CA1207688A - Procede de preparation d'enzymes cellulolytiques extracellulaires - Google Patents

Abstract

Des enzymes extracellulaires cellulolytiques sont produites par fermentation dans des conditions non-aseptiques et non-stériles. Le procédé de fermentation s'effectue de préférence dans des conditions très acides de pH <3 en utilisant des champignons cellulolytiques, acidophiles ou résistant aux acides ou avec une tolérance envers les acides. Dans ces conditions, on évite la contamination microbienne ou on la réduit au minimum.

Description

~2~

La présente invention se rapporte à un procédé de fermentation pour la préparation d'enzymes cellulolytiques que l'on peut utiliser pour l'hydrolyse de la cell~lose ou de l'hémicellulose. Cette inven~ion concerne aussi une methode de préparation d'enzymes cellulolytiques extracellulaires par fermentation dans des conditions non-stériles et non-aseptiques.
Le terme enzyme cellulolytique utilisé dans ce texte désigne un complexe enzymatique capable de dépolymériser et d'hydrolyser différents matériaux cellulosiques et ligno-cellulosiques pour produire des oligosaccharides et éventuel-lement des monosaccharides tel que le glucose (à partir de la ce]lulose) et du xylose ~à partir de l'hémicellulose)~ Le terme cellulase employé dans ce texte désigne un complexe enzymatique capable de dépolymériser et d'hydrolyser de la cellulose pour former des cellodextrines, de la cellobiose et du glucose. Le terme hémicellulase, utilisé ci-après, désigne un complexe enzymatique capable de dépolymériser et d'hydrolyser de l'hémicellulose en oligo, di-et monosaccharides, principalement des pentosesO C'est ainsi que les enzymes cellulolytiques incluent la cellulase et l'hémicellulase. Les enæymes de type cellulase qui ont surtout été étudiées sont la CMCase (synonymes: carboxyméthylcellulase, endoglucanase, (1-4)-D-glucan-4-glucanohydrolase, endo-~-1,4-glucanase, EC 3.2.1.4, Cx), llavicelase (synonymes: exoglucanase, cello-biohydrolase, 114-~-glucan cellobiohydrolase, exo-~-1,4-glucanase, EC 3.2.1.91 Cl), et la ~-glucosidase (synonymes:
cellobiase, EC 3.2.1.21, p-nitrophényl-~-glucosidase).
L'enzyme hémicellase plus communément étudiée est la xylanase.
Tous les procédés commerciaux et à l'échelle de laboratoire précédemment connus pour la préparation d'enzymes cellulolytiques extracellulaires par fermentation de micro-organismes bien définis (par contraste avec les flores mixtes de micro-organismes non-identifi~s) en milieu liquide (par contraste avec la fermentatlon du substrat à l'état solide) doivent être effectués dans des conditions aseptiques ou stériles en ayan-t recours à des standards pharmaceutiques pour l'appareillage et aussi pour le procédé d'opération. Cette contrainte oblige à des investissements de capitaux et des coûts d'opération très élevés pour la production commerciale d'enzymes cellulolytiques. Le coût élevé associé à la fermen-tation stérile ou aseptique sur une base industrielle constitue l'obstacle principal à la production commerciale d'enzymes cellulolytiques sous forme de produit chimique ou biochimique en vrac destiné à des usages industriels, par exemple, dans ; des procédés de transformation de matières cellulosiques en éthanol combustible ou de pureté chimique ~Stone J.E. (1982):
Analysis of Ethanol Production Potential for Cellulosic Feed-stocks, contractual report to the Conservation and Renewable Energy Branch, ~lergy, Mines and Resources Canada, 60 pages~.
Ces enzymes cellulolytiques connues sont principa-lement actives dans des zones de pH variant entre 5,0 et 7,0.
Cela signifie que le procédé de saccharification pour 12 dépolymérisation enzymatique et l'hydrolyse des mat~riaux cellulosiques et lignocellulosiques doit etre effectué à l'in-térieur de cette zone de pH, où i] est possible qu'intervienne toute sorte de contamination microbienne à partie d~un environ-nement non-stérile. Afin d'empêcher ou de réduire au minimum la contamination microbienne durant la saccharification et les périodes d'emmagasinage, on doit avoir recours soit à des con-ditions stériles, faire usage d'antibiotique. Reese et ~andels (1980) ont trouv~ que la tétracycline ou la chlorotétracycline représentent les meilleurs antibiotiques pour controler la con-tamination microbienne pendant la saccharification lorsque l'onutilise les enzymes cellulolityques du Trichoderma reesei QM 9~14.
Le procédé selon la présente invention, qui peut ~U7~

être utilisé dans la préparation d'enzymes cellulolytiques extracellulaires par fermentation dans des conditions non-aseptiques et non-stériles, est basé sur l'utilisation de champignons cellulolytiques acidophiles et particulièrement de champignons cellulolytiques acidophiles nouvellement isolés [Boa, J. and LeDuy, ~. (1981): Acidophilic Fungus SCP from Peat Hydrolyzate, Can. J. Chem. Eng., 60: 532-537, Cauchon, N. and LeDuy, A. ~1981): Activités Cellulolytiques d'un Fungus Acidi-phile Nouvellement Isolé, Proceedings of the Séminaire sur l'Hydrolyse des Matériaux Ligno-cellulosiques, Ministère de l'Energie et des Ressources du Québec 193-206]. Ces champignons poussent et produisent des enzymes cellulolytiques extracellu-laires dans un milieu très acide dont le pH varie entre 0 et 3, lequel constitue un environnement hostile pour presqlle tous les contaminants de nature microbienne. Lorsque le procédé
de fermentation pour la production d'enzymes cellulolytiques extracellulaires est effectué dans ces conditions très acides de pH ~3, la valeur exacte du pH dépendant de la souche con-venable des microorganismes cellulolytiques acidophiles ou résistant aux acides ou montrant une tolérance aux acides, on empeche la contamination microbienne ou on la réduit au minimum.
En conséquence, ce procédé de fermentation peut s'effectuer dans des conditions non-aseptiques ou non-stériles.
Dans son aspect large, l'invention concerne un proc~e qui comprend la fermentation d'un milieu de culture renfermant une source de carbone dérivée de matériaux cellulosiques ou lignosellulosiques, avec un microorganisme acidophile résistant aux acides ou montrant une tolérance aux acides, dans des condi-tions destinées à produire des enzymes cellulolytiques extracel-lulaires. Cette méthode de production d'enzymes cellulolytiques extracellulaires dans des conditions non-aseptiques ou non-stériles, n'exgige que peu d'investissement de capital et pour lesapplications ~Z~76~3 industrielles, implique peu de cout d'opération~ La fermentation peut se faire dans un réservoir ouvert, contenant ou bassin, en verre avec revêtement de plastique au lieu d'utiliser une cuve de fermentation pharmaceutique aseptique dispensieuse en acier ino-xydable. Le milieu de culture ne nécessite aucune stérilisation et la suite des opérations n'exige aucune précaution spéciale contre la contamination microbienne.
Cette invention est basée de préférence sur l'utilisa-tion du champignon acidophile de souche NC-ll de notre propre collection de culture. Ce champignon acidophile pousse et produit au moins deux enzymes de type cellulolytique extra-cellulaire, incluant la CMCase et la xylanase, et autres, dans un milieu de culture à pH 2,0 et dans des conditions non-stériles et non-aseptiques. Le milieu de culture que l'on utilise dans le procédé selon l'invention est constitué d'une source de carbone dérivée de matériaux cellulosiques ou lignocellulosiques, notamment Na-CMC, le xylane, la cellulose Avicel*~la poudre de cellulose, l'~-cellulose, la sciure de bois, etc., ou un mélange de ces derniers, éventuellement avec des ingré-20 dients simples, notamment (NH4)2S04, K2HPO~, MgS04 et ~aN03.
Le pH est ajusté à des valeurs très acides, notamment pH 2,0, avec un acide minéral, tel que H2S04, La fermentation s'effec-tue à température ambiante (2~ - 30C) de préférence à 28 - 30C, dans des conditions aérobiques et sans contrôle de pH. Deux autres avantages économiques associés à l'utilisation du cham-pignon acidophile de souche ~C-ll pour la préparation d'enzymes cellulolytiques extracellulaires sont que les ingrédients sont simples et peut coûteux, et qu'il n'est pas nécessaire d'exercer un contrale sur le pH à cause de l'auto-stabilisation du pH
dans le milieu de culture pendant le proc~de de fermentation.
La CMCase et la xylanase produites à partir du champignon acidop~ile de souche ~C-11 sont stables dans des * Marque de commerce ~' ~;~()7~

conditions d'e~magasinage simple, notamment dans un nouveau milieu de culture sans substrat pour une période de 3 jours à
une température quelconque entre 0 et 30C. Ces enzymes extracellulaires possèdent un pH idéal de 3,0, la fourchette préférée se situant entre environ 2,0 et 4,0, pour toute température située entre 15 et 60 C~ Les -températures idéales sont de 55 C pour une activité CMCase et 25 à 50C pour une activité xylanase, à un pH quelconque entre 2,0 et 7,0. Les constantes Michaelis Km sont de 5,9 g/L et 2,6 g/L pour la CMCase et la xylanase respectivement. Les enzymes cellulolyti-ques extracellulaires produites avec le champignon acidophile de souche NC-ll sont totalement différentes d'autres enzymes cellulolytiques connues à cause de leur pH acide optimum entre

2 et 4 pour les activités enzymatiques. Cela implique que le procédé de saccharification ou la dépolymerisation et l'hydro-lyse des matériaux cellulosiques et lignocellulosiques peuvent s'effectuer sous des conditions acides, notamment à un pH de 2,0 pour la meilleure activité enzymatique tout en contr81ant simultanément la contamination microbienne. Ainsi, le procédé
offre aussi des avantages économiques pour des applications industrielles parce que les enzymes cellulolytiques extracellu-laires peuvent etre emmagasinées et utilisées dans des conditions non-aseptiques ou non-stériles. De plus, lorsque les matériaux cellulosiques et lignocellulosiques sont prétraités par tout procédé acide, avant le procédé de saccharification, on peut éviter la neutralisation des boues prétraitées ou tout au moins la diminuer à très bas prix, si la saccharification s'effectue en utilisant des enzymes cellulolytiques extracellu-laires, parce que la saccharification s'effectue sous des conditions acides.
Le microorganisme utilisé pour la production des enzymes cellulolytiques extracellulaires selon la présente ~2~7~

invention est de préférence le champignon acidophile de souche NC-ll. On peut obtenir un échantillon de ce microorganisme en s'adressant à la collection permanente de l'American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, U.S.A.. Le numéro d'accession dans ce dépot est le ATCC-20677. On devra comprendre que la disponibilité de la culture ne constitue pas une licence pour la mise en oeuvre de l'invention.
Les exemples qui suivent de réalisations préférées de l'invention sont donnés à titre purement illustratif mais sans caractère limitatif.
EXEMPLE I
Prod ction de_CMCase et xylanase extracellulaire dans_des conditions asepti~
Le champignon acidophile fut cultivé dans huit flacons Erlenmeyer de 2 litres, chacun contenant un litre de milieu de culture. La composition du milieu était (en poids/
volume %): Na-CMC (Sigma, basse viscosité) 0,2, xylane (Sigma, du bois de melèze) 0,2, (NH4)2S04 0,02, K2HPO4 0,02, MgSO~.7H2O

20 0,0032, NaNO3 0,02. Le pH initial du milieu de culture -Eut aJusté à 2,0 av~c H2SO4 après stérilisation à la vapeur dans un autoclave. Un inoculat de sept jours cultivé dans le même milieu fut utilisé pour ensemencer les Erlenmeyers à 2% tv~v).
L'expérience s'est effectuée dans un shaker rotatif à 150 rpm et à température ambiante (25 - 27~) pendant 1~ jours en aseptie. Le filtrat de culture fut utilisé dans des tests enzymatiques pour la CMCase et pour la xylanase. L}activité
cellulolytique ~ut mesurée avec Na-CMC (Sigma, basse viscosité) ou le xylane (Sigma, à partir du bois melèze) comme substrat, tel que décrit par ~lan et al. (1981) [Khan, A~Wo~ Wall D. and ~an den Berg, L. (1981): Fermentative Conversion of Cellose to Acetic Acid Cellulolytic Enzyme Production by a Bacterial Mixed Culture Obtained from Sewage Sludge, Appl. Environ. MicrobiolO, 41:121~-1218]. La seule modification est que le tampon 0,4 M
acétate fut utilisé au lieu du 0,2 M tel qu'indique dans la r~ference mentionnée ci-dessus. Les unités pour ces activités étaient exprimées en l~ug d'équivalents glucose libérés par rnL par minute.
Le progrès de la production d'enzymes cellulolytiques dans un de ces Erlenmeyers es'l- illustré au Tableau I. La xyla-nase fut produite à partir du début etatteignit sa valeur maximale de 48-49 unités au huitième jour. La CMCase ne fut produite qu'à partir de la septième journée et atteingnit sa valeur maximale de 35-36 unités le dixième jour. Cela indique que cette souche de charnpignons acidophiles utilisa le xylane comme substrat préférentiel pour produire d'abord de la xyla-naseO Ensuite, le champignon commenca à utiliser le CMC
comme substrat avec comme résultat une forte production de CMCase dans une phase ultérieure de la fermentation. Les activités maximales des deux enzymes dans le filtrat de culture furent obtenues à la dixième journée de la fermentation. A
la fin de cette expérience, les contenus des huit Erlenmeyers furent combinés ensemble. Trente unités de CMCase et quarante-huit unités de ~ylanase furent détectées dans le fil-trat de ce ; lieu de culture combiné. Le pH du milieu de culture s'auto-sta~ilisa à 2,0 pendant le procédé de fermentation.

376~13 TABLEAU I

Production de CMCase et Xylanase Extracellulaire En Aseptie Activité Enzymatique (unité) Temps de CMCase Xylanase CMCase:
Fermentation ~ylanase (jour) 7 17 44 0,39 8 31 48 0,65 1010 35 49 0,71 14 36 49 0,73 - -- ..... ... .
EXEMPLE 2:
Production de CMCase et Xvlanase extracellulaire à 1~
divers substrats à base d'hydrate de carbone dansdes conditions non~aseetiques Le champignon acidophile fut cultivé dans des flacons Erlenmeyers de 250 mL, chacun renfermant 100 mL d'un milieu de culture. On utilise les substrats suivants à base d'hydrate de carbone à des concentrations de 1% ~poids/volume~: (i) D (+) maltose (BDH), (ii) ~(~) xylose (Sigma), (iii) D(+) glucose (Fisher), (iv~ D(+) sucrose (Fisher), (v~ D(+~ cellobiose (Sigma), (vi) D(-) fructose (Baker), (vi.i) Avicel type PH-101 microcristalline cellulose (FMC), (viii) poudre de cellulose CC-31 sous forme microgranulaire (Whatman*), (ix) -cellulose (sigma), (x) Na-CMC (Sigma) basse viscosité, (xi) xylane dérivé du bois de m~lèze (Sigma), et (xii) mélange de Na-CMC
et xylane à 1% (poids/volume) chacun. Le milieu basique contenait en poids/volume%: (~H4)2S04 0,1, K2HP04 0,1, ~IgS04.
30 7H2O 0,016, ~aNO3 0,1. Le pH initial fut ajusté à 2,0 avec H2SO4. Un inoculat vi~ux de sept jours ayant d'abord ~t~
* Marque de com~rce '7~

cultivé dans un milieu à base de xylane a 2% (poids/volume) et dans des conditions non-aseptiques fut utilisé pour ensemencer les Erlenmeyers à 5% (v/v). L'e~périence s'est effectuée sur un shaker rotatif à 150 rpm et à température ambiante (28-30C) durant 14 jours. Le milieu de culture ne fut pas stérilisé et l'expérience s'est effectuée dans des conditions non-aseptiques. Le filtrat du milieu de culture fut utilisé pour des essais enzymatiques de CMCase et de xylanase. La procédure utilisée pour les essais étaient telles que décrite précédemment (Exemple I)O
Les résultats rapportés au Tableau II indique qu'il n'y a eu production d'enzyrnes cellulolytiques extracellulaires avec aucun des mono- et disaccharides soumis à l'essai. La crois-sance cellulaire était bonne tel que révélé par la bonne con-; sommation des substrats dans ces milieux. Ces substrats étaient presque toujours complètement épuisés après 14 jours de fer-mentation. Dans tous les autres milieux de culture utilisant des substrats cellulosiques, la production de CMCase et xyla-nase extracellulaires était très bonne~ Plus de CMCase et xylanase étaient produits dans les milieux contenant des ma-tériaux cellulosiques cristallins tel que 1'~ -cellulose, la poudre de cellulose et l'Avicel. On s'est rendu compte de ce résultat en observant que pour ces substrats cellulosiques cristallins, on obtient des très hauts rapports CMCase-xyla-nase respectivement de 3,06, 2,03,et 1,64. Le Na-CMC donne des quantités presque égale de CMCase et xylanase, te~ qu'on le voit par le rapport CMCase-xylanase de 1,18. Lorsque le xylane est utilisé seul ou avec le Na-CMC, on a observé une plus grande production de xylanase comme en fait foi les bas rapports CMCase-xylanase de 0,17 et 0,39 que l'on obtient avec ces milieux respectifs. On obtient la plus grande activité CMCase de 67 unités avec de la poudre de cellulose et la plus grande ~'7~

activi-té xylanase de 66 - 67 unités lorsque le xylane est utilisé seul ou si l'on utilise le mélange CMC-xylane. Le mélange CMC-xylane a un effet bénéfique sur la production des deux enzymes toutes deux à haute concentration, tandis que seule une enzyme à haute concentration peut etre obtenue lorsque l'on utilise un seul substrat. Cependant, on n'a détect~
aucun effet sinergistique sur la synthèse de ces deux enzymes avec ce mélange de CMC et de xylane. Le sucre réducteur rési-duel mesuré dans les filtrats de culture des milieux cellulo-siques représente la quantité nette de sucre présente lors del'échantillonnage. Cette quantité nette de sucre résulte du sucre réducteur hydrolysé moins le sucre réducteur concerné
par le microorganisme, et de la quantité totale de restes r~siduels réducteur de substrats à ce stage~ On n'a détecté
aucune contamination microbienne à la fin de l'expérience pour tous les miliew~ sur lesquels on a fait des essais, incluant les milieux mono- et disaccharide. Le p~I des milieux de culture s'autostabilise à 2,0 pendant le procédé de fermenta-tion.

TABLEAU II
Production de CMCase et Xylanase Extracellulaire a partir de Substra-ts à Ba.se de Divers Elydrates de Carbone dans des Conditions Non-Aseptiques Sucre ~éducteur Milieu Fermentation Résiduel Activité Enzymatique CMCase:
(jour) (g~L)(unité) xylanase CMCase Xylanase Maltose 5 0,250 0 0 7 0,173 0 0 14 0,126 0 0 ~ylose 5 4,485 0 0 7 2,403 0 0 14 0,311 0 0 Glucose 5 5,510 0 0 7 2,387 0 0 14 1,213 0 0 Sucrose 5 4,975 7 2,387 0 0 14 0,171 0 0 Cellobiose 5 7.340 0 7 2,347 0 0 14 0,340 0 0 Fructose 5 5,870 0 0 7 2,3~5 0 0 14 0,344 0 0 Avicel 5 0,116 36 16 2,25 7 0,085 47 29 1,62 14 0,059 54 33 1,64 Poudre de 5 0,134 46 20 2,30 Cellulose 7 0,096 60 29 2,07 14 0,056 67 33 2,03 ~-Cellulose 5 0,114 10 16 0,63 7 0,087 27 9 3,00 14 0,054 55 18 3,06 Na-CMC 5 0,425 15 8 1,88 7 1,074 14 15 0,93 14 1,304 20 17 1,18 Xylane 5 0,719 7 48 0,15 7 0,565 7 59 0,12 14 0,349 11 66 0,17 CMC + XyIane 5 1,229 20 40 0,50 7 1,869 17 65 0,26 : 14 1,567 26 67- 0,3g .

'7~

EXEMPLE 3:
Production de CMCase et Xylanase extracellulaire à partir de divers substrats cellulosiques dans des conditions non-aseptiques et en qrands volumes Le champignon acidophile fut cultivé dans des ballons renfermant chacun douze litres de milieu de culture. Les substrats cellulosiques qui suivent furent utilisés à des concentrations en poids/volume %:(i) Na-CMC à basse viscosité
(Sigma) 0,5, (ii) un mélange de Na-CMC à basse viscosité (Sigma) 0,5 et de xylane dérivé du bois de mélèze (Sigma) 0,5, et (iii) de la sciure de bois (à partir de bois mou) 1,0. La composition du milieu de base pour les milieux (i) et (ii) était (en poids/
volume %): (NH4)2S04 0,05, K2HP0~ 0,05, MgS04.7H20 0,004, NaN03 0,05. Le m8me milieu de base à double force fut utilisé
pour le milieu (iii). Le pH initial était ajusté à 2,0 avec H2S04. Une culture de trois jours prise du milieu ~ii) fut utilisée pour ensemencer les ballons à 5% (volume/volume).
L'aération et l'agitation du milieu se faisaient simplement en barbottant de l'air humide à travers un tubage per~oré
placé à l'intérieur des ballons. La température était maintenue à l'intérieur de la plage 2~ - 30C. L'expérience a durée dix jours. Les milieux de culture n'étaient pas stérilisés et l'experience s'effectua dans des conditions non-aseptiques.
Le filtrat de culture fut ~chantillonné de façon quotidienne pour des essais enæymatiques de CMCase et de xylanase. La procédure d'essais enzymatiques s'effectua tel que décrit précédemment (Exemple 1~.

L'invention est aussi illustrée au moyen des ~essins qui suivent, dans lesquels:
L~ FIGURE 1 est un graphique montrant l'activité enzy-matique par rapport au temps de fermentation, La FIGURE 2 est un graphique montrant l'activité enzy-matique par rapport à la température, et La FIGURE 3 est un graphique montrant l'activité
enzymatique par rapport à la concentration du substrat.
Les résultats de la FIG. 1 confirment les memes observations que celles qui furent faites dans les exemples précédents, notamment:
(i) l'utilisation préférentielle du xylane par rapport au CMC pour la culture et la production d'enzymes cellu-lolytiques extracellulaires dans un milieu de culture contenant un mélange CMC-xylane. Cela est illustré
par la phase décalée de trois jours dans la production de CMCase par rapport à la production de xylanase dans ce milieu à base de substrats mixtes (FIG. 1).
(ii) l'effet bénéfique du xylane dans le mélange CMC-xylane comme substrat sur la production des deux enzymes CMCase et xylanase, toutes les deux à leur plus grande concen tration. Les activités enzymatiques obtenues le dixième jour de fermentation étaient de 40 unités de CMCase et 120 unités de xylanase dans ce milieu à base de substrats mixtes, par opposi-tion à celles de 32 unités de CMCase et 25 unités de xylanase dans le milieu CMC (FIG. 1~.
(iii) la production préférentielle de CM~ase par rapport à
la xylanase lorsque le substrat est constitué par des matériaux cellulosiques cristallins. On observe aussi ceci avec la sciure de bois comme substrat lignocellulo-sique. Le rapport CMCase-xylanase au dixième jour de fermentation était de 1,67 (FIG.l).
On n'a détecté aucune contàmination microbienne à la fin de l'expérience dans tous les milieux sur lesquels on a fait des essais. Le pH des milieux de culture s'autos-tabilise à 2,0 pendant le proc~dé de fermentation.

~2~7~

_XEMPLE 4:
Effet des -tampons sur la stabilité de la solution d'enzyme Le filtrat du milieu de culture obtenu lors de l'expéri-ence précédente (Exemple 1) fut concentré 1~ fois par ultra-filtration (Model 8400 Amicon cell. Diaflo membrane PM10).
Le concentré obtenu par ultra-filtration fut alors utilisé pour déterminer la stabilité des activités cellulolytiques dans différentes solutions tamponnées et sous des conditions différen-tes d'emmagasinage. Trois conditions d'emmagasinage furent mises à l'essai: au congélateur (-lSC), au réfrigérateur (0 - 4C) et à température ambiante (25 - 27C). Les cinq solutions tamponnées utilisées étaient les suivantes: (i) HC~-KCQ 0,OS M à pH 2,0, (ii) acide phosphorique-biphtalate`
de potassium 0,05 M à pH 2,0, (iii) HCR-biphtalate de potassium 0,05 M à pH 2,0, (iv) acide acétique-acétate de sodium 0,05 M
à pH 3,0 et (v) acide acétique-acétate de sodium 0,15 M à pH

3,0. Un milieu de culture fralchement préparé sans substrat à pH 2,0 fut aussi utilisé pour cet essai. Quatre volumes de ces solutions tamponnées ou le milieu de culture fraichement préparé furent ajoutées à un volume de la solution concentrée ; d'enzymes, après quoi les mélanges furent incub~s ausc trois températures d'emmagasinage décrites ci-dessus. Les activités CMCase et xylanase furent déterminées de fa,con quotidienne pen-dant cinq jours utilisant les méthodes décrites précédemment (Exemple 1).

I C~ 10 0 0 1~ ~ O ~D O ~ u~ d~ o ~ In un I r ~ U~ r) 01 O 1~ 1~ CO C~) a~ OD 1~ ~ ~)D 1~ a) u~ -r ~) . r ~~ ~
~ ,J o ~ ~ o o o ~ d~ n ~ o ~ N 1~ 1 ~ O

D O d~ ~ ~ r l O r~ r rl O
-rl -r ~r) (r) O O O ~ r~ O ~ ~D O O un o O
~ ~ I0 d~ ~ r-~ r-l r-l ~1 ~ O (~
_ C ~ o o ~ un 1~ o ~ ~ o o o O ~ "a F~J

N ~ ~ ~ ¦ ~ d ~ ) ~ ~ ~ r-l r-l ~ ~ ~ OD O O ~) U~ d~ I ~ (~ I~ d' O
O r-l ~ ) r~~ (~ O ~S) -r r-l ~ In D r~ r-l ~J\ r~ O ~5) O ~ O O O In O t~ O p~
u~ ~ ~ C~ d~ o oo 1~ ~ ct) ~ O o~ O 01 1~ 1~ o a) a) ~ ~n ~ ~r ~ ~ ~ ~ o o~ o ~D ~ ~ O ~ :o cn 0~ ~ O ~ ~ U
~ U c~ d ~ ~ ~ ~ 0~ co 0~ r~ r~ r-¦ U I rl O ~ ~) 1~ 1 O d~s~ D O r-l O O ~ r-l O rl ~1 _ _ ~ U~ U~ ) ~ ~) 0 ~5) I~ r-~ r~l r-l ~ U

::~ O ~ ~ u~ d~ d~ N g 0 1~ ~ t~ ~ $ 0 0 1~ ~9 0 ~ ~-r 0 r-l r-l ~ rl ~) _1 (S) ~ ) 0 CO CD ~) I~ ~1 r-¦ r-¦ O r-l O ~ 0 0 0 r n u~ n 0 1~ 0 0 r~ r-i r-l r a~ r ~
~H ~ rl ~ ~ -~-rl ~ ~ ~ rJ ~ ~ ~ d ~2i ~ rl rl > ~ rl~ rl rl ~> ~ rl ~ rl -rl ~ ~-rl un :~
-rl r rl r ~ ~ -r r r r ~ ~ ~I r r r ~ ~ m o ~ ~ a) r ~
r O ~ O- O

~a ~;) -r~ ~ ~ ~
f F~, O ~ rl ~; a) -~ J
. ~ rl a U

;)6~

Le choix d'une solution tamponn~e convenable pour fin d'emmagasinage est déterminant pour la stabilité de l'enzyme tel qu'on le voit par les résultats donnés au Tableau III. On a trouvé que l'activité de C~Case dans la solution enzymatique ~tait complètement restorée dans le milieu de cultu~e après emmagasinageà chacune des trois températures étudiées. Le tam-pon à base d'acide phosphorique et de biphtalate de potassium donnait le même résultat mais uniquement à température ambiante.
L'a-ctivit~ xylanase de la solution enzymatique fut aussi com-plètement restorée dans le milieu de culture fraîchement préparédans cette condition d'emmagasinage au cong~lateur. Dans ces con-ditions d'emmagasinage,on a noté une perte complète de l'activité
xylanase avec les tampons à base d'acide acétique et d~acétate de sodium. Après emmagasinage au réfrigérateur, il y eut une légère perte de 10% d'activité xylanase dans toutes les solu-tions tampons qui furent mises à l'essai, incluant le milieu de culture fraichement préparé. Le tampon à base de HC~-et de biphtalate de potassium, l'acide acétique-acétate de sodium 0,15 M à pH 3,0 et le milieu de culture fra~chement pr~paré
rétablirent complètement l'activité xylanase de la solution enzymatique à température ambiante pendant trois jours. ~n résumé, sous congélation, la stabilité de la solution enæyma-tique était très sensible à la nature de la solution tamponnée.
Les deux activités CMCase et xylanase de la solution enzymati-que furent completement restorées dans le milieu de culture fra~chement préparé sans substrat,au congélateur pendant au moins cinq jours et au réfrigérateur ou à température ambiante pendant au moins trois joursO
EXEMPLE 5:
Effet de la température et du pH sur les activités enz~mat ques de la solution enzymatique Le concen-tré obtenu par ultra-Eiltration qui fut préparé pour l'expérience décrite à l'Exemple 4 fut utilisé
pour étudier l'effet de la température et du pH sur ses activités enzymatiques. Ouatre volumes du milieu de culture fra1chement préparé sans substrat et à pH 2,0 furent ajoutés à un volume du concentré obtenu par ultra-filtration etle mélange fut utilisé pour tous les essais. Les essais enzymati-ques pour la détermination de CMCase et xylanase sur ce mélan-ge furent exécutés tel que décrit précédemment (Exemple 1), sauf que les tampons suivants furent utilisés au lieu du tampon acétate 0,4 M: HC~-KC~ 0,05 M à pH 2,0, acide acétique-acétate de sodium 0,05 M à pH 3,0, 4,0, 5,0, 6,0 et 7,0.
L'acide acétique-acétate de sodium 0,15 M à pH 3,0 fut utilisée pour les essais CMCase. La température d'incubation pour les essais enzymatiques variait entre 15 et 60C.
La FIG. 2 illustre les résultats pour les activités CMCase et xylanase. Il a été trouvé que le pH optimum pour les deux activités enzymatique se situait à pH 3,0 et la meilleure fourchette de pH était entre pH 2,0 et 4,0, pour toutes les températures étudiées. La température idéale pour l'activité
CMCase était de 55C. L'activité xylanase idéale de la solu-tion enzymatique était constante sur un plage étendue de tempé-rature allant de 25C à 50C, pour toutes les valeurs de pH
étudiées.

. .
Effet de la concentration de substrat sur les activités enzyma-tiques de la solution enzymatique Le champignon acidophile fut cultivé dans des flacons Erlenmeyers de 500 mL contenant chacun 100 mL de milieu de cul-ture. La composition du milieu (en poids~volume %) était la suivante:

7~

xylane (Sigma, dérivé de bois de m~lèze) 1,0, K2HPO4 0,1, MgSO4~7H2O 0,016. Ie p~ initial était ajusté à 2,0 avec H2SO
Un inoculat vieux de dix iours ayant déjà poussé dans le même milieu fut utilisé pour ensemencer les Erlenmeyers à 2% (v/v).
L'essai fut effectué sur un sha~er rotatif à 150 rpm et à
température ambiante (25 - 27C) pendant quatorze jours. Le filtrat du milieu de culture fut utilisé pour étudier l'effet de la concentration du substrat sur les activités enzymatiques.
Les essais enzymatiques de CMCase et xylanase furent exécutés tel que décrit précédemment (Exemple 1), sauf que la concentra-tion du su~strat variait de 0 à 1% (poids/volume). Le milieude culture fut stérilisé à la vapeur avant d'ajuster le pH et la fermentation pour la production d'enzymes fut effectuée en aseptie.
Les résultats pour les activités CMCase et xylanase sont donnés en FIG. 3. I,es Km et Vmax, calculés par la méthode Lineweaver-Burk, du filtrat de ce milieu de culture était 5,9 g/L, 124 lmités, et 2,6 g/I., 116 unités respective-ment pour la CMCase et xylanase. Des e~emples sur la repro-ductibilité des résultats et sur la stabilité de la solutionenzymatique provenant du champignon acidophile sont montrés sur cette Figure. On a obtenu des résultats quasi identiques pour l'effet à la CMCase avec un filtrat d'une culture fra~chement préparée et avec le filtrat du même bouillon fermenté qui fut gardé au réfrigérateur (en présence de cellules de champignon acidophile) durant quatre mois.
Bien que l'invention ait ét~ décrite en rapport avec des réalisations spéci~iques, il est évident qu'on peut y apporter d'autres modifications et la présente demande entend bien inclure toutes variations, utilisations ou adaptations de )'7~

l'invention y compris toutes modlfications de la présente divulgation tel qu'il est bien connu dans l'art, et en rapport avec les caractéristiques essentielles telles que décrites dans les revendications annexées.

Claims (16)

Les réalisations de l'invention, au sujet desquelles un droit exclusif de propriété ou de privilège est revendiqué, sont définies comme il suit:

1. Procédé comprenant la fermentation d'un milieu de culture contenant une source de carbone dérivé d'un matériau cellulosique ou lignocellulosique, avec un microorganisme acidophile, résistant aux acides ou tolérant aux acides, dans des conditions susceptibles de donner des enzymes cellulolyti-ques extracellulaires.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que le microorganisme comprend le champignon acidophile de souche NC-11.

3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait que la fermentation s'effectue dans des conditions acides.

4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé par le fait que la fermentation s'effectue à un pH inférieur à 3.

5. Procédé selon les revendications 1, 2 ou 3, caracté-risé par le fait que la fermentation s'effectue dans des con-ditions non-aseptiques.

6. Procédé selon la revendication 2, caractérisé par le fait que ledit milieu de culture renferme un matériau cellulo-sique ou lignocellulosique choisi dans le groupe constitué par Na-CMC, xylane, Avicel cellulose, poudre de cellulose, ?-cellu-lose, sciure de bois et mélange de ces derniers, la fermentation s'effectuant dans des conditions non-aseptiques à un pH inférieur à 3.

7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé par le fait que ledit milieu de culture comprend aussi un élément choisi dans le groupe constitué par (NH4)2SO4, K2HPO4, MgSO4, NaNO3 et un mélange de ces derniers.

8. Procédé selon la revendication 6, caractérisé par le fait que le pH est ajusté à environ 2 en ajoutant un acide minéral au milieu de culture.

9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé par le fait que l'acide minéral comprend H2SO4.

10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé par le fait que la fermentation s'effectue à température ambiante entre environ 24 et 30°C.

11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé par le fait que la fermentation s'effectue à une température entre environ 28 et 30°C.

12. Procédé selon la revendication 10, caractérisé par le fait que la fermentation s'effectue en aérobie et sans contrôle de pH.

13. Procédé de préparation de CMCase et xylanase compre-nant la fermentation d'un milieu de culture renfermant une source de carbone dérivé de Na-CMC et du xylane, et comprenant de plus (NH4)2SO4, K2HPO4, MgSO4 et NaNO3, à un pH d'environ 2, à une température d'environ 28 à 30°C durant environ 14 jours, en aérobie et dans des conditions non-aseptiques, en pré-sence du champignon acidophile de souche NC-11.

14. Les enzymes extracellulaires CMCase et xylanase, qui sont caractérisées par le fait qu'elles sont stables dans des conditions d'emmagasinage ordinaire pour une période de trois jours à une température quelconque entre 0 et 30°C, possèdent une plage de pH entre 2,0 et 4,0, pour une température quelconque entre environ 15 et 60°C, la température idéale de l'activité
CMCase étant de 55°C et celle de la xylanase étant 25 à 50°C, à un pH quelconque entre 2,0 et 7,0, les constantes Michaelis Km étant de 5,9 g/L et 2,6 g/L respectivement pour la CMCase et la xylanase.

15. Les enzymes extracellulaires selon la revendication 14, possédant un pH idéal de 3,0.

16. Dans un procédé d'hydrolyse de la cellulose et de l'hémicellulose, l'amélioration qui consiste à effectuer l'hydrolyse en utilisant un agent d'hydrolyse constitué
par une enzyme cellulolytique telle que définie dans les revendications 14 ou 15.