CA2331153A1 - Procede d'obtention de polysaccharides modifies - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne un procédé d'obtention de plantes produisant des polysaccharides modifiés (tels que de l'amidon ou du glycogène), ces polysaccharides modifiés extraits de ces plantes et les produits préparés à partir de ces polysaccharides modifiés. L'invention concerne également un procédé d'obtention d'amidon modifié ou de glycogène modifié dans lequel on met en contact un amidon ou un glycogène avec une enzyme .alpha.-1,4 glucanotransférase.

Description

Procédé d'obtention de polyrsaccharides modifiés La présente invention concerne un procédé d'obtention de plantes produisant des polysaccharides modifiés (tels que de l'amidon ou du s glycogène), ces polysaccharides modifiés extraits de ces plantes et les produits préparés à partir de ces polysaccharides modifiés.
L'amidon est le polyoside de stockage énergétique chez les végétaux. II constitue le principal apport calorique de l'alimentation animale et lo humaine et est également une source majeure de matière première végétale pour des utilisations non alimentaires. L'amidon est composé de deux fractions polysaccharidiques distinctes : l'amylose et l'amylopectine. L'amylose, qui représente la fraction minoritaire de l'amidon, est constitué de résidus glucose unis par des liaisons a-1,4, et présente moins de 1 % de ramifications.
ls L'amylopectine, qui représente la fraction majoritaire de l'amidon, est constituée de résidus glucose unis par des liaisons a-1,4, et présente environ 5% de ramifications, constituées par des résidus de glucose liés au polymère principal par une liaison a-1,6. La distribution asymétrique de la ramification de l'amylopectine est responsable de la croissance illimitée des molécules et par 2o conséquent des grains d'amidon, et rend également compte de la plupart des propriétés physico-chimiques de l'amidon.
La biosynthèse de l'amidon dépend d'une voie dont les étapes biochimiques principales sont la synthèse d'ADP-glucose suivie par le transfert de ce précurseur en position a-1,4 sur un glucane par des (ADP-glucose :1,4-«-2s D-glücane 4-a-D-glucosyl)transférases, le polymère formé étant ramifié par l'action des enzymes dites de ramification ou de « branchement » : les 1,4-«-D-glucane 6-«-D-(1,4-«-D-glucano)-transférases. La figure 1 annexée est un schéma simplifié du métabolisme de l'amidon jusqu'à présent connu de l'homme du métier.
3o Les a-1,4 glucanotransférases (ou 4-«-D-glucanotransférases) végétales connues sont communément désignées par "enzymes D" pour "disproportionating enzymes" ("enzymes disproportionnantes "). Elles catalysent le transfert de glucane d'une molécule 1,4-«-glucane vers une autre

2 (transglycosylation intermoléculaire). Les règles d'action de l'enzyme D sur des substrats oligosaccharidiques sont schématisées comme suit Schéma : Exemple d'activité disproportionnante par l'enzyme D
s sur le maltotriose Accepteur (n) Donneur (x) H Produit (n + + Donneur 2) -2 *G~G~GoH +'G~G~GoH H 'G~G~G~G-.GoH .'GoH

'GG~G~G-GoH +'G~G~GoH H 'G~G~G~G~G~G~GoH+"GoH

'G-GGoH . 'GG~G~G~G~G~G H 'G~G~G~G~G oH + 'G~G-G~G~G
oH

OH

'G~G-G-G~GoH +'G~G-G~G~GoH H 'G-G.-G-G~G~G-GoH+'G-.G-GoH

ls Le maltose ne peut servir de substrat donneur et seule une liaison à l'extrémité du rnaltotriose peut être attaquée. En outre, la première liaison du côté non-réducteur et l'avant-dernière liaison du côté réducteur sont résistantes à l'action de l'enzyme.
Takaha et al. ont rapporté au Congrès de l'AAB (Association of 2o Applied Biologists) qui s'est tenu du 6 au 8 avril 1998, à Edinburgh, UK, (congrès sur le thème : « production et utilisation de l'amidon ») que des pommes de terre sans enzyme D poussaient plus lentement que tes pommes de terre contrôles et que, malgré cela, la teneur en amidon présent dans les tubercules et sa composition apparaissaient normales en ce qui concerne 2s notamment l'aspect des grains d'amidon en microscopie optique ou étect~onique, les proportions en amylose et amylopectine, le poids moléculaire de l'amylopectine débranchée et le nombre et la longueur des ramifications a-1,6. Takaha et al. en ont conclu que l'enzyme D n'a pas un rôle direct sur les structures et les quantités d'amidon produit mais joue un rôle dans la 3o croissance de la plante et son développement, l'amylopectine et l'amylose servant de molécules donneuses pour le transfert de maltooligosaccharide vers le glucose, permettant ainsi la dislocation et la solubilisation des grains d'amidon (Takada et al, 1998).

3 De manière surprenante, les auteurs de la présente invention ont découvert que les a-1,4 glucanotransférases, et notamment les enzymes D
sont en fait impliquées dans ~la biosynthèse de l'amidon, en transférant des oligosaccharides sur un précurseur de l'amylopectine. Ces enzymes peuvent s en particulier transférer les oligosaccharides provenant du pool d'oligosaccharides produits in vivo par déramification du précurseur de l'amylopectine lors de la maturation de l'amylopectine. Elles peuvent notamment transférer les oligosaccharides pouvant contenir par exemple de 2 à 20, en particulier de 2 à 6, résidus de glucose. La figure 2 annexée présente io le rôle de l'enzyme D dans le cycle du métabolisme de l'amidon, tel que découvert par les auteurs de la présente invention.
Cette découverte a été mise à profit pour modifier, en fonction du taux d'enzyme a-1,4 glucanotransférase active présent, la distribution des is longueurs des chaînes de l'amylopectine, présent en particulier dans les organes de réserve des plantes. L'invention s'applique aussi au glycogène, présent en plus faible quantité que l'amylopectine dans les plantes mais que l'on peut trouver par exemple dans les grains de maïs doux, en permettant de la même façon la modification de la distribution de la longueur des chaînes de 2o glycogène.
La présente invention a donc pour objet l'utilisation d'un acide nucléique codant pour une enzyme a-1,4 glucanotransférase glucanotransférase ou une séquence antisens de ladite séquence codant pour 2s une enzyme a-1,4 glucanotransférase, pour modifier la distribution de la longueur des chaînes externes de l'amidon (à savoir de l'amylopectine et/ou de l'amylose) ou du glycogène.
La présente invention a plus particulièrement pour objet un procédé de modification de la distribution de la longueur des chaînes de 30 l'amylopectine d'un amidon ou des chaînes d'un glycogène dans lequel on augmente ou on diminue l'activité d'une enzyme a-1,4 glucanotransférase dans les cellules d'une plante de telle sorte que ladite plante produise un amidon modifié différant de l'amidon produit naturellement par les plantes par la

4 distribution de la longueur des chaînes de l'amylopectine ou produise un glycogène modifié différant du glycogène produit naturellement par la distribution de la longueur de ses chaînes externes.
s Selon un premier mode de réalisation de l'invention, on diminue le taux d'expression d'enzyme a-1,4 glucanotransférase endogène, de façon à
conduire à la production d'un amidon comprenant une amylopectine présentant un enrichissement en chaînes comportant moins de 6 résidus de glucose par rapport à un amidon produit naturellement. La diminution de l'expression d'une io enzyme a-1,4 glucanotransférase endogène peut être notamment réalisée selon le procédé comprenant les étapes consistant à
a) construire un vecteur d'expression comprenant une séquence nucléotidique antisens du gène codant pour ladite enzyme a-1,4 glucanotransférase endogène;
ls b) transformer une cellule de plante avec ledit vecteur d'expression ;
c) régénérer la plante à partir de la cellule transformée à
l'étape b, ladite plante transgénique ainsi obtenue produisant un amidon comprenant une amylopectine dont la distribution des longueurs de chaînes est 2o altérée, notamment dans le sens d'un enrichissement en chaînes comportant moins de 6 résidus de glucose.
De manière avantageuse, ladite cellule de plante transformée selon l'étape b) est également transformée par des séquences nucléotidiques antisens des gènes codant pour des enzymes affectant la répartition de la 2s longueur des oligosaccharides produits lors du métabolisme de l'amidon, telles que les phosphorylases et les amylases.
Une autre possibilité pour réduire l'activité de l'enzyme a-1,4 glucanotransférase dans les cellules des plantes est d'exprimer des ribozymes qui sont des molécules d'ARN qui agissent comme des enzymes catalysant 3o spécifiquement le clivage des transcrits codant pour l'enzyme l'enzyme a-1,4 glucanotransférase, par des techniques connues de l'homme du métier (EP
321 021 ).

s II est également possible d'obtenir une plante présentant une altération de l'expression d'enzyme a-1,4 glucanotransférase par le procédé
dit "transwitch" décrit dans W090/12084.
L'activité de l'enzyme a-1,4 glucanotransférase endogène peut s également être réduite par mutagénèse des cellules de plante soit par irradiation U.V ou par un agent mutagène chimique, soit par insertion de transposons. Les éléments transposables ont la capacité de perturber l'expression de gènes dans lesquels ils sont insérés et de générer des délétions, réarrangements, et mutations au locus cible (McClintock et al., l0 1950).
Une technique de mutagénèse par transposons qui peut être avantageusement utilisée est la mutagénèse par transposon Mutator confirmée' par un criblage en génétique inverse (Bensen et a I., 1995) (Das et al., 1995).
Cette technique met en oeuvre les étapes consistant à croiser une lignée is "Mutator" avec des hybrides des plantes d'intérêt puis à cribler les plantes F1 obtenues par PCR avec une amorce spécifique des transposons et une amorce spécifique de la séquence nucléotidique codant pour l'enzyme a-1,4 glucanotransférase. Les graines FZ obtenues à partir des plantes criblées F1 permettent d'obtenir des plantes dont le phénotype est alors analysé.
Selon un deuxième mode de réalisation de l'invention, on augmente le taux d'expression d'enzyme a-1,4 glucanotransférase dans la plante, de façon à conduire à la production d'un amidon comprenant une amylopectine présentant un enrichissement en chaînes comportant au moins 9 2s résidus de glucose par rapport à un amidon produit naturellement, ladite enzyme a-1,4 glucanotransférase étant identique à l'enzyme a-1,4 glucanotransférase endogène ou étant d'origine hétérologue.
L'augmentation du taux d'enzyme a-1,4 glucanotransférase peut être notamment réalisée selon le procédé comprenant les étapes consistant à
3o a) construire un vecteur d'expression comprenant une séquence nucléotidique codant pour une enzyme a-1,4 glucanotransférase, qui peut être une enzyme a-1,4 glucanotransférase identique à l'enzyme a-1,4 glucanotransférase endogène ou qui peut ëtre d'origine hétérologue ;
b) transformer une cellule de plante avec ledit vecteur d'expression ;
s c) régénérer la plante à partir de la cellule transformée à
l'étape b), ladite plante transgénique ainsi obtenue produisant un amidon comprenant une amylopectine dont la distribution des longueurs de chaînes est altérée, notamment dans le sens d'un enrichissement en chaînes comportant au moins 9 résidus de glucose.
lo De manière avantageuse, ladite cellule de plante transformée selon l'étape b) est également transformée par des séquences nucléotidiques codant pour des enzymes affectant la répartition de la longueur des oligosaccharides produits lors du métabolisme de l'amidon, telles que les phosphorylases et les amylases. De manière préférentielle, l'enzyme a-1,4 is glucanotransférase visée est une enzyme D.
Ladite séquence nucléotidique codant pour une enzyme a-1,4 glucanotransférase peut être d'origine hétérologue. Elle peut ainsi correspondre notamment à une enzyme choisie parmi l'enzyme D de la pomme de terre (Takaha et al, 1993) ou l'enzyme D de Chiamydomonas reinhardtü.
Est également compris dans l'invention un acide nucléique comprenant une séquence nucléotidique choisie parmi la séquence SEQ ID
n°
1, une séquence homologue et un fragment de cette séquence codant pour une protéine présentant une activité enzymatique d'a-1,4 glucanotransférase.
2s L'invention comprend encore les séquences complémentaires de la séquence SEQ ID n°1 ou de ses homologues et fragment, pouvant servir de séquences antisens dans le procédé de l'invention.
La séquence SEQ ID n° 1 représente un fragment d'ADN
génomique du gène codant pour l'enzyme D de Chiamydomonas reinhardtü.
3o Par "séquence nucléotidique homologue", on entend toute séquence nucléotidique qui diffère de la séquence SEQ ID n° 1 par substitution, délétion, etlou insertion d'un nucléotide ou d'un nombre réduit de nucléotides, à des positions telles que ces séquences nucléotidiques homologues codent pour des polypeptides homologues tels que définis ci-après.
De préférence, une telle séquence nucléotidique homologue est identique à au moins 75 % de la séquence SEQ ID n° 1, de préférence moins s 85 %, de préférence encore au moins 95 %.
De manière préférentielle, une telle séquence nucléotidique homologue hybride spécifiquement à la séquence complémentaire de la séquence SEQ ID n° 1, dans des conditions stringentes. Les paramètres définissant les conditions de stringence dépendent de la température à
laquelle l0 50% des brins appariés se séparent (Tm).
Pour les séquences comprenant plus de 30 bases, Tm est définie par la relation : Tm=81,5+0,41 (%G+C)+16,6Log(concentration en cations) 0,63(%formamide) -(600/nombre de bases) (Sambrook et al, Molecular Cloning, A laboratory manual, Cold Spring Harbor laboratory Press, 1989, is pages 9.54-9.62).
Pour les séquences de longueur inférieure à 30 bases, Tm est définie par la relation : Tm= 4(G+C) + 2 (A+T).
Dans des conditions de stringence appropriées, auxquelles les séquences aspéciflques n'hybrident pas, la température d'hybridation est 2o approximativement de 5 à 30°C, de préférence de 5 à 10°C en dessous de Tm, et les tampons d'hybridation utilisés sont de préférence des solutions de force ionique élevée telle qu'une solution 6xSSC par exemple.
Par « fragment nucléotidique », on entend tout fragment de la séquence SEQ 1D n° 1, ou des séquences nucléotidiques homologues de la 2s séquEnce SEQID n° 1, qui code pour un peptide ou une protéine présentant une activité enzymatique d'a-1,4 glucanotransférase, telle que définie précédemment.
La présente invention a également pour objet un vecteur de 3o clonage et/ou d'expression comprenant une séquence nucléotidique telle que définie précédemment.
La construction d'un vecteur d'expression mentionné ci-dessus est à la portée de l'homme du métier suivant les techniques standard. Ledit vecteur d'expression peut contenir une séquence nucléotidique antisens du gène codant pour ladite enzyme a-1,4 glucanotransférase endogène, selon le premier mode de réalisation de l'invention, ou une séquence nucléotidique codant pour une enzyme a-1,4 glucanotransférase, selon le deuxième mode s de réalisation de l'invention. La séquence nuciéotidique codant pour une enzyme a-1,4 glucanotransférase est associée aux éléments permettant son expression dans la plante, à savoir notamment un promoteur et un terminateur de transcription.
La transformation de cellules végétales peut être réalisée par io transfert des vecteurs susmentionnés dans les protoplastes, notamment après incubation de ces derniers dans une solution de polyéthylèneglycol en présence de cations divalents (Ca2+).
La transformation des cellules végétales peut également être réalisée par électroporation notamment selon la méthode décrite dans l'article Is de Fromm et al., 1986.
La transformation des cellules végétales peut également être réalisée par utilisation d'un canon à gène permettant la projection, à très grande vitesse, de particules métalliques recouvertes des séquences d'ADN
d'intérêt, délivrant ainsi des gènes à l'intérieur du noyau cellulaire, notamment 2o selon la technique décrite dans l'article de Sanford, (1988).
Une autre méthode de transformation des cellules végétales, est celle de la micro-injection cytoplasmique ou nucléaire.
Selon un mode de réalisation particulièrement préféré du procédé
de l'invention, les cellules végétales sont transformées par biolistique, c'est-à
2s dire par projection, au moyen d'un canon à particules, de microparticules recouvertes des séquences nucléotidiques à transférer (J. Finner, 1992).
Selon un autre mode de réalisation du procédé de l'invention, les cellules végétales sont transformées par un vecteur selon l'invention, ledit h8te cellulaire étant susceptible d'infecter lesdites cellules végétales en permettant 30 l'intégration dans le génome de ces dernières, des séquences d'ADN
d'intérêt initialement contenues dans le génome du vecteur susmentionné.
Avantageusement, l'hôte cellulaire susmentionné utilisé est Agrobacterium tumefaciens, notamment selon la méthode décrite dans l'article d'An et al., 1986, ou encore Agrobacterium rhizogenes, notamment selon la méthode décrite dans l'article de Jouanin et al., 1987.
De manière préférentielle, la transformation des cellules végétales est réalisée par le transfert de la région T du plasmide circulaire s extra-chromosomique inducteur de tumeurs Ti d'Agrobacterium tumefaciens, en utilisant un système binaire (Watson et al.).
Pour ce faire, deux vecteurs sont construits. Dans un de ces vecteurs, la région d'ADN-T a été éliminée par délétion, à l'exception des bords droit et gauche, un gène marqueur étant inséré entre eux pour permettre la io sélection dans les cellules de plantes. L'autre partenaire du système binaire est un plasmide Ti auxiliaire, plasmide modifié qui n'a plus d'ADN-T mais contient toujours les gènes de virulence vir, nécessaires à la transformation de la cellule végétale. Ce plasmide est maintenu dans Agrobacterium.
Parmi les terminateurs de transcription pouvant être utilisés, on is peut citer le terminateur polyA 35S du virus de la mosa'ique du chou-fleur (CaMV), décrit dans l'article de Franck et al., (1980), ou le terminateur polyA
NOS, qui correspond à la région en 3' non codante du gène de la nopaline synthase du plasmide Ti d'Agrobacterium tumefaciens souche à nopaline (Depicker et al., 1982).
2o Parmi les promoteurs de transcription pouvant être utilisés, on peut citer notamment - le promoteur 35S, ou avantageusement le promoteur constitutif double 35S (pd35S) du CaMV, décrits dans l'article de Kay et al., 1987 ;
- le promoteur PCRU du gène de la cruciférine de radis 2s permEttant l'expression des séquences associées uniquement dans les semences (ou graines) de la plante transgénique obtenue ;
- les promoteurs PGEA1 et PGEA6 correspondant à la région 5' non codante des gènes de la protéine de réserve de graines, GEA1 et GEA6, respectivement, d'Arabidopsis thaliana (Gaubier et al., 1993) et permettant une 3o expression spécifique dans les graines ;
- le promoteur chimérique super-promoteur PSP (Ni M et al., 1995), constitué de la fusion d'une triple répétition d'un élément activateur transcriptionnel du promoteur du gène de l'octopine synthase d'Agrobacterium i0 tumefaciens, d'un élément activateur transcriptionnel du promoteur du gène de mannopine synthase et du promoteur mannopine synthase d'Agrobacterium tumefaciens ;
- le promoteur active du riz suivi de l'intron active de riz (PAR-s IAR) contenu dans le plasmide pAct1-F4 décrit par Mc Elroy et al., 1991 ;
- le promoteur HMGW (High Molecuiar Weight Glutenine) d'orge ;
- le promoteur du gène de yzéine de mais (Przéine) contenu dans le plasmide py63, et permettant l'expression dans l'albumen des semences de maïs.
io Parmi les cellules végétales susceptibles d'être transformées conformément à la présente invention, on peut citer celles de la pomme de' terre, du blé, du mais et du riz.
La présente invention a également pour objet une plante ou partie is de plante telle que notamment la pomme de terre, le blé, le maïs ou le riz, produisant un amidon modifié différant de l'amidon produit naturellement par les plantes par la distribution des longueurs de ses chaînes externes ou produisant du glycogène modifié différant du glycogène produit naturellement par la distribution de la longueur de ses chaînes externes, ladite plante ou zo partie de plante étant obtenue par le procédé de l'invention tel que décrit précédemment.
Par « partie de plante », on entend notamment les organes de réserve naturellement riches en amidon, tels que les graines ou les tubercules, ou les organes naturellement riches en glycogène, par exemple les grains de 2s maïs doux. Par « partie de plante », on entend également les cellules de ladite plante.
L'invention concerne également un procédé d'obtention d'amidon modifié ou de glycogène modifié dans lequel on met en contact un amidon ou 3o un glycogène avec une enzyme a-1,4 glucanotransférase.
La présente invention a plus particulièrement pour objet un procédé d'obtention d'amidon modifié différant de l'amidon produit naturellement par les plantes par la distribution des longueurs de ses chaînes externes, dans lequel - on extrait l'amidon modifié à partir des plantes ou parties de plantes obtenues selon le procédé de l'invention. tel que décrit s précédemment.
- ou on met en contact un amidon, préalablement extrait de plantes ou parties de plantes puis solubilisé, avec une enzyme a-1,4 glucanotransférase, en présence de polysaccharides ou d'oligosaccharides éventuellement modifiés.
lo L'extraction de cet amidon est réalisée selon les techniques standard connues de l'homme du métier. La solubilisation de l'amidon est également connue de l'homme du métier et peut être réalisée par trempage et fractionnement du grain d'amidon (Whistler et al, (1967)), ou par exemple par chauffage. De manière alternative, on peut utiliser des enzymes destructurant ts l'amidon, telles que les amylases.
Selon un mode de réalisation de l'invention, on met en contact ledit amidon solubilisé avec une enzyme a-1,4 glucanotransférase, telle qu'une enzyme D, en présence de saccharides. Lesdits saccharides peuvent être en particulier des oligosaccharides modifiés chimiquement, de façon à modifier les 2o propriétés de l'amidon, par exemple sa digestibilité.
De manière avantageuse, on peut ajouter à l'enzyme a-1,4 glucanotransférase des enzymes affectant la répartition de la longueur des oligosaccharides produits lors du métabolisme de l'amidon, telles que les phosphorylases et les amylases.
La présente invention a également pour objet un procédé
d'obtention de glycogène modifié différant du glycogène produit naturellement (par les plantes ou par un organisme animal) par la distribution des longueurs de ses chaînes externes, dans lequel - on extrait le glycogéne modifié à partir des plantes ou parties de plantes obtenues selon le procédé de l'invention. tel que décrit précédemment.

_ WO 99/66056 PCT/FR99/01446 - ou on met en contact un glycogène (d'origine végétale ou animale) avec une enzyme a-1,4 glucanotransférase, en présence de polysaccharides ou d'oligosaccharides éventuellement modifiés.
s Ladite enzyme a-1,4 glucanotransférase, telle qu'une enzyme D, mise en contact avec l'amidon ou le glycogène, peut provenir de la même espèce de plante que celle dont on extrait l'amidon ou peut avoir une origine hétérologue. On peut en particulier choisir !'enzyme D parmi l'enzyme D de la pomme de terre (Takaha et al, 1993) ou l'enzyme D de Chlamydomonas lo reinhardtü de 62 kD telle que définie ci-après. De manière avantageuse l'enzyme D utilisée est thermostable.
L'enzyme D de Chlamydomonas reinhardtü est purifiée par le procédé comprenant les étapes consistant à
ls - centrifuger la souche Chlamydomonas reinhardfü;
- précipiter la fraction acellulaire au sulfate de protamine ;
- passer le surnageant obtenu à l'étape précédente sur une chromatographie d'échange d'anions ;
- soumettre la fraction non retenue à l'étape précédente à une 2o précipitation différentielle au sulfate d'ammonium ;
- soumettre le surnageant obtenu à l'étape précédente à une chromatographie de tamisage moléculaire ;
- concentrer par une chromatographie d'échange de cations le culot obtenu à l'étape précédente.
2s L'enzyme D de Chlamydomonas reinhardtü purifiée ainsi obtenue a un poids moléculaire de 62kD. Plus généralement, on peut utiliser, comme protéine présentant une activité enzymatique a-1,4 glucanotransférase, une protéine ou un peptide codé par un acide nucléique comprenant une séquence nucléotidique choisie parmi la séquence SEQ ID n° 1, une séquence 3o homologue ou un fragment de cette séquence.
La présente invention a également pour objet l'amidon modifié
différant de l'amidon produit naturellement par les plantes par la distribution _ WO 99/66056 PCT/FR99/01446 des longueurs de ses chaînes, ledit amidon modifié étant obtenu par le procédé de l'invention. En particulier l'amidon modifié obtenu par extraction et solubilisation de l'amidon de . plantes ou parties de plantes, puis mise en contact dudit amidon solubilisé avec une enzyme a-1,4 glucanotransférase, s éventuellement en présence de saccharides, comporte une amylopectine dont la distribution des longueurs des chaînes externes est modifiée par rapport à
un amidon produit naturellement.
La présente invention a également pour objet le glycogène modifié différant du glycogène produit naturellement (par exemple par les lo plantes, mais aussi du glycogène d'origine animale), par la distribution des longueurs de ses chaînes, ledit glycogène modifié étant obtenu par le procédé
de l'invention.
L'amidon modifié conformément à la présente invention peut être ls utilisé directement ou hydrolysé afin de produire des oligosaccharides d'intérêt (en particulier le glucose). L'obtention d'amidon modifié conformément à
l'invention peut permettre de diminuer les quantités d'enzymes nécessaires pour une telle hydrolyse.
Par ailleurs, l'amidon modifié conformément à l'invention peut être 2o utilisé lors de la fabrication de divers aliments, en particulier en tant qu'additif augmentant la viscosité ou favorisant la formation d'un gel.
L'amidon modifié conformément à l'invention peut également être utilisé dans de nombreuses industries : industrie du papier et du carton, industrie des adhésifs, industrie textile, industrie pharmaceutique (pour la 2s form~llation des médicaments), etc.
L'amidon modifié conformément à l'invention peut également subir d'autres modifications, en particulier des modifications chimiques telles qu'un traitement acide, une oxydation, une estérification, etc avant son utilisation.
3o La présente invention a également pour objet l'utilisation de cet amidon modifié ou de ce glycogène modifié pour la préparation de produits dérivés, notamment de produits alimentaires.

_ WO 99/66056 PCT/FR99/01446 La présente invention a également pour objet les produits ainsi préparés comprenant de l'amidon modifié différant de l'amidon produit naturellement par les plantes par la longueur de ses chaînes externes ou du glycogène modifié différant du glycogène produit naturellement par la longueur s de ses chaînes externes.
Les figures et exemples ci-après illustrent l'invention sans en limiter la portée.
lo LEGENDES DES FIGURES
La figure 1 représente un schéma simplifié du métabolisme de l'amidon jusqu'à présent connu de l'homme du métier.
ls Toutes les étapes décrites sont compartimentées dans le plaste.
O. Phosphoglucomutase D. ADP-glucose pyrophosphorylase O. Amidon synthétases solubles et liées ~. Enzymes de branchement 2o D. Phosphorylase ~. Amylases, enzymes de débranchement, maltases O. Hexokinase Glc=glucose ; Pi=phosphate inorganique La fi ure 2 représente un schéma simplifié de la synthèse 2s d'amylopectine, dans lequel est mis en évidence le rôle de l'enzyme D.
Toutes les étapes décrites sont compartimentées dans le plaste O.Conversion du G-6-P en G-1 P par la phosphoglucomutase plastidiaie ~.Synthèse du glycosylnucléotide précurseur ADP-glucose par 30 l'ADP-glucose pyrophosphorylase (AGPase) ~. Elongation par les amidons synthétases solubles (SS) ~. ramification par les enzymes de branchement (BE) ls ~. débranchement par l'isoamylase (DBE) et libération d'oligosaccharides (MOS) ~. réinsertion des oligosaccharides produits par débranchement par l'enzyme D.
s WSP=Polysaccharides solubles dans l'eau ;
MOS=Maltooligosaccharides; G-6-P= glucose-6-phosphate ; Glc=glucose.
Le coût énergétique d'épissage par le DBE et l'enzyme D décrite dans cette invention est de 2 ATP par glucane clivé et réintroduit dans l'amylopectine en ~ (WSP~~~). Ce coût découle de la réactivation du glucose lo produit par l'enzyme D en ADP-glucose. Le pointillé tracé à partir de WSP~~~
illustre la possibilité offerte au polysaccharide de reservir de substrat d'élongation tant que la structure requise pour l'insolubilisation dans le grain n'aura pas été atteinte. L'entrée et la sortie du cycle sont illustrées par les flèches en traits gras et sont constituées d'une part par la synthèse d'ADP-ls glucose et d'autre part par la cristallisation et finsolubilisation du polysaccharide à la surface du grain.
La synthèse d'amylose est postérieure à l'insolubilisation et se réalise exclusivement dans le granule.
La figure 3A représente la distribution des longueurs des 20 oligosaccharides solubles non débranchés accumulés par la souche mutante JV45J de Chlamydomonas reinhardtü.
La figure 3B représente la distribution de longueurs des chaînes de l'amylopectine débranchée de la souche Chlamydomonas reinhardtü
sauvage.
2s La fauve 3C représente la distribution de longueurs des chaînes de l'amylopectine débranchée de la souche mutante JV45J Chlamydomonas reinhardtü.
La figure 3D représente la distribution de longueurs des chaînes de l'amylopectine débranchée de maïs « waxy » avec l'enzyme D pure de 3o Chlamydomonas reinhardtü en l'absence d'oligosaccharides.
La figure 3E représente la distribution de longueurs du maltotriose incubé avec l'enzyme D pure de Chlamydomonas reinhardfü.

La figure 4 représente l'incorporation de maltooligosaccharides sur l'amylopectine de la souche sauvage de Chlamydomonas reinhardtü.
La fi ug re 5 représente la séparation de l'amylopectine et de l'amylose des amidons de JV45J (sta 11-1 ) et de 137C (wt) sur s chromatographie de filtration sur gel CL-2B. Le mutant JV45J est représenté
par l'amidon radiomarqué (DPM) et la souche 137C est représentée par fabsorbance.
EXEMPLES
lo Les auteurs de la présente invention ont étudié la biosynthèse de l'amidon à partir d'un modèle approprié : l'algue Chlamydomonas reinhardtü
(Buléon et al, 1997). En effet cet organisme unicellulaire stocke un amidon qui est identique à celui stocké dans l'albumen des céréales et contient en outre les mêmes enzymes de biosynthèse de l'amidon.
ls Les auteurs de la présente invention ont sélectionné un nouveau mutant de l'algue Chlamydomonas reinhardtü accumulant de petits oligosaccharides linéaires et présentant un taux de synthèse d'amidon réduit de 90% (Exemple 1 ).
L'amidon résiduel comporte une structure modifiée nouvelle 2o caractérisée par un enrichissement en amylose et par une amylopectine dont les chaînes ultra-courtes (environ 2, 3, ou 4 résidus de glucose) sont surabondantes relativement aux chaînes de longueur moyenne (environ de 9 à
18 résidus de glucose) (Exemples 2 et 3).
Les auteurs de la présente invention ont en outre montré que ce 2s mutant était dépourvu d'une protéine de 62kD normalement présente chez les souches sauvages de Chlamydomonas reinhardtü, ont identifié cette protéine comme étant une 4-a-D-glucanotransférase (enzyme D), et ont mis en évidence de nouvelles fonctions de cette enzyme D vis-à-vis des polysaccharides (Exemple 4).
3o Ces résultats peuvent être mis à profit pour obtenir des plantes transgéniques productrice de polysaccharides (amidon, glycogène) modifiés (Exemple 5).

Les auteurs de la présente invention ont en outre mis en évidence le rôle de l'enzyme D dans la dégradation de malto-oligosaccharides par la phosphorylase (Exemple 6).
Les auteurs de la présente invention sont par ailleurs parvenus à
s cloner les séquences codant pour l'enzyme D de Chlamydomonas reinhardtü
(Exemple 7).
Ils ont enfin montré que l'expression de la mutation pouvait varier en fonction des conditions physiologiques {Exemple 8).
lo Isolement du mutant sta 11 de Chlamydomonas reinhardtü
Sélection de la souche JV45J de Chlamydomonas reinhardtü_ ls Au cours d'une mutagenèse UV (12 % de survie) réalisée sur la souche sauvage de référence 137C de Chlamydomonas reinhardtü, 5.104 plages cellulaires carencées en azote ont été criblées par une méthode de vaporisation d'iode (Delrue et al., 1992). Toutes les souches renfermant moins de 20 % de la quantité normale d'amidon accumulée par la souche 137C sont 2o repérées par leur coloration jaune et ont été caractérisées. Un échantillon de cinq souches sauvages et sept mutants est inoculé en plage cellulaire sur un milieu carencé en azote. Les plages ont été vaporisées à deux reprises après cinq jours d'incubation en lumière vive continue. Les plages jaunes contiennent moins de 12 % de la quantité d'amidon accumulées par les plages noires. La 2s teints olive observée chez certaines plages peu colorées suggèrent l'existence d'un amidon résiduel enrichi en amylose. Parmi ces souches, ont été
sélectionnées celles qui affichaient une complémentation en trans avec des mutants porteurs de sta-1, sfa6-1 :: ARG7, sfa7-1::ARG7, sta5-1 qui sont défectueux pour les loci codant pour la grosse et la petite sous-unité de 30 l'AGPase (STA9 et STA6) pour l'isoamylase de 88 kDa (STA7) ou pour la phosphoglucomutase plastidiale (STAS). Seule une souche parmi les 5.104 colonies (JV45J) faisant preuve d'une réduction de 90 à 95 % de la quantité
d'amidon synthétisée en conditions d'accumulation (carence en azote) a été

retenue après cette sélection. Ce mutant a ensuite été croisé avec une souche sauvage et 257 produits de méiose ont respectivement classé en 119 souches de phénotype mutant pour 128 clones d'aspect sauvage.
Un nouveau type de mutant (JV45J), qui accumule 4 % de la s quantité normale en amidon, a ainsi pu être isolé. Le caractère responsable du phénotype défectueux se comporte comme un caractère récessif mendélien au vu de la ségrégation après croisement, et définit un nouveau locus génétique nommé STA11, puisque la mutation complémente en trans et recombine avec l'ensemble des défectuosités testées.
lo Caractérisation des polysaccharides du mutant sta91 ls Les polysaccharides présents dans les souches porteuses de STA11 ont été isolés. En plus de l'amidon granulaire, les mutants stall-9 accumulent une quantité équivalente (5 %) de glucanes solubles, les malto-oligosaccharides de petite taille (figure 3A).
La présence simultanée d'une fraction d'oligosaccharides et du 2o phénotype "pauvre en amidon" a été retrouvée dans toutes les souches portant la mutation sta 11-1 (n=50). La structure résiduelle de l'amidon granulaire a été
mesurée par différentes techniques incluant l'analyse d'une diffraction grand-angle aux rayons X , la microscopie électronique à transmission (TEM) et la microscopie électronique à balayage (SEM), la séparation de l'amylose et 2s l'amylopectine par chromatographie sur gel filtration, la RMN (Résonnance Magnétique Nucléaire) du proton et le débranchement enzymatique sur l'amylose et l'amylopectine ainsi purifiées.
1. L'amidon 4ranulaire 3o L'amidon granulaire et les glucanes solubles ont été analysés séparément. L'amidon dispersé dans le DMSO aqueux et délipidé par une précipitation avec quatre volumes d'éthanol a été resuspendu dans 10 mM

NaOH pour être ensuite fractionné par chromatographie de tamisage moléculaire sur gel de sépharose CL2B.
a) Composition en amylose et amlyopectine (filtration sur gel).
s La séparation de l'amylopectine et de l'amylose est opérée par gel filtration de la souche mutante JV45J et la référence sauvage 137C. L'amidon dissous dans 10 mM NaOH a été fractionné par chromatographie de tamisage moléculaire selon la méthode décrite par Delrue et al. (1992). Un échantillon de chaque fraction a été coloré à l'iode et le spectre complet du complexe lo polysaccharide-iode a été enregistré. Des dosages à l'amyloglucosidase ont révélé la présence de 30 % d'amylose (15 % pour la référence sauvage).
Relativement à la souche sauvage, famylopectine est caractérisée par une ~max du complexe polysaccharide-iode qui s'est accru de 20 à 30 nm (de 550 à
570-580 nm). Cette dernière caractéristique est retrouvée dans un grand ls nombre d'amidons enrichis en amylose.
Les profils de filtration sur gel décrits montrent un doublement de la quantité d'amylose chez le mutant par rapport au sauvage ainsi qu'une modification apparente de la distribution en longueur de chaînes de la fraction amylosique. Une nouvelle analyse de ségrégation de l'amylopectine et de 20 l'amylose sur chromatographie de filtration sur gel CL-2B a été réalisée à
partir de 500pg d'amidon de JV45J (sta11-1) marqué au '4C et 10 mg d'amidon de 137C. Les résultats (Fig. 5) tendent à confirmer les données de l'étude de co-ségrégation, c'est-à-dire une diminution de la longueur des chaînes d'amylose produites par la souche JV45J ; l'amylose apparaït donc comme plus 2s abondante et de moindre masse.
Un comptage radioactif et l'absorbance sont déterminés pour chaque fraction. L'élution de la colonne s'effectue dans de la soude 10 mM.
3o b) forme des granules et structure cristalline Les diffractogrammes des rayons X montrent un changement du réseau cristallin du type A sauvage de forte cristallinité vers un mélange de types A et B de cristallinités beaucoup plus faibles. La forme des granules est particulièrement altérée et leur taille globale est réduite. En fait, la souche sauvage présente globalement des grains à surface lisse tandis que le mutant présente des grains de taille plus réduite avec une surface de grains rugueuse et irrégulière.
s 2. Les alucanes solubles - malto-olic,~osaccharide depetite taille La fraction des glucanes solubles (WSP) a été soumise à une triple extraction au méthanol chloroforme. La phase aqueuse a été lyophilisée et le culot sec redissous dans un tampon et fractionné par chromatographie de io tamisage moléculaire sur colonne de TSK-HW-50 comme l'ont décrit Mouille et al., 1996. Contrairement aux fractions solubles (WSP) purifiées à partir de mutants déficients en isoamylase, aucun phytoglycogène ou autre-polysaccharide soluble de masse importante n'a été trouvé. Par contre, la fraction WSP accumulée par les mutants stal1 est constituée exclusivement ts par des oligosacharides peu ramifiés (moins de 1, 5 % de branchements) de faible masse (figure 3A).

2o Mise en évidence d'une modification de l'amytopectine.
Débranchement enzymatique à l'isoamylase et examen de la distribution de longueur de chaînes Les fractions amylose et amylopectine obtenues par 2s chromatographie de tamisage moléculaire ont ensuite subi un débranchement enzymatique à l'isoamylase suivi d'une séparation électrophorétique des chaînes débranchées. Les résultats illustrés par la figure 3 établissent la nouveauté de la structure présentés par l'amylopectine de la souche JV45J. En effet, l'amylopectine présente un accroissement en chaînes traditionnellement 3o absent de la structure.
Un marquage par l'APTS (acide 8-amino-1,3,6-pyrènetrisulfonique) a été effectué sur les extrémités réductrices avant de séparer les chaînes en fonction de leur longueur sur gel de séquence. Alors qu'aucun changement n'est détecté au niveau de la distribution des longueurs de chaînes de l'amylose, une modification significative de la distribution des très courtes longueurs de chaînes est observée pour l'amylopectine (figure 3C
comparée à figure 3B).
s La distribution de la longueur des chaînes de l'amylopectine des souches sauvage et mutante après débranchement à l'isoamylase, a été
confirmée par électrophorèse capillaire des glucanes marqués à l'APTS selon la méthode décrite par O'Shea et al., 1996. Une modification significative de la distribution des très courtes chaînes est observée chez le mutant JV45J, lo comparativement à la souche sauvage. Une analyse soustractive, dans laquelle le pourcentage différentiel de la masse totale de chaque oligosaccharide est obtenu par soustraction de la distribution de longueur de~
chaîne des amylopectines débranchées, confirme l'enrichissement trouvé dans les mutants de la gamme des glucanes extra-courts (DP 3, 4, 5 aux dépends ls de DP6 à DP11 ). Ces données confirment l'action de l'enzyme D in vivo sur la structure de l'amylopectine.

zo Nouvelles fonctions de l'enzyme D
1. Détection de la défectuosité enzvmologiaue dans les mutants et action de l'enzyme D sur les po~rsaccharides.
La détection de la défectuosité a été réalisée selon une technique 2s de zKmogramme sous conditions dénaturantes (Mouille et al., 1996). De plus, une étude enzymologique détaillée a été effectuée en extraits bruts et semi-purifiés pour toutes les enzymes connues susceptibles de participer à la biosynthèse de l'amidon.
Cette étude implique des mesures quantitatives et qualitatives 3o des activités enzymatiques, parallèlement à des caractérisations cinétiques et des analyses des profils d'élution sur colonnes Mono-Q échangeuse d'anion (chromatographie FLPC). Les enzymes testées sont les suivantes : ADP-glucose pyrophosphorylase, phosphoglucomutase, amidon synthétase soluble _ WO 99/66056 PCT/FR99/01446 I, amidon synthétase soluble II, amidon synthétase liée au granule, enzymes de branchement (deux types), enzymes de débranchement (pullulanase et isoamylase), phosphorylases et toutes les hydrolases de l'amidon qui peuvent être détectées dans des gels de zymogramme contenant de l'amidon. Aucune s différence qualitative ou quantitative de ces activités enzymatiques n'a co-ségrégé avec le gène mutant.
Lors de la réalisation de zymogrammes en conditions dénaturantes, l'absence d'une bande de 62 kD se colorant en rouge foncé à
l'iode a été visualisée dans les produits de méiose portant la mutation sta 11-to sur zymogramme en présence d'amidon ou d'amylopectine alors que cette bande de 62 kD apparaît distinctement chez les ségrégeants sauvages (n=75).
Selon la technique mise au point par Mouille et al., 1996), le polysaccharide~
d'une bande de gel a été élué, le produit a été soumis à une analyse RMN. Le spectre du proton de l'amylopectine incubée s'était considérablement modifiée.
is En fait, le signal bimodal du proton, initialement de 5,3 à 5,2 ppm a été
remplacé par un signa! monomodal à la même position de 5,2 ppm, dans les conditions standard de RMN.
2. Purification de l'en~me et activité de transfert de glucanes 2o Une purification nécessite 20 litres de culture d'une souche sauvage de Chlamydomonas reinhardtü en milieu TAP (Harris, 1989) pendant trois jours afin d'obtenir une densité cellulaire de 2 x 106 cellules par ml.
Après centrifugation à 3000 rpm pendant 10 minutes, le culot cellulaire est passé
deux fois à la presse de French et immédiatement congelé à -80°C. Cet extrait 2s brut décongelé est centrifugé 20 minutes à 1000 rpm à 4°C. Les protéines de l'extrait (350 à 500 mg) sont dosées par la méthode de Bradford (kit de dosage Bio-rad).
Le surnageant est précipité par de la protamine sulfate 5 % (40 girl par ml d'extrait 15 minutes dans la glace) puis centrifugé à 10000 rpm pendant 30 20 minutes à 4°C.
Le surnageant (200 à 400 mg de protéines} est injecté grâce à un programme de multi-injections sur une colonne échangeuse d'ions MonoQ

_ WO 99/66056 PCT/FR99/01446 (Pharmacia HR 10/10 d'un volume de 9 ml, débit : 2 ml.miri') équilibrée dans un tampon acétate de sodium 50 mM, DTT 2 mM (pH 6 par l'acide acétique).
La fraction non- retenue (40 à 70 mg) subit une première précipitation au sulfate d'ammonium 30 % (176 mg/ml) 45 minutes à 4°C
puis s est centrifugée à 1 000 rpm pendant 20 minutes.
Le surnageant (30 à 60 mg) est ensuite précipité à 50 % 45 minutes à 4°C (126 mg/ml) puis est centrifugé à 10000 rpm pendant 20 minutes.
Le culot (10 à 20 mg de protéines) est resuspendu dans 2 ml de io tampon acétate de sodium 50 mM, DTT 2 mM pH 6 puis injecté sur gel filtration S 100 (FPLC ; Pharmacia séphacryl 2,6 x 60 cm ; débit : 2 ml.min~~ ; volume de fraction : 2 ml ; support alkyl dextran ponté par du N,N' méthylène bisacrylamide ; gel sphérique d'un diamètre de 25 à 75 pm ; gamme de fractionnement : 1000 à 10000) équilibrée dans le même tampon. Les fractions is d'intérêt sont collectées 30 minutes après l'injection puis repérées par révélation de l'activité sur zymogrammes selon la technique décrite par Mouille et al., (1996). L'enzyme d'intérêt est retrouvée dans les fractions 14 à 26.
Ces fractions sont rassemblées et concentrées à l'aide d'une colonne échangeuse de cations UnoS12 commercialisée par Bio-Rad (gel d'un volume de 15 x 68 2o mm greffé de groupes d'acide sulfonique) dans un tampon acétate de sodium 50mM, DTT 2 mM. L'enzyme disproportionnante est éluée par un gradient continu de NaCI (tampon acétate de sodium 50 mM, NaCI 1 M) et l'enzyme est récupérée dans les fractions correspondant à l'élution par le NaCI 50 %.
Toutes les colonnes sont effectuées en FPLC sur un appareil 2s Pharmacia LCC-500.
L'enzyme pure a reproduit les effets observés sur l'amylopectine par RMN du proton. L'incubation d'amylopectine avec l'enzyme pure a conduit des changements importants dans !a distribution des chaînes longues de l'amylopectine (figure 3D). L'action sur l'amylopectine a pu être précisée par 3o débranchement du produit incubé avant et après traitement à la ~i-amylase.
Comme les ~i-amylases sont des enzymes processives qui digèrent sélectivement les chaînes extérieures des polysaccharides, le résultat obtenu montre que les modifications majeures sont restreintes aux chaînes _ WO 99/66056 PCT/FR99/01446 externes du polymère. II est important de noter qu'aucun oligosaccharide n'est libéré dans le processus alors que la quantité de liaisons a-1,6 reste constante.
L'enzyme de 62kD est donc une a-1,4 glucanotransférase dont la fonction est de cliver les liaisons a-1,4 présentes sur les chaînes externes du donneur s amylopectine pour les transférer aux extrémités non réductrices de chaînes voisines extérieures de l'accepteur. Dans les plantes, les seules a-1,4 glucanotransférases connues pour être présentes lors de la synthèse de l'amidon, sont communément appelées enzymes D. Elles sont connues pour agir sur des oligosaccharides solubles longs d'au moins trois résidus glucose io (maltotriose) pour donner des oligosaccharides de longueurs variables aux dépends de la formation du glucose. La réaction consiste en un clivage d'un glucane donneur et un transfert sur une chaîne récepteur.
L'action de l'enzyme de 62 kD identifiée a parallèlement été
testée sur le glucose, le maltose, le maltotriose, le maltotetraose, le is maltopentaose, le maltohexaose et le maltoheptaose : l'enzyme disproportionne avec succès tous les oligosaccharides plus longs que le maltose et le glucose, sur lesquels elle n'a aucune action. Ses effets sur le maltotriose ont été décrits à la figure 3E. Les très faibles quantités de maltose dans tous les cas confirment que l'enzyme obéit aux règles présentées 2o précédemment définissant l'action des enzymes disproportionnantes.
Le protocole de purification de l'enzyme D peut être modifié, par exemple selon la variante suivante Le surnageant obtenu après centrifugation de l'extrait brut tel que décrit à l'exemple 3 est précipité par de la protamine sulfate (50 NI de 2s protamine sulfate 10% par ml d'extrait 15 minutes dans la glace) puis centrifugé à 10000 rpm pendant 20 minutes à 4°C.
Le surnageant (200 à 400 mg de protéines) est ensuite injecté
grâce à un programme de multi-injections sur une colonne échangeuse d'anions MonoQ (Pharmacie HR10/10 d'un volume de 9 ml, débit : 2ml.min'') 3o couplée à une colonne échangeuse de cations UNO-S12 (BIO-RAD d'un volume de 12 ml, débit : 2 ml.min''). Ces deux colonnes sont équilibrées dans un tampon acétate de sodium 50mM, DTT 2mM (pH 6 par acide acétique).

_ WO 99/66056 PCT/FR99/01446 2s L'élution se fait par un palier de 30 mn à 5% NaCI. Les fractions d'intérêt sont recueillies puis repérées par révélation de l'activité sur zymogrammes amidon.
300 NI d'échantillon sont déposés sur colonne d'affinité
maltotriose (SIGMA : Maltotriose immobilisé sur de fagarose. Volume : 1 ml) s équilibrée dans un tampon acétate de Sodium 50mM, DTT 2mM (pH 6 par acide acétique). La colonne est lavée par 2 mi de ce même tampon et félution se fait par un tampon acétate de sodium 50 mM, NaCI 1 M.
Activit totale Activit spcifique nmol/min nmoUmin/mg avant colonne d'affinit92.1 2046 aprs colonne d'affinit13.9s 93000 Rendement Facteur de purification 15% 45%

io L'activité ainsi purifiée se manifeste à un pH optimum entre pH5 et pH7.5 et diminue de façon significative au-dessus de pH9.
3_. Incorporation d'oli4osaccharides sur les chaînes externes de giycoaene is L'incorporation de maltooligosaccharides marqués sur le glycogène, donne un exemple supplémentaire de l'activité de l'enzyme D mise en évidence sur l'amylopectine, avec la procédure du zymogramme. La co-élution de la bande à 62kD (enzyme-D) manifeste une activité enzymatique retrouvée dans les procédures zymogramme et tests quantitatifs de purification 2o de l'enzyme. Une coségrégation entre la présence des 3 activités (production de glucose à partir de maltotriose, modification de l'amylopectine et incorporation de glucanes débranchés dans le glycogéne) et l'allèle sauvage STA11 dans les individus issus des croisements entre les souches sauvage et mutante de Chlamydomonas a également été démontrée.
2s Pour la mise en évidence de l'incorporation de malto-oligosaccharides marqués de longueur contrôlée (DP1 : glucose à DP7 maltoheptaose), la procédure de zymogramme décrite à l'exemple 3 a été

suivie : 100 et 300 Ng d'extraits bruts de protéines ont été chargés sur des gels contenant du glycogène et mis à incuber séparément avec 2mM DP1 (glucose) à DP7 (maltoheptaose) ou sans malto-oligosaccharides (témoin négatif), pendant la nuit à température ambiante. L'apparition d'une bande à 62 kD avec s la longueur croissante du substrat donneur montre que l'efficacité de transfert sur les chaînes externes de glycogène augmente avec la longueur de la chaîne donneuse. Aucun marquage n'est observé lorsque le maltotriose est utilisé
comme substrat donneur, même à très forte concentration de substrat (20mM) et après une incubation prolongée (48h). Les glucanes plus longs que le io maltotetraose définissent donc le substrat actuel préféré pour la réaction d'incorporation. Ceux-ci seraient produits in vivo au cours de la maturation de la pré-amylopectine par les isoamylases.
Le système zymogramme mime assez bien la synthèse de polysaccharide à la surface du granule d'amidon en ce qu'il permet aux is oligosaccharides de diffuser librement dans un large volume de tampon tandis que le polysaccharide est retenu dans un petit volume du gel, là où se manifeste une forte activité enzymatique spécifique.
4. Nouvelle fonction polymérase de l'enzyme D.
2o Des oligosaccharides sont marqués radioactivement au '4C par débranchement in vivo de l'amylopectine marquée. II a été vérifié que la distribution de la longueur des chaînes dans le mélange des chaînes débranchées correspondait à celle présentée à la figure 3B.
L'incorporation des oligosaccharides dans l'amylopectine (figure 2s 4) on le glycogène de foie de lapin a été mesurée avec succès, à des concentrations physiologiques en maltooligosaccharides. En effet, l'enzyme D
a manifesté une activité polymérase très efficace sur le glycogène et sur famylopectine. Les substrats et produits de la réaction ont été séparés par chromatographie de tamisage moléculaire en gel de TSK-HW-50 (glycogène) 30 ou en sépharose CL2B.
L'incorporation du marquage des maltooligosaccharides sur famylopectine fournit un essai plus fiable sur l'activité de l'enzyme D
comparativement à la production de glucose.

_ WO 99/66056 PCT/FR99/01446 II a par ailleurs été mis én évidence que la polymérisation in vitro était localisée sur les chaînes externes de l'amylopectine. En effet, le signal de radioactivité incorporée dans le polysaccharide disparaît lorsque l'amylopectine qui a subi l'incorporation des oligosaccharides est mise en présence de ~i-s amylase, enzyme spécifique des chaînes externes de l'amylopectine.

Obtention de plantes de maïs transgéniques io A. Obtention et utilisation de cal de mais comme cible pour la transformation génétique.
La transformation génétique du maïs, quelle que soit la méthode employée (électroporation ; biolistique, microfibres, canon à particules), ts requiert généralement l'utilisation de cellules indifférenciées en divisions rapides ayant conservé une aptitude à la régénération de plantes entières. Ce type de cellules compose le cal friable ernbryogène (dit de type II) de maïs.
Ces cals sont obtenus à partir d'embryons immatures de génotype H1 II ou (A188 x B73) selon la méthode et sur les milieux décrits par 2o Armstrong (1994).Les cals ainsi obtenus sont multipliés et maintenus par repiquages successifs tous les quinze jours sur le milieu d'initiation.
Des plantules sont ensuite régénérées à partir de ces cals en modifiant l'équilibre hormonal et osmotique des cellules selon la méthode décrite par Vain et al (1989). Ces plantes sont ensuite acclimatées en serre où
2s elles~euvent être croisées ou autofécondées.
B. Utilisation du canon à particules pour la transformation génétique du maïs.
Le paragraphe précédent décrit l'obtention et la régénération des 30 lignées cellulaires à la transformation. On décrit ici une méthode de transformation génétique conduisant à l'intégration stable des gènes modifés dans le génome de !a plante. Cette méthode repose sur l'utilisation d'un canon à particules. Les cellules cibles sont des fragments de cals décrits dans le _ WO 99/66056 PCT/FR99/01446 paragraphe A. Ces fragments d'une surface de 10 à 20 mm2 ont été disposés, 4 heures avant bombardement, à raison de 16 fragments par boîte au centre d'une boîte de Pétri contenant un milieu de culture identique au milieu d'initiation, additionné de 0,2 M de mannitol + 0,2 M de sorbitol. Les plasmides s portant les séquences nucléotidiques à introduire telles que l'ADNc codant pour l'enzyme D de la pomme de terre (Takada et al., 1993) ou les séquences antisens obtenues à partir de cet ADNc sont purifiées sur colonne Qiagen, en suivant les instructions du fabricant. lls sont ensuite précipités sur des particules de tungsten (M10) en suivant le protocole décrit par Klein et al io (1987). Les particules ainsi enrobées sont projetées vers les cellules cibles à
l'aide du canon et selon le protocole décrit par J. Finner (1992).
Les boîtes de cals ainsi bombardés sont ensuite scellées à l'aide-de ~Scellofrais, puis cultivées à l'obscurité à 27°C. Le premier repiquage a lieu 24 heures après, puis tous les quinze jours pendant trois mois sur milieu is identique au milieu d'initiation additionné d'un agent sélectif. Les agents sélectifs utilisables consistent généralement en composés actifs de certains herbicides (~Basta, ~Roundup) ou certains antibiotiques (Hygromycine, kanamycine, ...).
On obtient après trois mois ou parfois plus tôt, des cals dont la 2o croissance n'est pas inhibée par l'agent de sélection, habituellement et majoritairement composés de cellules résultant de la division d'une cellule ayant intégré dans son patrimoine génétique une ou plusieurs copies du gène de sélection. La fréquence d'obtention de tels cals est d'environ 0,8 cal pour boîte bombardée.
2s Ces cals sont identifiés, individualisés, amplifés puis cultivés de façon à régénérer des plantules. Afin d'éviter toute interférence avec des cellules non transformées, toutes ces opérations sont menées sur des milieux de culture contenant l'agent sélectif.
Les plantes ainsi régénérées sont acclimatées puis cultivées en 3o serre où elles peuvent être croisées ou autofécondées.

Ç. Utilisation d'Avrobacterium tumefaciens pour la transformation génétique du maïs.
l_a technique utilisée est décrite par Ishida et al., 1996.
s Mise en évidence du rôle de l'enzyme D dans la dégradation de malto-oligosaccharides par la phosphorylase Dans la bactérie, il est suggéré que l'amylomaltase, une a-1,4 io glucanotranferase similaire à l'enzyme D, augmente la production de glucose 1-phosphate par la maltodextrine phosphorylase, en générant des glucanes assez longs (DP5) pour être utilisables par la phosphorylase (Boos et al.,~
1998). Une mesure de la production de glucose-1-phosphate à partir de maltotriose, maltotétraose, maltopentaose et maltoheptaose (2.5mM} en is présence de 100Ng d'extraits de souche sauvage (137C) et mutante stall-1 (JV45J) de Chlamydomonas, a mis en évidence une stimulation d'un facteur 5 au moins, en présence d'enzyme D, de la dégradation du maltotetraose et du maltotriose par la phosphorylase. Sachant que la production de glucose-1-phosphate à partir de glucane de longueur DP5 est retrouvée à la fois chez les 2o bactéries et les plantes, l'enzyme D pourrait également faciliter l'action de la phosphorylase chez les plantes.

2s Clonage des séquences codant pour l'enzyme D
Une analyse préliminaire de dosage de gènes dans des souches diploïdes et triploïdes, sauvage et mutante respectivement, a permis d'établir une corrélation entre le nombre d'allèles sauvages STA99 et la quantité
d'enzyme correspondante.
3o L'isolement de séquences génomiques codant pour l'enzyme D
de Chlamydomonas a suivi le protocole suivant : un alignement de séquences réalisé entre Soianum tuberasum, Streptococcus pneumoniae, Mycobacterium tuberculosis et Clostridium butyricum, a permis de choisir des oügonucléotides _ WO 99/66056 PCT/FR99/01446 correspondants aux régions conservées (régions 1 et 2), pour servir d'amorces à des réactions de PCR. Pour faciliter le clonage d'un éventuel fragment de PCR, une extension de 16 nucléotides contenant les séquences de restrictions de 3 enzymes différentes a été ajouté en 5' [EcoRl, Sac!!, NotIJ.

5 rgion 1 Rgion 2 .-.
P.G.P.Y.G.LG R.LD.H.F.R.G.F

Oligonuclotide dgnr correspondantOligonuclotide dgnr correspondant 5~[AGAATTCCGCGGCCGC]CCNGGYSC 5~[AGAATTCCGCGGCCGC]R.AA.RCCV

STAYGGYATYGG3~ GCRAAATGRTCRATVCG3~

Toutes les réactions de PCR ont été réalisées avec l'ADN
polymérase faq de chez GibcoBRL Life Technologies, couplée à un anticorps et qui ne devient active qu'après un passage de 3 minutes à 94°C.
io Les conditions optimales pour l'amplification spécifique de la région d'intérêt sont les suivantes: une concentration en MgCl2 de 3 mM et la séquence de programmation qui suit - 3 minutes à 94°C
- 45 secondes à 94°C
is - 30 secondes à 62°C
- 1 minute 30 secondes à 72°C
- répétition 35 fois des étapes 2 à 4 - 10 minutes à 72°C
- conservation à 4°C
2o Une bande d'environ 1,6 Kb a ainsi pu être amplifiée à partir d'ADN génomique.
Ce produit de PCR est extrait d'un gel TAE 0,$% selon le protocole "DNA Purification Kit" de PROLABO, et placé dans le site multiple de clonage du plasmide pBlueskipt II SK au site Notl. Une transformation de la 2s souche d'Escherichia coli XL1-Blue rendue compétente permet alors l'amplification du clone. Un séquençage rapide des 1,6 Kb (entre les primers T3 et T7) suivant la méthode de Sanger a alors été réalisé (SEQ ID
N°1 ).

_ WO 99/66056 PCT/FR99/01446 Selon un protocole adapté, le clonage chez le mutant sfall-1 de la région correspondant au gène de l'enzyme D peut être réalisé, pour déterminer la nature de la mutation conduisant à l'absence de la protéine dans s la cellule mutante. La mise en évidence de modifications allèle spécifique du profil de restriction de la souche mutée et l'étude de la coségrégation du polymorphisme de restriction et de la mutation chez les ségrégants d'un croisement entre une souche sauvage et une souche STA11 peuvent permettent de corréler définitivement le gène STA11 à l'enzyme D.
lo Expression conditionnelle de la mutation Une analyse comparative des souches sauvage et mutante ls sta11-1 en condition carencée en azote ou normale montre que l'expression du phénotype mutant stal1-1 est partiellement conditionnelle. Ceci indique que l'expressivité de la mutation sur le phénotype peut varier en fonction des conditions physiologiques pour un même organisme. II est possible que ces variations d'expressivité du phénotype se retrouvent d'une espèce végétale à
2o une autre. II est possible de trouver des conditions dans lesquelles la baisse de la quantité d'amidon ne se produit pas alors que des modifications phénotypiques sont observées (présence d'oligosaccharides, modification de la structure de l'amylopectine).
Le tableau ci-après présente les résultats obtenus sur les 2s phénotypes des souches sauvage et mutante lors de la synthèse de l'amidon de transition ou de stockage respectivement à partir de culture non carencée en azote (+N) et de culture carencée en azote (-N).

6 PCT/FR99/01446 Phénotype des souches sauvage et mutante lors de la synthèse de l'amidon de transition ou de stockage Les valeurs listées sont la moyenne de trois mesures séparées s dans une seule expérience.
Souche Gnotypepp Amidonb MOS Am ~,m~a /d +N -N +N -N +N -N +N -N

C023 + 566 560 1.2 13 0.011 0.018 1 .14 C065 + 570 542 0.4 24.7 0.007 0.001 2 15 C035 + 564 554 0.91 22.8 0.012 0.017 S 25 C029 stall-1576 570 1 1.7 0.45 0.45 7 38 C0137 stall-1572 564 2 0.83 0.3 0.17 10 25 C0214 stall-1575 562 0.31 0.78 0.2 0.2 12 24 a : Ap ~,max, longueur d'onde de l'absorbance maximale d'un complexe polysaccharide iodé d' amylopectine purifiée par filtration sur gel.
b : quantité de polysaccharide insolubie, exprimée en ug.l0-6 cellules, purifié
par sédimentation (mesure par dosage standard de l'amyloglucosidase).
MOS : quantité de malto-oligosaccharides solubles, exprimée ~g.10-6 cellules. 0.5 ug.l0'6 cellules correspond à une concentration plastidiale de 10 mM si tout le MOS devait être considéré comme étant du maltotriose d : Le pourcentage d'amylose dans l'amidon purifié a été calculé par filtration sur gel des polysaccharides dispersés.

_ WO 99/66056 PCT/FR99/01446 BIBLIOGRAPHIE
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LISTE DE SEQUENCES
<110> Biogemma <120> Procédé d'obtention de polypeptides modifiés <130> BFF 98/0267 <140>
<141>
<150> FR/9B07589 <151> 1998-06-16 <160> 1 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1557 <212> ADN
<213> Chlamydomonas reinhardtii <400> 1 ccgggtgcgt acggtattgg cgatattggt gatgaggcca agcgcttcgt cgactggctc 60 gccgaccacg gcatgcagtg ctggcagctg ctgccgctgg tgcccccgga ccccatgtac 120 tactccccct actcgggcac ggacgccaac tgcggcaacc cccttgtggt gagcattgag 180 gagctcatca aggacggact gctggagttc tcggagacgc ccccgcgcgt gcccatcgcc 240 gacgttgact atcccgctgt ggccgcggcc aagctgcccc tgctcaagcg cgcggcgcag 300 cggctgctta aggaggaccg cttcacgcgg ctgcgggagg aatacctcaa gtaccgcaaa 360 gagcacccct gggtggagta cagcgcgctg tttgatgtgg cgcgcaacct gccggagctg 420 agccagttgg cgtggtggca gtggccggag cgttgcgctg cgcagaagga ggcgctcaag 480 gagttccggg agacaaacaa ggacgcaatt gacgagttcg ttgtgatcca gtacttcttc 540 gagaacagtg gaaggcgatc cgggtgggtt acggctgggg gtgagggtta ccgggagggt 600 ttggacgcca ggcttacggt gtccagccgg cccgccccgt tggcggcggg gaaacggcat 660 gcagggtggg ggcgtttgtg catggcctgg tgccacggac gtatggcgct gacatcacat 720 gccgtgtgtc gggtagcgtc tgcacgcagc gagctggtgc tctgtgccta tcagcacacc 780 gacccccacg ccctcgctca cactggtccg tggccatgtg ccctgaccct gtcacatccg B40 tccttgcttt tgcactgctg cagtcctacg cgaacggcaa gggcatcaaa ctcatcggcg 900_ acatgccatc tacgtgggcg gccacagcgc agatgtgtgg ccaaccgcca cctgttcgag 960 ctgaacgagg cggcctgccc gagcaggtca gcggagtgcc gccggacgcc ttctcagcaa 1020 cgggtgaggc cggcgctacg gtggtgcggt gcggtgcggt gtaagagtgc agggcgagcc 1080 tgcacggaat ggggcatagc tgtgcgctgg agagttgggg cgaggcgacg attgggcatg 1140 gtggtggtgg acacaggcgt ccggtatccg gagttacgag ggagcaaggg aaaggggtcg 1200 acaccgtgcg tgcaggacgc gcaagcaagc cgtgcgccgc tatctgtatt acctggcgtt 1260 accgtgcgta tgtgcgtagc gcggcaggat ggatgaagca agggggctgg cggcgctcag 1320 gcagccagta ggaatatgag cggggtgggg cccacggtag catacctcct taacataacg 1380 gttcgccctg ggactgaatc gccgcgcctg ctgccgtcac caacaggcca gctgtggggc 1440 agcccgcttt acaagtggcc ggcccacaag aaggagggct tcaagtggtg gacggcgcgc 1500 atggcccgga ccctggagct gtacgacgag tgccggatcg accatttcgc cggtttc 1557

Claims (17)

REVENDICATIONS

1. Procédé de modification de la distribution de la longueur des chaînes d'un amidon ou des chaînes d'un glycogène, dans lequel on augmente ou on diminue l'activité d'une enzyme .alpha.-1,4 glucanotransférase dans les cellules d'une plante de telle sorte que ladite plante produise un amidon modifié différant de l'amidon produit naturellement par les plantes par la distribution de la longueur de ses chaînes externes ou produise un glycogène modifié différant du glycogène produit naturellement par la distribution de la longueur de ses chaînes externes.

2. Procédé selon la revendication 1 dans lequel on diminue le taux d'expression d'enzyme .alpha.-1,4 glucanotransférase endogène de façon à
conduire à la production d'amidon comprenant une amylopectine présentant un enrichissement des chaînes comportant moins de 6 résidus de glucose.

3. Procédé selon la revendication 2 comprenant les étapes consistant à
a) construire un vecteur d'expression comprenant une séquence nucléotidique antisens du gène codant pour ladite enzyme .alpha.-1,4 glucanotransférase ;
b) transformer une cellule de plante avec ledit vecteur d'expression ;
c) régénérer la plante à partir de la cellule transformée à l'étape b, ladite plante transgénique ainsi obtenue produisant un amidon comprenant une amylopectine présentant un enrichissement des chaînes comportant moins de 6 résidus de glucose.

4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédéntes, dans lequel ladite enzyme .alpha.-1,4 glucanotransférase est une enzyme D.

5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ladite enzyme .alpha.-1,4 glucanotransférase est une protéine comprenant une séquence d'acides aminés codée par la séquence nucléotidique choisie parmi la séquence SEQ ID n° 1, ou une séquence homologue de celle-ci.

6. Plante ou partie de plante, telle que notamment pomme de terre, blé, maïs ou riz, produisant de l'amidon modifié différant de l'amidon produit naturellement par les plantes par la distribution de la longueur de ses chaînes externes ou produisant du glycogène modifié différant du glycogène produit naturellement par la distribution de la longueur de ses chaînes externes, ladite plante ou partie de plante étant obtenue par le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes.

7. Procédé d'obtention d'amidon modifié différant de l'amidon produit naturellement par les plantes par la distribution de la longueur de ses chaînes externes, dans lequel:
- on extrait l'amidon modifié à partir des plantes ou parties de plantes selon la revendication 6 ;
- ou on met en contact un amidon, préalablement extrait de plantes ou parties de plantes puis solubilisé, avec une enzyme .alpha.-1,4 glucanotransférase, en présence de polysaccharides ou d'oligosaccharides éventuellement modifiés.

8. Amidon modifié obtenu selon le procédé de la revendication 7.

9. Utilisation d'amidon modifié selon la revendication 8 pour la préparation de produits dérivés, notamment de produits alimentaires.

10. Produits contenant un amidon modifié selon la revendication 9.

11. Procédé d'obtention de glycogène modifié différant du glycogène produit naturellement par la distribution des longueurs de ses chaînes externes, dans lequel :
- on extrait le glycogène modifié à partir des plantes ou parties de plantes obtenues selon le procédé de l'invention. tel que décrit précédemment.
- ou on met en contact un glycogène avec une enzyme .alpha.-1,4 glucanotransférase, en présence de polysaccharides ou d'oligosaccharides éventuellement modifiés.

12. Enzyme D de Chlamydomonas reinhardfii purifiée par le procédé comprenant les étapes consistant à:
- centrifuger la souche Chlamydomonas reinhardtii;
- précipiter la fraction acellulaire au sulfate de protamine ;
- passer le surnageant obtenu à l'étape précédente sur une chromatographie d'échange d'anions ;
- soumettre la fraction non retenue à l'étape précédente à une précipitation différentielle au sulfate d'ammonium ;
- soumettre le surnageant obtenu à l'étape précédente à une chromatographie de tamisage moléculaire ;
- concentrer par une chromatographie d'échange de cations le culot obtenu à l'étape précédente.

13. Acide nucléique comprenant une séquence nucléotidique choisie parmi la séquence SEQ ID n° 1, et un fragment de cette séquence codant pour une protéine présentant une activité enzymatique d'.alpha.-1,4 glucanotransférase.

14. Acide nucléique comprenant une séquence complémentaire de la séquence telle que définie à la revendication 13.

15. Vecteur de clonage et/ou d'expression comprenant une séquence nucléotidique telle que définie dans la revendication 13 ou 14.

16. Protéine présentant une activité enzymatique d'.alpha.-1,4 glucanotransférase, comprenant une séquence d'acides aminés codée par une séquence nucléotidique telle que définie dans la revendication 13.

17. Utilisation d'un acide nucléique comprenant une séquence codant pour une enzyme .alpha.-1,4 glucanotransférase ou une séquence antisens de ladite séquence codant pour une enzyme .alpha.-1,4 glucanotransférase, pour modifier la distribution de la longueur des chaînes externes de l'amidon ou du glycogène.