21 ~4409 wo ss/2sso3 Adenov~rus recomb1nants codant pour le facteur de cro~ssance des f~broblastes ac~des (afGF) La présente invention c-~ncerne des vecteurs recomhin~nt.c d'origine virale et leur utilisation pour le tr~itement et/ou la pr~vw~lion des maladies neurodegenératives.
5 Plus particulièrement, elle concerne des adénovirus reccmhin~nt.c comportant une séquence d'ADN codant pour le facteur de croi~s~n~e des fibroblastes acide (aFGF, "acidic fib,.)bla~l grow~ factor"). L'invention concerne eg~lPmPnt la ~.~p~dlion de ces vecteurs, les compositions pharm~cel~tiques les contenant et leur utilisation thérapeutique, notamment en thérapie génique.
0 Les m~ iPs neurodégénératives représentent une large part des dépenses de santé dans les pays occident~tlx, part qui ne cesse de s'accroitre suite au vieillissement de la population. Au titre de ces affections, on peut citer notamment la maladied'~ P;-..e~, le maladie de Parkinson, la chorée de Huntington, la sclérose latérale allJyul~ophique~ etc. Les signes pathologiques et l'étiologie de ces m~l~clies sont fort variés, mais toutes ces maladies résultent d'une perte progressive de cellules neuronales dans le système nerveux central, parfois au sein de structure très loc~li.
comme la subst~nce noire dans la maladie de Parkinson. Bien que certains traitements pha.lnacologiques p~ tif.s soient déjà disponibles, leurs effets sont relativement limités. La présente invention décrit une approche thérapeutique nouvelle, particulièrement avantageuse pour le traitement de ces maladies. Plus particulièrement, la présente invention décrit des vecteurs permettant de promouvoir directement la survie des cellules neuronales impliquées dans ces pathologies, par expression efficace et localisée de certains facteurs trophiques.
Les facteurs trophiques sont une classe de molécules ayant des propriétés de 2s stimulation de la croi~s~n-~e neuritique ou de la survie des cellules nerveuses. Le lier facteur po.~éd~nt des propriétés nellrotl~,phiques, le NGF ("Nerve Growth Factor"), a été caractérisé il y a une quaralllaine d'années (pour revue, voir Levi-Mont~l~ini et Angelleti, Physiol. Rev. 48 (1968) 534). Ce n'est que récemment que d'autres facteurs neurotrophiques ont été identifiés, et notamment le facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF) (Thoenen, Trends in NeuroSci. 14 (1991) 165), le CNTF, etc. La demanderesse s'est .nlé-es~ee plus particulièrement au facteur de croi~s~nce des fibroblastes acide (aFGF). Le aFGF est une protéine de 134 à 155 acides aminés environ et de poids moléculaire compris entre 15 et 17 kD selon les Woss/2s803 2 1 8 4 4 0 9 PCT/~h9s,~249 formes. Le aFGF a été décrit initi~l~ment pour ses propriétés de c--~iss~lce desfibroblastes, qui lui confé,aient un intérêt dans le traitement de certaines pathologies telles que not~mment la Gic~tri.~sion. Récemm~nt, il a été montré que le aFGF
sub,ssait un transport rétrograde dans pll~ciel-rs populations neuronales, dont le système nigro-strié (Fer~us~oll et Johnson, J. Comp. Neurol. 313 (1991) 693), et qu'il pouvait permettre, in vitro, la survie de neurones dop~minergiques du m~nf~é~h~le (Knusel et al., J. Neurosci. 10 (1990) 558). Toutefois, bien que ses propriétés soient i"~ére~ les, l'application thérapeutique du aFGF se heurte à différents ob.staGles. En particulier, l'absence de biodisponibilité du aFGF limite toute utilisation thé,~peu~ique.
0 Par ailleurs, il n'existe pas de moyens efficaces permettant de délivrer le aFGF de manière durable et localisée à certaines régions désirées de l'org~ni.cm~ Enfin, il est ~entiel que le aFGF délivré soit actif et puisse exercer une activité thérapeutique in vivo.
La présente invention apporte une solution particulièrement avantageuse à ces problèmes. La présente invention réside en effet dans la mise au point de vecteurs particulièrement efficaces pour délivrer in vivo et de manière localisée, des quantités thérapeutiquement actives de aFGF. Dans la demande cop~nd~nte n PCT/EP93/02519, il a été montré que les adénovirus pouvaient être utilisés pour le transfert de gènes in vivo dans le système nerveux. La présente invention con- ~rne des constructions nouvelles, particulièrement adaptées et efficac~-c pour le transfert d'un gène spécifique dans le système nerveux. Plus particulièrement, la présente invention concerne un adénovirus recombin~nt comprenant une séquence d'ADN codant pour le facteur de croissance des fibroblastes acide (aFGF), sa préparation, et son utili.c~tion pour le traitement et/ou la pl~venlion des maladies neurodégénératives.
La clem~n~leresse a m~inten~nt montré qu'il est possible de construire des adénovirus recombinants conten~nt une séquence codant pour le aFGF, d'~lmini.~trer ces adénovirus recombinants in vivo, et que cette ~imini~tration permet une expression stable et localisée de quantités thérapeutiquement actives de aFGF in vivo, et en particulier dans le système nerveux, et sans effet cytopathologique. Les propriétés particulièrement avantageuses des vecteurs de l'invention découlent notamment de la construction utilisée (adénovirus défectif, délété de certaines régions virales), du promoteur utilisé pour l'expression de la séquence codant pour le aFGF
(promoteur viral ou tissu-spécifique de préférence), et des méthodes d'aministration dudit vecteur, permettant l'expression efficace et dans les tissus app,~priés du aFGF.
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21 ~440q WO9S/25803 P~-/r~9S/00249 La présente invention fournit ainsi des vecteurs viraux utili~bles direct~m~nt en thérapie génique, particulièrell-enl adaptés et effic~c~s pour diriger l~eA~ès~ion du aFGF in vivo. La p~èsell~e invention offre ainsi une nouvelle approche particulièlelllenl avantageuse pour le tl~ile~ nl et/ou la prévention des maladies neuro~légén~-ratives.
Un premier objet de l'invention réside donc dans un adénovirus ~ècolnh;n~
défectif complellant une séquence d'ADN codant pour le factêur de cn~;s~ e des fibroblastes acide (aFGF) ou un dérivé de celui-ci.
L'invention a ég~lemçnt pour objet l'utilisation d'un tel adénovirus recombin~nt défectif pour la préparation d'une composition ph~rma-e~1tique destinée lo au traitement ou à la ~l~vell~ion des maladies neurodégénératives.
Le facteur de croissance des fibroblastes acide (aFGF) produit dans le cadre de la présente invention peut être le aFGF humain ou un aFGF animal. En particulier, la séquence d'ADN codant pour le aFGF humain a été clonée et séquencée ~Jaye et al., Science 273 (1986) 541). Préalablement à leur incorporation dans un vecteur adénovirus selon l'invention, ces séquences sont avantageusement modifiées, par exemple par mut~g~ne~se dirigée, en particulier pour l'insertion de sites de restriction appropl;és. Les séquences décrites dans l'art antérieur ne sont en effet pas construites pour une utilisation selon l'invention, et des adaptations préalables peuvent s'avérer n~cess~ires, pour obtenir des expressions importantes (voir exemple 1.2.). Dans le cadre de la présente invention, on préfère utiliser une séquence d'ADN codant pour le facteur de croissance des fibroblastes acide humain (haFGF). Par ailleurs, commeindiqué ci-avant, il est également possible d'tltiliser une construction codant pour un dérivé du aFGF, en particulier un dérivé du aFGF hllm~in Un tel dérivé col--prend par exemple toute séquence obtenue par mutation, délétion et/ou addition par rapport à la 2s séquence native, et codant pour un produit conservant l'une au moins des propriétés biologiques du aFGF (effet trophique et/ou différentiateur). Ces mo-lific~tions peuvent être réalisées par les techniques connues de l'homme du métier (voir techniques générales de biologie moléculaire ci-après et exemple 2). L'activité biologique des dérivés ainsi obtenus peut ensuite être aisément ~ét~nin~e, comme indiqué
notamment dans l'exemple 3. Les dérivés au sens de l'invention peuvent ég~ m~nt être obtenus par hybridation à partir de banques d'acides nucléiques, en utilisant comme sonde la séquence native ou un fragment de celle-ci.
wo 9S/25803 PCr/FR95/00249 Ces dérivés sont notamment des molécules ayant une plus grande affinité
pour leurs sites de fixation, des séquences permettant une ~p,e~ion améliorée invivo, des molécules p-~se~ une plus grande r.osict~n~e aux protéases, des moléc~ s ayant une efficacité thérapeutique plus grande ou des effets secondaires moindres, ou S éventuellement de nouvelles propriétés biologiques.
Parmi les dérivés préférés, on peut citer plus particulièle,l,e,ll les variants naturels du aFGF. Ainsi, comme décrit par exemple dans le brevet US 4,868,113, diffél~llles formes de aFGF existent, et notamment une forme compre,lant 154 acides aminés, une forme co-"prenant 140 acides aminés, et une forme co",pr~,lant 134 10 acides aminés. Il est ent~n~ que le terme aFGF comprend ces dif~e~ es formes.D'autres dérivés préférés sont not~.~m~e"l les molécules dans lesquelles un ou plusieurs résidus ont été substitués, les dérivés obtenus par délétion de régions n'~l~el venant pas ou peu dans l'interaction avec les sites de liaison considérés ou exprimant une act*ité
indésirable, et les dérivés comportant par rapport à la séquence native des résidus 15 supplem~ns~ires, tels que par exemple un signal de sécrétion et/ou un peptide de jonction.
De manière particuliel~ll,elll avantageuse, la séquence utilisée dans le cadre de la présente invention contient égalemPnt un signal de sécrétion permettant dediriger le aFGF synthétisé dans les voies de sécrétion des cellules infectées, de manière 20 à ce que le aFGF synthétisé soit libéré plus efficacement dans les co",pa"iments extracellulaires et puisse activer ses récepteurs. Le signal de sécrétion utilisé peut être un signal de sécrétion hétérologue ou même artificiel. Avantageusement, on utilise un signal de sécrétion fonctionnel dans les cellules nerveuses, tel que le signal de sécrétion d'une cytokine. A titre d'exemple, on peut citer le signal de sécrétion de l'intel~ér-Jn de 25 fibroblastes hum~inc qui permet la sécrétion importante de aFGF.
La séquence d'ADN codant pour le facteur de croissance des fibroblastes acide utilisée dans le cadre de la présente invention peut être un ADNc, un ADN
g~nomillue (ADNg), ou une construction hybride concict~nt par exemple en un ADNcdans lequel seraient insérés un ou plusieurs introns. Il peut ég~l~m~nt s'agir de 30 séquences synthétiques ou semisynthétiques. De manière particulièrement avantageuse, on utilise un ADNc ou un ADNg. En particulier, l'utilisation d'un ADNg peut permettre une meilleure expression dans les cellules hllm~in~s Dans un premier mode de réalisation de l'invention, l'adénovirus comprend donc une séquence d'ADNc codant pour le facteur de croissance des fibroblastes acide 35 (aFGF). Dans un autre mode de réalisation préféré de l'invention, l'adénovirus ~1 ~4DQ9 WO 95/25803 P~lirr.SS/00249 comprend une séquence d'ADNg codant pour le facteur de croissance des fibrobl~stes acide (aFGF). Av~nt~g~ucem~nt, la séquence d'ADN code pour le aFGF précéde d'un signal de sécrétion hétérologue fonctionnel dans les cellules ne, ~ellses.
s Av~nt~u~ment. la séquence codant pour le aFGF est placée sous le contrôle de signaux permettant son eApression dans les cellules nerveuses.
Préférenti-?llem~nt, il s'agit de signaux d'expression hétérologues, c'est-à-dire de signaux différents de ceux natur~ m~nt responsables de l'eAplession du aFGF. Il peut s'agir en particulier de séquences responsables de l'expression d'autres protéines, ou de séquences synthétiques. Not~mm~nt, il peut s'agir de séquences promotrices de gènes eucaryotes ou viraux. Par exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule que l'on désire infecter. De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus, y compris l'adénovirus utilisé. A cet égard, on peut citer par exemple les promoteurs ElA, MLP, CMV, LTR-RSV, etc. En outre, ces séquences d'expression peuvent etre modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, ou permettant une expression tissu-spécifique. Il peut en effet etre particulièrement intéressant d'utiliser des signaux d'expression actifs spécifiquement ou majoritairement dans les cellules nerveuses, de manière à ce que la séquence d'ADN ne soit exprimée et ne produise son effet que lorsque le virus a effectivement infecté une cellule nerveuse. A cet égard, on peut citer par exemple les promoteurs de l'énolase neurone-spécifique, de la GFAP, etc.
Dans un premier mode de réalisation particulier, l'invention concerne un adénovirus recombinant défectif comprenant une séquence d'ADNc codant pour le facteur de croissance des fibroblastes acide humain (haFGF) sous le contrôle du promoteur LTR-RSV.
Dans un autre mode de réalisation particulier, l'invention concerne un adénovirus recombin~nt défectif col"prenant une séquence d'ADNg codant pour le facteur de cloissance des fibroblastes acide humain (haFGF) sous le contrôle du promoteur LTR-RSV.
La clem~n~l~resse a en effet montré que le promoteur LTR du virus du sarcome de rous (RSV) permettait une expression durable et importante du aFGF dans les cellules du système nerveux, no~a,~"l,~nl central.
Toujours dans un mode préféré, l'invention concerne un adénovirus recombinant défectif comprenant une séquence d'ADN codant pour le facteur de 21 ~ 4409 wo ss / 2sso3 Adenov ~ rus recomb1nants coding for the growth factor of f ~ broblasts ac ~ des (afGF) The present invention c- ncerne vectors recomhin ~ nt.c of viral origin and their use for tr ~ itement and / or pr ~ vw ~ lion neurodegenerative diseases.
5 More particularly, it relates to reccmhin ~ nt.c adenoviruses comprising a DNA sequence coding for the fibroblast acid growth factor (aFGF, "acidic fib,.) bla ~ l grow ~ factor"). The invention relates to eg ~ lPmPnt la.. ~ P ~ dlion de these vectors, the pharm ~ cel ~ tick compositions containing them and their use therapeutic, particularly in gene therapy.
0 Neurodegenerative m ~ iPs represent a large share of health in western countries ~ tlx, part which continues to increase following aging Population. These diseases include, in particular, the disease ~ P; - .. e ~, Parkinson's disease, Huntington's chorea, lateral sclerosis allJyul ~ ophic ~ etc. The pathological signs and etiology of these m ~ l ~ clies are strong varied, but all these diseases result from a progressive loss of cells neuronal in the central nervous system, sometimes within a very local structure.
like the black substance in Parkinson's disease. Although some treatments pha.lnacologiques p ~ tif.s are already available, their effects are relatively limits. The present invention describes a new therapeutic approach, particularly advantageous for the treatment of these diseases. More specifically, the present invention describes vectors for directly promoting the survival of neural cells involved in these pathologies, by effective expression and localized of certain trophic factors.
Trophic factors are a class of molecules with properties of 2s stimulation of neuritic growth or the survival of nerve cells. The link factor in. ~ ed ~ nt nellrotl ~, phiques properties, NGF ("Nerve Growth Factor "), was characterized some forty years ago (for review, see Levi-Mont ~ l ~ ini and Angelleti, Physiol. Rev. 48 (1968) 534). It is only recently that other neurotrophic factors have been identified, including the factor Brain Derived Neurotrophic (BDNF) (Thoenen, Trends in NeuroSci. 14 (1991) 165), the CNTF, etc. The plaintiff is .nlé-es ~ ee more particularly to the factor of croi ~ s ~ nce of acid fibroblasts (aFGF). AFGF is a protein from 134 to 155 amino acids approximately and of molecular weight between 15 and 17 kD depending on the Woss / 2s803 2 1 8 4 4 0 9 PCT / ~ h9s, ~ 249 shapes. AFGF was originally described for its c-- ~ iss ~ lce desfibroblast properties, which gives it an interest in the treatment of certain pathologies as not ~ mment the Gic ~ tri. ~ sion. Recently, it has been shown that the aFGF
sub, ssait a retrograde transport in pll ~ ciel-rs neuronal populations, including nigro-striated system (Fer ~ us ~ oll and Johnson, J. Comp. Neurol. 313 (1991) 693), and that could allow, in vitro, the survival of dop ~ minergic neurons of m ~ nf ~ é ~ h ~ the (Knusel et al., J. Neurosci. 10 (1990) 558). However, although its properties are i "~ ére ~ les, the therapeutic application of aFGF comes up against various ob.staGles.
in particular, the absence of bioavailability of aFGF limits any use of tea, ~ little ~ ic.
0 Furthermore, there are no effective means to deliver the aFGF from sustainable and localized to certain desired regions of the org ~ ni.cm ~ Finally, it is ~ that the aFGF delivered is active and can exercise therapeutic activity in vivo.
The present invention provides a particularly advantageous solution to these problems. The present invention resides in fact in the development of vectors particularly effective in delivering in vivo and in a localized manner, quantities therapeutically active from aFGF. In the request cop ~ nd ~ nte n PCT / EP93 / 02519, it has been shown that adenoviruses can be used for gene transfer in vivo in the nervous system. The present invention relates to new constructions, particularly suitable and efficient ~ -c for the transfer of a specific gene in the nervous system. More particularly, the present invention relates to a recombinant adenovirus ~ nt comprising a DNA sequence coding for acid fibroblast growth factor (aFGF), its preparation, and its use for the treatment and / or pl ~ venlion of neurodegenerative diseases.
The clem ~ n ~ leresse am ~ inten ~ nt showed that it is possible to build Recombinant adenoviruses contain a sequence coding for aFGF, of ~ lmini. ~ trer these recombinant adenoviruses in vivo, and that this ~ imini ~ tration allows a stable and localized expression of therapeutically active amounts of aFGF in vivo, and in particular in the nervous system, and without cytopathological effect. The particularly advantageous properties of the vectors of the invention arise in particular of the construction used (defective adenovirus, deleted from certain regions viral), of the promoter used for the expression of the sequence coding for aFGF
(preferably viral or tissue-specific promoter), and administration methods of said vector, allowing efficient expression and in app tissues, ~ required of aFGF.
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21 ~ 440q WO9S / 25803 P ~ - / r ~ 9S / 00249 The present invention thus provides viral vectors utili ~ bles direct ~ m ~ nt in gene therapy, particulièrell-enl adapted and effic ~ c ~ s to direct the ~ eA ~ ès ~ ion aFGF in vivo. The p ~ èsell ~ e invention thus offers a new particulièlelllenl approach advantageous for tl ~ island ~ nl and / or prevention of neuro ~ legen ~ -rative diseases.
A first object of the invention therefore resides in an adenovirus ~ ècolnh; n ~
defect complelling a DNA sequence coding for the factor of cn ~; s ~ e des acid fibroblasts (aFGF) or a derivative thereof.
The invention aeg ~ lemçnt relates to the use of such an adenovirus recombinant ~ nt defective for the preparation of a composition ph ~ rma-e ~ 1tique intended lo treatment or ~ l ~ vell ~ ion of neurodegenerative diseases.
The acid fibroblast growth factor (aFGF) produced as part of the present invention can be human aFGF or animal aFGF. In particular, the DNA sequence coding for human aFGF has been cloned and sequenced ~ Jaye et al., Science 273 (1986) 541). Prior to their incorporation into a vector adenovirus according to the invention, these sequences are advantageously modified, by example by mut ~ g ~ ne ~ is directed, in particular for the insertion of restriction sites approved. The sequences described in the prior art are in fact not constructed for use according to the invention, and prior adaptations may prove to be necessary necessary, to obtain important expressions (see example 1.2.). In the In the context of the present invention, it is preferred to use a DNA sequence encoding the human acid fibroblast growth factor (haFGF). Furthermore, as indicated above, it is also possible to use a construction coding for a derivative of aFGF, in particular a derivative of aFGF hllm ~ in Such a derivative col - takes example any sequence obtained by mutation, deletion and / or addition with respect to the 2s native sequence, and coding for a product retaining at least one of the properties biological factors of aFGF (trophic and / or differentiating effect). These mo-lific ~ tions can be performed by techniques known to those skilled in the art (see techniques general molecular biology below and example 2). The biological activity of derivatives thus obtained can then be easily ~ ét ~ nin ~ e, as indicated in particular in Example 3. The derivatives within the meaning of the invention may eg ~ m ~ nt be obtained by hybridization from nucleic acid libraries, using as probes the native sequence or a fragment thereof.
wo 9S / 25803 PCr / FR95 / 00249 These derivatives are in particular molecules having a greater affinity for their binding sites, sequences allowing a ~ p, e ~ ion enhanced invivo, molecules p- ~ se ~ greater r.osict ~ n ~ e to proteases, molecules ~ s with greater therapeutic efficacy or less side effects, or S possibly new biological properties.
Among the preferred derivatives, there may be mentioned more particularly, l, e, ll the variants aFGF natural. Thus, as described for example in US patent 4,868,113, diffél ~ llles aFGF forms exist, including a compre form, lant 154 acids amino, a co form "taking 140 amino acids, and a co form", pr ~, lant 134 10 amino acids. It is ent ~ n ~ that the term aFGF includes these dif ~ e ~ es forms. Other preferred derivatives are not ~. ~ M ~ e "l molecules in which one or more residues have been substituted, the derivatives obtained by deletion of regions which do not come from or little in the interaction with the binding sites considered or expressing an activity undesirable, and the derivatives with respect to the native sequence of the residues 15 supplements ~ ns ~ ires, such as for example a secretion signal and / or a peptide junction.
Particularly ~ ll, elll advantageous, the sequence used in the context of the present invention also contains a secretion signal making it possible to direct the aFGF synthesized in the secretion pathways of the infected cells, so 20 that the synthesized aFGF be released more efficiently in the co ", pa" iments extracellular and can activate its receptors. The secretion signal used can be a heterologous or even artificial secretion signal. Advantageously, a signal of functional secretion in nerve cells, such as the signal of secretion of a cytokine. As an example, we can cite the secretion signal of the intel ~ er-Jn of 25 hum ~ inc fibroblasts which allow the important secretion of aFGF.
The DNA sequence encoding fibroblast growth factor acid used in the context of the present invention may be a cDNA, a DNA
g ~ nomillue (gDNA), or a hybrid construct concict ~ nt for example in a cDNAin which would be inserted one or more introns. It can also be 30 synthetic or semi-synthetic sequences. Particularly advantageously, cDNA or gDNA is used. In particular, the use of a gDNA can allow better expression in hllm ~ in ~ s cells In a first embodiment of the invention, the adenovirus comprises therefore a cDNA sequence coding for the acid fibroblast growth factor 35 (aFGF). In another preferred embodiment of the invention, the adenovirus ~ 1 ~ 4DQ9 WO 95/25803 P ~ lirr.SS / 00249 includes a gDNA sequence encoding fibrobl growth factor acid (aFGF). Av ~ nt ~ g ~ ucem ~ nt, the DNA sequence codes for the aFGF preceded by a signal of heterologous secretion functional in ne cells, ~ ellses.
s Av ~ nt ~ u ~ ment. the sequence coding for aFGF is placed under the control of signals allowing its eApression in nerve cells.
Preferably? Llem ~ nt, these are heterologous expression signals, i.e.
signals different from those natur ~ m ~ nt responsible for the eAplession of aFGF. he can in particular, sequences responsible for the expression of other proteins, or synthetic sequences. Not ~ mm ~ nt, these can be gene promoter sequences eukaryotic or viral. For example, they may be promoter sequences derived from the genome of the cell you want to infect. Likewise, they can be sequences promoters from the genome of a virus, including the adenovirus used. In this regard, mention may be made, for example, of promoters ElA, MLP, CMV, LTR-RSV, etc. In addition, these expression sequences can be modified by adding sequences activation, regulation, or allowing tissue-specific expression. He can effect be particularly interesting to use active expression signals specifically or mainly in nerve cells, so that the DNA sequence is expressed and only takes effect when the virus has actually infected a nerve cell. In this regard, one can cite for example the promoters of neuron-specific enolase, GFAP, etc.
In a first particular embodiment, the invention relates to a defective recombinant adenovirus comprising a cDNA sequence encoding the human acid fibroblast growth factor (haFGF) under the control of LTR-RSV promoter.
In another particular embodiment, the invention relates to a recombinant adenovirus ~ nt defective col "taking a gDNA sequence coding for cleavage factor of human acid fibroblasts (haFGF) under the control of LTR-RSV promoter.
The clem ~ n ~ l ~ resse has indeed shown that the LTR promoter of the virus red sarcoma (RSV) allowed long-lasting and significant expression of aFGF in cells of the nervous system, no ~ a, ~ "l, ~ nl central.
Still in a preferred embodiment, the invention relates to an adenovirus defective recombinant comprising a DNA sequence encoding the factor
2 1 84409 Wo 95/25803 PCT~R95/00249 croi~s~nre des fibroblastes acide humain (haFGF) sous le contrôle d'un promoteurpe".,~U~t une eA~,e~ion majoritaire dans le système nerveux.
Un mode particulièr~menl préféré de mise en oeuvre de la présente i~v~l~tion réside dans un adénovirus recombinant défectif co,npre,lant les séquences ITR, une 5 séquence permettant l'encapsidation, une séquence d'ADN codant pour le facteur de croissance des fibroblastes acide humain (haFGF) ou un dérivé de celui-ci sous le contrôle d'un promoteur permettant une expression majoritaire dans le système nerveux, et dans lequel le gène E1 et au moins un des gènes E2, E4, L1-L5 est non fonctionnel.
Les adénovirus défectifs selon l'invention sont des adénovirus inrapables de se répliquer de façon autonome dans la cellule cible. Génér~lement, le génome des adénovirus défectifs utilisés dans le cadre de la présente invention est donc dépourvu au moins des séquences neces~ires à la réplication dudit virus dans la cellule infectée.
Ces régions peuvent être soit éliminees (en tout ou en partie), soit rendues non-15 fonctionnelles, soit substituées par d'autres séquences et not~mm~nt par la séquence d'ADN codant pour le aFGF.
~ r~fe,en~iellement, le virus défectif de l'invention conserve les séquences de son génome qui sont necçs~ires à l'encaps~ tion des particules virales. Encore plus pr~ nli~llem~nt, comme indiqué ci-avant, le génome du virus recombin~nt défectif20 selon l'invention comprend les séquences ITR, une séquence permettant l'encapsidation, le gène E1 non fonctionnel et au moins un des gènes E2, E4, L1-L5 non fonctionnel. Il s'agit préférentiellement des gènes E1 et E4.
Il existe différents sérotypes d'adénovirus, dont la structure et les propriétésvarient quelque peu. Parmi ces sérotypes, on préfère utiliser dans le cadre de la 25 présente invention les adénovirus h~ in.~ de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale (voir lem~n(le FR 93 05954). Parmi les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, (exemple: Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple: SAV). De 30 préférence, l'adénovirus d'origine animale est un adénovirus canin, plus préférentiellement un adénovirus CAV2 [souche m~nh~ n ou A26/61 (ATCC VR-800) par exemple]. De préférence, on utilise dans le cadre de l'invention des adénovirus d'origine humaine ou canine ou mixte.
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Wo 95/25803 Pcr~R95/00249 -Les adénovirus recombin~nt.c défectifs selon l'invention peuvent être pr~pa,~s par toute technique connue de l'homme du métier (Levrero et al., Gene 101 (1991)195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). En particulier, ils peuvent être pt~parés par recombinaison homologue entre un adénovirus et un plasmide portant 5 entre autre la séquence d'ADN codant pour le aFGF. La reco."binaiscn homologue se produit après co-transfection desdits adénovirus et plasmide dans une ligné~e cellulaire appr~,iée. La lignée cellulaire utilisée doit de préférence (i) être transformable par lesdits é1em~nt~, et (ii), comporter les séquences capables de complémen~er la partie du génome de l'adénovirus défectif, de préférence sous forme intégrée pour éviter les o risques de recombinaison. A titre d'exemple de lignée, on peut mentionner la lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) qui contient nul~ e-~l, intégrée dans son génome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (12 ~o). Des stratégies de construction de vecteurs dérivés des adénovirus ont ég~lem~?nt été décrites dans les demandes n FR 93 05954 et FR 93 08596 qui sont incorporées à la présente par référence.
F.n~uite, les adénovirus qui se sont multipliés sont récupérés et purifiés selonles techniques classiques de biologie moléculaire, comme illustré dans les exemples.
Comme indiqué ci-avant, la présente invention conceme ég~lem~nt toute ~tili~qtion d~un adénovirus tel que décrit ci-dessus pour la pr~pa,~ion d'une 20 composition pharmaceutique destinée au traitement et/ou à la pt~ve"~ion des m~ c neurodégénératives. Plus particulièrement, elle concerne toute utilisation de ces adénovirus pour la ~,epaldtion d'une composition pharmaceutique destinée au tr~itement et/ou à la prévention de la maladie de Parkinson, de la maladie d'.Al7heimf~r, de la sclérose latérale a-ryotl~,phique (ALS), de la maladie d'HllntinEton, de l'épilepsie 25 et de la démence vasculaire.
La présente invention concerne également une composition pharm~cel-tique col"pte,lant un ou plusieurs adénovirus recombinants défectifs tels que décrits précédemm.?nt Ces compositions pharmaceutiques peuvent être formulées en vue d'~lmini~trations par voie topique, orale, parentérale, intr~n~c~le, inllaveineuse, 30 intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc. De préférence, les compositions ph~ ceutiques de l'invention contiennent un véhicule ph~rm~ceu-tiquement acceptable pour une formulation injectable, notamment pour une injection directe dans le système nerveux du patient. Il peut s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment Iyophili.~ees, qui, par i 2 1 84~0~
Wo 9S/25803 PCTIFR95/00249 addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la con~titution de solutés injectables. L'injection directe dans le système nerveux du patient est avantageuse car elle permet de concentrer l'effet thérapeutique au niveau des tissus affectés. L'injection directe dans le système nerveux central du patient est 5 avantageucem~nt réalisée au moyen d'un appareil d'injection stéréotaxique. L'emploi d'un tel appareil permet en effet de cibler avec une grande précision le site d'injection.
A cet égard, l'invention concerne ég~lçm~nt une méthode de traitement des m~ s neurodégénératives co~-~prenan~ .n;.~ lion à un patient d'un adénovirus recombinant tel que défini ci-avant. Plus particulièrement, l'invention concerne une 10 méthode de traitement des maladies neurodégénératives comprenant l'ar~ ;n;.,lla~ion stéréotaxique d'un adénovirus recombin~nt tel que défini ci-avant.
Les doses d'adénovirus recombinant défectif utili~é~s pour l'injection peuvent être adaptées en fonction de dirrél~nls paramètres, et notamment en fonction du mode d'~mini~tration utilisé, de la pathologie concernée ou encore de la durée du traitement 15 recherchée. D'une manière générale, les adénovirus recombin~nt~ selon l'invention sont formulés et a~mini~trés sous forme de doses comprises entre 104 et 10l4 pfu/ml, et de ple~érence 106 à 10l pfu/ml. Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond aupouvoir infectieux d'une solution de virus, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire appr ,p iée, puis mesure, généralement après 48 heures, du nombre de plages 20 de cellules infectées. Les techniques de détermination du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans la littérature.
Un autre objet de l'invention concerne toute cellule de m~mmifère infectée par un ou plusieurs adénovirus recomhin~nt.c défectifs tels que décrits ci-dessus. Plus particulièrement, l'invention concerne toute population de cellules hurn~ines infectée 25 par ces adénovirus. Il peut s'agir en particulier de fibroblastes, myoblastes, hépatocytes, kératinocytes, cellules endothéliales, cellules gliales, etc.
Les cellules selon l'invention peuvent être issues de cultures pri~,aires. Celles-ci peuvent être prélevées par toute technique connue de l'homme du métier, puis mises en culture dans des conditions permettant leur prolifération. S'~gi~sant plus 30 particulièrement de fibroblastes, ceux-ci peuvent être aisément obtenus à partir de biopsies, par exemple selon la technique décrite par Ham [Methods Cell.Biol. 21a(1980) 255]. Ces cellules peuvent être utilisées directement pour l'infection par les adénovirus, ou conservées, par exemple par congélation, pour l'ét~bli~mçnt de banques autologues, en vue d'une utilisation ultérieure. Les cellules selon l'invention Wo 95/25803 Pcr/FR95/00249 -peuv~ égal~m~nt être des cultures secondaires, obtenues par PYemrle à partir de banques préétablies.
Les cellules en culture sont ensuite infectées par des adénovirus recombin~nt~, pour leur conférer la capacité de produire du aFGF. L'infection est 5 réalisée in vitro selon des techniques connues de l'homme du métier. En particulier, selon le type de cellules utilisé et le nombre de copies de virus par cellule désiré, l'homme du métier peut adapter la multiplicité d'infection et éventuellement le nombre de cycles d'infection réalisé. Il est bien ~ntenrlll que ces étapes doivent être effectuées dans des conditions de stérilité applupriées lorsque les cellules sont cl~-stin~s à une 10 ~-lmini~tration in vivo. Les doses d'adénovirus recombinant utilicees pour l'infection des cellules peuvent être adaptées par l'homme du métier selon le but ~cl~el.,hé. Les conditions décrites ci-avant pour l'administration in vivo peuvent être appliquées à
l'infection in vitro.
Un autre objet de l'invention concerne un implant compr~nant des cellules 15 n~,.n;~ infectées par un ou plusieurs adénovirus recomhin~nt~c défectifs telles que décrites ci-dessus, et une matrice extracellulaire. Préférlontiell.om~nt les impl~ntc selon l'invention c~.l,pl~ ent 105 à 101 cellules. Plus prerel~llliellement, ils en conlplelment 106 à 108.
Plus particulièrement, dans les implants de l'invention, la matrice extracellulaire con,p~end un composé gélifiant et éventuellement un support permettant l'ancrage des cellules.
Pour la yl~pal~tion des implants selon l'invention, difrél~ types de gélifiants peuvent être employés. Les gélifiants sont utilisés pour l'inclusion des cellules dans une matrice ayant la constitution d'un gel, et pour favoriser l'ancrage des cellules 2~ sur le support, le cas échéant. Différents agents d'adhésion cellulaire peuvent donc être utilisés comme ~lifi~nt~, tels que notamment le collagène, la gel~tin~, les glycosaminoglycans, la fibronectine, les lectines, etc. De préférence, on utilise dans le cadre de la présente invention du collagène. Il peut s'agir de coll~ne d'originehumaine, bovine ou murine. Plus préférenciellement, on utilise du collagène de type I.
Comme indiqué ci-avant, les compositions selon l'invention co-llpl~lment avantageusement un support permettant l'ancrage des cellules. Le terme ancrage désigne toute forme d'interaction biologique et/ou chimique et/ou physique enlldînant l'adhésion et/ou la fixation des cellules sur le support. Par ailleurs, les cellules peuvent soit recouvrir le support utilisé, soit pénétrer à l'intérieur de ce support, soit les deux.
WO 9S/25803 P~l/rl~9S/00249 On préfère utiliser dans le cadre de l'invention un support solide, non toxique et/ou bio-cnmpatihle. En particulier, on peut utiliser des fibres de polytétrafluoroéthylène ) ou un support d'origine biologique.
Les imr~nt~ selon l'invention peuvent être implantés en différents sites de 5 l'or~ ~,s,l,e. En particulier, l'impl~nt~tion peut être effectuée au niveau de la cavité
péritonéale, dans le tissu sous-cutané (région sus-pubienne, fosses iliaques ou inguinales, etc), dans un organe, un muscle, une tumeur, le système ne,v~ux central, ou encore sous une muqueuse. Les impl~nt~ selon l'invention sont particuliè~-ne"l avantageux en ce sens qu'ils permettent de contrôler la libération du produit 10 thé,c.peulique dans l'organisme: Celle-ci est tout d'abord déterminée par la mllltipli~ite d'infection et par le nombre de cellules implantées. Ensuite, la libération peut être contrôlée soit par le retrait de l'implant, ce qui arrête deLn,~ivement le tr~itement, soit par l'utilisation de systèmes d'expression régulable, permettant d'induire ou de réprimer l'expression des gènes thérapeutiques.
La présente invention offre ainsi un moyen très efficace pour le tr~ite-ment ou la p,ev~"lion des maladies neurodégénératives. Elle est tout particuliè~el"~nL adaptée au traitem~nt des m~ s d'Alzheimer, de Parkinson, de Huntington, et de l'ALS. Les vecteurs adénoviraux selon l'invention présentent en outre des avantages impo~L~L~, 20 liés notamment à leur très haute efficacité d'infection des cellules nerveuses, permettant de réaliser des infections à partir de faibles volumes de suspension virale.
De plus, l'infection par les adénovirus de l'invention est très localisée au site d'injection, ce qui évite les risques de diffusion aux structures cérébrales voisines.
En outre, ce traitement peut concerner aussi bien l'homme que tout animal tel 2s que les ovins, les bovins, les an""aux domestiques (chiens, chats, etc), les chevaux, les poissons, etc.
La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
~ ~pende des fgures Figure 1: Représentation du vecteur pXL2244 Figure 2: ReprésPnt~tion du vecteur pSh-Ad-aFGF
wo 95/25803 PCT~R95/00249 Techniques ~énérales de biolo~ie moléculaire Les méthodes classiquement utilisées en biologie moléculaire telles que les extractions p,~pal~lives d'ADN pl~mi~ique~ la centrifugation d'ADN p~ que en gradient de chlorure de césium, l'électrophorèse sur gels d'agarose ou d'acrylamide, la 5 pllrifi~ation de fr~gment~ d'ADN par électroélution, les extraction de protéines au phénol ou au phénol-chlol~folme, la précipitation d'ADN en milieu salin par de l'éthanol ou de l'iso~,opanol, la tran~fo".lalion dans F~rh~ichi~ coli, etc ... sont bien connl~es de l'homme de métier et sont abondament décrites dans la li~léLa~ [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Labo,~loLy Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, n Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley 8c Sons, New York, 1987].
Les pl~mi~i~s de type pBR322, pUC et les phages de la série M13 sont d'origine commerciale (Bethesda Research Laboratories).
Pour les ligatures, les fragments d'ADN peuvent être séparés selon leur taille l5 par électrophorèse en gels d'agarose ou d'acrylamide, extraits au phénol ou par un mélange phénoVchlol. foll-le, précipités à l'éthanol puis incubés en présence de l'ADN
ligase du phage T4 (Biolabs) selon les recomm~n~l~tions du fournisseur.
Le remplissage des extrémités 5' proéminentes peut être effectué par le fragment de Klenow de l'ADN Polymérase I d'E. coli (Biolabs) selon les spécifications 20 du fournisseur. La destruction des extrémités 3' proéminentes est effectuée en présence de l'ADN Polymérase du phage T4 (Biolabs) utilisée selon les recornm~n~i~tions du fabricant. La destruction des extrémités 5' proéminentes est effectuée par un traitement ménagé par la nucléase S1.
La mutag~nèse dirigée in vitro par oligodéoxynucléotides synthétiques peut 25 être effectuée selon la méthode développée par Taylor et al. lNucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764] en l~tilisant le kit distribué par Amersham.
L'amplification enzymatique de fragments d'ADN par la technique dite de PCR
[E~olymérase-catalyzed_hain Reaction, Saiki R.K. et al., Science ~ (1985) 1350-1354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzyrn. 155 (1987) 335-350] peut être 30 effectuée en utili~c~nt un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) selon les spécificafions du fabricant.
La vérification des séquences nucléotidiques peut être effectuée par la méthode développée par Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467] en utilisant le kit distribué par Amersham.
Wo 95/2s803 Pcr/l~h5S,'~249 F,xempl~c Exemple l: Construction du vecteur pSh-Ad-aFGF.
Cet exemple décrit la construction d'un vecteur co,--prenalll une séquence d'ADN codant pour le aFGF précédée d'une séquence de sécrétion hétérologue, sous5 le contrôle d'un promoteur con~itué par le LTR du virus du sarcome de rous (LTR-RSV).
1.1. Vecteur de départ (pXL2244): Le plasmide pXL2244 contient l'ADNc de l'ApoAI sous le contrôle du promoteur LTR du virus RSV, ainsi que des séquences de l'adénovirus Ad5 (figure 1). Il a été con~ uil par insertion d'un fragment ClaI-EcoRV
lO contenant l'ADNc codant pour la préproApoAI dans le vecteur pLTR RSV-~gal (Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest. 90 (1992) 626), digéré par les même enzymes.
1.2. Construction d'une séquence ADNc codant pour le aFGF.
lS Pour permettre la réalisation de vecteurs selon l'invention, une séquence d'ADNc codant pour le aFGF humain a été construite comme suit:
- Une séquence d'ADNc codant pour le aFGF humain comprenant 134 acides aminés (aFGF134) a été isolée à partir du plasmide pMJ26 ~Jaye et al., J. Biol. Chem.
262 (1987) 16612). Le pl~cmi~e pMJ26 contient une séquence d'ADNc codant pour le20 aFGF humain précédée de la séquence du site de restriction EcoRI. La séquence du plasmide au niveau de cette région est la suiv~ e (site EcoRI sollligné et codon start en gras):
...GA~TTCATG...
Après digestion par l'enzyme EcoRI, les extrémités du site de restriction ont 2s été rendues franches par traitement à la nucléase mung bean. Les fr~gm~ntc obtenus possèdent les e~rén,i~es suivantes (codon start en gras):
...GAATTCATG... (pMJ26) ...G CATG... (EcoRI + Nucléase mung bean) Cette séquence a ensuite été modifiée par insertion d'une séquence de sécrétion. L'introduction de cette séquence est particulièrement avantageuse puisqu'elle permet la libération extr~cell~ ire plus efficace du aFGF synthétisé par les cellules infectées par les vecteurs de l'invention. Plus particulièrement, la séquence obtenue ci-dessus a été modifiée par insertion, à l'exllémi~e 5' et en phase de Wo 95/25803 PCT~s5/00249 la séquence codante du aFGF, d'un oligonucléotide synthétique double brin correspondant à la séquence de sécrétion de l'in~rén~n de fibroblastes h~ ;n~
(Taniguchi et al., Gene 10 (1980) 11). Chaque brin de cet olig~ n~cléoti~ie a été
synthétisé chimiquement au moyen d'un synth~ti~ r d'acides nucléiques, puis hybridé
5 pour recon~tittler l'ADN double brin. La séquence utilisée conti~nt l'~n~h~in~m~nt des 70 pb suivantes (SEQ ID n 1):
GGCTCGAG ATG ACC AAC AAG TGT CTC CTC CAA ATT GCT CTC CTG TTG TGC
Met Thr Asn Lys Cys Leu Leu Gln Ile Ala Leu Leu Leu Cys TTC TCC ACT ACA GCT CTT TC
Phe Ser Thr Thr Ala Leu Se - Cet oligonucléotide comprend, à l'extrémité 5' de la séquence de sécrétion, un site XhoI (souligné dans la séquence ci-dessus). Cet oligon~lrléotide double brin a été
ligaturé avec la séquence codant pour le aFGF digérée par EcoRI et la mlcle~e mung bean comme décrit ci-avant. Un clone prés~nt~nt l'insert dans l'orientation correcte a ensuite été isolé et vérifié par séquençage. Le fragment complet présent dans ce clone, contenant la séquence codant pour le aFGF précédée de la séquence de sécrétion, a ensuite été isolé par digestion par les enzymes XhoI et BglII (site BglII situé après Ie codon stop), puis ligaturé avec le vecteur p267 ~Jaye et al., EMBO J. 7 (1988) 963) préalablement ouvert par les mêmes enGy",es. Le vecteur résultant a été désigné
pMJ35.
- La séquence préparée ci-dessus a ensuite été modifiée par la technique de PCR, en l1tili.~nt comme amorce les oligonucléotides suivants:
Oligonucléotide 5': 5'-GCGATCGATCTCGAGATGACCAACAAG-3' (SEQ ID n2) Oligonucléotide 3': 5'-CTCGGTACCTCTTTAATCAGAAGAGAC-3' (SEQ ID n3) Les étapes d'amplification par PCR sur le plasmide pMJ35 permettent d'introduire de part et d'autre de la séquence chimPrique "séquence de sécrétion/aFGF"
des sites de restriction applopliés. Plus précisément, ces étapes perrnettent l'incor~d~ion d'un site ClaI à l'extrémité 5' (séquence soulignée en simple dansl'oligonucléotide 5', qui indique sa position par rapport au codon start souligné en double) et d'un site KpnI à l'~ e~l,ilé 3' (séquence soulignée en simple dans l'oligonucléotide 3'). Les sites créés permettent l'insertion de la séquences dans des conditions d'expression dans les vecteurs de l'invention.
1.3. Construction du vecteur pSh-Ad-aFGF
2 1 ~4409 wo 95/25803 P~ l/1'~55~D249 Cet exemple décrit la construction du vecteur pSh-Ad-aFGF cont~n~nt la séquence codant pour le aFGF précédée d'une séquence de sécrétion, sou~. contrôle du LTR du virus RSV, ainsi que des séquences de l'adénovirus Ad5 permettant la recornbin~i~n in vivo.
Le fragment de PCR préparé dans l'exemple 1.2. a été digéré par les er~ym~s ClaI et KpnI, et le fragment de 0,5 kb résultant, cont~n~nf la séquence codant pour le aFGF précédée du signal de sécrétion de l'.nt~,~élon de fibroblastes hurnain a ensuite été isolé et purifié par électrophorèse sur un gel d'agarose LMP ("Low Melting Point"). Parallèlement, le vecteur pXL2244 a été digéré par les mêmes en~ymes delo restriction ClaI et KpnI, puis précipité après inactivation de ces dernières. Le vecteur linéaire résultant, préalablement isolé et purifié par électrophorèse sur un gel d'agarose, et le fragment de 0,5 kb ont ensuite été ligaturés pour générer le vecteur pSh-Ad-aFGF (figure 2). L'ensemble de la séquence nucléotidique de l'insert aFGF a ensuite été vérifiée par séquençage didéoxynucléotides.
Exemple 2. Fonctionalité du vecteur pSh-Ad-aFGF
La c~pacité du vecteur pSh-Ad-aFGF à exprimer sur culture cellulaire une forme biologiquement active du aFGF a été démontrée par transfection transitoire de cellules COS1. Pour cela, les cellules (2.106 cellules par boite de 10 cm de diamètre) ont été transfectées (8 ~lg de vecteur) en présence de Transfectam. Après 48 heures, le surn~ge~nt de culture des cellules a été récolté. Des dilutions sérielles (1/200 et 1/50) de ce surnageant ont ensuite été ajoutées à des cultures de cellules NIH 3T3. L'effet trophique sur ces cultures a été observé par incorporation de thymidine radiomarquée.
Parallèlement, la production de aFGF par les cellules transfectées a ég~l~ment été
démc-ntrée par immunodétection.
Exemple 3. Construction d'un adénovirus recombinant Ad-aFGF contenant une séquence codant pour le aFGF
Le vecteur pSh-Ad-aFGF a été linéarisé et cotransfecté avec un vecteur adénoviral déficient, dans les cellules helper (lignée 293) apportant en t7ans les fonctions codées par les régions E1 (ElA et ElB) d'adénovirus.
Plus précisément, l'adénovirus Ad-aFGF a été obtenu par recombinaison homologue in vivo entre l'adénovirus mutant Ad-dll324 (Thimm~ppaya et al., Cell 31 (1982) 543) et le vecteur pSh-Ad-aFGF, selon le protocole suivant: le plasrnide pSh-WO 95/25802 1 84409 Wo 95/25803 PCT ~ R95 / 00249 grow human fibroblast acid (haFGF) under the control of a promoter. ", ~ U ~ t an eA ~, e ~ ion majority in the nervous system.
A particular mode ~ preferred menl of implementation of the present i ~ v ~ l ~ tion resides in a defective recombinant adenovirus co, npre, lant ITT sequences, a 5 sequence for packaging, a DNA sequence coding for the factor growth of human acid fibroblasts (haFGF) or a derivative thereof under the control of a promoter allowing a majority expression in the system nervous, and in which the E1 gene and at least one of the E2, E4, L1-L5 genes is non functional.
The defective adenoviruses according to the invention are adenoviruses which cannot be replicate autonomously in the target cell. Generally, the genome of defective adenoviruses used in the context of the present invention is therefore devoid of at least sequences necessary for the replication of said virus in the infected cell.
These regions can either be eliminated (in whole or in part) or made non-existent.
15 functional, or substituted by other sequences and not ~ mm ~ nt by the sequence of DNA encoding aFGF.
~ r ~ fe, in ~ iellement, the defective virus of the invention preserves the sequences of its genome which are necçs ~ ires to encaps ~ tion of viral particles. Even more pr ~ nli ~ llem ~ nt, as indicated above, the genome of the defective recombinant virus ~ nt according to the invention comprises the ITR sequences, a sequence allowing packaging, the non-functional E1 gene and at least one of the E2, E4, L1-L5 genes nonfunctional. They are preferably the E1 and E4 genes.
There are different serotypes of adenovirus, the structure and properties of which vary somewhat. Among these serotypes, it is preferred to use in the context of 25 present invention adenovirus h ~ in. ~ Type 2 or 5 (Ad 2 or Ad 5) or adenovirus of animal origin (see lem ~ n (FR 93 05954). Among the adenoviruses of animal origin which can be used in the context of the present invention, mention may be made of adenovirus of canine, bovine, murine origin (example: Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, avian or even simian (example: SAV). Of Preferably, the adenovirus of animal origin is a canine adenovirus, more preferably a CAV2 adenovirus [strain m ~ nh ~ n or A26 / 61 (ATCC VR-800) for example]. Preferably, in the context of the invention, adenovirus of human or canine or mixed origin.
.
Wo 95/25803 Pcr ~ R95 / 00249 -The defective recombinant adenovirus ~ nt.c according to the invention can be pr ~ pa, ~ s by any technique known to the skilled person (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). In particular, they can be pt ~ prepared by homologous recombination between an adenovirus and a plasmid carrying 5 inter alia the DNA sequence coding for aFGF. The recce. "Binaiscn counterpart product after co-transfection of said adenovirus and plasmid in a cell line appr ~, iée. The cell line used should preferably (i) be transformable by said é1em ~ nt ~, and (ii), include the sequences capable of complémen ~ er the part of the defective adenovirus genome, preferably in integrated form to avoid o risks of recombination. As an example of a line, the line of human embryonic kidney 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) which contains null ~ e- ~ l, integrated into its genome, the left part of the genome of a Ad5 adenovirus (12 ~ o). Strategies for constructing vectors derived from adenoviruses have also been described in applications n FR 93 05954 and FR 93 08596 which are incorporated herein by reference.
Finally, the adenoviruses which have multiplied are recovered and purified according to the conventional techniques of molecular biology, as illustrated in the examples.
As indicated above, the present invention relates to ~ lem ~ nt any ~ tili ~ qtion of ~ an adenovirus as described above for the pr ~ pa, ~ ion of a 20 pharmaceutical composition for the treatment and / or pt ~ ve "~ ion of m ~ c neurodegenerative. More particularly, it relates to any use of these adenovirus for ~, epaldtion of a pharmaceutical composition intended for tr ~ itement and / or prevention of Parkinson's disease, Al7heimf ~ r disease, a-ryote lateral sclerosis, phique (ALS), HllntinEton disease, epilepsy 25 and vascular dementia.
The present invention also relates to a pharm ~ cel-tick composition cervix, one or more defective recombinant adenoviruses as described Previously These pharmaceutical compositions can be formulated for of topical, oral, parenteral, intravenous, inllaveinous, Intramuscular, subcutaneous, intraocular, transdermal, etc. Preferably, ph ~ ceutiques compositions of the invention contain a vehicle ph ~ rm ~ ceu-tically acceptable for an injectable formulation, in particular for an injection directly into the patient's nervous system. These may in particular be solutions sterile, isotonic, or dry compositions, in particular Iyophili. ~ ees, which, by i 2 1 84 ~ 0 ~
Wo 9S / 25803 PCTIFR95 / 00249 addition according to the case of sterilized water or physiological saline, allow the con ~ titution of injectable solutions. Direct injection into the nervous system of the advantageous because it allows the therapeutic effect to be concentrated at the level affected tissue. Direct injection into the patient's central nervous system is 5 advantageous ~ nt performed by means of a stereotaxic injection device. Employment such a device makes it possible to target with great precision the injection site.
In this regard, the invention relates eg ~ lçm ~ nt a method of processing m ~ s neurodegenerative co ~ - ~ prenan ~ .n;. ~ lion to an adenovirus patient recombinant as defined above. More particularly, the invention relates to a 10 method of treatment of neurodegenerative diseases comprising ar ~; n;., Lla ~ ion stereotaxic of a recombinant adenovirus ~ nt as defined above.
The doses of defective recombinant adenovirus used for injection can be adapted according to dirrél ~ nls parameters, and in particular according to the mode of ~ mini ~ tration used, the pathology concerned or the duration of treatment 15 sought. In general, the recombinant adenoviruses ~ nt ~ according to the invention are formulated and a ~ mini ~ very in the form of doses between 104 and 10l4 pfu / ml, and ple ~ erence 106 to 10l pfu / ml. The term pfu ("plaque forming unit") corresponds to the infectious power of a virus solution, and is determined by infection of a culture cell, learned, then measured, generally after 48 hours, of the number of tracks 20 infected cells. Techniques for determining the pfu titer of a viral solution are well documented in the literature.
Another subject of the invention relates to any m ~ mmiferous cell infected with one or more defective recomhin ~ nt.c adenoviruses as described above. More in particular, the invention relates to any infected population of hurn ~ ines cells 25 by these adenoviruses. It can in particular be fibroblasts, myoblasts, hepatocytes, keratinocytes, endothelial cells, glial cells, etc.
The cells according to the invention can come from pri ~ cultures, areas. Those-these can be removed by any technique known to those skilled in the art, and then put in culture under conditions allowing their proliferation. Being more Particularly fibroblasts, these can be readily obtained from biopsies, for example according to the technique described by Ham [Methods Cell.Biol. 21a (1980) 255]. These cells can be used directly for infection by adenovirus, or preserved, for example by freezing, for the ét ~ bli ~ mçnt de autologous banks, for future use. The cells according to the invention Wo 95/25803 Pcr / FR95 / 00249 -may be ~ equal ~ m ~ nt be secondary cultures, obtained by PYemrle from pre-established banks.
The cultured cells are then infected with adenoviruses recombin ~ nt ~, to give them the ability to produce aFGF. The infection is 5 carried out in vitro according to techniques known to those skilled in the art. In particular, depending on the type of cells used and the number of copies of virus per cell desired, the skilled person can adapt the multiplicity of infection and possibly the number of infection cycles performed. It is good ~ ntenrlll that these steps should be performed under sterile conditions applupriés when the cells are cl ~ -stin ~ s at a 10 ~ -lmini ~ tration in vivo. Doses of recombinant adenovirus used for infection cells can be adapted by those skilled in the art according to the purpose ~ cl ~ el., hey. The conditions described above for in vivo administration can be applied to in vitro infection.
Another object of the invention relates to an implant comprising cells 15 n ~, .n; ~ infected with one or more defective recomhin adenoviruses ~ nt ~ c such as described above, and an extracellular matrix. Préférlontiell.om ~ nt impl ~ ntc according the invention c ~ .l, pl ~ ent 105 to 101 cells. More prerel ~ llliellement, they conlplelment 106 to 108.
More particularly, in the implants of the invention, the matrix extracellular con, p ~ end a gelling compound and possibly a support allowing the anchoring of cells.
For yl ~ pal ~ tion of implants according to the invention, difrél ~ types of gelling agents can be used. Gelling agents are used for the inclusion of cells in a matrix having the constitution of a gel, and to favor the anchoring of the cells 2 ~ on the support, if applicable. Different cell adhesion agents can therefore be used as ~ lifi ~ nt ~, such as in particular collagen, gel ~ tin ~, glycosaminoglycans, fibronectin, lectins, etc. Preferably, one uses in the part of the present invention of collagen. It can be a collection of human, bovine or murine origin. More preferably, type I collagen is used.
As indicated above, the compositions according to the invention co-llpl ~ lment advantageously a support allowing the anchoring of the cells. The term anchoring means any form of biological and / or chemical and / or physical interaction involving adhesion and / or fixing of the cells on the support. Furthermore, cells can either cover the support used, or penetrate inside this support, or both.
WO 9S / 25803 P ~ l / rl ~ 9S / 00249 It is preferred to use, within the framework of the invention, a solid, non-toxic and / or bio-cnmpatihle. In particular, polytetrafluoroethylene fibers can be used ) or a support of biological origin.
The imr ~ nt ~ according to the invention can be located in different sites of 5 gold ~ ~, s, l, e. In particular, the impl ~ nt ~ tion can be performed at the level of the cavity peritoneal, in the subcutaneous tissue (suprapubic region, iliac fossa or inguinal, etc), in an organ, a muscle, a tumor, the system, central v ~ ux, or under a mucous membrane. The impl ~ nt ~ according to the invention are particular ~ -ne "l advantageous in that they allow the release of the product to be controlled 10 tea, c.peulique in the organism: This is first of all determined by the mllltipli ~ ite infection and the number of cells implanted. Then release can be controlled either by the removal of the implant, which stops deLn, ~ only tr ~ itement, or by the use of regulatable expression systems, making it possible to induce or suppress expression of therapeutic genes.
The present invention thus provides a very effective means for tr ~ ite-ment or the p, ev ~ "lion of neurodegenerative diseases. It is very particular ~ el" ~ nL adapted to the treatment of Alzheimer's, Parkinson's, Huntington's, and ALS's. The adenoviral vectors according to the invention also have impo ~ L ~ L ~ advantages, 20 linked in particular to their very high efficiency of infection of nerve cells, allowing infections to be carried out from small volumes of viral suspension.
In addition, infection with the adenoviruses of the invention is very localized at the injection site, which avoids the risks of diffusion to neighboring brain structures.
In addition, this treatment can concern both humans and any animal such as 2s that the sheep, the cattle, the years "" to the servants (dogs, cats, etc), the horses, the fish, etc.
The present invention will be more fully described with the aid of the examples.
which follow, which should be considered as illustrative and not limiting.
~ ~ hangs from the figures Figure 1: Representation of the vector pXL2244 Figure 2: Representation of the vector pSh-Ad-aFGF
wo 95/25803 PCT ~ R95 / 00249 General techniques of molecular biology The methods conventionally used in molecular biology such as extractions p, ~ pal ~ lives of pl ~ mi ~ ic DNA ~ centrifugation of DNA p ~ only in cesium chloride gradient, electrophoresis on agarose or acrylamide gels, 5 pllrifi ~ ation of fr ~ gment ~ DNA by electroelution, protein extraction at phenol or phenol-chlol ~ folme, the precipitation of DNA in a saline medium by ethanol or iso ~, opanol, tran ~ fo ".lalion in F ~ rh ~ ichi ~ coli, etc ... are good Connl ~ es of the skilled person and are abundantly described in the li ~ léLa ~ [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Labo, ~ loLy Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, n Cold Spring Harbor, NY, 1982; Ausubel FM et al. (eds), "Current Protocols in Molecular Biology ", John Wiley 8c Sons, New York, 1987].
The pl ~ mi ~ i ~ s type pBR322, pUC and phages of the M13 series are of commercial origin (Bethesda Research Laboratories).
For ligations, DNA fragments can be separated according to their size l5 by electrophoresis in agarose or acrylamide gels, phenol extracts or by a phenoVchlol mixture. foll it, precipitated with ethanol then incubated in the presence of DNA
phage T4 ligase (Biolabs) according to the supplier's recommendations.
The filling of the protruding 5 ′ ends can be carried out by the Klenow fragment of DNA Polymerase I from E. coli (Biolabs) according to specifications 20 of the supplier. The destruction of the protruding 3 'ends is carried out in the presence of phage T4 DNA Polymerase (Biolabs) used according to the recornm ~ n ~ i ~ tions of maker. Destruction of the prominent 5 'ends is effected by treatment formed by nuclease S1.
Mutagenesis directed in vitro by synthetic oligodeoxynucleotides can 25 be carried out according to the method developed by Taylor et al. lNucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764] using the kit distributed by Amersham.
Enzymatic amplification of DNA fragments by the so-called PCR technique [E ~ olymerase-catalyzed_hain Reaction, Saiki RK et al., Science ~ (1985) 1350-1354; Mullis KB and Faloona FA, Meth. Enzyrn. 155 (1987) 335-350] may be 30 carried out using a "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) according to the manufacturer specifications.
Verification of nucleotide sequences can be carried out by the method developed by Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467] in using the kit distributed by Amersham.
Wo 95 / 2s803 Pcr / l ~ h5S, '~ 249 F, xempl ~ c Example 1: Construction of the vector pSh-Ad-aFGF.
This example describes the construction of a vector co, - prenalll a sequence DNA coding for aFGF preceded by a heterologous secretion sequence, under the control of a promoter con ~ ituted by the LTR of the sarcoma virus (LTR-RSV).
1.1. Starting vector (pXL2244): The plasmid pXL2244 contains the cDNA of ApoAI under the control of the RSV virus LTR promoter, as well as sequences of Ad5 adenovirus (Figure 1). It was designed by insertion of a ClaI-EcoRV fragment lO containing the cDNA coding for preproApoAI in the vector pLTR RSV- ~ gal (Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest. 90 (1992) 626), digested by the same enzymes.
1.2. Construction of a cDNA sequence coding for aFGF.
lS To allow the production of vectors according to the invention, a sequence of cDNA encoding human aFGF was constructed as follows:
- A cDNA sequence coding for human aFGF comprising 134 acids amines (aFGF134) was isolated from the plasmid pMJ26 ~ Jaye et al., J. Biol. Chem.
262 (1987) 16612). The pl ~ cmi ~ e pMJ26 contains a cDNA sequence encoding human aFGF20 preceded by the EcoRI restriction site sequence. The sequence of plasmid at the level of this region is the following (EcoRI site requested and codon start in bold):
... GA ~ TTCATG ...
After digestion with the EcoRI enzyme, the ends of the restriction site have 2s were made frank by treatment with nuclease mung bean. The fr ~ gm ~ ntc obtained have the following e ~ ren, i ~ es (start codon in bold):
... GAATTCATG ... (pMJ26) ... G CATG ... (EcoRI + Nuclease mung bean) This sequence was then modified by inserting a sequence of secretion. The introduction of this sequence is particularly advantageous since it allows the more efficient extr ~ cell ~ ire release of the aFGF synthesized by cells infected with the vectors of the invention. More specifically, the sequence obtained above was modified by insertion, at the exllémi ~ e 5 'and in the phase of Wo 95/25803 PCT ~ s5 / 00249 the coding sequence for aFGF, a synthetic double-stranded oligonucleotide corresponding to the secretion sequence of in ~ ren ~ n of fibroblasts h ~; n ~
(Taniguchi et al., Gene 10 (1980) 11). Each strand of this olig ~ n ~ cleoti ~ ie has been chemically synthesized using a synth ~ ti ~ r of nucleic acids, then hybridized 5 to reconstitute double stranded DNA. The sequence used conti ~ nt the ~ n ~ h ~ in ~ m ~ nt 70 bp following (SEQ ID n 1):
GGCTCGAG ATG ACC AAC AAG TGT CTC CTC CAA ATT GCT CTC CTG TTG TGC
Met Thr Asn Lys Cys Leu Leu Gln Ile Ala Leu Leu Leu Cys TTC TCC ACT ACA GCT CTT TC
Phe Ser Thr Thr Ala Leu Se - This oligonucleotide comprises, at the 5 'end of the secretion sequence, a XhoI site (underlined in the sequence above). This double stranded oligonucleotide was ligated with the sequence coding for the aFGF digested by EcoRI and the mlcle ~ e mung bean as described above. A clone presents the insert in the correct orientation.
then isolated and verified by sequencing. The complete fragment present in this clone, containing the sequence coding for aFGF preceded by the secretory sequence, a then isolated by digestion with the enzymes XhoI and BglII (BglII site located after Ie codon stop), then ligated with the vector p267 ~ Jaye et al., EMBO J. 7 (1988) 963) previously opened by the same enGy ", es. The resulting vector has been designated pMJ35.
- The sequence prepared above was then modified by the technique of PCR, in l1tili. ~ Nt as primer the following oligonucleotides:
5 'oligonucleotide: 5'-GCGATCGATCTCGAGATGACCAACAAG-3' (SEQ ID n2) 3 'oligonucleotide: 5'-CTCGGTACCTCTTTAATCAGAAGAGAC-3' (SEQ ID n3) The PCR amplification steps on the plasmid pMJ35 allow to introduce on either side of the chemical sequence "secretion sequence / aFGF"
restriction sites applied. More specifically, these steps allow the incor ~ d ~ ion of a ClaI site at the 5 ′ end (sequence underlined in single in the oligonucleotide 5 ′, which indicates its position relative to the start codon underlined in double) and a KpnI site at ~ e ~ l, 3 'island (sequence underlined in single in oligonucleotide 3 '). The sites created allow the insertion of the sequence in expression conditions in the vectors of the invention.
1.3. Construction of the vector pSh-Ad-aFGF
2 1 ~ 4409 wo 95/25803 P ~ l / 1 '~ 55 ~ D249 This example describes the construction of the vector pSh-Ad-aFGF cont ~ n ~ nt the sequence coding for aFGF preceded by a secretory sequence, sou ~. control of RSV virus LTR, as well as Ad5 adenovirus sequences allowing the recornbin ~ i ~ n in vivo.
The PCR fragment prepared in Example 1.2. has been digested by er ~ ym ~ s ClaI and KpnI, and the resulting 0.5 kb fragment, contains the sequence encoding the aFGF preceded by the secretion signal of the nt ~, ~ elon of human fibroblasts a then was isolated and purified by electrophoresis on an agarose gel LMP ("Low Melting Point "). At the same time, the vector pXL2244 was digested with the same en ~ ymes delo restriction ClaI and KpnI, then precipitated after inactivation of the latter. The vector resulting linear, previously isolated and purified by electrophoresis on an agarose gel, and the 0.5 kb fragment were then ligated to generate the vector pSh-Ad-aFGF (Figure 2). The entire nucleotide sequence of the aFGF insert was then was verified by dideoxynucleotide sequencing.
Example 2. Functionality of the vector pSh-Ad-aFGF
The capacity of the vector pSh-Ad-aFGF to express on cell culture a biologically active form of aFGF has been demonstrated by transient transfection of COS1 cells. For this, the cells (2,106 cells per 10 cm diameter box) were transfected (8 ~ lg of vector) in the presence of Transfectam. After 48 hours, the cell culture supernatant was harvested. Serial dilutions (1/200 and 1/50) of this supernatant were then added to cultures of NIH 3T3 cells. The effect trophic on these cultures was observed by incorporation of radiolabelled thymidine.
At the same time, the production of aFGF by the transfected cells has also been demonstrated by immunodetection.
Example 3. Construction of a Ad-aFGF Recombinant Adenovirus Containing a coding sequence for aFGF
The vector pSh-Ad-aFGF was linearized and cotransfected with a vector adenoviral deficient, in helper cells (line 293) providing in t7ans the functions encoded by the E1 regions (ElA and ElB) of adenovirus.
More specifically, the Ad-aFGF adenovirus was obtained by recombination homologous in vivo between the mutant adenovirus Ad-dll324 (Thimm ~ ppaya et al., Cell 31 (1982) 543) and the vector pSh-Ad-aFGF, according to the following protocol: the plasrnide pSh-WO 95/2580
3 P~l/r~9S/00249 -Ad-aFGF et l'adénovirus Ad-dll324, line~ri~é par l'enzyme ClaI, ont été co-transfectés dans la lignée 293 en présence de phosph~te de s~ m, pour permettre la recombinaison homologue. Les adénovirus recomhin~nt~ ainsi générés ont été
sélectionnés par purific~ticn sur plaque. Après i.colemPtlt, l'ADN de l'adénovirus 5 recombinant a été ~mplifie dans la lignée cellulaire 293, ce qui conduit à un surnageant de culture co..len~.l l'adénovirus défectif recomhin~nt non purifié ayant un titre d'environ 101 pfu/ml.
Les particules virales sont ensuite p Irifiées par centrifugation sur gradient de chlorure de césium selon les techniques connues (voir notamment Graham et al., lo Virology 52 (1973) 456). L'adénovirus Ad-aFGF peut être conservé à -80C dans 20 % de glycérol.
Exemple 4. Fonctionalité de l'adénovirus Ad-aFGF
La c~p~cité de l'adénovirus Ad-aFGF à infecter des cellules en culture et à
exprimer dans le milieu de culture une forme biologiquement active du aFGF a été1S démontrée par infection des lignées 293 hum~ine et PC12 de rat. La présence de aFGF
actif dans le surnageant de culture a ensuite été dherminée dans les mêmes conditions que dans l'exemple 2.
Ces études permettent de montrer que l'adénovirus exprime bien une forme biologiquement active du aFGF en culture cellulaire.
20 Exemple 5: Transfert in vivo du gène aFGF par un adénovirus recombinant à
des rats p. e~ tant une lésion du fimbria-fornix Cet exemple décrit le transfert du gène aFGF in vivo au moyen d'un vecteur adénoviral selon l'invention. Il montre sur un modèle animal de la lésion du fimbria-fornix, que les vecteurs de l'invention permettent d'induire l'expression in vivo de 25 quantités thérapeutiques de aFGF.
Sur des rats préalablement ~n~sthé~ies, la voie septo-hippocampique (fimbria-fornix) a été sectionnée au niveau de l'hélJ,is~hère gauche. Cette lésion m~c~nique a été réalisée à l'aide d'un couteau chirurgical rétractable. Les coordonnées stéréotaxiques utilisées à cet effet sont, par rapport au bregma: AP: -1,7; ML: +1,5;
V: -5,5 à -0,5.
Wo ss/2s803 Pcr/FR95/00249 L'adénovirus recombinant aFGF a été injecté immét~i~tem~nt après la lésion, dans le noyau médian du septum et dans la partie dorsale de l'hippocampe déaf~élelllé
(hippocampe du coté de la lésion). Plus particuliè~elllen~, l'adénovirus injecté est l'adénovirus Ad-aFGF préparé dans l'exemple 3.1., utilisé sous forme purifiée (3,5 106 5 pfu/lll), dans une solution saline phQsph~te (PBS).
Les injections sont réalisées à l'aide d'une canule (tli~mptre extérieur 280 ~m)connectée à une pompe. La vitesse d'injection est fixée à 0,5 ~I/min, après quoi, la canule reste en place pendant 4 minutes suppli~m~ntaires avant d'être remontée. Les 10 volumes d'injection dans l'hippocampe et le septum sont respectivement 3 ~l et 2 ~l.
La concentration d'adénovirus injectée est de 3,5. 106 pfu/~l.
Pour l'injection dans l'hippocampe, les coordonn~çs stéréotaxiques sont les suivantes: AP=-4; ML=3,5; V=-3,1 (les coordonnées AP et ML sont déterminées par rapport au bregma, la coordonnée V par rapport à la surface de l'os crânien au niveau 15 du bregma.
Pour l'injection dans le septum, les coordonnées stéréotaxiques sont les suivantes: AP=1; ML=1; V=-6 (les coordonnées AP et ML sont déterminées par rapport au bregma, la coordonnée V par rapport à la surface de l'os crânien au niveau du bregma. Dans cette condition, la canule présente un angle de 9 degrés par rapport à
20 la verticale (dans le sens médio-latéral) afin d'éviter le sinus veineux mérli~n Les effets thérapeutiques de l'~mini.~tration de l'adénovirus selon l'invention ont été mis en évidence par trois types d'analyse: une analyse histologique et immunohi~tochimique, une analyse quan~i~a~ive et une analyse comportement~
Analyse histologique et immunohistochimique La lésion mécanique du fimbria-fornix induit une perte de neurones cholinergiques (révélée en immunohistologie par un anticorps anti-choline acétyltransférase, ChAT) dans le septum médian, ainsi que la dénervation cholinergique dans l'hippocampe (detectee en histochimie par l'activité de l'acétyl choline estérase, AChE).
L'analyse histologique des cerveaux injectés est réalisée 3 s~m~in~s après I'injection intracérébrale de l'adénovirus Ad-aFGF. Pour cela, les animaux sont sacrifiés, sous anesthésie, par perfusion intracardiaque de 4% paraformaldéhyde. Après prélèvement, post-fixation et cryoprotection, le cerveau est coupé au cryomat selon le WO 95l25803 PcrlFRssloo249 plan coronal: des coupes sériées coronales de 30 ,um d~épai~el~r sont réalisées sur toute la longueur du septum médian et aux niveaux ~nt~riellr, médian et postérieur de l'hippocampe. Pour le septum médian, des coupes espacées de 180 ,um (1 coupe sur 6) sont colorées au crésyl violet (pour évaluer la densité neuronale) et ;.. ~no.. ~uées 5 par un anticorps anti ChAT (Biochem) (pour identifier les neurones cholinergiques).
La méthode immlmc)hi~to~himique est celle de la ~ t~vidine-biotine pe~u~y~se révélée par la DAB. Pour l'hippocampe, des coupes espacéos de 180 ,um sont colorées selon la méthode hi~tochimique pour l'AChE (acétyl choline estérase) afin de détecter l'imlel va~ion cholinergique. Les coupes sont montées sur lames de verre.
lO Analyse qua"li~alive Le nombre de neurones cholinergiques (ChAT positifs) dans le septum médian est le paramètre d'évaluation des effets de l'adénovirus Ad-aFGF. Le dénombrement est réalisé sur un échantillon (1 coupe sur 6 sur toute la longueur du septum médian). Pour chaque coupe, les neurones ChAT positifs sont tlenomhrés 15 sépali~ ent des 2 cotés du septum. Les résultats cumulés pour toutes les coupes sont exprimés par le rapport du nombre de neurones ChAT positifs du coté lésé sur le nombre de neurones ChAT positifs du coté non lésé.
Analyse comportementale Il est connu qu'une lésion bilatérale de la voie septo-hippocampique conduit à
20 des déficits mnésiques. Les effets fonctionnels protecteurs d'une injection d'adénovirus Ad-aFGF sur ce type de lésion sont mis en évidence par analyse des performances mnésiques des animaux au cours de 2 tests comportementaux: le test de la piscine de Morris (mémoire de référence visuo-spatiale) et le test TMTT (I'two-trials memory task"; "mémoire à court-terme d'un environnement nouveau").
25 Exemple 6: Transfert in vivo du gène aFGF par un adénovirus recombinant à
des rats présentant une lésion de la voie nigro-striée Cet exemple décrit le transfert du gène aFGF in vivo au moyen d'un vecteur adénoviral selon l'invention. Il montre sur un modèle animal de la lésion de la voie nigro-striée, que les vecteurs de l'invention permettent d'induire l'expression in vivo de 30 qllal~ és thérapeutiques de aFGF.
21 ~4~0~
WO9S/25803 PCIlr~5;~ 249 Sur des rats préalablement anesthésiés, la voie nigro-striée a été lésée au niveau du f~iscea,l me~ncéph~lique médian (MFB) par injection de la toxine 6-llydl~y dopa",-ne (60H-DA). Cette lésion chimique par injection a été unilatérale, suivant les coordonnees stéréotaxiques S~livdnl~s: AP: 0 et -1; ML: +1,6; V: -8,6 et -9 (les coordonnées AP et ML sont déterminées par rapport au bregma, la coordonnée V par rapport à la dure-mère). La barre d'incisive est fixée au niveau +5 mm.
L'adénovirus recombin~nt aFGF a été injecté imme~i~t~m~nt après la lésion, dans la subst~nce noire et le stri~hlm, du coté de la lésion. Plus particulièrement, l'adénovirus injecté est l'adénovirus Ad-aFGF préparé dans l'exemple 3.1., utilisé sous forme purifiée (3,5 106 pfu/,ul), dans une solution saline phQ~ph~te (PBS).
- Les injections ont été réalisées à l'aide d'une canule (diamètre extérieur 280 m) connectée à une pompe. La vitesse d'injection est fixée à 0,5 ~l/min, après quoi, la canule reste en place pendant 4 minutes supplémentaires avant d'être remontée Les volumes d'injection dans le striatum et la substance noire sont respectivement 2x3 ~l et 2 ~1. La concentration d'adénovirus injectée est de 3,5. 106 pfu/~l.
Pour l'injection dans la substance noire, les coordonnées stéréotaxiques sont les suivantes: AP=-5,8; ML=+2; V=-7,5 (les coordonnées AP et ML sont (leterminées par rapport au bregma, la coordonnée V par rapport à la dure-mère).
Pour les injections dans le striatum, les coordonnées stéréotaxiques sont les suivantes: AP=+0,5 et -0,5; ML=3; V=-5,5 (les coordonnées AP et ML sont déterminées par rapport au bregma, la coordonnée V par rapport à la dure-mère).
Les effets thérapeutiques de l'administration de l'adénovirus selon l'invention ont été mis en évidence par trois types d'analyse: une analyse histologique et immunohi~to~himique~ une analyse quantil~tive et une analyse comportem~nt~le.
Analyse histologique et immunohistochimique La lésion chimique de la voie nigro-striée induit une perte neuronale dans la substance noire ainsi que la dénervation dopaminergique dans le striatum (révélées en immunohistologie par un anticorps anti-tyrosine hydroxylase, TH).
L'analyse histologique des cerveaux injectés est réalisée 3 s~m~in~s après l'injection intracérébrale de l'adénovirus Ad-aFGF dans les conditions décrites dans W095/25803 2 1 8 4 4 0 9 P~l/r~S/00249 l'~Y~mple 6. Les coupes sériées coronales de 30 ,um d'ép~ e~ sont réalisées dans la subst~nce noire et le stnatl~m. Des coupes espacées de 180 ,um (1 coupe sur 6) sont colorées au crésyl violet (pour évaluer la densité neuronale) et immuno."af~,lées par un anticorps anti ty~sine },y~ylase (TH) (pour détecter les neurones 5 dop~minergiques dans la suhst~nce noire et leur innervation dans le stri~t..m).
Analyse qua,~ alive Le nombre de neurones dopaminergiques (TH positifs), dans la subst~nre noire est le paramètre d'évaluation des effets de l'adénovirus Ad-aFGF. Le dénombrement est réalisé sur un é~h~ntillon (1 coupe sur 6 sur toute la longueur de la o substance noire). Pour chaque coupe, les neurones TH positifs sont dénombrés séparément des 2 cotés de la subst~n~e noire. Les résultats cumulés pour toutes les coupes sont exprimés en propol~ion: nombre de neurones TH positifs du coté lésé par rapport au nombre de neurones TH positifs du coté non lésé.
Analyse comportementale Les effets fonctionnels protecteurs d'une injection d'adénovirus Ad-aFGF sur la lésion de la voie nigro-striée sont mis en évidence par analyse des performances sensori-motrices des animaux au cours de 2 tests comportementaux: le test de la rotation induite par des agonistes dopaminergiques (apomorphine, ~mphet~mine et lévodopa), et le test de préhension ("paw-reaching").
Exemple 7: Transfert in vivo du gène aFGF par un adénovirus recombinant à
des rats présentant une lésion de la voie perforante Cet exemple décrit le transfert du gène aFGF in vivo au moyen d'un vecteur adénoviral selon l'invention. Il montre sur un modèle animal de la lésion de la voie perforante, que les vecteurs de l'invention permettent d'induire l'expression in vivo de quantités thérapeutiques de aFGF.
Sur des rats préalablement anesthésiés, la voie entorhino-hippocampique (voie perforante) a été sectionnée unilatéralement à l'aide d'un couteau chirurgical. Les coordonnées stéréotaxiques utilisées à cet effet sont, par rapport au lambda: AP:
+0,75; ML: +4,1 à 6,6; V: -7,7 (coordonnée V déterminée par rapport à la dure-mère).
w095/25803 21 84409 Pcr~95/00249 L'adénovirus recombinant aFGF est injecté immé~ tem~nt après la lésion, soit au niveau de la lésion, soit au niveau de l'hippocampe et du cortex e-.lo.l.;l-~l Plus particulièrement, l'adénovirus injecté est l'adénovirus Ad-aFGF préparé dans l'~xemr'e 3.1., utilisé sous forme purifiée (3,5106 pfu/,ul), dans une solution saline phosphate 5 (PBS).
Les injections ont été réalisées à l'aide d'une canule (diamètre extérieur 280 m) connectée à une pompe. La vitesse d'injection est fixée à 0,5 ~l/min, après quoi, la canule reste en place pendant 4 minutes suppl~om~nt~ires avant d'être rem~ntée. Les lo volumes d'injection dans l'hippocampe, le cortex ~ o.l~ l et le site de lésion de la voie ~,~anle sont respectivement 3 ~l, 2 ~ll et 2 ~l. La concentration d'adénovirus injectée est de 3,5. 106 pfu/~l.
Les effets thérapeutiques de l'administration de l'adénovirus selon l'invention peuvent être mis en évidence par une analyse comportementale dans les conditions de 5 l'exemple 5.
W 095/25803 2 1 &4 'T O~ P~l/rh9S/00249 T.TST~ DF~. SEOUT~'N~T~'~
(1) INFORMATION GENERALE:
s (i) DEPOSANT:
(A) NOM: RHONE-POULENC RORER S.A.
(B) RUE: 20, avenue Raymond ARON
(C) VILLE: ANTONY
(E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 92165 (ii) TITRE DE L' INVENTION: Virus rec~mhinAnts, préparation et utilisation en thérapie génique (iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 3 (iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Tape (B) ORDINATEUR: IBM PC co~patible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (OEB) (2) TNFORMATION POUR T-~ SEO ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 70 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(vi) ORIGINE:
(A) ORGANISME: Homo sapiens (ix) CARACTERISTIQUE ADDITIONELLE:
(D) AUTRE INFORMATION: /product= Séquence Signal (xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
Met Thr Asn Lys Cys Leu Leu Gln Ile Ala Leu Leu Leu Cys Phe Ser Thr Thr Ala Leu (2) INFORMATION POUR T-~ SEO ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 27 paires de bases (B) TYPE: acide nuclélque (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
WO95/25803 2 1 ~ 4 i~ o 9 P~lrn95loo249 (iii) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
(2) INFORMATION POUR T,~ S~O Tn NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 27 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON
(iii) ANTI-SENS: NON
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3: 3 P ~ l / r ~ 9S / 00249 -Ad-aFGF and the adenovirus Ad-dll324, line ~ ri ~ é by the enzyme ClaI, were co-transfected in line 293 in the presence of phosph ~ te of s ~ m, to allow the homologous recombination. The recomhin ~ nt ~ adenoviruses thus generated were selected by purific ~ ticn on plate. After i.colemPtlt, the DNA of the adenovirus 5 recombinant was ~ amplified in cell line 293, which leads to a supernatant of culture co..len ~ .l the defective adenovirus recomhin ~ nt not purified having a titer about 101 pfu / ml.
The viral particles are then filtered by centrifugation on a gradient.
cesium chloride according to known techniques (see in particular Graham et al., lo Virology 52 (1973) 456). Ad-aFGF adenovirus can be stored at -80C in 20 % glycerol.
Example 4. Functionality of the Ad-aFGF Adenovirus The c ~ p ~ city of the Ad-aFGF adenovirus to infect cells in culture and express in the culture medium a biologically active form of aFGF has been demonstrated by infection of lines 293 hum ~ ine and rat PC12. The presence of aFGF
active in the culture supernatant was then dherminated under the same conditions as in Example 2.
These studies show that the adenovirus expresses a form well biologically active aFGF in cell culture.
Example 5: In Vivo Transfer of the aFGF Gene by a Recombinant Adenovirus to rats p. e ~ both a lesion of the fimbria-fornix This example describes the transfer of the aFGF gene in vivo using a vector adenoviral according to the invention. It shows on an animal model of the lesion of the fimbria-fornix, that the vectors of the invention make it possible to induce the expression in vivo of 25 therapeutic amounts of aFGF.
On rats previously ~ n ~ sthé ~ ies, the septo-hippocampal pathway (fimbria-fornix) has been severed at helJ, is ~ left here. This mechanical injury has was performed using a retractable surgical knife. The coordinates stereotaxics used for this purpose are, with respect to bregma: AP: -1.7; ML: +1.5;
V: -5.5 to -0.5.
Wo ss / 2s803 Pcr / FR95 / 00249 The recombinant adenovirus aFGF was injected immet ~ i ~ tem ~ nt after the lesion, in the median nucleus of the septum and in the dorsal part of the deaf hippocampus ~ elelllé
(hippocampus on the side of the lesion). More particularly ~ elllen ~, the adenovirus injected is the Ad-aFGF adenovirus prepared in Example 3.1., used in purified form (3.5 106 5 pfu / lll), in a phQsph ~ te saline solution (PBS).
The injections are carried out using a cannula (tli ~ external mptre 280 ~ m) connected to a pump. The injection speed is set at 0.5 ~ I / min, after which the cannula remains in place for an additional 4 minutes before being reassembled. The 10 injection volumes in the hippocampus and the septum are 3 ~ l and 2 ~ l respectively.
The concentration of adenovirus injected is 3.5. 106 pfu / ~ l.
For injection into the hippocampus, the stereotaxic coordinates are following: AP = -4; ML = 3.5; V = -3.1 (the AP and ML coordinates are determined by relative to bregma, the V coordinate relative to the surface of the cranial bone at the level 15 of bregma.
For injection into the septum, the stereotaxic coordinates are the following: AP = 1; ML = 1; V = -6 (AP and ML coordinates are determined by relative to bregma, the V coordinate relative to the surface of the cranial bone at the level bregma. In this condition, the cannula has an angle of 9 degrees to 20 vertical (in the medio-lateral direction) to avoid the venous sinus merli ~ n The therapeutic effects of the ~ mini. ~ Tration of the adenovirus according to the invention were highlighted by three types of analysis: histological analysis and immunohi ~ tochemical, a quan ~ i ~ a ~ ive analysis and a behavior analysis ~
Histological and immunohistochemical analysis Mechanical damage to the fimbria-fornix induces loss of neurons cholinergic (revealed in immunohistology by an anti-choline acetyltransferase antibody, ChAT) in the median septum, as well as the cholinergic denervation in the hippocampus (detected in histochemistry by the activity of acetyl choline esterase, AChE).
Histological analysis of the injected brains is carried out 3 s ~ m ~ in ~ s after Intracerebral injection of the adenovirus Ad-aFGF. For this, animals are sacrificed, under anesthesia, by intracardiac infusion of 4% paraformaldehyde. After sampling, post-fixation and cryoprotection, the brain is cut in cryomat according to the WO 95l25803 PcrlFRssloo249 coronal plane: serial coronal sections of 30, um ~ thick ~ el ~ r are made on the entire length of the median septum and at the ~ nt ~ riellr, median and posterior levels of the seahorse. For the middle septum, sections spaced 180, um (1 section out of 6) are stained with cresyl violet (to assess neuronal density) and; .. ~ no .. ~ uées 5 by an anti-ChAT antibody (Biochem) (to identify cholinergic neurons).
The immlmc) hi ~ to ~ himic method is that of the ~ t ~ vidine-biotin pe ~ u ~ y ~ se revealed by DAB. For the hippocampus, sections spaced 180, um are colored according to the hi ~ tochemical method for AChE (acetyl choline esterase) in order to detect the imlel goes ~ cholinergic ion. The sections are mounted on glass slides.
lO Analysis qua "li ~ alive The number of cholinergic neurons (ChAT positive) in the septum median is the endpoint for the effects of Ad-aFGF adenovirus. The enumeration is carried out on a sample (1 section out of 6 over the entire length of the median septum). For each section, the positive CHAT neurons are tlenomhré
15 sepali ~ ent on both sides of the septum. The cumulative results for all cuts are expressed by the ratio of the number of positive ChAT neurons on the injured side to the number of positive ChAT neurons on the uninjured side.
Behavioral analysis It is known that a bilateral lesion of the septo-hippocampal pathway leads to 20 memory deficits. Protective functional effects of an adenovirus injection Ad-aFGF on this type of lesion are highlighted by performance analysis animal memory during 2 behavioral tests: the pool test Morris (visual-spatial reference memory) and the TMTT test (I'two-trials memory task ";" short-term memory of a new environment ").
Example 6: In Vivo Transfer of the aFGF Gene by a Recombinant Adenovirus to rats with nigro-striated lesion This example describes the transfer of the aFGF gene in vivo using a vector adenoviral according to the invention. It shows on an animal model of the pathway lesion nigro-striated, which the vectors of the invention allow to induce the expression in vivo of 30 qllal ~ és therapeutic of aFGF.
21 ~ 4 ~ 0 ~
WO9S / 25803 PCIlr ~ 5; ~ 249 In rats previously anesthetized, the nigro-striated pathway was damaged level of f ~ iscea, me ~ median nceph ~ lique (MFB) by injection of toxin 6-llydl ~ y dopa ", - ne (60H-DA). This chemical injury by injection was unilateral, following the stereotaxic coordinates S ~ livdnl ~ s: AP: 0 and -1; ML: +1.6; V: -8.6 and -9 (the AP and ML coordinates are determined relative to the bregma, the coordinate V compared to the dura mater). The incisor bar is fixed at the +5 mm level.
The recombinant adenovirus ~ nt aFGF was injected imme ~ i ~ t ~ m ~ nt after the lesion, in the black substance and the stri ~ hlm, on the side of the lesion. More specifically, the adenovirus injected is the adenovirus Ad-aFGF prepared in Example 3.1., used under purified form (3.5 106 pfu /, ul), in a phQ ~ ph ~ te saline solution (PBS).
- The injections were carried out using a cannula (outside diameter 280 m) connected to a pump. The injection speed is set at 0.5 ~ l / min, after which the cannula remains in place for an additional 4 minutes before being reassembled injection volumes into the striatum and the substantia nigra are respectively 2x3 ~ l and 2 ~ 1. The concentration of adenovirus injected is 3.5. 106 pfu / ~ l.
For dark substance injection, the stereotaxic coordinates are the following: AP = -5.8; ML = + 2; V = -7.5 (the AP and ML coordinates are (terminated with respect to bregma, the V coordinate with respect to the dura mater).
For injections into the striatum, the stereotaxic coordinates are the following: AP = + 0.5 and -0.5; ML = 3; V = -5.5 (the coordinates AP and ML are determined with respect to bregma, the V coordinate with respect to the dura mater).
The therapeutic effects of the administration of the adenovirus according to the invention were highlighted by three types of analysis: histological analysis and immunohi ~ to ~ himique ~ a quantil ~ tive analysis and a behavioral analysis.
Histological and immunohistochemical analysis The chemical lesion of the nigro-striated pathway induces a neuronal loss in the black substance as well as the dopaminergic denervation in the striatum (revealed in immunohistology by an anti-tyrosine hydroxylase antibody, TH).
Histological analysis of the injected brains is carried out 3 s ~ m ~ in ~ s after intracerebral injection of the Ad-aFGF adenovirus under the conditions described in W095 / 25803 2 1 8 4 4 0 9 P ~ l / r ~ S / 00249 the ~ Y ~ mple 6. The serial coronal sections of 30 μm of thickness ~ e ~ are produced in the black stuff and the stnatl ~ m. Slices spaced 180 µm apart (1 in 6 cuts) are stained with cresyl violet (to assess neuronal density) and immuno. "af ~, an anti ty ~ sine}, y ~ ylase (TH) antibody (to detect neurons 5 minergic dop ~ in the black suhst ~ nce and their innervation in the stri ~ t..m).
Qua, ~ alive analysis The number of dopaminergic neurons (TH positive), in the subst ~ nre black is the endpoint for the effects of the Ad-aFGF adenovirus. The enumeration is carried out on a é ~ h ~ ntillon (1 section out of 6 over the entire length of the o black substance). For each section, TH positive neurons are counted separately from the 2 sides of the black substance. The cumulative results for all sections are expressed in propol ~ ion: number of TH neurons positive on the side injured by compared to the number of positive TH neurons on the uninjured side.
Behavioral analysis The protective functional effects of an injection of Ad-aFGF adenovirus on lesion of the nigro-striated pathway are highlighted by performance analysis sensorimotor of animals during 2 behavioral tests: the test of rotation induced by dopaminergic agonists (apomorphine, ~ mph and ~ mine and levodopa), and the paw-reaching test.
EXAMPLE 7 In Vivo Transfer of the aFGF Gene by a Recombinant Adenovirus to rats with a piercing lesion This example describes the transfer of the aFGF gene in vivo using a vector adenoviral according to the invention. It shows on an animal model of the pathway lesion that the vectors of the invention make it possible to induce the expression in vivo of therapeutic amounts of aFGF.
On rats previously anesthetized, the entorhino-hippocampal route (perforating route) was cut unilaterally using a surgical knife. The stereotaxic coordinates used for this purpose are, with respect to the lambda: AP:
+0.75; ML: +4.1 to 6.6; V: -7.7 (V coordinate determined with respect to duration-mother).
w095 / 25803 21 84409 Pcr ~ 95/00249 The recombinant adenovirus aFGF is injected immé ~ tem ~ nt after the lesion, either at the level of the lesion, or at the level of the hippocampus and the cortex e-.lo.l.; l- ~ l More in particular, the adenovirus injected is the adenovirus Ad-aFGF prepared in ~ xemr'e 3.1., Used in purified form (3.5106 pfu /, ul), in a phosphate saline solution 5 (PBS).
The injections were carried out using a cannula (outside diameter 280 m) connected to a pump. The injection speed is set at 0.5 ~ l / min, after which the cannula remains in place for 4 minutes suppl ~ om ~ nt ~ ires before being rem ~ ntée. The lo injection volumes in the hippocampus, the cortex ~ ol ~ l and the lesion site of the track ~, ~ anle are respectively 3 ~ l, 2 ~ ll and 2 ~ l. Adenovirus concentration injected is 3.5. 106 pfu / ~ l.
The therapeutic effects of the administration of the adenovirus according to the invention can be highlighted by a behavioral analysis in the conditions of 5 example 5.
W 095/25803 2 1 & 4 'TO ~ P ~ l / rh9S / 00249 T.TST ~ DF ~. SEOUT ~ 'N ~ T ~' ~
(1) GENERAL INFORMATION:
s (i) DEPOSITOR:
(A) NAME: RHONE-POULENC RORER SA
(B) STREET: 20, avenue Raymond ARON
(C) CITY: ANTONY
(E) COUNTRY: FRANCE
(F) POSTAL CODE: 92165 (ii) TITLE OF THE INVENTION: Recurrent viruses, preparation and use in gene therapy (iii) NUMBER OF SEQUENCES: 3 (iv) COMPUTER-READABLE FORM:
(A) TYPE OF SUPPORT: Tape (B) COMPUTER: IBM PC compatible (C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS / MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release # 1.0, Version # 1.25 (EPO) (2) TNFORMATION FOR T- ~ SEO ID NO: 1:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 70 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) NUMBER OF STRANDS: double (D) CONFIGURATION: linear (ii) TYPE OF MOLECULE: cDNA
(iii) HYPOTHETIC: NO
(iii) ANTI-SENSE: NO
(vi) ORIGIN:
(A) ORGANIZATION: Homo sapiens (ix) ADDITIONAL FEATURE:
(D) OTHER INFORMATION: / product = Signal Sequence (xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
Met Thr Asn Lys Cys Leu Leu Gln Ile Ala Leu Leu Leu Cys Phe Ser Thr Thr Ala Leu (2) INFORMATION FOR T- ~ SEO ID NO: 2:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 27 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) NUMBER OF STRANDS: single (D) CONFIGURATION: linear (ii) TYPE OF MOLECULE: cDNA
(iii) HYPOTHETIC: NO
WO95 / 25803 2 1 ~ 4 i ~ o 9 P ~ lrn95loo249 (iii) ANTI-SENSE: NO
(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
(2) INFORMATION FOR T, ~ S ~ O Tn NO: 3:
(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:
(A) LENGTH: 27 base pairs (B) TYPE: nucleic acid (C) NUMBER OF STRANDS: single (D) CONFIGURATION: linear (ii) TYPE OF MOLECULE: cDNA
(iii) HYPOTHETIC: NO
(iii) ANTI-SENSE: NO
(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 3: