de la germination.
Villalba et collaborateurs (27) ont montré qu'une glycoprotéine élicitrice isolée de parois de Ppn, appelée CBEL pour Çellulose Binding Elicitor Lectin, induit le gène LOXl lorsqu'elle est infiltrée dans le mésophylle foliaire de plantes de tabac. Les transcrits LOXl apparaissent lors des premières quatre heures suivant l'infiltration et leur niveau est maximum à 12 heures. LTn polysaccharide issu d'algues marines, le ~,-carraghénane, est également inducteur du gène LORI lorsqu'il est appliqué à des plantes de tabac par infiltration dans le mésophylle foliaire (28).
Dans des cellules de tabac, l'expression du gène LOXI est détectée consécutivement à des traitements éliciteurs. Dans le cas d'éliciteur de Pph (extrait de parois), une induction de l'expression du gène LOXI est détectée dans les deux premières heures après traitement, avec un maximum d'accumulation à 24 heures (22). La cryptogéine, un peptide éliciteur de Phytophtho~a cryptogea, oomycète pour lequel le-tabac n'est pas un hôte ainsi que l'endopolygalacturonase de Colletotrichum lindemuthianum permettent aussi l'induction du gène LORI (26). Il a été montré par ailleurs que l'induction du gène LOXI
était plus précoce que celle de gènes de défense comme ceux codant les protéines PR qui sont les chitinases et 131-3 glucanases, suggérant le rôle potentiel de la voie de la LOX dans la transduction du signal déclenchant les réactions de défense (26). L'expression de LORI dans les cellules est également inductible par le methyl jasmonate (22, 29), indiquant ainsi une auto-amplification possible de cette voie, alors qu'aucune accumulation de transcrits LOX n'est détectée après l'application d'acide salicylique (22).
L'analyse de l'expression du gène LORI montre que l'induction de la LOX
constitue une réponse précoce de la plante à l'infection par Pp~, suggérant un rôle dans l'établissement de la résistance. Ce rôle potentiel a été confirmé par l'obtention de plantes S
transgéniques exprimant l'ADN complémentaire du gène en orientation anti-sens.
En effet, ces plantes, provenant de la lignée 46-8 normalement résistante à la race 0 de Pph, présentent des niveaux d'activité LOX fortement diminués et ont perdu leur capacité à
déclencher la réaction incompatible (30, 31). Cette expérience montre clairement que l'expression du gène LOX est nécessaire à l'établissement de l'état de résistance dans l' interaction de type gène-pour-gène entre le tabac et Ppn . Les plantes anti-sens LOX sont également plus sensibles à un autre champignon pathogène du tabac, Rhizoctonia solarci (30, 31). En parallèle, Rustërucci et collaborateurs (32), ont montré que des hydroperoxydes s'accumulent durant la réponse de type hypersensible du tabac à
la cryptogéine, et que cette accumulation est nécessaire au développement de cette réaction.
Chez une autre solanacée, la pomme de terre, des oxylipines issues de la voie 9-LOX, en particulier les acides colnéléique et colnélénique, s'accumulent préférentiellement dans des cellules en culture en réponse à un éliciteur de P. infestas (33). L'ensemble de ces données suggère un rôle majeur de la voie 9-LOX chez les solanacées, dont le tabac, dans la réponse aux agents pathogênes, en particulier les Oomycètes. Chez ces plantes, la voie participe à la réponse aux agents pathogènes, comme le montre la synthèse précoce de jasmonates (29); elle est également impliquée dans la réponse à la blessure et aux insectes.
Ainsi, des plantes de pomme de terre exprimant une construction anti-sens 13-LOX se sont révélées plus sensibles à l'attaque par des insectes (34).
Peu de tentatives de sur-exprimer une LOX dans les plantes ont été rapportées dans la littérature. En effet, l'expression d'une LOX pose des questions de faisabilité en raison des propriétés toxiques potentielles des LOXs, si elles oxydent directement les biomembranes, et des produits qu'elles forment .
Chez le tabac, l'introduction de la LOX2 de soja sous le contrôle d'un promoteur chimérique, formé par fusion du promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV) et d'un "enhancer" isolé du virus de la mosaïque de la luzerne, a permis la production de cals transgéniques présentant une activité LOX environ 2 fois plus forte que celle de cals transformés avec le vecteur dépourvu de séquence LOX. Ces cals sont capables de former de 3 à 6 fois plus d'aldéhydes volatils, produits de la voie 13-LOX
via une 13-HPL, que les cals contrôle. Des plantes transgéniques ont été régénérées à
partir de ces cals mais bien que présentant une forte accumulation de la protéine hétérologue, ces plantes n'ont pas une activité LOX différente de celle de plantes contrôle. Elles forment cependant des quantités plus importantes d'aldéhydes volatils que les plantes contrôle (35). Plus récemment, une 13-LOX spécifique des corps lipidiques de graines de concombre a été

exprimée chez le tabac (36). La protéine hétérologue s'accumule dans toute la plante, chez les tabacs transgéniques, et en particulier dans les graines où elle est localisée essentiellement dans les corps lipidiques comme chez le concombre. Sa présence se traduit par une modification qualitative de l'activité LOX des plantes transgéniques, tant in vitro que in vivo. Une 13-LOX chloroplastique d'Arabidopsis, AtLOX2, a été utilisée dans une construction en orientation sens sous le contrôle du promoteur CaMV 35S pour transformer des arabettes. Les auteurs se sont cependant focalisës sur les évènements de transformation ayant conduit à une diminution d'activité LOX par co-suppression (37). Enfin, chez la lentille, la transformation transitoire de protoplastes avec une construction contenant une LOX de lentille sous le contrôle du promoteur CaMV 35S a conduit à une augmentation de 20°lo de l'activité LOX de ces protoplastes (38). Aucune des plantes ou cultures transformées décrites ci-dessus n' a été testée par rapport à une réponse en relation avec l'attaque par des agents pathogènes. Par ailleurs, les expériences réalisées concernent essentiellement des 13-LOXs.
En outre, les hypothèses concernant la participation des lipoxygénases dans les mécanismes de défense des plantes reposent essentiellement sur les activités biologiques de certaines oxylipines (39). Or, la biosynthèse d'une majorité des oxylipines, et en particulier l'acide jasmonique et les aldéhydes volatils issus de la voie 13-LOX, et les divinylethers issus de la voie 9-LOX, nécessite l'activité d'enzymes métabolisant les produits de la LOX, telles que TAOS, l'HPL, ou la DES, au-delà de la LOX elle-même. L'expression des gènes correspondant à ces enzymes est souvent inductible. Chez la tomate et Arabidopsis thaliana, l'expression de gènes codant l'AOS et l'HPL est inductible par la blessure (40-42). Par conséquent, faction des seules lipoxygénases ne semble donc pas suffisante pour dëclencher les mécanismes de résistance des plantes.
Les plantes cultivées subissent l'agression de nombreux organismes pathogènes tels que les virus, les bactéries et les champignons mais également d'organismes ravageurs tels que les insectes. Ces agressions affaiblissent les plantes et diminuent les rendements de leur culture. Il existe donc un besoin important d'accroître les mécanismes de résistance des plantes et de diminuer leur sensibilité aux maladies et aux agressions par des organismes parasites ou pathogènes. Les mécanismes de réponse des plantes aux agressions par des agents pathogènes ont fait l'objet de nombreuses études. Il est maintenant communément admis que la voie de la lipoxygénase chez les plantes participe à leur système de défense et à l'ëtablissement d'un état de résistance à travers la voie des oxylipines notamment.

Cependant, la connaissance de ces voies métaboliques et des lipoxygénases n'a pas permis de développer des procédés permettant d'accroitre directement la résistance des plantes.
Ce problème est résolu par la présente invention puisqu'on a maintenant constaté que la sur-expression d'une lipoxygénase dans les plantes diminue directement la sensibilité des plantes aux maladies et aux attaques par des agents pathogènes. De façon inattendue, et bien que la lipoxygénase s'intègre dans des voies métaboliques complexes, la sur-expression d'une lipoxygénase dans les plantes est suffisante pour améliorer la réponse des plantes aux agressions par des pathogènes. De plus, la sur-expression de la lipoxygénase n'affecte pas de manière substantielle le phénotype des plantes transformées en dehors des nouvelles propriétés acquises.
La présente invention consiste donc à sur-exprimer une lipoxygénase dans les plantes pour diminuer la sensibilité des plantes aux maladies et aux attaques par des organismes pathogènes ou ravageurs. L'invention a également pour objet des cassettes d'expression préférées pour la sur-expression de la lipoxygénase dans les plantes ainsi que des cellules végétales et des plantes transformées.
Description de la liste des séquences SEQ ID No. 1: Lipoxygénase (LOXl) de tabac.
SEQ ID No.2: Cassette d'expression Promoteur CaMV 35S - Séquence codante du gène LOXl de tabac - Terminateur nos.
SEQ ID No. 3-6: Amorces pour PCR.
Description de l'invention La présente invention concerne un procédé pour diminuer la sensibilité des plantes aux maladies et aux agressions par des organismes pathogènes. Ce procédé
consiste à sur-exprimer une lipoxygénase dans ces plantes.
Par "lipoxygénase" on entend une enzyme catalysant la dioxygenation d'acides gras polyinsaturés contenant un motif (Z,Z)-1,4-pentadiène. Chez les végétaux, les substrats de l'enzyme sont (acide linoléique (C18:2) et linolénique (C18:3), deux constituants majeurs des membranes cellulaires.
"Sur-expression" signifie que la lipoxygénase est exprimée à un niveau supérieur au niveau d'expression observée dans une plante référence (non induite). Cette sur-expression se traduit par une accumulation plus importante des transcrits du gène de la lipoxygénase, de ô
la lipoxygénase elle-même et par une activité spécifique lipoxygénase accrue dans les tissus de la plante. Pour diminuer la sensibilité des plantes aux maladies et aux attaques par des organismes pathogènes il est important que le niveau d'expression de la lipoxygénase soit supérieur à celui d'une plante référence lorsque se produit (agression par (organisme pathogène.
La sur-expression de la lipoxygénase permet de diminuer la sensibilité des plantes aux maladies et aux attaques par des organismes pathogènes. Par "agressions d'organismes pathogènes" on entend notamment des agressions des plantes par des virus, des bactéries, des champignons, des oomycètes ou encore des insectes.
Dans un mode de réalisation préféré, le procédé consiste à sur-exprimer constitutivement une lipoxygénase dans les plantes. Le terme "constitutivement" désigne l'expression temporelle et spatiale de la lipoxygénase dans les plantes dans les procédés selon (invention. Par "constitutivement" on entend (expression d'une lipoxygénase dans les tissus de la plante pendant toute la vie de la plante et notamment au cours de (ensemble de son cycle végétatif. Dans un premier mode de réalisation, la lipoxygénase est exprimée de façon constitutive dans tous les tissus de plante. Dans un deuxième made de rëalisation, la lipoxygénase est exprimée constitutivement dans les racines, les feuilles, les tiges, les fleurs etlou les fruits. Dans un autre mode de réalisation de (invention, la lipoxygénase est exprimée constitutivement dans les racines, les feuilles etlou les tiges.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la lipoxygénase est une lipoxygénase "inductible" dans une plante rëfërence. Dans la présente invention on entend par lipoxygénase "inductible" une lipoxygénase qui n'est pas exprimée ou exprimée à des niveaux très faibles et dont l'expression est fortement induite en réponse à
des éliciteurs dans la réponse au stress, aux blessures et en particulier aux maladies et aux attaques par des organismes pathogènes.
Dans un mode de réalisation préféré des procédés selon l'invention, la lipoxygénase a préférentiellement une activité de 9-lipoxygénase. Les lipoxygénases (LOX) sont classées selon la position du carbone sur lequel est inséré préférentiellement (oxygène moléculaire.
Chez les végétaux on distingue les 13-LOX et les 9-LOX. Des méthodes permettant de déterminer la spécificité de (activité lipoxygénase sont décrites dans la littérature (Fourrier et al., Plaht.I. 3:63-70, 1993; Hornung et al., PNAS 96:4192-4197, 1999;
Rustérucci et al., J. Biol. Biochem. 274:36446-36455, 1999).
Toute lipoxygénase dont la sur-expression dans les plantes permet de diminuer la sensibilité des plantes aux maladies et aux attaques par des organismes pathogènes est utilisable dans les procédés selon (invention. Les lipoxygénases sont connues de (homme du métier et d'autres lipoxygénases peuvent être identifiées en utilisant des techniques connues. On citera notamment à titre d'exemple les lipoxygénases de pomme de terre (Kolomoiets M.V. et al., PZahtPhysiol. 124:1121-1130, 2000), de tomate (Genbank AY008278) de tubercule de pomme de terre (Royo et al., J.Biol.Chem., 271:21012-21019, 1996; Casey, R., Plaht Physiol., 107:265-266, 1995), la lipoxygénase de graine d'amande (Mita et al., Eur. J. Biochem., 268:1500-1507, 2001) et la lipoxygénase de grain d'orge (Van Mechelem et al., Biochem. Biophys. Acta, 1254:221-225, 1995).
De préférence, la lipoxygénase est une lipoxygénase de plante.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, il s'agit d'une lipoxygénase de plante solanacée. Parmi les plantes solanacées on citera notamment le tabac, la tomate, la pomme de terre ou encore le piment.
Dans un autre mode de réalisation préférée de (invention, la lipoxygénase présente au moins 80% d'homologie avec la lipoxygénase 1 (LOXl) de tabac de la SEQ ID
No.l. De manière avantageuse, le pourcentage d'homologie sera d'au moins 80 %, 85 %, 90 %, 95 et de préférence d'au moins 98 % et plus préférentiellement d'au moins 99 %
par rapport à la SEQ ID No.l . Le terme "homologue" désigne un polypeptide pouvant présenter une délétion, une addition ou une substitution d'au moins un acide aminé. Les méthodes de mesure et d'identification des homologies entre polypeptides ou protéines sont connues de (homme du métier. On peut employer par exemple le « package » UWGCG et le programme BESTFITT pour calculer les homologies (Devereux et al., Nucleic Acid Res. 12, 387-395, 1984). De préférence, ces lipoxygénases homologues conservent la même activité
biologique que la lipoxygénase (LOX1) de tabac de la SEQ ID No.l.
Préférentiellement, ces polypeptides ont donc une activité de lipoxygénase et encore plus préférentiellement de 9-2S lipoxygénase.
Dans un mode de réalisation encore plus préféré, les procédés selon la présente invention utilisent la lipoxygénase de la SEQ ID No.l .
La sur-expression de la lipoxygënase dans les plantes est réalisée en transformant les plantes ou par application sur les plantes d'une molécule stimulant la synthèse de la lipoxygénase dans la plante.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la lipoxygénase est sur-exprimée par intégration dans le génome des plantes d'une cassette d'expression comprenant une séquence codant pour une lipoxygénase sous le contrôle d'un promoteur fonctionnel dans les plantes.

Par "promoteur", on entend selon l'invention la région non codante d'un gène impliquée dans la liaison avec l'ARN polymérase et avec d'autres facteurs qui sont responsables de l'initiation et de la régulation de la transcription conduisant à la production d'un transcrit d'ARN. Les promoteurs de plantes, utilisables dans les procédés selon la

5 présente invention, sont largement décrits dans la littérature.
De préférence, le promoteur est un promoteur constitutif dans les plantes. Les promoteurs constitutifs utilisables dans les procédés selon (invention sont également bien connus de (homme du métier.
Comme séquence de régulation promotrice dans les plantes, on peut utiliser toute 10 séquence promotrice d'un gène s'exprimant naturellement dans les plantes comme par exemple des promoteurs dits constitutifs d'origine bactérienne, virale ou végétale. On citera des promoteurs bactériens comme celui du gène de foctopine synthase ou encore le gène de la nopaline synthase, des promoteurs viraux, comme le promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur ou le promoteur CSVMV (W0 97/48819) et les promoteurs d'origine végétale comme le promoteur du gène d'histone (EP0507698) ou le promoteur d'un gène d'actine de riz (IJS 5,641,876). Selon l'invention, on peut notamment utiliser, en association avec la séquence de régulation promotrice, d'autres séquences de régulation, qui sont situées entre le promoteur et la séquence codante, telles que des activateurs de transcription ("enhancer").
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, le promoteur constitutif est le promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur.
Dans un autre mode de réalisation de (invention, (expression constitutive ou la sur-expression de la lipoxygénase est obtenue en transformant les plantes de manière à placer un promoteur constitutif ou une séquence "enhancer" en amont ou à proximité du gène de la lipoxygénase dans les plantes. On peut notamment utiliser toute séquence de régulation permettant d'augmenter le niveau d'expxession de la lipoxygénase dans les plantes.
Préférentiellement, la lipoxygénase est sur-exprimée dans les tiges, les feuilles etlou les racines des plantes.
On entend par "plante" selon l'invention, tout organisme multicellulaire différencié
capable de photosynthèse, en particulier monocotylédones ou dicotylédones, plus particulièrement des plantes de culture destinées ou non à l'alimentation animale ou humaine, comme le maïs, le blé, forge, le sorgho, le colza, le soja, le riz, la canne à sucre, la betterave, le tabac, le coton, etc.

La sur-expression de la lipoxygénase peut être obtenue dans toute plante selon des méthodes connues de (homme du métier.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, les plantes sont choisies parmi les plantes solanacées. Parmi les plantes solanacées on citera notamment le tabac, la tomate, la pomme de terre ou encore le piment.
Dans un mode de réalisation préféré de (invention, la lipoxygénase est sur-exprimée par intégration dans le génome des plantes d'une cassette d'expression comprenant une séquence codant pour une lipoxygénase sous le contrôle d'un promoteur fonctionnel dans les plantes. Un polynucléotide codant pour une lipoxygénase est inséré dans une cassette d'expression en utilisant des techniques de clonage bien connues de l'homme du métier.
Cette cassette d'expression comprend les éléments nécessaires à la transcription et à la traduction des séquences codant pour la lipoxygénase dans les plantes.
Avantageusement, cette cassette d'expression comprend à la fois des éléments permettant de faire produire la lipoxygénase par les plantes transformées et des éléments nécessaires à la régulation de cette expression. La présente invention concerne aussi des cassettes d'expression préférées pouvant être mises en oeuvre dans les procédés selon l'invention.
Dans un mode de réalisation, la présente invention concerne des cassettes d'expression fonctionnelles dans les cellules végétales et les plantes comprenant un promoteur ayant une activité constitutive dans les plantes contrôlant (expression d'un polynucléotide codant pour une lipoxygénase homologue à au moins 90 % à la lipoxygénase de la SEQ ID No.
1. De manière avantageuse, le pourcentage d'homologie sera d'au moins 80 %, 85 %, 90 %, 95 et de préférence d'au moins 98 % et plus préférentiellement d'au moins 99 %
par rapport à la SEQ ID No.l. De préférence, ce polynucléotide code pour une lipoxygénase ayant une activité 9-lipoxygénase. Plus préférentiellement, ce polynucléotide code pour la lipoxygénase de la SEQ ID No.l . Dans un mode de réalisation particulier de (invention, le promoteur est le promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur.
Les cassettes d'expression selon l'invention comprennent préférentiellement une séquence terminatrice. Ces séquences permettent la terminaison de la transcription et la polyadénylation de fARNm. Toute séquence terminatrice fonctionnelle dans les plantes peut être utilisée. Pour l'expression dans les plantes on peut notamment utiliser le terminateur nos d'Agrobacterium tumefaciehs, ou encore des séquences terminatrices d'origine végétale, comme par exemple le terminateur d'histone ( EP 0 633 317), le terminateur CaMV 35 S et le terminateur tml. Ces séquences terminatrices sont utilisables dans les plantes monocotylédones et dicotylédones.

Les techniques de construction de ces cassettes d'expression sont largement décrites dans la littérature (voir notamment Sambrook et al., Molecular Cloning : A
Laboratory Manual, 1989).
Avantageusement, les cassettes d'expression selon la présente invention sont insérées dans un vecteur pour leur réplication ou pour la transformation des plantes.
La présente invention concerne également des vecteurs pour la transformation des plantes comprenant au moins une cassette d'expression selon la présente invention. Ce vecteur peut notamment être constitué par un plasmide ou un virus dans lequel est inséré
une cassette d'expression selon (invention. De nombreux vecteurs ont été
développés pour la transformation des plantes avec Ag-robacter~ium tumefaciehs. D'autres vecteurs sont utilisés pour les techniques de transformation ne reposant pas sur l'utilisation d'Agrobacterium. Ces vecteurs sont bien connus de l'homme du métier et largement décrits dans la littérature. De manière préférée, les vecteurs de (invention comprennent également au moins un marqueur de sélection. Parmi les marqueurs de sélection, on peut citer les gènes de résistance aux antibiotiques tel que le gène hptll pour la résistance à la kanamycine (Bevan et al., Nature 304:184-187, 1983) et le gène hph pour la résistance à
fhygromycine (Gritz et al., Gene 25:179-188, 1983). On citera également les gènes de tolérance aux herbicides tel que le gène bar (White et al., NAR 18:1062, 1990) pour la tolérance au bialaphos, le gène EPSPS (LJS 5,188,642) pour la tolérance au glyophosate ou encore le gène HPPD (W0 96138567) pour la tolérance aux isoxazoles.
La présente invention concerne donc des vecteurs comprenant une cassette d'expression selon (invention.
L'invention a encore pour objet un procédé de transformation des plantes avec une cassette d'expression ou un vecteur selon (invention.
Selon la présente invention la transformation des plantes peut être obtenue par tout moyen connu approprië, les techniques de transformation des plantes sont amplement décrites dans la littérature spécialisée.
Certaines techniques utilisent Ag~obacterium notamment pour la transformation des dicotylédones. Une série de méthodes consistent à utiliser comme moyen de transfert dans la plante un gène chimère inséré dans un plasmide Ti d'Ag~obacte~ium tumefaciehs ou Ri d'Agrobacterium ~hizogenes. D'autres méthodes consistent à bombarder des cellules, des protoplastes ou des tissus avec des particules auxquelles sont accrochées les séquences d'ADN. D'autres méthodes peuvent également être utilisées telles que la micro-injection ou félectroporation, ou encore la précipitation directe au moyen de PEG.

L'homme du métier fera le choix de la méthode appropriée en fonction de la nature de la cellule végétale ou de la plante.
La présente invention concerne les cellules végétales transformées comprenant une cassette d'expression et/ou un vecteur selon l'invention.
Par "cellule végétale", on entend selon l'invention toute cellule issue d'une plante et pouvant constituer des tissus indifférenciés tels que des cals, des tissus différenciés tels que des embryons, des parties de plantes, des plantes ou des semences.
La présente invention concerne également les plantes transformées comprenant une cassette d'expression, un vecteur et /ou des cellules transformées selon l'invention.
On entend par "plante" selon l'invention, tout organisme multicellulaire différencié
capable de photosynthèse, en particulier monocotylédones ou dicotylédones, plus particulièrement des plantes de culture destinées ou non à l'alimentation animale ou humaine, comme le maïs, le blé, l'orge, le sorgho, le colza, le soja, le riz, la betterave, le tabac, le coton, etc.
FIGURES
Figure 1 La figure 1 présente la construction 35S-9-LOX utilisée pour la transformation du tabac. La séquence codante 9-LOX (LOXI ) a été obtenue par amplification PCR puis insérée entre le promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (35S) et le terminateur de la nopaline synthase d'Agrobaeterium tumefascie~cs (tnos). Ce vecteur comprend également le gène de la néomycine phosphotransférase (NPTl~ conférant la résistance à la kanamycine chez les bactéries et les plantes. "F" ("sens 35S") désigne (amorce sens et "R" ("reverse LOXl ") désigne l'amorce reverse.
Fi ug-re 2 La figure 2 est un histogramme représentant la mesure de (activité
spécifique LOX dans les tiges des plants de tabac en nKAT/mg de protéine. 46-8 WT et 49-10 WT désigne les lignées parentales. S46-21, S46-26, S49-18 désigne les lignées transgéniques. En effet, préalablement à des tests d'inoculation par Ppn, l'activité spécifique LOX ainsi que le niveau de transcrits correspondants ont été analysés pour des tiges de plantes de tabac âgées de 12 semaines. On observe que le niveau d'activité spécifique LOX dans les trois lignées transgéniques retenues est significativement supérieur à celui mesuré
dans les lignées parentales correspondantes.
Figure 3 La figure 3 est un histogramme représentant la mesure de la longueur des lésions en mm. Ces mesures ont été réalisées 48 heures (48h) ou 72 heures (72h) après l'inoculation. Les nombres entre parenthèses correspondent aux répétitions indépendantes réalisées. Les deux lignées S46-21 et S46-26, inoculées par Ppn 1 présentent des longueurs de lésions significativement inférieures à celles obtenues avec le même agent pathogène chez le parent sauvage, 46-8 WT. De même, la lignée S49-18 présente des lësions plus courtes que celles mesurées chez son parent sauvage 49-10 WT lors de l'inoculation de ces deux lignées par Ppn 0. Ces différences sont significatives à 48 heures et à 72 heures après l'inoculation.
EXEMPLES
Exemple 1: Matériel biologique Des plantes de tabac (Nicotiana tabacum L.) sauvages des deux lignées quasi-isogéniques 46-8 (46-8 WT) et 49-10 (49-10 WT) ont été utilisées (Helgeson et al., Phytopath. 62,1439-1443, 1972). Ces lignées se différencient par la présence chez la lignée 46-8 WT d'un locus de résistance à la race 0 de Pph. Ainsi, la lignée 46-8 WT
est résistante à la race 0 de Pph et sensible à la race 1 de cet agent pathogène tandis que la lignée 49-10 WT est sensible aux deux races de Ppn.
Les graines de lignées sauvages ou transgéniques sont stérilisées (Rancé et al., Plant Cell Report, 13, 647-651, 1994) et semées sur milieu MS solide, additionné
dans le cas des lignées transgéniques, de kanamycine (50 ~g.ml-1). Après 4 semaines de croissance i~ ritr~o (hygrométrie 40%, température constante 25°C, lumière 60 ~mol.rri 2.s 1 : 16h, obscurité
8h), les plantes sauvages ou transgéniques résistantes à la kanamycine, sont transférées sur vermiculite en salle à culture (hygrométrie 80%, lumière 125 ~mol.ni 2.s'1:
16h, 25°C, obscurité : 8h, 18°C).
Les souches de Ppn utilisées correspondent aux isolats 1156 (race 0) et 1452 (race 1) (Hendrix, J.W. & Apple, J.L., Tobacco Science 11, 148-150, 1967). Le mycélium de Pph est cultivé à l'obscurité sur un milieu synthétique solide (I~een, N.T., Science 187, 74-75, 1975).

Exemple 2: Obtention de la cassette promoteur CaMV 35S-séquence codante LOX1-terminateur nos (p35S-LOXl~
TL-J2 est un ADN complémentaire de 2888 pb, correspondant au gène LOXI de tabac induit par la pathogenèse. L'obtention de cet ADN complémentaire est décrite par Véronési et collaborateurs (Véronési et al., Plaut Physiol. 108, 1342, 1995), sa séquence est déposée dans GenBank sous le numéro d'accession X84040. Cet ADNc a été utilisé comme matrice pour l'amplification par PCR de la séquence codante de LOXl.
Des amorces ont été synthétisées pour amplifier un fragment d'ADN de 2,6 kb, couvrant les positions 49 à 2667 de l'ADNc - Amorce sens = 5'-GTTATCAAACAGTTTAAAATGTTTCTGGAG-3' - Amorce reverse = 5'-TGATTTAAAGTTCTATATTGAC-3' Ces amorces permettent de plus l'introduction de sites DraI (soulignés dans la séquence des amorces) en amont du codon d'initiation de la traduction et en aval du codon stop (indiqués en caractères gras dans la séquence des amorces) de la séquence LOXl.
La réaction PCR a été conduite dans un volume total de 25 ~,1, contenant 50 ng de plasmide pTL-J2, 50 pmol de chacune des amorces sens et reverse ci-dessus, 2,5 unités d'ADN
polymérase Pfu (Stratagene Cloning Systems) et ajusté à 200 ~M de chaque dNTP
et 2 mM
MgCla. Après 5 min de dénaturation à 94°C, le programme du thermocycleur était composé
de 20 cycles, incluant chacun 1 min de dénaturation à 94°C, 1 min d'hybridation à 50°C et 6 min d'extension à 72°C, suivis d'une étape finale de 40 min d'extension à 72°C.
L'ADN de cette réaction a été digéré par D~aI, et séparé sur gel d'agarose 0,8%. Le fragment à bouts francs de 2,6 kb a été purifié à partir du gel (Kit QiaEx II, Qiagen) et cloné
au site Smal du vecteur pIPMO (Rancé et al., PNAS 6554-6559, 1998) entre le promoteur CaMV 35S et la région 3' non traduite du gène de la nopaline synthase d'Agrobacte~ium tumefaciehs (terminateur nos). Ce vecteur comprend également deux copies du gène de la neomycine phosphotransférase (NPTl~ conférant la résistance à la kanamycine chez les bactéries et les plantes. Le mélange de ligation a été utilisé pour transformer des bactéries Escherichia eoli XLlBlue compétentes, et des colonies résistantes à la kanamycine ont été
sélectionnées puis criblées pour la présence de séquence LOX à l'aide de la sonde moléculaire TL-J2. Des colonies positives ont été mises en culture et les plasmides correspondant purifiés. L'orientation de la séquence LOX1 a été examinée pour chacun des plasmides par PCR en utilisant les amorces suivantes - Amorce F, « sens 35S » : 5'-GGCCATGGAGTCAAAGATTC-3' ciblant les nucléotides 6906-6925 du promoteur CaMV 35S (séquence disponible dans Genbank sous le numéro d'accession J02048).
- Amorce R, « reverse LOXl » : 5'-GCTCTGGCATGAAATTTCG-3' ciblant les nucléotides 2290-2272 (brin non-codant) de TL-J2.
Les réactions d'amplification ont été conduites dans un volume de 50 ~.l et comprenaient 100 ng de plasmide à tester, 10 pmol de chaque amorce et 1 unité de Taq ADN
polymerase dans un milieu ajusté à 200 ~M de chaque dNTP et 1,5 mM MgCl2. Le programme du thermocycleur incluait une étape de dénaturation initiale de 5 min à
94°C, puis 40 cycles consistant chacun en 1 min de dénaturation à 94°C, 1 min d'hybridation à 65°C et 2 min d'extension à 72°C, suivis d'une étape d'élongation finale de 10 min à
72°C. Les produits de la réaction ont été séparés sur gel 0.8% d'agarose. Un plasmide pour lequel la présence d'un produit d'amplification de la taille attendue (2,8 kb) indiquait l'orientation sens de la séquence LOX par rapport au promoteur CaMV 35S dans la construction, a été
sélectionné.
La séquence LOX et les jonctions de celle-ci avec le promoteur et le terminateur ont été
entièrement séquencées. Le plasmide ainsi vérifié est nommé p35S-LOXl. La séquence de la construction CaMV 35S-LORI est décrite à la SEQ ID No.2.
Exemple 3: Transformation ~ënétique du tabac Le plasmide p35S-LOXI a été mobilisé dans la souche LBA4404 d'Agrobacterium tumefaciehs par choc thermique (Holsters et al., Mol. Geh. Genet. 163, 181-187, 1978). Une colonie résistante à la kanamycine a été isolée, le plasmide purifié, et l'intégrité de la construction vérifiée par PCR avec les amorces F et R et dans les conditions décrites ci-dessus pour la détermination de l'orientation relative de la séquence LOX. Les bactëries recombinantes obtenues ont ensuite été utilisées pour (infection de disques foliaires de tabac, Nicotiaua tabacum, lignées 46-8 WT et 49-10 WT suivant des protocoles déjà décrits (Horsch et al., Science 227, 1229-1231, 1985).
Les plantes régénérées sur un milieu de Murashige et Skoog (MS) contenant 150 ~g.ml-1 de Kanamycine ont été placées en chambre de culture puis en serre pour l'obtention des graines T1, par auto-fécondation. Les lignées transgëniques régénérées à
partir des lignées parentales 46-8 WT et 49-10 WT sont nommées plantes S46-x et S49-x, respectivement.

Exemple 4: Caractérisation des transformants primaires La présence de la cassette d'expression 35S-LOXI ainsi que le nombre de copies du transgène dans le génome des plantes régénérées ont été déterminés par des expériences de PCR et d'hybridation ADN/ADN (Southern). L'ADN génomique de plantes sauvages ou de plantes régénérées résistantes à la kanamycine a été préparé selon la méthode décrite par Dellaporta et collaborateurs (Dellaporta et al., Plant Mol. Biol. Rep. 1, 19-21, 1983).
L'intégrité de l'ADN-T transféré a été vérifiée par amplification PCR à l'aide des amorces F « sens 35S » et R « reverse LOXl » , décrites ci-dessus. Les conditions de la réaction étaient celle décrites ci-dessus, mais la quantité d'ADN matrice était dans ce cas de 800 ng d'ADN génomique. Le nombre de copies d'ADN-T insérées a été estimé par Southern blot (50). L'ADN génomique (15 ~,g) a été digéré par BamHl et les produits de digestion ont été
séparés sur gel d'agarose, puis transférés sur membrane de nylon. Une sonde CaMV 35S
(nucléotides 6909 à 7440 de la séquence Genbank J02048) a été utilisée après marquage au [a 32P] dCTP. Le nombre de bandes hybridant cette sonde, après révélation par autoradiographie, est une bonne indication du nombre de sites d'insertion de la construction.
Exemple 5: Transformation du tabac par la séguence codant la LOXl de tabac sous le contrôle du promoteur constitutif CaMV 35 S
Afin d'exprimer constitutivement la L~X1 de tabac dans des tabacs transgéniques, la séquence codante correspondante a été introduite en orientation sens dans l'ADN de transfert du vecteur binaire pIPMO, en aval du promoteur constitutif CaMV 35S
(p35S) (Fig.
1A). Cette construction, appelée p35S-LORI contient également un gène de résistance à la kanamycine (NPTll) permettant de sélectionner les cellules végétales transformées. Les lignées de tabac 46-8 WT et 49-10 WT ont été transformées par Agrobacterium tumefaciehs LBA 4404 dans laquelle la construction p35S-LORI a été introduite. A partir des cals sélectionnés sur un milieu contenant de la kanamycine, 15 transformants primaires indépendants S46-x dérivant de la lignée 46-8 WT ont été régénérés. La lettre x désigne le numéro de la plante obtenue. De même, 25 transformants primaires indépendants S49-x ont été régénérés à partir de la lignée 49-10 WT. Ces plantes ont été acclimatées en chambre de culture puis transférées en serre jusqu'à floraison. Les graines correspondant aux plantes Tl ont été obtenues par auto-fécondation des transformants primaires.
L'intégrité de la construction introduite dans le génome des plantes transgéniques a été
vérifiée par amplification PCR à partir d'une préparation d'ADN génomique des transformants primaires cultivés sur kanamycine et d'un couple d'amorces, l'une spécifique de la région 5' du promoteur CaMV 35S (F) et l'autre de la région 3' de la séquence codante LOXl (R). Les produits d'amplification ont été séparés sur un gel d'agarose et révélés au bromure d'ethidium. Pour 10 des 11 transformants primaires analysés, le profil obtenu correspond à une bande unique dont la taille (2,8 kb) correspond à la taille estimée du produit. En outre, ce profil est identique à celui obtenu avec le vecteur binaire p35S-LOXl, ce qui suggère qu'au moins une copie a été intégrée dans le génome de ces transformants.
En revanche, un transformant primaire ne possède pas un tel profil bien qu'il soit résistant à
la kanamycine, indiquant une intégration incomplète de la construction. Les lignées parentales 46-8 WT et 49-10 WT, analysées en tant que témoins négatifs ne présentent pas de signal correspondant à la construction.
Le nombre de copies insérées dans chacune des lignées régénérées a été estimé
par hybridation de type Southern à partir d'ADN génomique digéré par BamHI et d'une sonde homologue au promoteur CaMV 355. L'ADN de transfert possède deux sites BamHI :
le premier est situé entre le promoteur CaMV 35S et la séquence LOXI et un second dans la séquence LOXl. Les fragments BamHI hybridant la sonde CaMV 35S radiomarquée résultent donc d'une première coupure entre le promoteur CaMV 35S et LOXI et d'une seconde coupure dans le génome végétal, en amont de la bordure gauche de l'ADN
de transfert. L'insertion de I'ADN de transfert dans le génome des plantes ëtant aléatoire, les fragments BamHI hybridant la sonde CaMV 3 5 S radiomarquée, obtenus dans le cas d'insertions multiples, auront des tailles dépendant de la position du site BamHl dans l'ADN génomique et donc probablement différentes. C'est pourquoi le nombre de ces fragments permet d'évaluer le nombre de sites d'insertion dans le génome. Les profils obtenus indiquent que les transformants primaires S46-3, S46-4, S46-26, S49-8, et S49-13 contiennent une copie du transgène, alors que deux copies ont été insérées dans le génome des lignées S49-18 et S49-28, et trois copies dans le génome des lignées S46-21, S49-14 et S49-30. La sonde radiomarquée CaMV 35S n'a pas hybridé avec l'ADN génomique correspondant aux lignées S49-24, ni avec celui des lignées parentales 46-8 WT
et 49-lOWT.
Exemple 6: Extraction et analyse des ARN
L'ARN total a été isolé à paxtir d'échantillons congelés de plantes de génération T1 ou sauvages. Le matériel végétal a été broyé dans l'azote liquide et l'ARN
extrait à l'aide du I~it Extract-a.ll (Eurobio). La concentration en acides nucléiques a été
estimée par spectrophotométrie. Les expériences de northern blot ont été réalisées comme précédemment décrit (Rickauer et al., Piahta 202, 155-162, 1997). Les filtres ont été
hybridés avec la sonde TL-J2 radiomarquëe.
Exemple 7: Analyse de l'accumulation des transcrits LOX dans les lignées transgéniques Tl Le niveau d' expression LOX a été évalué dans les différentes lignées transgéniques T1 en mesurant l'accumulation des transcrits LOX par northern blot. Les échantillons d'ARN totaux ont été préparés à partir de jeunes plantes de tabac transgéniques de 4 semaines sélectionnées in vitro sur un milieu contenant de la kanamycine.
L'évaluation des niveaux respectifs d'expression du transgène dans ces lignées a été réalisée en comparant les profils obtenus avec le niveau de transcrits détectés dans des plantes sauvages, ainsi que dans une suspension cellulaire de tabac contrôle (témoins négatifs), ou dans une suspension cellulaire de tabac traitées par des éliciteurs de Ppn (témoin positif). Les résultats obtenus indiquent que le niveau de transcrits est faible, voire indétectable, dans les lignées transgéniques S46-3, S46-4, S49-8, S49-13, S49-24, S49-28 et S49-30. En revanche, les lignées S46-21, S46-26, S49-14 et S49-18 présentent une accumulation importante de transcrits LOX atteignant, après quantification, de 30 à 66 % du niveau détecté dans les cellules de tabac élicitées. Aucune accumulation de transcrit LOX n'est détectée dans la lignée sauvage ni dans les cellules de tabac témoin. L'introduction de la construction promoteur 35S LOXI dans le tabac s'accompagne donc d'une expression constitutive importante dans les lignées transgéniques S46-21, S46-26, S49-14 et S49-18.
Exemple 8: Immunodétection de la LOX
Obtention d'un sérumpolyclonal de lapin anti-LOXl de tabac : Des lapins ont été
immunisés avec une protéine de fusion exprimée chez Escheriehia coli et comprenant les 244 résidus C-terminaux de la LOX1 de tabac fusionnés à la glutathione S-transférase (GST) de Schistosoma japonicum. Un fragment XhoI de pTL-J2, correspondant aux nucléotides 1921 à 2888, a été inséré au site XhoI du vecteur pGEX-SX-3 (Pharmacia, séquence disponible dans Genbank sous le numéro d'accession U13858) ce qui a permis l'obtention d'une fusion traductionnelle avec la séquence codante de la GST.
Une colonie de bactéries contenant le plasmide recombinant a été sélectionnée et mise en culture. Ces bactéries ont été traitées par l'isopropylthio-(3-galactoside à 4 mM pendant 16 heures à 37°C
afm d'induire la production de la protéine de fusion. Les bactéries ont été
récoltées par centrifugation à 6000 x g pendant 10 min puis les protéines ont été extraites par re-suspension du culot bactérien dans une solution tamponnée ajustée à 140 mM
NaCI, 2,7 mM KCI, 10 mM NaaHP04, 1,8 mM I~HHaP04, pIi 7,3, à raison de 40 ~1 de solution par ml de culture, puis soniquation du mélange en 3 cycles de 1 min chacun, sur la glace. Le soniquat a été centrifugé à 10000 x g pendant 5 min et les protéines insolubles contenues 5 dans le culot de centrifugation ont été récupérées et extraites dans le tampon de charge SDS-PAGE 1X (50) à 100°C pendant 10 min. Aprés une nouvelle centrifugation à 10000 x g pendant 5 min, l'extrait protéique a été chargé sur un gel dénaturant de polyacrylamide à
8%. Après électrophorèse et brève coloration au bleu de Coomassie, le gel a été décoloré et la bande correspondant à la protéine de fusion (55 kDa) a été excisée du gel et utilisée pour 10 l'immunisation des animaux (Eurogentec). L'un des sérums, qui présentait le meilleur titre par rapport à la protéine de fusion et à la LOX1 de tabac a été retenu comme sérum anti-LOX1. Analyse western : Des extraits enzymatiques dialysés et concentrés, préparés comme décrit ci-dessus, ont été séparés en SDS-PAGE sur un gel à 10% à raison de 100 ~g de protéines par piste, et après électrophorèse, les protéines séparées ont été
transférées sur 15 membrane de nitrocellulose par electro-transfert. Les analyses western ont été réalisées selon des protocoles standards. Le sérum anti-LOXl à la dilution de 1 :1000 a été utilisé
comme anticorps primaire, et des IgGs de chèvre anti-IgGs de lapin, couplées à
la phosphatase alcaline (Sigma), ont été utilisées comme anticorps secondaire.
L'activité
enzymatique phosphatase alcaline a été détectée par la mëthode au NBT-BCIP.
r Exemple 9: Détection de la protéine LOXl dans les lignées trans~éniques T1 A partir des lignées transgéniques exprimant constitutivement le transgène LOXI , la recherche de la protéine LOX1 a été entreprise par une analyse western. Des extraits de protéines solubles, préparés à partir des parties aériennes de plantes de 8 semaines, ont été
séparés par SDS-PAGE. La dëtection de la protéine LOXl a été réalisée à l'aide d'un sérum polyclonal de lapin dirigé contre la partie C-terminale de la protéine LOX1.
La révélation immunochimique montre la présence d'une bande unique dans les pistes correspondant aux lignées transgéniques S46-26 et S49-18. La taille du produit correspondant, comprise entre 79 et 101 kDa, est cohérente avec la taille calculée à partir de la séquence primaire de la protéine LOX1 (92kDa). En revanche, la protéine LOXl n'est pas détectée dans les extraits préparés à partir des lignées parentales 46-8 WT et 49-10 WT. L'expression constitutive du transgène LORI s'accompagne donc d'une accumulation de la protéine correspondante dans les lignées transgéniques S46-26 et S49-18.

Exemple 10: Mesure de l'activité LOX
Les échantillons de plantes sauvages ou transgéniques ont été congelés puis broyés dans l'azote liquide et homogénéisés dans le tampon phosphate de sodium 0.25 M, pH6.5, contenant 5% de polyvinylpolypirrolidone, à raison de 1 ml de tampon par g de matière fraîche. Après décongélation, les extraits ont été mélangés au vortex et centrifugés pendant 5 min à 12000 x g. Le surnageant de centrifugation constitue l'extrait enzymatique brut.
Deux méthodes de mesure de l' activité LOX ont été employées.
Méthode chromatoaraphique (CCM) : Un protocole a été adapté à partir d'une méthode décrite par Caldelari et Farmer (Caldelari, D. & Farmer, E.E., Phytochemist~y 47, 599-604, 1998). L'essai LOX a été conduit avec un aliquote de (extrait enzymatique brut correspondant à 50 ~,g de protéines, dans un volume total de 0,4 ml de tampon phosphate de sodium 0,25 M, pH 6,5, saturé en air et contenant de l'acide linoléique marqué
au 14C sur le carbone 1, à une concentration finale de 1,2 ~,M, pendant 30 min à
30°C. Le mélange réactionnel a ensuite été extrait 2 fois avec un mélange methanol-chloroforme (2 :1) et les phases organiques ont été concentrées sous flux d'azote. Les extraits ont été
séparés en chromatographie sur couche mince sur des plaques de silice, dans un mélange ether-hexane-acide formique (70 :30 :1). Les produits radio-marqués issus de la métabolisation de l'acide linoléique ainsi que le substrat restant ont été révélés par phosphorimaging.
La quantité de substrat restant dans chaque réaction a été estimée par comparaison avec une réaction contrôle sans extrait enzymatique (logiciel ImageQuaNT~ ) Méthode spectrophotométric~ue : L'extrait enzymatique brut a été dialysé et concentré par centrifugation sur une unité Ultrafree-4 (Millipore) ëquipée d'une membrane Biomax l OkDa NMWL, pendant 30 min à 3500 x g et à 4°C, puis a subi trois étapes de lavage par addition de 0,5 ml de tampon phosphate de sodium 0,25 M, pH 6,5 et centrifugation dans la même unité. L'activité LOX a été déterminée dans un essai d'un volume total de 475 ~,1, par mesure de la formation de diènes conjugués à x,234 nm (E=27000 M-l .crri 1) pendant 4 min à
30°C, dans du tampon phosphate de sodium 0,25 M, pH 6,5, saturé en air.
L'acide linoléique a été utilisé comme substrat à la concentration finale de 820 ~M.
Les résultats sont exprimés en nanokatal.mg'1 protéines. La teneur en protéines des aliquotes testës a été
déterminé par la méthode de Bradford (Bradford, Ahal. Biochem. 72, 248-254, 1976).

Exemple 11: Transformation in vitro de l'acide linoléique,par les Qlantes trans~~éniques Le niveau d'activité LOX des plantes transgéniques a été comparé à celui des lignées parentales 46-8 WT et 49-10 WT en mesurant, in vitro, la capacité de différents extraits enzymatiques à transformer un substrat naturel de cette enzyme, l'acide linoléique. Ces extraits, préparés à partir des parties aériennes de plantes âgées de 8 semaines, ont été
incubés in vitro avec de l'acide linoléique marqué au 14C. Les produits radiomarqués, extraits puis séparés par chromatographie en couche mince (CCM), ont été
révélés à l'aide d'un phosphorimager. A partir de l'image digita.lisée de la CCM, l'acide linoléique non métabolisé à la fin de la réaction a été quantifié pour chaque piste et exprimé en pourcentage de l'acide linoléique mesuré dans une réaction témoin ne comportant pas d'extrait enzymatique. Ces pourcentages correspondent à la moyenne de trois répétitions indépendantes. Dans les essais, l'acide linoléique disparaît presque complètement dans les pistes correspondant aux plantes transgéniques S46-26 et S49-18 avec seulement 5 et 10 de substrat restant en fin de réaction alors que dans le cas des lignées parentales 46-8 WT et 49-10 WT, environ 50 % du substrat n'est pas métabolisé. Afin de vérifier que cette différence entre les lignées WT et transgéniques est bien due à l'expression constitutive du transgène introduit, la même réaction a été réalisée en pré-incubant les extraits enzymatiques avec de l'ETYA (acide 5,8,11,14-eicosatétraynoïque), un inhibiteur spécifique des LOXs. Dans ce cas, environ 50 % de l'acide linoléique est détecté en fin de réaction aussi bien pour les lignées parentales que pour les lignées transgéniques. Ceci suggère que l'ensemble des lignées possède une activité indépendante de la LOX, capable de métaboliser une partie de l'acide gras introduit. Dans le cas où les extraits enzymatiques sont bouillis avant d'être incubës avec le substrat, entre 80 et 90% de l'acide gras est extrait en fin de réaction, montrant qu'il s'agit bien d'une réaction enzymatique et suggérant soit qu'une partie du substrat (entre 10 et 20%) est dégradée chimiquement, soit qu'elle n'est pas extractible dans les conditions utilisées. Cette expérience montre donc que les lignées transgéniques S46-26 et S49-18 présentent une activité de conversion de l'acide linoléique sensible à l'ETYA, ce qui n'est pas le cas des lignées parentales 46-8 WT et 49-10 WT.
Ceci montre que l'expression constitutive du transgène LOJ~1, ainsi que la présence de la protéine LOX1 dans les lignées transgéniques se traduit également par une augmentation de l'activité LOX dans ces plantes. Cette augmentation d'activité a également été
mesurée dans la lignée S46-21.

Exemule 12: Inoculation de Mantes de tabac par Pnn Une méthode d'inoculation caulinaire du tabac par Ppn a été employée. Des plantes de tabac sauvages (lignées 46-8 WT et 49-10 WT) ou transgéniques, âgées de 12 semaines, ont été inoculées par application d'une pastille de mycélium sur la tige après section de la partie apicale de celle-ci (à environ un tiers du sommet)'avec une lame de rasoir. Les pastilles de mycélium provenaient de cultures en milieu gélosé âgées de 7 jours. Des plantes contrôle ont été traitées de manière identique, à l'exception de l'application de la pastille de mycélium, remplacée par une pastille de milieu stérile. Les tiges contrôle et inoculées ont été recouvertes d'un film d'aluminium pour préserver les tissus végétaux et le mycélium de la dessiccation.
Exemple 13: Observation et mesure des svmQtômes Les symptômes ont été observés et quantifiés 48 heures ou 72 heures après inoculation. Les tiges ont été sectionnées longitudinalement et la longueur des lésions a été
mesurée pour chaque demi-tige en cinq points équidistants, répartis sur toute la largeur de la section. La longueur de lésion utilisée pour chaque individu correspond à la moyenne de ces 10 mesures.
Exemple 14: Mesure de l'accumulation des transcrits LOXI et de l'activité
snécifaue LOX dans les tiges des lignées trans, épiques Tl La méthode retenue pour tester l'interaction entre le tabac et le microorganisme pathogène, Pp~, consiste à inoculer la tige par du mycélium de Pp~, après section de l'apex de la plante. En préambule à cette expérience, le niveau d'expression du transgène ainsi que l'activité spëcifique LOX des tiges des lignées transgéniques S46-21, S46-26 et S49-18 ont ëté comparés à ceux observés chez les lignées parentales 46-8 WT et 49-10 WT.
Pour chaque lignée, des ARNs totaux ont été préparés à partir d'un pool de 3 morceaux de tige provenant chacun d'une plante indépendante. Le résultat de l'hybridation avec une sonde LORI radiomarquée confirme l'accumulation des transcrits LOX dans les tiges des lignées transgéniques S46-21, S46-26 et S49-18 alors qu'aucun transcrit LOX n'est détecté dans les lignées parentales 46-8 WT et 49-10 WT. L'activité spécifique LOX a également été
mesurée dans cet organe à partir d'extraits enzymatiques concentrés et dialysés. L'analyse a été réalisée au spectrophotomètre en mesurant, à 234 nm, l'apparition des hydroperoxydes d'acide gras. Pour chaque lignée étudiée, 3 mesures indépendantes ont été
réalisées. Les résultats obtenus, rassemblés dans un histogramme (Fig. 2), indiquent que l'activité
spécifique LOX mesurée dans les lignées transgéniques S46-21, S46-26 et S49-18 est de 1,8 à 5 fois plus importante que le niveau d'activité mesuré dans les lignées parentales 46-8 WT
et 49-10 WT. En outre, ces niveaux d'activité atteignent 25 % (S46-21) et 70 %
(S49-18) du niveau d'activité LOX mesuré dans des cellules de tabac élicitées pendant 24 heures (353,8 nkat.mg 1 protéine, donnée non montrée). Cette analyse confirme donc que l'expression constitutive du transgène LOX ainsi que l'augmentation de l'activité LOX
mesurées dans les plantes transgéniques caractérisent également les tiges.
Exemple 15: Analyse de l'interaction entre Pph et les lunées transgéniques Tl ayant une activité LOX constitutive Afin d'examiner les conséquences de l'expression constitutive LOXI chez les lignées transgéniques S46-21, S46-26 et S49-18 sur leur interaction avec Ppn, des plantes de ces lignées, âgées de 12 semaines, ont été inoculées par cet agent pathogène au niveau des tiges. Les symptômes obtenus après inoculation par une race virulente de Pph ont été
comparés à ceux observés au cours d'une interaction compatible mettant en jeu la lignée parentale correspondante. Ainsi, les lignées S46-21, S46-26 et 46-8 WT ont été
inoculées par la race 1 de Pph alors que les lignées S49-18 et 49-10 WT ont été
inoculées par la race 0 de Pph. Un témoin d'incompatibilité a été réalisé en inoculant la lignée 46-8 WT par la race 0 de Pp~. Les symptômes obtenus 48 heures ou 72 heures après l'inoculation ont été
observés sur des sections longitudinales des tiges et les lésions ont été
mesurées (figure 3).
Les symptômes observés sur les lignées parentales 46-8 WT et 49-10 WT sont typiques des interactions tabac l Ppn ; la lignée 46-8 WT, inoculée par la race 0 de Ppn, présente des lésions sèches et localisées caractéristiques d'une interaction incompatible.
En revanche, les longues lésions brunes macérées, observées dans les interactions 46-8 WT l Pph 1 et 49-10 WT l Ppn 0 traduisent la colonisation de la tige par l'agent pathogène et sont typiques d'interactions compatibles. En comparaison avec ces dernières, les lésions mesurées dans les lignées transgéniques, inoculées par la méme race virulente que celle utilisée avec la lignée parentale correspondante, sont nettement réduites. Chez les deux lignées transgéniques retenues, S46-21 et S46-26, l'inoculation par la race 1 du champignon ne provoque pas la formation des ces longues lésions macérées. On observe des lésions beaucoup plus réduites que dans le cas compatible mais également beaucoup moins macérées. Cette différence est également observée lorsque sont comparées l'interaction compatible 49-l OWT l Pp~ 0 (lignée sauvage sensible à Ppn 0) et l'interaction entre la lignée transgénique S49-18, qui est issue de la lignée 49-l OWT, et Pph 0. On observe que les lésions provoquées lors de l'interaction S46-26 / Pp~ 1 ressemblent davantage aux nécroses apparaissant lors d'une interaction incompatible (46-8 WT l Ppn 0), qu'aux lésions accompagnant la colonisation des tissus de la plante par le champignon dans le cas d'une 5 interaction compatible (46-8 WT l Pph 1). Par exemple, les lésions obtenues 48 heures après l'inoculation dans les interactions S46-21 / Ppn 1 et S46-26 / Pph 1 sont respectivement 3,4 et 2,4 fois plus courtes que celles mesurées dans l'interaction compatible 46-8 WT l Ppn 1. Pour la lignée S49-18, l'inoculation par la race 0 de Pph provoque des lésions 2 fois plus courtes que celles observées pour la lignée parentale 49-10 WT inoculée 10 par la même race du champignon. L'ensemble de ces résultats montre que l'expression constitutive LOX dans les lignées transgéniques s'accompagne d'une limitation nette de la progression du champignon.
Au delà de la réduction de taille des lésions observées dans les lignées transgéniques inoculées par une race virulente de Ppn, la nature de celle-ci est également modifiée. Les 15 lésions obtenues dans l'interaction S46-26 / Ppn 1 ne sont pas macérées comme dans l'interaction compatible 46-8 WT l Ppn 1 mais plutôt sèches comme dans l'interaction incompatible 46-8 WT l Ppn 0. Ceci montre que l'activité constitutive LOX
mesurée dans les lignées transgéniques S46-21, S46-26 et S49-18 participe activement à la résistance du tabac à Ppn.
Exemple 16: Analyse de l'interaction entre Ppn et les plantes transgéniques T1 ayant une activité LOX constitutive - innoculation racinaire Des plantes exprimant constitutivement la LOXl de tabac ont été obtenues précédemment. Dans un test d'inoculation caulinaire, ces plantes ont montré
une sensibilité
réduite à Phytophthora parasitica var. ~cicotiav~ae (Pph) en comparaison de la lignée sauvage dont elles sont issues. Le comportement de ces plantes dans un test d'inoculation racinaire a été étudié.
Des plantes de tabac (NicQtiaha tabaeum L.) sauvages de la lignée 46-8 (46-8 WT) caractérisée par la présence d'un locus de résistance à la race 0 de Ppv~ et des plantes de la lignée transgénique sens-lipoxygénase S46-21, dérivant de la lignée 46-8 WT, ont été
semées i~ vitro. Les graines de lignées sauvages ou transgéniques ont été
stérilisées et semées en boîtes de Pétri, sur milieu MS solide à raison d'environ 30 graines par boîte, en intercalant un disque de toile synthétique entre le milieu et les graines. Les boîtes ont été

placées en position inclinée pour orienter la croissance des racines. Après 3 semaines de croissance in vitro (hygrométrie 40%, température constante 25°C, lumière 60 ~mol.m a.s 1 16h, obscurité : 8h), les disques de toile supportant les plantes ont été
transférés dans de nouvelles boites de Pétri contenant du milieu MS liquide et des billes de verre, et les plantes ont été replacées en chambre de culture pendant 2 jours, avant inoculation.
Les souches de Ppn utilisées correspondent aux isolats 1156 (race 0) et 1452 (race 1). Le mycëlium de Pp~c a été cultivé à l'obscurité sur un milieu synthétique solide.
Une méthode d'inoculation racinaire du tabac par une suspension de zoospores de Ppn a été employée. Une colonie de mycélium de Ppn obtenue sur milieu V8 a été
placée en carence sur eau gélosée pendant 4 jours, puis les zoospores ont été libérées par choc froid (30 min à 15 °C puis 30 min à température ambiante) dans 10 ml d'eau.
Après comptage, la suspension de zoospores est ajustée à 4000 spores l ml. Pour chaque boîte, le milieu MS
liquide est retiré et remplacé par la suspension de spores. Les plantes ne présentant aucun symptôme de maladie sont comptées après 6 à 11 jours, et le pourcentage de survie (plantes dépourvues de symptômes l plantes totales) est calculé pour chaque combinaison.
Afin d'examiner les conséquences de l'expression constitutive LOXl chez le tabac sur l'interaction avec Pph, des plantes de la lignée transgénique S46-21, âgées de 3 semaines, ont été inoculées au niveau des racines par la race 1 virulente de cet agent pathogène. Le devenir des plantes inoculées a été comparé à celui de plantes sauvages de la lignée parentale correspondante 46-8 WT inoculées par cette même race (interaction compatible). Un témoin d'incompatibilité a été réalisé en inoculant la lignée 46-8 WT par la race 0 de Pph dans les mêmes conditions ainsi qu'un contrôle non inoculé. Les plantes ont été observées 6 ou 11 jours après inoculation dans une première expérience, et 7 jours après inoculation dans une deuxième expérience. Les plantes exemptes de symptômes de maladie ont été dénombrées et les pourcentages de survie ont été calculés (Tableau 1).
La lignée 46-8 WT, inoculée par la race 0 de Pp~, ne présente pas de symptômes et le pourcentage de survie est très voisin de 100%. En revanche, dans l'interaction 46-8 WT /
Ppn 1, la colonisation des plantes par l'agent pathogène se traduit par une mortalité
importante et un faible pourcentage de survie (20 à 24%). En comparaison avec cette interaction compatible, les plantes de la lignée transgénique sens LOX S46-21, inoculées par la même race virulente que celle utilisée avec la lignée 46-8 WT d' origine, présentent un pourcentage de survie beaucoup plus élevé , et ceci dans deux expériences indépendantes (taux de survie 80 à 88 %). L'ensemble de ces résultats confirme que l'expression constitutive LOX chez le tabac s'accompagne d'une diminution remarquable de la sensibilité à Ppn .
Tableau 1. Pourcentage de survie des plantes sauvages ou transgéniques sens-LOX, après inoculation avec la race 1 virulente de Pph , et comparaison avec l'interaction incompatible 46-8 WT / race 0 Nombre Taux de survies total de EXPERIENCE N1 J6 Jl l plantes 46-8 WT l Pp~ 0 (incompatible)n=58 100 % 100 46-8 WT l Pph 1 (compatible)n=55 24.0 20.0 %

S46-21 ! Pptz 1 n--54 88.8 88.8 %

46-8 WT contrle n=47 95.7 46-8 WT l Ppn 1 (compatible) n=82 21.9 S46-21 / Pp~t 1 n=65 80.0 a Taux de survie = % nombre de plantes sans symptômes de maladie / nombre total de plantes Références Bibliographiques 1. Brash, A. R., Ingram, C. D. & Harris, T. M. (1987) Analysis of a specific oxygenation reaction of soybean lipoxygenase-1 with fatty acids esterified in phospholipids, Biochemistry 26, 5465-5471.
2. Maccarrone, M., van Aarle, P. G., Veldink, G. A. & Vliegenthart, J. F.
(1994) In vitro oxygenation of soybean biomembranes by lipoxygenase-2, Biochim. Biophys.
Acta 1190, 164-169:
3. Feussner, L, Bachmann, A., Hohne, M. & Kindl, H. (1998) All three acyl moieties of trilinolein are efficiently oxygenated by recombinant His-tagged lipid body lipoxygenase in vitro, FEBS Lett. 431, 433-436.
4. Blée, E. (1998) Phytooxylipins and plant defense reactions, Prog. Lipid Res. 37, 33-72.
5. Rosahl, S. (1996) Lipoxygenases in plants - their role in development and stress response, Z. Naturforsch., C: Biosci. 51, 123-138.

6. Hornung, E., Walther, M., Kuhn, H. & Feussner, I. (1999) Conversion of cucumber linoleate 13-lipoxygenase to a 9-lipoxygenating species by site-directed mutagenesis, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 4192-4197.

7. Kuhn, H. & Thiele, B. J. (1999) The diversity of the lipoxygenase family.
Many sequence data but little information on biological significance, FEBS Lett 449, 7-11.

8. Galliard, T. & Chan, H. W. S. (1980) in The Biochemistry of Plants A
comprehensive treatise, ed. Stumpf, P. I~. (Academic Press, INC, New York), Vol. 4, pp.
131-161.

9. Slusarenko, A. J. (1996) in Lipoxygenase and lipoxygenase pathway enzymes, ed.
Piazza, G. J. (AOCS Press, Champain, Illinois), pp. 176-197.

10. Croft, K. P. C., Jüttner, F. & Slusarenko, A. J. (1993) Volatile products of the lipoxygenase pathway evolved from Phaseolus vulgaris (L.) leaves inoculated with Pseudomonas syringae pv. phaseolicola, Plant Physiol. 101, 13-24.

11. Bate, N. J. & Rothstein, S. J. (1998) C6-volatiles derived from the lipoxygenase pathway induce a subset of defense-related genes, Plant J. 16, 561-569.

12. Reymond, P. & Farmer, E. E. (1998) Jasmonate and salicylate as global signals for defense Bene expression, Curent Opinion in Plant Biology 1, 404-411.

13. McConn, M., Creelman, R. A., Bell, E., Mullet, J. E. & Browse, J. (1997) Jasmonate is essential for insect defense in Arabidopsis, Proc. Natl. Acad.
Sci. U. S. A. 94, 5473-5477.

14. Staswick, P. E., Yuen, G. Y. & Lehman, C. C. (1998) Jasmonate signaling mutants of Arabidopsis are susceptible to the soif fungus Pythium irregulare, Plant J.

15, 747-754.
15. Howe, G. A., Lightner, J., Browse, J. & Ryan, C. A. (1996) An octadecanoid pathway mutant (JLS) of tomato is compromised in signaling for defense against insect attack, Plant Cell 8, 2067-2077.

16. Itoh, A. & Howe, G. A. (2001) Molecular cloning of a divinyl ether synthase Identification as a CYP74 cytochrome P-450, J. Biol. Chem. 276, 3620-3627.

17. Weber, H., Chetelat, A., Caldelari, D. & Farmer, E. E. (1999) Divinyl ether fatty acid synthesis in late blight-diseased potato leaves, Plant Cell 1 l, 485-494.

18. Schweizer, P., Felix, G., Buchala, A., Muller, C. & Metraux, J. P. (1996) Perception of free cutin monomers by plant tells, Plant J. 10, 331-341.

19. Rickauer, M., Fournier, J., Pouénat, M. L., Berthalon, E., Bottin, A. &
Esquerre-Tugaye, M. T. (1990) Early changes in ethylene synthesis and lipoxygenase activity during defense induction in tobacco tells, Plaht Physiology ahd Biochemistry 28, 647-653.

20. Fournier, J., Pouénat, M. L., Rickauer, M., Rabinovitch-Chable, H., Rigaud, M.
& Esquerré-Tugayé, M. T. (1993) Purification and characterisation of elicitor-induced lipoxygenase in tobacco tells, Plaht J. 3, 63-70.

21. Véronési, C., Fournier, J., Rickauer, M., Marolda, M. & Esquerré-Tugayé, M.
T. (1995) Nucleotide sequence of an elicitor-induced tobacco lipoxygenase cDNA
(Genbank X84040), Plant Physiol. 108, 1342.

22. Véronési, C., Rickauer, M., Fournier, J., Pouénat, M. L. & Esquerré-Tugayé, M. T. (1996) Lipoxygenase gene expression in the tobacco-Phytophthora parasitica uicotiauae interaction, Plant Physiol. 112, 997-1004.

23. Koch, E., Meier, B. M., Eiben, H. G. & Slusarenko, A. J. (1992) A
lipoxygenase from leaves of tomato (Lycopersicum esculentum Mill) is induced in response to plant pathogen Pseudomouas, Plant Physiol. 99, 571-576.

24. Peng, Y. L., Shirano, Y., Ohta, H., Hibino, T., Tanaka, K. & Shibata, D.
(1994) A novel lipoxygenase from rite. Primary structure and specific expression upon incompatible infection with rite blast fungus, J. Biol. Chem. 269, 3755-3761.

25. Kolomiets, M. V., Chen, H., Gladon, R. J., Braun, E. J. & Hannapel, D. J.
(2000) A leaf lipoxygenase of potato induced specifically by pathogen infection, Plant Physiol. 124, 1121-1130.

26. Véronési, C. (1995) (Université Paul Sabatier - Toulouse III, Toulouse), pp. 90.

27. Villalba Mateos, F., Rickauer, M. & Esquerré-Tugayé, M. T. (1997) Cloning and characterization of a cDNA encoding an elicitor of Phytophthora parasitica var. nicotiahae that shows cellulose-binding and lectin-like activities, Mol. Plant-Microbe Interact. 10, 1045-1053.

28. Mercier, L., Lafitte, C., Borderies, G., Briand, X., Esquerre-Tugaye, M.
T. &
Fournier, J. (2001 ) The algal polysaccharide carrageenans tan act as an elicitor of plant defence, The New Phytologist 149, 43-51.

29. Rickauer, M., Brodschelm, W., Bottin, A., Véronési, C., Grimai, H. &
Esquerré-Tugayé, M. T. (1997) The jasmonate pathway is involved differentially in the regulation of different defence responses in tobacco tells, Planta 202, 155-162.

30. Rancé, I. (1997) (Université Paris XI - Orsay), pp. 111.

31. Rancé, L, Fournier, J. & Esquerré-Tugayé, M. T. (1998) The incompatible interaction between Phytophthora parasitica var. nieotianae race 0 and tobacco is suppressed in transgenic plants expressing antisense lipoxygenase sequences, Proc. Natl.
Acad. Sci. U. S. A. 95, 6554-6559.

32. Rustérucci, C., Montillet, J. L., Agnel, J. P., Battesti, C., Alonso, B., Knoll, A., Bessoule, J. J., Etienne, P., Suty, L., Blein, J. P. & Triantaphylides, C.
(1999) Involvement of lipoxygenase-dependent production of fatty acid hydroperoxides in the development of the hypersensitive cell death induced by cryptogein on tobacco leaves, J.
Biol. Chem. 274, 36446-36455.

33. G~bel, C., Feussner, L, Schmidt, A., Scheel, D., Sanchez-Serrano, J., Hamberg, M. & Rosahl, S. (2001) Oxylipin profiling reveals the preferential stimulation of the 9-5 lipoxygenase pathway in elicitor-treated potato cells, .J. Biol. Chem. 276, 6267-6273.

34. Royo, J., Leon, J., Vancanneyt, G., Albar, J. P., Rosahl, S., Ortego, F., Castanera, P. & Sanchez-Serrano, J. J. (1999) Antisense-mediated depletion of a potato lipoxygenase reduces wound induction of proteinase inhibitors and increases weight gain of insect pests, Proc. Natl. Aead. Sci. U. S. A. 96, 1146-1151.
10 35. Deng, W., Grayburn, W. S., Hamilton-Kemp, T. R., Collins, G. B. &
Hildebrand, D. F. (1992) Expression of soybean-embryo lipoxygenase 2 in transgenic tobacco tissus, Planta 187, 203-208.
36. Hanse, B., Weichert, H., Hohne, M., Kindl, H. & Feussner, I. (2000) Expression of cucumber lipid-body lipoxygenase in transgenic tobacco: lipid-body lipoxygenase is 15 correctly targeted to seed lipid bodies, Planta 210, 708-714.
37. Bell, E., Creelman, R. A. & Mullet, J. E. (1995) A chloroplast lipoxygenase is required for wound-induced jasmonic acid accumulation inArabidopsis, Pros.
Natl. Acad.
Sci. U. S. A. 92, 8675-8679.
38. Maccarrone, M., Hilbers, M. P., Veldink, G. A., Vliegenthart, J. F. &
Finazzi 20 Agro, A. (1995) Inhibition of lipoxygenase in lentil protoplasts by expression of antisense RNA, Biochim. Biophys. Acta 1259, 1-3.
39. Grechkin, A. (1998) Recent developments in biochemistry of the plant lipoxygenase pathway, Pr~og. Lipid Res. 37, 317-352.
40. Laudert, D., Pfannschmidt, U., Lottspeich, F., Hollander-Czytko, H. &
Weiler, 25 E. W. (1996) Cloning, molecular and functional characterization ofA~abidopsis thaliana allene oxide synthase (CYP 74), the first enzyme of the octadecanoid pathway to jasmonates, Plant Mol. Biol. 31, 323-335.
41. Bats, N. J., Sivasankar, S., Moxon, C., Riley, J. M., Thompson, J. E. &
Rothstein, S. J. (1998) Molecular characterization of anArabidopsis Bene encoding 30 hydroperoxide lyase, a cytochrome P-450 that is wound inducible, Plant Physiol. 117, 1393-1400.
42. Howe, G. A., Lee, G. L, Itoh, A., Li, L. & DeRocher, A. E. (2000) Cytochrome P450-dependent metabolism of oxylipins in tomato. Cloning and expression of allene oxide synthase and fatty acid hydroperoxide lyase, Plant Physiol 123, 711-24.
43. Helgeson, J. P., Kemp, J. D., Haberlach, G. T. & Maxwell, D. P. (1972) A
tissus culture system for studying disease resistance : the black shank disease in tobacco callus culture, Phytopath. 62, 1439-1443.
44. Rancé, L, Tian, W. Z., Mathews, H., De Kochko, A., Beachy, R. N. &
Fauquet, C. M. (1994) Partial dessication of mature embryo-derived calli, a simple treatment that dramatically enhances the regeneration ability of indica rice., Plant Cell Report 13, 647-651.
45. Hendrix, J. W. & Apple, J. L. (1967) Stem resistance to Phytophthora parasitica var. nicotianae in tobacco derived from Nicotiana longiflora and Nicotiana plumbaginifolia, Tobacco Science 11, 148-150.

46. Keen, N. T. (1975) Specific elicitors of plant phytoalexin production :
determinants of race specificity in pathogens?, Science 187, 74-75.
47. Holsters, M., de Waele, D., Depicker, A., Messens, E., van Montagu, M. &
Schell, J. (1978) Transfection and transformation of Agrobacterium tumefaciens, Mol. Gen.
Genet. 163, 181-187.
48. Horsch, R. B., Fry, J. E., Hoffmann, N. L., Eicholtz, D., Rogers, S. G. &
Fraley, R. T. (1985) A simple and general method for transferring genes into plants, Science 227, 1229-1231.
49. Dellaporta, S. L., Wood, J. & Hicks, J. B. (1983) A plant DNA
minipreparation version IL, Plant Mol. Biol. Rep. 1, 19-21.
50. Sambrook, J., Fritsh, E. F. & Maniatis, T. (1989) Molecular cloning : a laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, New-York).
51. Caldelari, D. & Farmer, E. E. (1998) A rapid assay for the coupled cell free generation of oxylipins, Phytochemistry 47, 599-604.
52. Bradford, M. M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Anal.
Biochem. 72, 248-254.
53. Seo, H. S., Song, J. T., Cheong, J.-J., Lee, Y.-H., Lee, Y.-W., Hwang, L, Lee, J.
S. & Choi, Y. D. (2001) Jasmonic acid carboxyl methyltransferase: A key enzyme for jasmonate-regulated plant responses, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S A. 98, 4788-4793.

LISTE DE SEQUENCES
<110> RHOBIO
<120>
<130> PM01021 G1 <140>
<141>
<150> FR O1 07470 <151> 2001-06-07 <160> 6 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 862 <212> PRT
<213> Nicotiana tabacum <300>
<308> X84040 <400> 1 Met Phe Leu Glu Lys Ile Val Asp Ala Ile Thr Gly Lys Asp Asp Gly Lys Lys Val Lys Gly Thr Val Val Leu Met Lys Lys Asn Val Leu Asp Phe Thr Asp Ile Asn Ala Ser Val Leu Asp Gly Val Leu Glu Phe Leu

35 40 45 Gly Arg Arg Val Ser Leu Glu Leu Ile Ser Ser Val Asn Ala Asp Pro Ala Asn Gly Leu Gln Gly Lys Arg Ser Lys Ala Ala Tyr Leu Glu Asn Trp Leu Thr Asn Ser Thr Pro Ile Ala Ala Gly Glu Ser Ala Phe Arg Val Thr Phe Asp Trp Asp Asp Glu Glu Phe Gly Val Pro Gly Ala Phe Ile Ile Lys Asn Leu His Phe Ser Glu Phe Phe Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Val Pro Asn His Gly Lys Val His Phe Val Cys Asn Ser Trp Val Tyr Pro Ala Asn Lys Tyr Lys Ser Asp Arg Ile Phe Phe Ala Asn Gln Ala Tyr Leu Pro Ser Glu Thr Pro Asp Thr Leu Arg Lys Tyr Arg Glu Asn Glu Leu Val Thr Leu Arg Gly Asp Gly Thr Gly Lys Leu Glu Glu Trp Asp Arg Val Tyr Asp Tyr Ala Tyr Tyr Asn Asp Leu Gly Asp Pro Asp Lys Gly Gln Asp Leu Ser Arg Pro Val Leu Gly Gly Ser Ser Glu Tyr Pro Tyr Pro Arg Arg Gly Arg Thr Gly Arg Lys Pro Thr Lys Thr Asp Pro Asn Ser Glu Ser Arg Ile Pro Leu Leu Met Ser Leu Asp Ile Tyr Val Pro Arg Asp Glu Arg Phe Gly His Ile Lys Leu Ser Asp Phe Leu Thr Phe Ala Leu Lys Ser Ile Val Gln Leu Leu Leu Pro Glu Phe Lys Ala Leu Phe Asp Ser Thr His Asn Glu Phe Asp Ser Phe Glu Asp Val Leu Lys Leu Tyr Glu Gly Gly Ile Lys Leu Pro Gln Gly Pro Leu Leu Lys Ala Ile Thr Asp Ser Ile Pro Leu Glu Ile Leu Lys Glu Leu Leu Arg Ser Asp Gly Glu Gly Leu Phe Lys Tyr Pro Thr Pro Gln Val Ile Gln Glu Asp Lys Thr Ala Trp Arg Thr Asp Glu Glu Phe Gly Arg Glu Met Leu Ala Gly Val Asn Pro Val Ile Ile Ser Arg Leu Gln Glu Phe Pro Pro Lys Ser Lys Leu Asp Pro Lys Ile Tyr Gly Asn Gln Asn Ser Thr Ile Thr Arg Glu Gln Ile Glu Asp Lys Leu Asp Gly Leu Thr Ile Asp Glu Ala Ile Lys Thr Asn Arg Leu Phe Ile Leu Asn His His Asp Ile Leu Met Pro Tyr Leu Arg Arg Ile Asn Thr Ser Thr Asp Thr Lys Thr Tyr Ala Ser Arg Thr Leu Leu Phe Leu Gln Asp Asn Gly Thr Leu Lys Pro Ser Ala Ile Glu Leu Ser Leu Pro His Pro Asp Gly Asp Gln Phe Gly Ala Val Ser Lys Val Tyr Thr Pro Ala Asp Gln Gly Val Glu Gly Ser Ile Trp Gln Leu Ala Lys Ala Tyr Ala Ala Val Asn Asp Ser Gly Val His Gln Leu Ile Ser His Trp Leu Asn Thr His Ala Ala Ile Glu Pro Phe Val Ile Ala Thr Asn Arg Gln Leu Ser Ala Leu His Pro Ile Tyr Lys Leu Leu His Pro His Phe Arg Glu Thr Met Asn Ile Asn Ala Leu Ala Arg Gln Ile Leu Ile Asn Gly Gly Gly Leu Leu Glu Leu Thr Val Phe Pro Ala Lys Tyr Ser Met Glu Met Ser Ala Val Val Tyr Lys Asp Trp Val Phe Pro Glu Gln Ala Leu Pro Thr Asp Leu Ile Lys Arg Gly Val Ala Val Glu Asp Ser Ser Ser Pro Leu Gly Ile Arg Leu Leu Ile Gln Asp Tyr Pro Tyr Ala Val Asp Gly Leu Lys Ile Trp Ser Ala Ile Lys Ser Trp Val Thr Glu Tyr Cys Asn Tyr Tyr Tyr Lys Ser Asp Asp Ala Val Gln Lys Asp Thr Glu Leu Gln Ala Trp Trp Lys Glu Leu Arg Glu Glu Gly His Gly Asp Lys Lys Asp Glu Pro Trp Trp Pro Lys Met Gln Thr Val Gln Glu Leu Ile Asp Ser Cys Thr Ile Thr Ile Trp Ile Ala Ser Ala Leu His Ala Ala Val Asn Phe Gly Gln Tyr Pro Tyr Ala Gly Tyr Leu Pro Asn Arg Pro Thr Leu Ser Arg Asn Phe Met Pro Glu Pro Gly Ser Pro Glu Tyr Glu Glu Leu Lys Thr Asn Pro Asp Lys Val Phe Leu Lys Thr Ile Thr Pro Gln Leu Gln Thr Leu Leu Gly Ile Ser Leu Ile Glu Ile Leu Ser Arg His Ser Ser Asp Thr Leu Tyr Leu Gly Gln Arg Glu Ser Pro Glu Trp Thr Lys Asp Gln Glu Pro Leu Ser Ala Phe Ala Arg Phe Gly Lys Lys Leu Ser Asp Ile Glu Asp Gln Ile Met Gln Met Asn Val Asp Glu Lys Trp Lys Asn Arg Ser Gly Pro Val Lys Val Pro Tyr Thr Leu Leu Phe Pro Thr Ser Glu Gly Gly Leu Thr Gly Lys Gly Ile Pro Asn Ser Val Ser Ile <210> 2 <211> 3390 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle:
construction CaMV 35S-LOX
<220>
<221> promoter <222> (1)..(532) <223> promoteur CaMV 35S
<220>
<221> CDS
<222> (543)..(3131) <223> Séquence codante LOX1 de tabac <220>
<221> terminator <222> (3138)..(3390) <223> Terminateur nos <400> 2 ccatggagtc aaagattcaa atagaggacc taacagaact cgccgtaaag actggcgaac 60 agttcataca gagtctctta cgactcaatg acaagaagaa aatcttcgtc aacatggtgg 120 agcacgacac gcttgtctac tccaaaaata tcaaagatac agtctcagaa gaccaaaggg 180 caattgagac ttttcaacaa agggtaatat ccggaaacct cctcggattc cattgcccag 240 ctatctgtca ctttattgtg aagatagtgg aaaaggaagg tggctcctac aaatgccatc 300 attgcgataa aggaaaggcc atcgttgaag atgcctctgc~cgacagtggt cccaaagatg 360 gacccccacc cacgaggagc atcgtggaaa aagaagacct tccaaccacg tcttcaaagc 420 aagtggattg atgtgatatc tccactgacg taagggatga cgcacaatcc cactatcctt 480 cgcaagaccc ttcctcctat aaggaagttc atttcatttg gagaggacac gcggtaccca 540 aa atg ttt ctg gag aag att gtg gat gca atc aca ggg aaa gat gat 587 Met Phe Leu Glu Lys Ile Val Asp Ala Ile Thr Gly Lys Asp Asp gga aaa aag gta aaa gga aca gtg gtt ttg atg aag aaa aat gtt ttg 635 Gly Lys Lys Val Lys Gly Thr Val Val Leu Met Lys Lys Asn Val Leu gat ttt act gat att aat gcc tca gtt ctt gat gga gtt ctt gag ttc 683 Asp Phe Thr Asp Ile Asn Ala Ser Val Leu Asp Gly Val Leu Glu Phe ctt ggt cgg agg gtc tct ctc gag ttg atc agt tct gtt aat gct gat 731 Leu Gly Arg Arg Val Ser Leu Glu Leu Ile Ser Ser Val Asn Ala Asp cct gca aat ggt tta caa ggg aaa cgc agc aaa gca gca tat ttg gag 779 Pro Ala Asn Gly Leu Gln Gly Lys Arg Ser Lys Ala Ala Tyr Leu Glu S
aac tgg cta aca aat agc acc cca ata gca gca ggt gaa tca gca ttt 827 Asn Trp Leu Thr Asn Ser Thr Pro Ile Ala Ala Gly Glu Ser Ala Phe aga gtc aca ttt gat tgg gat gat gag gaa ttt gga gtt cca gga gca 875 Arg Val Thr Phe Asp Trp Asp Asp Glu Glu Phe Gly Val Pro Gly Ala ttc att atc aag aac ttg cat ttt agt gag ttc ttc ctc aag tca ctc 923 Phe Ile Ile Lys Asn Leu His Phe Ser Glu Phe Phe Leu Lys Ser Leu acc ctt gaa gat gtt cct aat cat ggc aaa gtt cat ttt gtc tgt aat 971 Thr Leu Glu Asp Val Pro Asn His Gly Lys Val His Phe Val Cys Asn tct tgg gtt tat cct gct aat aaa tat aag tca gat cgc atc ttc ttc 1019 Ser Trp Val Tyr Pro Ala Asn Lys Tyr Lys Ser Asp Arg Ile Phe Phe gcg aat cag gct tat cta cca agt gaa aca cca gac aca ttg cga aaa 1067 Ala Asn Gln Ala Tyr Leu Pro Ser Glu Thr Pro Asp Thr Leu Arg Lys tac aga gaa aat gaa tta gta acc tta aga gga gat gga act gga aag 1115 Tyr Arg Glu Asn Glu Leu Val Thr Leu Arg Gly Asp Gly Thr Gly Lys ctt gag gaa tgg gat aga gtt tat gac tat gct tac tac aat gac ttg 1163 Leu Glu Glu Trp Asp Arg Val Tyr Asp Tyr Ala Tyr Tyr Asn Asp Leu ggt gat cca gac aaa ggc caa gat ttg tca agg cct gtc tta gga gga 1211 Gly Asp Pro Asp Lys Gly Gln Asp Leu Ser Arg Pro Val Leu Gly Gly tct tct gag tac ccg tat cct cgt aga ggc agg aca ggc cgc aaa cca 1259 Ser Ser Glu Tyr Pro Tyr Pro Arg Arg Gly Arg Thr Gly Arg Lys Pro acc aaa aca gat cct aat tcc gag agc agg att cca ttg ctt atg agc 1307 Thr Lys Thr Asp Pro Asn Ser Glu Ser Arg Ile Pro Leu Leu Met Ser tta gac ata tat gtg cca agg gac gag cga ttt ggt cat ata aag ttg 1355 Leu Asp Ile Tyr Val Pro Arg Asp Glu Arg Phe Gly His Ile Lys Leu tca gac ttc ttg aca ttt gct ttg aaa tcc att gtg cag ttg ctt ctc 1403 Ser Asp Phe Leu Thr Phe Ala Leu Lys Ser Ile Val Gln Leu Leu Leu cct gag ttt aag gct ttg ttc gat agc acg cat aat gag ttt gat agt 1451 Pro Glu Phe Lys Ala Leu Phe Asp Ser Thr His Asn Glu Phe Asp Ser ttt gag gat gta ctt aaa ctg tat gaa gga gga atc aag ttg cct caa 1499 Phe Glu Asp Val Leu Lys Leu Tyr Glu Gly Gly Ile Lys Leu Pro Gln ggc cct ttg ttg aaa gcc att act gat agc att cct tta gag ata cta 1547 Gly Pro Leu Leu Lys Ala Ile Thr Asp Ser Ile Pro Leu Glu Ile Leu aaa gaa ctc ctt cga agt gat ggt gaa ggc cta ttt aag tac cca act 1595 Lys Glu Leu Leu Arg Ser Asp Gly Glu Gly Leu Phe Lys Tyr Pro Thr cct cag gtt att caa gag gat aaa act gca tgg agg acg gat gaa gaa 1643 Pro Gln Val Ile Gln Glu Asp Lys Thr Ala Trp Arg Thr Asp Glu Glu ttt ggg aga gaa atg ttg gcg gga gtc aat cct gtc ata atc agt aga 1691 Phe Gly Arg Glu Met Leu Ala Gly Val. Asn Pro Val Ile Ile Ser Arg ctc caa gaa ttc cct ccg aaa agc aag ttg gat cct aaa ata tat ggc 1739 Leu Gln Glu Phe Pro Pro Lys Ser Lys Leu Asp Pro Lys Ile Tyr Gly aac caa aac agt aca att acc aga gag cag ata gag gat aag ttg gat 1787 Asn Gln Asn Ser Thr Ile Thr Arg GIu Gln Ile Glu Asp Lys Leu Asp gga cta aca att gat gag gca atc aag act aac aga cta ttc ata ttg 1835 Gly Leu Thr Ile Asp Glu Ala Ile Lys Thr Asn Arg Leu Phe Ile Leu aac cat cat gat atc ctt atg cca tac ttg agg aga att aac acg tcg 1883 Asn His His Asp Ile Leu Met Pro Tyr Leu Arg Arg Ile Asn Thr Ser aca gac aca aaa acc tat gcc tca aga act ctg ctc ttc ttg caa gat 1931 Thr Asp Thr Lys Thr Tyr Ala Ser Arg Thr Leu Leu Phe Leu Gln Asp aat gga act ttg aag cca tca gca att gaa cta agc ttg cca cat cca 1979 Asn Gly Thr Leu Lys Pro Ser Ala Ile Glu Leu Ser Leu Pro His Pro gac gga gat caa ttt ggc gct gtt agc aaa gta tat aca cca gct gat 2027 Asp Gly Asp Gln Phe Gly Ala Val Ser Lys Val Tyr Thr Pro Ala Asp caa ggt gtt gaa ggt tct atc tgg cag ttg gcc aaa gcc tat gca gca 2075 Gln Gly Val Glu Gly Ser Ile Trp Gln Leu Ala Lys Ala Tyr Ala Ala gtg aat gat tcg ggc gtt cat caa ctc atc agt cac tgg ttg aat aca 2123 Val Asn Asp Ser Gly Val His Gln Leu Ile Ser His Trp Leu Asn Thr cat gca gcg ata gag cca ttc gtg atc gca aca aat agg caa cta agc 2171 His Ala Ala Ile Glu Pro Phe Val Ile Ala Thr Asn Arg Gln Leu Ser gcg ctt cac cct att tat aag ctt ctc cac cct cat ttc cgt gag acg 2219 Ala Leu His Pro Ile Tyr Lys Leu Leu His Pro Hïs Phe Arg Glu Thr atg aac ata aat gct tta gca aga cag atc ttg atc aac ggt ggt gga 2267 Met Asn Ile Asn Ala Leu Ala Arg Gln Ile Leu Ile Asn Gly Gly Gly ctt ctt gag ttg aca gtt ttt ccg gcc aaa tat tcc atg gaa atg tca 2315 Leu Leu Glu Leu Thr Val Phe Pro Ala Lys Tyr Ser Met Glu Met Ser gca gta gtt tac aaa gac tgg gtt ttc cct gaa caa gca ctt cct act 2363 Ala Val Val Tyr Lys Asp Trp Val Phe Pro Glu Gln Ala Leu Pro Thr gat ctc atc aaa aga gga gta gct gtt gag gac tcg agc tcc cca ctt 2411 Asp Leu Ile Lys Arg Gly Val Ala Val Glu Asp Ser Ser Ser Pro Leu ggc att cga tta ctg att cag gac tat cca tat gct gtt gat ggg ttg 2459 Gly Ile Arg Leu Leu Ile Gln Asp Tyr Pro Tyr Ala Val Asp Gly Leu aaaatt tggtcagca attaaaagt tgggtaact gaatactgc aactac 2507 LysIle TrpSerAla IleLysSer TrpValThr GluTyrCys AsnTyr tattac aaatcagat gatgcggtt caaaaagac actgaactc caagcc 2555 TyrTyr LysSerAsp AspAlaVal GlnLysAsp ThrGluLeu GlnAla tggtgg aaggaactc cgcgaagag ggacacggt gacaagaaa gatgag 2603 TrpTrp LysGluLeu ArgGluGlu GlyHisGly AspLysLys AspGlu ccttgg tggcctaaa atgcagaca gtgcaagaa ttgatagac tcttgc 2651 ProTrp TrpProLys MetGlnThr ValGlnGlu LeuIleAsp SerCys accatc acaatatgg atagcttca gcacttcat gcagcagtc aatttc 2699 ThrIle ThrIleTrp IleAlaSer AlaLeuHis AlaAlaVal AsnPhe gggcaa tacccttat gctggttat ctccctaat cgccctaca ttaagc 2747 GlyGln TyrProTyr AlaGlyTyr LeuProAsn ArgProThr LeuSer cgaaat ttcatgcca gagccagga agtcctgag tatgaagag ctcaag 2795 ArgAsn PheMetPro GluProGly SerProGlu TyrGluG1u LeuLys acaaat ccggataag gtattcctc aaaacaatc actcctcag ctgcag 2843 ThrAsn ProAspLys ValPheLeu LysThrIle ThrProGln LeuGln acactg cttggcatt tccctcata gagatcttg tcaaggcat tcttcg 2891 ThrLeu LeuGlyIle SerLeuIle GluIleLeu SerArgHis SerSer gataca ctttacctc gggcaaagg gaatcacct gaatggaca aaggat 2939 AspThr LeuTyrLeu GlyGlnArg GluSerPro G1uTrpThr LysAsp caagaa ccactttca gcttttgcg aggtttgga aagaagctg agtgat 2987 GlnGlu ProLeuSer AlaPheAla ArgPheGly LysLysLeu SerAsp atcgag gatcagatt atgcagatg aatgtcgat gagaaatgg aagaac 3035 IleGlu AspGlnIle MetGlnMet AsnValAsp GluLysTrp LysAsn agg tcg ggt cct gtt aaa gtt cca tac acc ttg ctc ttc ccc aca agt 3083 Arg Ser Gly Pro Val Lys Val Pro Tyr Thr Leu Leu Phe Pro Thr Ser gaa gga gga ctt act ggc aaa gga att cct aac agt gtg tca ata tag 3131 Glu Gly Gly Leu Thr Gly Lys Gly Ile Pro Asn Ser Val Ser Ile aactttcccg atctagtaac atagatgaca ccgcgcgcga taatttatcc tagtttgcgc 3191 gctatatttt gttttctatc gcgtattaaa tgtataattg cgggactcta atcataaaaa 3251 cccatctcat aaataacgtc atgcattaca tgttaattat tacatgctta acgtaattca 3311 acagaaatta tatgataatc atcgcaagac cggcaacagg attcaatctt aagaaacttt 3371 attgccaaat gtttgaacg 3390 <210> 3 <211> 30 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: Amorce sens <400> 3 gttatcaaac agtttaaaat gtttctggag 30 <210> 4 <211> 22 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: Amorce reverse <400> 4 tgatttaaag ttctatattg ac 22 <210> 5 <211> 20 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: Amorce F
<400> 5 ggccatggag tcaaagattc 20 <210> 6 <211> 19 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>

<223> Description de la séquence artificielle: Amorce R
<400> 6 ggtctggcat gaaatttcg 19

Claims (18)

1) Procédé pour diminuer la sensibilité des plantes aux maladies et aux agressions par des organismes pathogènes caractérisé en ce qu'il consiste à sur-exprimer une lipoxygénase dans lesdites plantes.

2) Procédé selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il consiste à sur-exprimer constitutivement une lipoxygénase dans lesdites plantes.

3) Procédé selon l'une des revendications 1-2 dans lequel ladite lipoxygénase a une activité
de 9-lipoxygénase.

4) Procédé selon fane des revendications 1-3 dans lequel ladite lipoxygénase est une lipoxygénase de plante.

5) Procédé selon l'une des revendications 1-4 dans lequel ladite lipoxygénase est une lipoxygénase de plante solanacée.

6) Procédé selon l'une des revendications 1-5 dans lequel ladite lipoxygénase est homologue à au moins 80 % à la lipoxygénase de la SEQ ID No.1.

7) Procédé selon la revendication 6 dans lequel ladite lipoxygénase est représentée à la SEQ ID No.1.

8) Procédé selon l'une des revendications 1-7 dans lequel ladite lipoxygénase est sur-exprimée par intégration dans le génome de ladite plante d'une cassette d'expression comprenant une séquence codant pour ladite lipoxygénase sous le contrôle d'un promoteur fonctionnel dans les plantes.

9) Procédé selon la revendication 8 dans lequel ledit promoteur est un promoteur constitutif dans les plantes.

10) Procédé selon la revendication 9 dans lequel ledit promoteur constitutif est le promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur.

11) Procédé selon fane des revendications 1-10 dans lequel ladite lipoxygénase est sur-exprimée dans les tiges, les feuilles et les racines desdites plantes.

12) Cassette d'expression fonctionnelle dans les cellules végétales et les plantes caractérisée en ce qu'elle comprend un promoteur ayant une activité constitutive dans les plantes contrôlant l'expression d'un polynucléotide codant pour une lipoxygénase homologue à
au moins 90 % à la lipoxygénase de la SEQ ID No. 1.

13) Cassette d'expression selon la revendication 12 dans laquelle ledit polynucléotide code pour une lipoxygénase ayant une activité 9-lipoxygénase.

14) Cassette d'expression selon l'une des revendications 12 ou 13 dans laquelle ledit polynucléotide code pour la lipoxygénase de la SEQ ID No.1.

15) Cassette d'expression selon fane des revendications 12-14 dans laquelle ledit promoteur est le promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur.

16) Vecteur caractérisé en ce qu'il comprend une cassette d'expression selon l'une des revendications 12-15.

17) Cellules végétales transformées caractérisées en ce qu'elles comprennent une cassette d'expression selon fane des revendications 12-15 et/ou un vecteur selon la revendication 16.

18) Plantes transformées caractérisées en ce qu'elles comprennent une cassette d'expression selon l'une des revendications 12-15, un vecteur selon la revendication 16 et/ou des cellules végétales transformées selon la revendication 17.