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BRPI9913698B1 - peptídeo sinalizador de enterotoxina ii de e. coli modificado e um microorganismo expressando uma proteína de fusão do peptídeo e uma proteína heteróloga - Google Patents

peptídeo sinalizador de enterotoxina ii de e. coli modificado e um microorganismo expressando uma proteína de fusão do peptídeo e uma proteína heteróloga Download PDF

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BRPI9913698B1
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Jay Do Choi
Ki Doo Choi
Se-Chang Kwon
Sung-Youb Jung
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Hanmi Science Co Ltd
Hanmi Pharm Ind Co Ltd
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Abstract

"peptídeo sinalizador de enterotoxina ii de e.coli modificado e um microorganismo expressando uma proteína de fusão do peptídeo e uma proteína heteróloga". uma proteina heteróloga é produzida por: (i) cultivo de um microorganismo transformado com um vetor de expressão compreendendo um gene codificando um peptídeo sinalizador de enterotoxina ii de b.coli modificado, fundido à proteína heteróloga para produzir e secretar a proteína heteróloga para periplasma, o peptídeo sinalizador de enterotoxina ii de b.coli modificado é obtido por substituição de pelo menos um dos segundo, quarto, quinto, décimo segundo, vigésimo e vigésimo segundo aminoácidos do peptídeo sinalizador de enterotoxina ii de b.coli da seguinte seqüência de aminoácido (srq id no: 1) com outro aminoácido, contanto que, pelo menos um dos segundo e quarto aminoácidos do peptídeo modificado seja lisina; e (ii) recuperando a proteína heteróloga do periplasma.

Description

" PEPTÍDEO SINALIZADOR DE ENTEROTOXINA II DE E.COLI MODIFICADO E UM MICROORGANISMO EXPRESSANDO UMA PROTEÍNA DE FUSÃO DO PEPTÍDEO E UMA PROTEÍNA HETERÓLOGA" Campo da Invenção A presente invenção se refere a um peptídeo sina-lizador de enterotoxina II de E.coli, um gene codificando tal peptídeo, um vetor compreendendo o gene fundido a um gene codificando uma proteína heteróloga, um microorganismo transformado com o vetor e a um processo para produzir a proteína heteróloga usando o microorganismo.
Histórico da Invenção Muitas proteínas heterólogas foram produzidas usando microorganismos hospedeiros geneticamente transformados por um processo intracelular ou processo de secreção.
No processo intracelular, um gene codificando uma proteína heteróloga é expresso e acumulado no citoplasma de um microorganismo. Embora este processo seja conhecido por fornecer um rendimento de proteína heterólogo relativamente alto, a proteína heteróloga expressa não é de uma forma natural ativa, porém metionilada no terminal N. Adicionalmente, a proteína heteróloga biologicamente inativa produzida por este processo freqüentemente forma corpos de inclusão insolúveis que devem ser solubilizados e convertidos em uma forma natural, ativa, por um processo de reentrelaçamento.
Como para o processo de secreção, um gene codificando uma proteína de fusão de um pepetídeo de sinal e proteína heteróloga é expresso no citoplasma de um microorganismo e, então, a proteína de fusão é processada pela pepti- dase de sinal do microorganismo para remover o peptídeo de sinal, enquanto passando através da membrana citoplásmica. A proteína processada é secretada no espaço do periplasma entre a membrana citoplásmica (interna) e a membrana externa do microorganismo. Contudo, este processo é conhecido por fornecer um rendimento muito baixo da proteína heteróloga, quando comparado ao processo intracelular. Portanto, há uma necessidade de aperfeiçoar a produtividade do processo de secreção. Nesta linha, foi reportado que a divagem apurada e eficiente da porção do peptídeo sinalizador de um proteína de fusão expressa pela peptidase sinalizadora é importante na melhora do rendimento da proteína heteróloga secretada (Akita, M. e outros, J. Biol. Chem, , 265, 8164 (1990)).
Em geral, os peptídeos sinalizadores são classificados em dois grupos, peptídeos sinalizadores hidrófilos e peptídeos sinalizadores hidrófobos. Um peptídeo sinalizador hidrófilo é geralmente composto de 12 a 7 0 aminoácidos. Um peptídeo sinalizador hidrófobo típico, por exemplo, peptídeo sinalizador de enterotoxina II de E.coli, contém 13 a 30 aminoácidos e é compreendido de três regiões; uma região hi-drófila de terminal N contendo um ou dois aminoácidos básicos; uma região hidrófoba central contendo cerca de 10 aminoácidos básicos e uma região hidrófila de terminal C contendo aminoácidos possuindo cadeias laterais pequenas.
Como uma proteína heteróloga expressa na forma de uma proteína de fusão com um peptídeo sinalizador é freqüen-temente degradada rapidamente pela proteinase citoplásmica, o rendimento da proteína heteróloga secretada diminui con- forme a eficiência secretória do peptídeo sinalizador torna-se baixa. Portanto, o rendimento das proteínas heterólogas secretadas pode ser melhorado por modificação da porção de peptídeo sinalizador de proteínas de fusão expressas nos microorganismos hospedeiros. O hormônio do crescimento humano (hGH) é composto de 191 aminoácidos e possui um peso molecular de 21.500 Da. Uma vez que uma forma purificada de hGH foi isolada primeiro da pituitária humana em 19 5 6 (Li e Papkoff, Science, 124, 1293 (1956)), foram realizados vários trabalhos no hGH para elucidar, por exemplo, o efeito do hGH no metabolismo humano (Beck, J.C. e outros, Science, 125, 884 (1957)) e atividade inibidora de hGH na nanocormia pituitária (Raben, M.S., J. Clin. Endocrinol., 18, 901 91958)). Recentemente, foi reportado que hGH é também eficaz no tratamento da síndrome de Turner, osteoporose, "vulnus" e queimadura.
Como a quantidade de hGH obtida da pituitária humana é limitada, tem sido feita uma tentativa de produção de uma grande quantidade de hGH no E.coll geneticamente transformado por um processo intracelular (Goeddel, D.V. e outros, Nature, 281, 544 (1979)). Contudo este processo é impedido pelo problema mencionado anteriormente de produção de hGH metionilado que não é apropriado para aplicação humana. Uma tentativa adicional de remover a metionina do hGH metionilado usando aminopeptidase I de dipeptidila resultou èm um rendimento inaceitavelmente baixo de hGH.
Consequentemente, a produção secretora de hGH natural foi tentada. Por exemplo, os EP números 55942, 20147 e 114695 revelam processos para expressar uma forma natural de hGH e recuperação da mesma por secreção. Contudo, a quantidade recuperável de hGH produzido por estes processos é apenas marginal. O EP número 177.343 revela um processo para produção de hGH, que compreende a expressão de um gene codificando uma proteína de fusão de hGH e fosfatase alcalina ou peptídeo sinalízador de enterotoxina, em presença de um indutor de expressão, isopropiltio-P-D-galactosideo (IPTG), e secretando hGH dentro do periplasma. Contudo, o processo fornece um rendimento de hGH baixo e requer o uso do indutor de expressão caro, IPTG.
Consequentemente, existe a necessidade de desenvolver-se um processo mais eficaz para produção de hGH em rendimento alto.
Sumário da Invenção Conseqüentemente, é um objetivo da presente invenção prover um peptídeo sinalizador de enterotoxina II de E.coli que possa ser vantajosamente empregado em um processo de secreção de produção de uma proteína heteróloga para melhorar a eficiência da secreção.
Outro objetivo da presente invenção é prover um gene codificando o peptídeo.
Um objetivo adicional da presente invenção é prover um vetor compreendendo o gene fundido ao gene codificando um proteína heteróloga.
Um objetivo adicional da presente invenção é prover um microorganismo transformado com o vetor.
Um objetivo adicional da presente invenção é prover um processo para produção de uma proteína heteróloga usando o microorganismo.
De acordo com um aspecto da invenção, é provido um peptídeo sinalizador de enterotoxina II E.coli modificado (designado MST) caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos segundo, quarto, quinto, décimo segundo, vigésimo e vigésimo segundo aminoácidos de peptídeo sinalizador de enterotoxina II de E.coli da seguinte seqüência de aminoácido (SEQ ID NO: 1) é substituído por outro aminoácido, contanto que, pelo menos um dos segundo e quarto aminoácidos do peptídeo modificado seja lisina: Met Lys Lys Asn Ile Ala Phe Leu Leu Ala Ser Met Phe Vai Phe 5 10 15 Ser Ile Ala Thr Asn Ala Tyr Ala 20 Breve Descrição dos Desenhos Os objetivos e aspectos acima da presente invenção ficarão claros a partir da descrição que se segue das concretizações preferidas, tomada em conjunto com os desenhos anexos, nos quais: A figura 1 mostra o procedimento para construção de um vetor pT-hGH; A figura 2 mostra o procedimento para construção dos vetores pUCl9ST e pUC19SH; A figura 3 representa o procedimento para construção do vetor pTl4SSH; A figura 4 mostra o procedimento para construção do vetor pTl4SlSH; e A figura 5 reproduz o resultado da análise SDS-PAGE de hGH purificado.
Descrição Detalhada da Invenção Entre os peptídeos sinalizadores de enterotoxina II de E.coli (MSTs) modificados da presente invenção, são preferidos aqueles onde: o segundo aminoácido Lys não é substituído; o quarto aminoácido Asn é substituído por Sr, Thr, Lys ou Gin; o quinto aminoácido Ile não é substituído ou substituído por Thr ou Ser; o décimo segundo aminoácido Met não é substituído ou substituído por Ala, Gly, Vai, Leu ou Ile; o vigésimo aminoácido Asn não é substituído ou substituído por Ile, Phe, Ala ou Vai; e o vigésimo segundo aminoácido Tyr não é substituído ou substituído por Gin, Asn, Ala ou Lys.
Também preferidos são aqueles onde o segundo aminoácido Lys é substituído por qualquer outro aminoácido; o quarto aminoácido Asn é substituído por Lys; o quinto aminoácido Ile é substituído por Ser, Thr, Asn, Gin ou Arg; o décimo segundo aminoácido Met não é substituído ou é substituído por Ala, Gly, Vai, Leu ou Ile; o vigésimo aminoácido Asn não é substituído ou é substituído por lie, Phe, Ala ou Vai; e o vigésimo segundo aminoácido Tyr não é substituído ou substituído por Gin, Asn, Ala ou Lys. MSTs mais preferidos são aqueles possuindo um dos seguintes conjuntos de substituição de aminoácido: (a) o quarto Asn por Thr e o vigésimo segundo Tyr por Gin; (b) o quarto Asn por Thr, o vigésimo Asn por Vai e o vigésimo segundo Tyr por Gin; (c) o quarto Asn por Lys, o quinto Ile por Thr e o vigésimo segundo Tyr por Gin; (d) o quarto Asn por Ser e o vigésimo segundo Tyr por Gin; (e) o quarto Asn por Ser, o vigésimo Asn por Vai e o vigésimo segundo Tyr por Gin; (f) o quarto Asn por Thr, o décimo segundo Met por Gly, o vigésimo Asn por Vai e o vigésimo segundo Tyr por Gin; (g) o quarto Asn por Thr, o décimo segundo Met por Leu, o vigésimo Asn por Vai e o vigésimo segundo Tyr por Gin; (h) o quarto Asn por Lys, o quinto Ile por Ser e o vigésimo segundo Tyr por Gin; (i) o segundo Lys por Vai, o quarto Asn por Lys, o quinto Ile por Thr e o vigésimo segundo Tyr por Gin; e (j) o quarto Asn por Lys, o vigésimo Asn por Vai e o vigésimo segundo Tyr por Gin. O MST da presente invenção pode ser codificado por um gene compreendendo uma seqüência de nucleotideo deduzida da seqüência de aminoácido de MST de acordo com o código genético. Sabe-se que vários códons diferentes codificando um mesmo aminoácido podem existir devido à degeneração do códon e, portanto, o MST da presente invenção inclui todas as se-qüências de nucleotideo deduzidas da seqüência de aminoácido de MST. Preferivelmente, o gene de MST pode incluir um ou mais códons preferidos de E.coli. O gene MST pode ser preparado por mutação de um ou mais nucleotídeos do gene de peptídeo sinalizador de entero-toxina II de E.coli nativo (designado gene STII) usando uma mutagenese dirigida ao sítio (Papworth, C. e outros, Strate-gies, 9_, 3 (1996)) . O gene de STII de E.coli pode ser obtido por utilização de um processo convencional (Sambrook e outros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA (1989)). Adicionalmente, o gene MST pode também ser sintetizado quimica-mente. O MST da presente invenção, quando fundido à proteína heteróloga, realiza uma secreção altamente eficaz da proteína heteróloga através da membrana citoplásmica de um microorganismo, por exemplo, E.coli. Consequentemente, usando um vetor de expressão compreendendo um gene MST fundido a um gene codificando uma proteína heteróloga, uma proteína de fusão de MST e proteína heteróloga (designada proteína MST/heteróloga) pode ser vantajosamente expressa no cito-plasma de E.coli, a proteína de fusão sendo eficazmente pro- cessada para remover a porção MST para liberar a proteína heteróloga rapidamente dentro do periplasma de E.coli. Assim, o uso do MST da invenção leva a uma razão muito melhorada de produção de proteína heteróloga. A fusão do gene MST ao gene codificando uma proteína heteróloga pode ser conduzida de acordo com um processo de ligação convencional {Sambrook e outross, vide supra).
Proteínas heterólogas representativas incluem hormônio do crescimento humano (hGH), fator de estimulação de colônia de granulócito (G-CSF), interferon, interleucina, prouroquinase, insulina, fator VIII, hirudina, dismutase de superóxido e calcitonina, porém estes não limitam as proteínas heterólogas que podem ser usadas na presente invenção. Um gene codificando uma proteína heteróloga pode ser obtido por um processo convencional, por exemplo, classificação de coletânea de cDNA e PCR. 0 vetor de expressão da presente invenção pode compreender, adicionalmente, uma seqüência Shine-Delgado de enterotoxina II de E.coli modificada (Seqüência STII SD modificada) da seguinte seqüência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 2) inserida imediatamente antes do códon de iniciação do gene MST: 5'-GAGGTGTTTT-3' A seqüência STII SD modificada é composta de uma seqüência STII SD longa de 4 nucleotídeos (GAGG) e uma seqüência rica em T longa de 6 nucleotídeos. A seqüência STII SD da seqüência STII SD modificada provê um sítio de ligação de ribossoma muito forte, que melhora o nível de expressão na ausência de um indutor de expressão, por exemplo, isopropiltio-p-D-galactosídeo (IPTG). A sequência rica em T da seqüência STII SD modificada desempenha um papel importante na prevenção da formação de estruturas secundárias de mRNA transcritas da mesma, pelo que, melhorando a eficiência da expressão· A seqüência de STII SD modificada pode ser preparada por processos convencionais (Sambrook e outros, vide supra), por exemplo, processo sintético químico. Adicionalmente, o gene SDII SD possuindo a seguinte seqüência de nucleotideo {SEQ ID NO: 3) pode ser submetida a uma mutagenese dirigida ao sítio para obter a seqüência STII SD modificada: 5'-GCTCTAGAGGTTGAGGTGTTTTATGAAAAAGAATA-3' (SEQ ID NO: 3) A seqüência STII SD modificada pode ser inserida na frente do códon de iniciação ATG de um gene MST ou a seqüência STII SD precedendo o códon ATG de um gene MST pode ser modificada.
Vetores de expressão exemplares da presente invenção incluem pT14SlSH-4T22Q, OT14S1SH-4T20V22Q, pT14SlSH-4K5T22Q, pTl4S1SH-4S22Q, pT14SlH-4S20V22Q, pT14SlSH-4T12G20V22Q, PT14S1SH-4T12L20V22Q, pT14SSH-4K5S220Q, pT14SSK-2V4K5t22Q e Ptl4SSh-4K20V22Q que são preparados nos Exemplos 1 a 10 e os vetores preferidos são pT14SlSH-4T22Q e pT14SlSH~4T20V22Q.
Os vetores de expressão da presente invenção podem ser introduzidos no microorganismo, por exemplo, E.coli, de acordo com um processo de transformação convencional (Sambrook e outros, acima). Entre os microorganismos transformados, são preferidos os transformantes E.coli HM10011 e ΗΜ10012 que foram depositados no Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM) (Endereço: Department of Food Engineering, College of Eng., Yonsei University, Sodaemungu, Seoul 120-749, República da Coréia) em 12 de agosto de 1998 sob os números de acesso KCCM-10137 e KCCM-10138, respectivamente, de acordo com os termos do Budapest Treaty on International Recognition of the Deposit of Microorganism para o Purpose of Patent Procedure.
Uma proteína heterõloga pode ser produzida por cultivo de microoganismo transformante para expressar o gene que codifica a proteína de fusão MST/heteróloga e secretar uma proteína heterõloga para o periplasma e recuperar a proteína heterõloga do periplasma. O microorganismo transformante pode ser cultivado de acordo com um processo convencional (Sambrook e outros, acima). A cultura de microorganismo pode ser centrifuga ou filtrada para coletar microorganismo secretando uma proteína heterõloga. O microorganismo transformado pode ser rompido de acordo com um processo convencional (Ausubel, F.M. e outros, Current Protocols in Molecular Biology (1989)) para obter uma solução periplãsmica. Por exemplo, o microorganismo pode ser rompido em uma solução hipotônica, por exemplo, água destilada, por um choque osmótico. A recuperação da proteína heterõloga na solução periplãsmica pode ser conduzida por um processo convencional (Sambrook e outros, acima), por exemplo, cromatografia de troca de íon, cromatografia de coluna de filtração de gel ou cromatografia de coluna imune. Por exemplo, hGH pode ser purificada por condução sequencial de cromatografia de coluna de DEAE- Separose, cromatografia de coluna de Fenil Separose e cromatografia de coluna Sephadex G-100. A proteína heteróloga produzida de acordo cona a presente invenção é de uma forma natural, não metionilada no terminal ΚΓ e, portanto, pode ser usada como esta em várias aplicações.
Os exemplos que se seguem são destinados a ilustrar, adicionalmente, a presente invenção sem limitar seu escopo.
Exemplo de Preparação 1: Classificação do Gene de cDNA de Hormônio do Crescimento Humano (Etapa 1) Construção da biblioteca de cDNA da pituitária humana A 1 g da pituitária humana foram adicionados 10 ml de solução de guanidina (isocianato de guanidina 4M, 50 mM de Tris- HC1, pH 7,5, 10 mM de EDTA e 5% de 2 -mercaptoetanol) e homogeneizada. O homogenizado foi centrifugado a 10.000 rpm por 10 minutos a 6°C. Ao sobrenadante foi adicionado um volume de 1/10 do Éter Sarkosil a 2% (Sigma, USA) e a mistura foi mantida a 65 °C por 2 minutos. Cloreto de césio foi adicionado à solução resultante a uma concentração de 0,1 g/ml e a mistura foi centrifugada a 25.000 rpm por 16 horas sobre 9 ml de uma solução de enchimento (5,7 M CsCl e 0,1 mM EDTA) para obter precipitado de RNA. O precipitado foi dissolvido em 3 ml de solução de supensão (5 mM EDTA, 0,5% Sarkosil, e 5% mercaptoetanol), e então extraída seqüencialmente com uma mistura de fenol/clorofórmico/ãlcool isoamílico (25:24:1, v/v/v) e mistura de clorofórmio/ãlcool isoamílico (24:1, v/v) .
Aos extratos combinados foram adicionados volume 1/10 de acetato de sódio 3M e um volume 2,5 de etanol e a mistura foi centrifugada usando processo convencional (Sambrook e outros, supra) para obter precipitado de RNA. O precipitado de RNA foi dissolvido em água destilada (D.W.) e mantido a 702C por 10 minutos. Cloreto de lítio foi adicionado ao mesmo a uma concentração de 0,5 M e então submetido a cromato-grafia de oligo-dT-celulose (Tipo 3, Collaboratory Research, USA) para isolar poli (A)+ RNA de acordo com o processo de Aviv e Leder (Avivi, H e Leder P. , J. Mol. Biol. , 134, 743 (1972)). O poli (A)+ RNA assim obtido foi tratado a 652C por 5 minutos, resfriado a 02C e adicionados imediatamente ao mesmo 2 0 μΐ de 5mM dNTPs, 40 μΐ de solução de tampão 5X (0,25 M Tris-HCl, pH 8,3, 0,5 M KC1 e 50 mM MgCl2) , 10 μΐ de 200 mM DTT, 20 μΐ de 0,5 mg/ml oligo (dTi2_is) {Pharmacia Inc. , Suécia), 80 μΐ de água destilada, 10 μΐ (10 unidades) de RNAsin (Promega, USA) e 20 μΐ (20 unidades) de transcrip-tase inversa AMV (Life Science Inc. USA). Após deixar a mistura reagir a 422C por 90 minutos, 5 μΐ de 0,5 M EDTA (pH 8,0) e 200 μΐ de fenol tamponado tris foram adicionados a mistura de reação, misturados e centrifugados a 10.000 rpm por 10 minutos a temperatura ambiente. O sobrenadante foi extraído duas vezes com éter dietílico e os extratos combinados foram misturados com 20 μΐ de 3M acetato de sódio e 1 ml de etanol a 95% para precipitar cDNA de filamento simples precipitado (ss cDNA).
Para sintetizar o cDNA de filamento duplo (ds cDNA) do ss cDNA, o precipitado de sscDNA foi dissolvido em 284 μΐ de água destilada, e foram adicionados ao mesmo 40 μΐ de 5 mM NTPs, 80 μΐ de solução de tampão de segundo filamento (SS) 5X (250 mM Tris-HCl (pH 7,2), 450 mM de KCl, 15 mM de ditiotreitol, 15 mM de MgCl2 e 0,25 mg/ml de albumina de soro bovino), 12 μΐ de 5 mM β-ΝΑ0+, 2 μΐ de 3000Ci/mmol [a-32P]dCTP, 4 μΐ (4 unidades) de ligase de DMA E.coli e 10 μΐ (100 unidades) de polimerase I de DNA de E.coli. Após a mistura ser reagida a 14aC por 16 horas, a mistura de reação foi submetida a extração de fenol e precipitação de etanol conforme estabelecido acima, para obter precipitado de ds cDNA.
Para obtenção de uma extremidade cega de ds cDNA, o precipitado de cDNA foi dissolvido em 42 μΐ de água destilada e foram adicionados ao mesmo 5 μΐ de dNTPs, 16 μΐ de solução de tampão 5 X SS, 1 μΐ de 5 mM β-ΝΑϋ+, 4 μΐ de RNAa-se A (2 ug/ml, Biolabs, USA), 4 μΐ (4 unidades) de Rnase H, 2 μΐ (20 unidades) de ligase de DNA E.coli e 4 μΐ (8 unidades) de polimerase de DNA T4, seguido por reação da mistura a 37 aC por 45 minutos. Após o término da reação, a mistura de reação foi submetida a extração de fenol e precipitação de etanol foi ajustada para obter precipitado de ds cDNA de extremidade cega.
Para proteger o sítio de restrição de EcoRI do ds cDNA por metilação, o precipitado de ds cDNA de extremidade cega foi dissolvido em 25 μΐ de água destilada e foram adicionados ao mesmo 27 μΐ de tampão 2 X metilase (100 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl, pH 8,0, e 1 mM de EDTA), 1 μΐ de solução 50 X SAM (1 mg de S-adenosilmetionina em 0,14 ml de acetato de sódio (pE 5,2)) e 10 μΐ (10 unidades) de metilase de EcoRI (Biolabs, USA). Após deixar a mistura reagir a 37°C por duas horas, a mistura de reação foi submetida a extração de fenol e precipitação de etanol conforme descrito acima. O CDNA precipitado foi combinado com ligante EcoRI (Biolabs, USA) e a mistura foi reagida a 4°C por 16 horas, para obter uma cDNA ligado em ligante EcoRI. O cDNA ligado ao ligante EcoRI foi tratado com EcoRI e submetido â cromatografia de coluna CL-4B Sepharose para remover os ligantes residuais. CDNA ligado em ligante EcoRI foi inserido no sitio EcoRI de Àgtll (Amersham, USA), ÃGTll assim obtido foi submetido ao empacotamento in vifcro usando kit de empacotamente in vitro λ (Amershm Co., USA) E.coli Y1088 (ATCC37195) foi transferido com o mesmo para obter uma biblioteca de Cdna de pituitaria humana. (Etapa 2) Classificação do gene de cDNA de hormônio do crescimento humano.
Para classificar os clones de hormônio do crescimento humano da biblioteca de cDNA preparada na Etapa 1, a hibridização foi conduzida como se segue.
Com base na sequência de aminoãcido reportada para o terminal N do hormônio do crescimento humano (Liu, W.K. e outros, Biochem. Biophys. Acat., 93, 428 (1964); Li, C.H. e outros, J. Amer. Chem. Soc. , 88, 2050 (1966)), 30 fragmentos de nucleotídeo da sonda de oligonucleotideo de seqüência mista representados pela seguinte seqüência de nucleotídeo foram designados e sintetizados: Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg (SEQ ID NO: 4) 5'-TTCCCAACCATTCCCTTATCCAGG-31 (SEQ ID NO: 5) A hibridização da placa primária foi conduzida usando uma sonda de oligonucleotídeo de sequência mista, de acordo com o processo de Benton e outros (Benton, W.E. e outros, Science, 196, 180 (1977)) para obter clones positivos.
Estes clones foram submetidos a hibridizações de placa secundária e terciária para obter um clone possuindo gene cDNA de hormônio do crescimento humano.
Para confirmar que o clone possui o gene do hormônio do crescimento humano, DNA de fago clonado foi clivado com EcoRI e então os fragmentos de DNA foram submetidos ao Manchamento Southern (Southern, E., J. Mol. Biol., 98, 503 (1975)) usando a sonda de oligonucleotídeo de seqüência mista. Adicionalmente, um fragmento de EcoRI de 0,65 kb contendo gene de hormônio do crescimento humano foi inserido no sítio de EcoRI do vetor Ml3mpl8 (Pharmacia, USA) para obter o vetor Ml3-hGH. A seqüência de nucleotídeo do gene de hormônio do crescimento humano do vetor M13-hgH foi determinada usando o processo de terminação de cadeia mediado por dideó-xi {Sanger, F. e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 74, 54- 63-5467 (1977)) .
Exemplo de Preparação 2: Preparação do Hormônio de Crescimento Humano Maduro Codificando o Gene A
Para preparar um hormônio de crescimento humano maduro codificando o gene cDNA, o vetor Ml3-hGH obtido na Etapa 2 do Exemplo de Precipitação 1 foi submetido a PCR usando os primers que se seguem SI e ASl. 0 primer de sentido Sl foi designado para prover um sítio de restrição Ndel (5'-CATATG-31) a montante do códon para o primeiro aminoáci-do (fenilalanina) do hormônio de crescimento humano maduro e o primer de sentido contrário AS1, para prover um sítio de restrição BamHI (5'-GGATCC-3') a jusante do códon de terminação do mesmo. primer de sentido Sl (SEQ ID NO: 6): 5’-CCGCATATGTTCCCAACCATTCCC-3' primer de sentido contrário AS1 (SEQ ID NO: 7): 5'-GCTGGATCCTAGAAGCCACAGCTGC-3' O gene do hormônio do crescimento humano ampliado foi clivado com Ndel e BamHI para obter um hormônio do crescimento humano maduro codificando o gene (designado gene hGH) . O gene hGH foi inserido na seção Ndel/BamHI do vetor pETl4b(Movagen, USA) para obter o vetor pT-hGH. A figura 1 mostra o procedimento acima para construção do vetor pT-hGH.
Exemplo de Preparação 3: Construção do vetor con- tendo um gene codificando proteína de fusão hGH/peptídeo si-nalizador de enterotoxina II de E. coli (Etapa 1) Clonagem do gene de peptídeo sinalizador de enterotoxina II de E.coli Para preparar o gene de peptídeo sinalizador de enterotoxina II de E.coli, o par que se segue de oligonucle-otídeos complementares foi designado com base na seqüência de nucleotídeo do peptídeo sinalizador de enterotoxina II de E.coli e sintetizado usando sintetizador de DNA (Modelo 380B, Applied Biosystem, USA).
Oligonucleotídeo stii SI de fita de sentido (SEQ ID NO: 8) 5' TCATGAAAAAGAATATCGCATTTCTTCTTGCATCTATGTTCGTTTTTTCTATT GCTACAAATGCCTACGCGT-3' oligonucleotídeo STII AS1 de fita de anti-sentido {SEQ ID NO: 9) 5' ACGCGTAGGCATTTGTAGCAATAGAAAAAACGAACATAGATGCAAGAAGAAAT GCGATATTCTTTTTCATGA-3' Os oligonucleotídeos foram designados para possuir sítios de restrição Ncol e BspHI a montante do códon de iniciação da enterotoxina II de E.coli e um sítio de restrição MluI introduzido por uma alteração silenciosa na outra extremidade.
Ambos os oligonucleotídeos foram temperados a 95°C para obter fragmentos de ds DNA de terminação cega possuindo uma seqüência de nucleotídeo codificando o peptídeo sinalizador de enterotoxina II de E.coli (gene STII). 0 gene STII foi inserido no sítio Smal do vetor puC19 (Biolabs, USA) para obter o vetor pUC19ST.
(Etapa 2) Preparação de um gene codificando a proteína de fusão STII/hGH
Para preparar um gene de codificação de proteína de fusão STII/hGH, o vetor pT-hGH obtido no Exemplo de Preparação 2 foi submetido a PCR usando os primers S2 E AS1 usados no Exemplo de Preparação 2. O primer de sentido S2 foi projetado para prover um sítio de restrição MluI (5'-CARATG-3') a montante do códon para o primeiro aminoãcido (fenilalanina) do hormônio de crescimento humano maduro. primer de sentido S2 (SEQ ID NO: 10) 5'-GCGACGCGTTCCCAACCATTCCCTTATCC-3' Os fragmentos de DNA ampliados foram clivados com MluI e BamHI e então inseridos na seção MluI/BamHI do pUC19ST obtido na Etapa 2. O vetor Pucl9SH assim obtido continha um gene codificando uma proteína de fusão STII/hGH (designada gene STII-hGH). A figura 2 ilustra o procedimento acima para construção dos vetores pUC19ST e pUC19SH.
(Etapa 3) Adição da sequência Shine-Delgarno da enterotoxina II de E.coli ao gene STII-hGH O vetor pUCISSH obtido na Etapa 2 foi clivado com BspHl e BamHI para obter um fragmento STII-hgH de 640 pares de base, que foi inserido em uma seção Ncoil/BamHI do vetor pET14b (Novagem, USA) para obter o vetor pT14SH. O vetor pT14SH foi submetido a PCR usando primers S3 e AS3 . 0 primer de sentido S3 foi projetado para prover uma sequência Shine-Dalgano de enterotoxina II de E.coli (designada seqüência STII SD) e um sítio de restrição Xbal e o primer de sentido contrário AS3, para proverem um sítio de restrição BamHI a jusante do códon de terminação de hGH maduro para obter um fragmento de DNA (STII SD-hGH) contendo um gene de fusão STII SD e STII-hGH. primer de sentido S3 (SEQ ID NO: 11) 5'-GCTCTAGAFFTTGAGGTGATTTTATGAAAAAGAATA-3' primer de anti-sentido AS3 (SEQ ID No: 12} 5'-GGATGCCACGCTGGATCCTAGAAAGCCACAGCTG-3' 0 fragmento STII SD-STII-hGH foi clivado com Xbal e BamHI e então inserido na seção Xbal/BamHl do vetor pETl4b (Movagen, USA) para obter o vetor pTl4SSH. E.coli BL21 (DE3) (Stratagene, USA) foi transformado com o vetor pTl4SSH para obter um transformante designado E.coli HM10010. A figura 3 representa o procedimento acima para o vetor de construção pTl4SSH, Exemplo de Preparação 4: Produção de hGH usando o gene STII-hGH
Para examinar o efeito da sequência SD de entero-toxina II de E.coli na produção de hGH, E.coli BL21 (DE3) transformado com o vetor pTl4SH obtido na Etapa 3 do Exemplo de Preparação 3 e E.coli HM10010 obtido também na Etapa 3 do Exemplo de Preparação 3 foram cultivados em presença e ausência de um indutor de expressão (IPTG), respectivamente, no meio LB {1% bacto-triptona, 0,5% de extrato de bacto- levedura e 1% de NaCl) a 3 7-C por 2 4 horas. Cada uma das culturas foi centrifugada a 10.000 rpm por 10 minutos para precipitar a célula bacteriana e o precipitado foi suspenso em um volume 1/10 de solução isotônica (20% de sacarose, 10 mM de solução de tampão Tris-Cl contendo 1 iriM de EDTA, pH 7,0). A suspensão foi deixada descansar em temperatura ambiente por 30 minutos e então centrifugada a 10.000 rpm por 15 minutos para coletar células bacterianas. As células foram ressuspensas em água destilada a 42C e centrifugadas a 12.000 rpm por 20 minutos para obter um sobrenadante como uma solução periplásmica. O nível de hGH na solução peri-plásmica foi analisado de acordo com o processo ELISA (Kato, K. e outros, J. Imuno1, 116, 1554 (1976)) usando um anticorpo contra hGH (Boehringer Mannheim), que foi calculado como a quantidade de hGH produzida por 1 litro de cultura. Os resultados são mostrados na Tabela I. _______________________TABELA I____________________________ Exemplos 1 a 10 Exemplos 1 a 10 descrevem a construção de vetores, cada um contendo um gene codificando uma proteína de fusão MST/hGH de acordo com a presente invenção, onde MST representa o peptídeo sinalizador de enterotoxina II de E.coli modificado. 0 gene STII ou seqüência STII SD de plasmideo PT14SSH obtido na Etapa 3 do Exemplo de Preparação 3 foi modificado de acordo com a mutagnese direcionada ao sítio (Pa-pworth, C. e outros, Strategies, 9, 3 (1996)) que foi conduzida por PCR do plasmideo com um primer de sentido possuindo uma seqüência de nucleotídeo modificada e um primer de sentido contrário possuindo uma seqüência de nucleotídeo complementar ao primer de sentido.
Os peptídeos sinalizadores de enterotoxina II de E.coli obtidos nos Exemplos 1 a 10, MSTs (MST1 a ΜΞΤ10) são caracterizados na Tabela II em conjunto com STII, e o procedimento preparativo dos Exemplos 1 a 10 é descrito a seguir. __________________________Tabela II __________________________ Exemplo MST 22 4a 5a 12a 20a 22a Exemplo 1: Construção do Vetor Contendo um Gene Codificando Proteína de Fusão MSTl/hGH (Etapa 1) 0 vetor pT14SSH obtido na Etapa 3 do Exemplo de Preparação 3 foi submetido a PCR usando os seguintes primers complementares S4 le AS4 que foram projetados para substituir o códon Thr (ACA) para o quarto códon (AAT) de STII. primer de sentido S4 (SEQ ID NO: 23): 5'-GGTGTTTTATGAAAAAGACAATCGCATTTCTTC-3' primer de sentido contrário AS4 (SEQ ID NO:24}: 5'-GAAGAAATGCGATTGTCTTTTTCATAAAACACC-3' 0 vetor assim obtido foi clivado com Xbal e MluI para obter um fragmento de 0,1 kb de Xbal/Mlul, que foi inserido na seção Xbai/Mlul do vetor pT14SSH para obter o vetor pT14SSH-4T. 0 vetor pT14SSH-4T contém um gene codificando uma proteína de fusão STII/hGH modificada possuindo Thr no lugar do quarto aminoácido de STII. (Etapa 2) 0 vetor pTl4SSH-4T foi submetido a PCR utilizando os primers complementares que se seguem S5 e AS5 que foram projetados para substituir códon Gin (CAA) para o vigésimo segundo códon (TAT) de STII, para obter o valor pT14SSH-4T22Q. primer de sentido S5 (SEQ ID NO: 25): 5'-CAAATGCCCAAGCGTTCCCA-3' primer de sentido contrário AS5(SEQ ID NO: 26): 5'-TGGGAACGCTTGGGCATTTG-3' 0 vetor pT14SSH-4T22Q continha um gene codificando Proteína MSTl/Hgh de fusão onde o quarto e vigésimo segundo aminoácidos de STII foram substituídos por Thr e Gin, respectivamente. (Etapa 3) O vetor pT14SSH-4T22Q foi submetido a PCR empregando os primers complementares que se seguem S6 e AS6 possuindo as seis seqüências de nucleotídeo mostradas abaixo entre a sequência STII SD 5f-GAGG-3' e o códon de iniciação de STII a fim de prevenir a formação de estruturas secundárias de mRNA transcritas das mesmas.
Primer de sentido S6{SEQ ID NO· 27): 5'-TCTAGAGGTTGAGGTGTTTTATGA-3' primer de anti-sentido AS6(SEQ ID NO: 28); 5'-TCATAAAACACCTCAACCTCTAGA-3' O vetor pT14SlSH-4T22Q assim obtido continha a seqüência modificada STII SD e um gene codificando a proteína MSTl/Hgh de fusão onde o quarto e vigésimo segundo aminoãcidos de STII foram substituídos por Thr e Gin, respectivamente. A figura 4 mostra o procedimento acima para o vetor de construção pT14S!SH. E.coli BL21 (DE3) foi transformado com o vetor pT14SlSH4T22Q para obter um transformante denominado E. coli HM10011, que foi depositado no Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM) em 12 de agosto 1998 sob o número de acesso KCCM-10137.
Exemplo 2: Construção do Vetor Contendo um Gene Codificando Proteína de Fusão MST2/hGH O procedimento da etapa 2 do Exemplo 1 foi repetido exceto pelo emprego dos primers complementares que se seguem S7 e AS7 que foram projetados para substituir cõdons Vai e Gin (GTT e CAA) para o vigésimo e vigésimo segundo cõdons (AAT e TAT) de STII, respectivamente, para obter o vetor pT14SSH-4T2Q. primer de sentido S7(SEQ ID NO: 29): 5'-GTTTTTTCTATTGCTACAGTTGCCCAAGCGTTCCCAACCATTCCC-3' primer de anti-sentido AS7(SEQ ID NO: 30): 5'-GGGAATGGTTGGGAACGCTTGGGCAACTGTAGCAATAGAAAAAAC-3' Então, o procedimento da etapa 3 do Exemplo 1 foi repetido exceto pelo emprego do vetor pT14SSH-4T20V22Q, para obter o vetor pT14SISH-4T20V22Q. O vetor pT14SlSH-4V20V22Q continha uma següência modificada STIl SD e um gene codificante proteína de fusão MST3/hGH onde o quarto, vigésimo e vigésimo segundo aminoâcidos de STIl foram substituídos por Thy, Vai e Gin, respectivamente. E.Coli BL21 (DE3) foi transformado com o vetor pT14SlSH4T2 0V22Q para obter um transformante denominado E.coli HM10012, que foi depositado no KCCM em 12 de agosto de 1998 sob o número de acesso KCCM-10138.
Exemplo 3 : Construção do Vetor Contendo um Gene Codificando Proteína de Fusão MST3/hGH O procedimento da etapa 1 do Exemplo 1 foi repetido exceto pelo emprego dos primers complementares que se seguem S8 e AS8, que foram projetados para substituir cõdons Lys e Thr codons (AAG e ACA) para o quarto e quinto cõdons (AAT e ATC) de STIl, respectivamente, para obter o vetor pT14SSH-4K5T. primer de sentido S8(SEQ ID NO: 31): 5'-GAGGTGTTTTATGAAAAAGAAGACAGCATTTCTTC-3' primer anti-sentido AS8(SEQ ID NO: 32): 5'-GAAGAAATGCTGTCTTCTTTTTCATAAAACACCTC-3' Utilizando o vetor pT14SSH-4kst, o procedimento da etapa 2 do Exemplo 1 foi repetido para obter o vetor pT14SSH4K5T22Q.
Então, o procedimento da etapa 3 do Exemplo 1 foi repetido utilizando o vetor pT14SSH-4K5T22Q, para obter o vetor pT14SlSH4KST22Q. O vetor pT14SlSH-4K5T22Q continha a sequência modificada STII SD e um gene codificando a proteína de fusão MST3/Hgh onde o quarto, quinto e vigésimo segundo do aminoãcidos de STII foram substituídos por Lys, Thr e Gin, respectivamente. E. c oli BL21 (DE3) foi transformado com o vetor pT4SlfíH4K5T22Q para obter um transformante denominado E. coli HM10013.
Exemplo 4: Construção do Vetor Contendo um Gene Codificando a Proteína de Fusão MST4/hGH O procedimento da etapa 1 do Exemplo 1 foi repetido exceto pelo emprego dos primers complementares que se seguem 59 e AS9 que foram projetados para substituir o códon Ser (TCT) para o quarto códon (AAT) de STII, para obter o vetor pT14SSH-4S, o procedimento da etapa 2 do Exemplo 1 foi repetido para obter o vetor pT14SSH-4S22Q. primers de sentido S9(SEQ ID NO: 33) 5'-GAGGTGTTTTATGAAAAAGRCTATCGCATTTCTTC-3' primers de anti-sentido AS9(SEQ ID NO: 34) 5’-GAAGAAATGCGATAGACTTTTTCATAAAACACCTC-3' Utilizando o vetor pT14SSH-4S, o procedimento da etapa 2 do Exemplo 1 foi repetido para obter o vetor pT14SSH-4S22Q.
Então, o procedimento da etapa 3 do Exemplo 1 foi repetido utilizando o vetor pT14SSH-4S22Q, para obter o vetor PT14S1SH-4S22Q. 0 vetor pT14SlSH-4S22Q continha a sequência modificada STII SD e um gene codificando a proteína de fusão MST4/hGH, onde o quarto e vigésimo segundo aminoãcidos de STTI foram substituídos por Ser e Gin, respectivamente. E. coli BL21 (DE3) foi transformado com o vetor pT14SlSH4S22Q para obter um transformance denominado E. coli HM10014.
Exemplo 5: Construção do Vetor Contendo um Gene Codificando a Proteína de Fusão MST5/hGH O procedimento da etapa 2 do Exemplo 1 foi repetido exceto pelo emprego do vetor pT14SSH-4S obtido no Exemplo 4 e os primers S7 e AS7 como usados no Exemplo 2, para obter o vetor pT14SSH-4S20V22Q.
Então, o procedimento da etapa 3 do exemplo 1 foi repetido utilizando o vetor pT14SSH-4S20V22Q, para obter o vetor pT14SlSH-4S20V22Q. O vetor pT14SlSH-4S20V22Q continha a seqüência modificada STII SD e um gene codificando a proteína de fusão MST5/Hgh onde o quarto, vigésimo e vigésimo segundo aminoãcidos de STII foram substituídos por Ser, Vai e Gin, respectivamente. E. coli BL21 (DE3) foi transformado com o vetor pT14SlSH-4S20V22Q para obter um transformante denominado E. coli HM10015.
Exemplo 6 : Construção do Vetor Contendo um Gene Codificando Proteína de Fusão MST6/hGH 0 vetor pT14SSH-4T20V22Q obtido no Exemplo 2 foi submetido a PCR utilizando os primers complementares que se seguem 510 e AS10 que foram designados para substituir o código Gly (ggt) para o décimo segundo códon (ATG) de STII, para obter o vetor pT14SSH-4T12G20V22Q. primer de sentido S10(SEQ ID NO: 35): 5'-GCATTTCTTCTTGCATCTGGTTTCGTTTTTTCTATTGC-3' primer de anti-sentido AS10{SEQ ID NO: 36): 5'-GCAATAGAAAAAACGAAACCAGATGCAAGAAGAAATGC-3' Então, o procedimento da etapa 3 do Exemplo 1 foi repetido utilizando o vetor pT14SSH-4T12G20V22Q, para obter o vetor pT14SlSH-4T12G20V22Q. O vetor pT14SlSH-4T12G20V22Q continha uma sequência modificada STII SD e um gene codificando a proteína de fusão MST6/hGH, onde o quarto, décimo segundo, vigésimo e vigésimo segundo aminoãcidos de STII foram substituídos por Thr, Gly, Vai e Gin, respectivamente. E. coli BL21 (DE 3) foi transformado com o vetor pT14SlSH-4T12G20V22Q para obter um transformante denominado E. coli HM10016.
Exemplo 7: Construção do Vetor Contendo um Gene Codificando a Proteína de Fusão MST7/Hgh O vetor pT14SSH-4T12G20V22Q obtido no Exemplo 6 foi submetido a PCR utilizando os primers complementares que se seguem 511 e AS 11 que foram designados para substituir o códon Leu (CTT) para o décimo segundo códon (GGT) de MST6, para obter o vetor pT14SSH-4T12L2 0V22Q. primer de sentido Sll(SED ID NO: 37): 5'-GCATTTCTTCTTGCATCTCTTTTCGTTTTTCTATTGC-3' primer de anti-sentido AS11(SEQ ID NO: 38): 5'-GCAATAGAAAAAACGAAAAGAGATGCAAGAAGAAATGC-3' Então, o procedimento da etapa 3 do Exemplo 1 foi repetido utilizando o vetor pT14SSH-4T12L20V22Q, para obter o vetor pT14SlSH“4T12L20V22Q. O vetor pT14SlSH-4T12l20V22Q continha uma seqüência modificada STII SD e um gene codificando a proteína de fusão MST7/hGH, onde o quarto, décimo segundo, vigésimo e vigésimo segundo aminoãcidos de STII foram substituídos por Thr, Leu, Vai e Gin, respectivamente. E. coli BL21 (DE3) foi transformado com o vetor pT14SlSH-4T12L20V22Q para obter um transformante denominado E. coli HM10017.
Exemplo 8 : Construção do Vetor Contendo um Gene Codificando a Proteína de Fusão MST8/hGH O procedimento da etapa 1 do Exemplo 1 foi repetido exceto pelo emprego dos primers complementares que se seguem S12 e AS 12 que foram projetados para substituir os códigos Lys e ser (AAG e TCT) para o quarto e quinto códons (AAT e ATC) de STII, respectivamente, para obter o vetor pT14SSH-4K5S. primers de sentido S12(SEQ ID NO: 39): 5'-GAGGTGTTTTATGAAAAAGAAGTCTGCATTTCTTC-3' primers de anti-sentido AS12(SEQ ID NO: 40): 5'-GAAGAAATGCAGACTTCTTTTTCATAAAACACCTC-3' Utilizando o vetor pT14SSH-4K5S, o procedimento da etapa 2 do Exemplo 1 foi repetido para obter o vetor pT14SSH-4KSS22Q. O vetor pT14SSH-4K5S22Q continha um gene codificando a proteína de fusão MST8/hGH, onde o quarto, quinto e vigésimo segundo aminoãcidos de STII foram substituídos por Lys, Ser e Gin, respectivamente. E. coli BL21(DE3) foi transformado com o vetor pT14SSH-4K5S22Q para obter um transformante denominado E. coli HM10018.
Exemplo 9: Construção do Vetor Contendo um Gene Codificando a Proteína de Fusão MST9/hGH 0 procedimento da Etapa 1 do Exemplo 1 foi repetido, exceto pelo emprego dos primers complementares que se seguem S13 e AS13 que foram projetados para substituir os códons Vai, Lys e Thr códons (GTT, AAG e ACA) para o segundo, quarto e quinto códons (AAA, AAT e ATC) de STII, respectivamente, para obter o vetor pT14SSH-2V4K5T. primer de sentido S13(SEQ ID NO: 41): 5'-GAGGTGTTTTATGGTTAAGAAGACAGCATTTCTTC-3' primers de anti-sentido AS13(SEQ ID NO: 42): 5'-GAAGAAATGCTGTCTTCTTAACCATAAAACACCTC-3 Utilizando o vetor pT14SSH-2V4K5T, o procedimento da etapa 2 do Exemplo 1 foi repetido para obter o vetor pT14SSH-2V4K5T22Q. O vetor pT14SSH-2V4K5T22Q continha um gene codificando a proteína de fusão MST9/hGH, na qual o segundo, quarto, quinto e vigésimo segundo aminoãcidos de STII foram substituídos por Vai, Lys, Thr e Gin, respectivamente. E. coli BL21 (DE3) foi transformado com o vetor pT14SSH-2V4k5T22Q para obter um transformante denominado E. Coli HM10019.
Exemplo 10: Construção do Vetor Contendo um Gene Codificando a Proteína de Fusão MSTIO/hGH O procedimento da etapa 1 do Exemplo 1 foi repetido exceto pelo emprego dos primers complementares que se seguem S14 e AS14 que foram projetados para substituir o códon Lys (AAG) para o quarto códon (AAT) de STII, para obter o vetor pT14SSH-4K.
Primer de sentido S14(SEQ ID NO: 43): 5'-GAGGTGTTTTATGAAAAAGAAGATCGCATTTCTTC-3' primer de sentido contrário AS14(SEQ id no: 44): 5'-GAAGAAATGCGATCTTCTTTTTCATAAAACACCTC-3' Utilizando o vetor pT14SSH-4K, o procedimento da etapa 2 do Exemplo 1 foi repetido para obter o vetor pT14SSH-4K22Q. 0 vetor pT14SSH-4K22Q foi submetido a PCR utilizando os primers S7 e AS7 empregados no Exemplo 2 para obter o vetor pT14SSH-4K20V22Q. O vetor pT14SSH-4K20V22Q continha um gene codificando a proteína de fusão MSTIO/hGH, onde o quarto, vigésimo e vigésimo segundo aminoácidos de STII foram substituídos por Lys, Vai e Gin, respectivamente. E. coli BL21 (DE3) foi transformado com o vetor pT14-9SH4K20V22Q para obter um transf ormante denominado E. coli HM10020.
Exemplo 11: Produção de hGH usando o Gene MST/Hgh Para examinar o efeito de MST na produção de hGH, o procedimento de Preparação do Exemplo 4 foi repetido usando os transformantes (E.coli HM10011 a HM10020) preparados nos Exemplos 1 a 10, na ausência de IPTG adicionado. 0 transformante HM10010 preparado na Etapa 3 do Exemplo de Preparação 3 foi usado como um controle. O nível de hGH foi calculado como a quantidade de hGH produzida por 1 litro de meio de cultura. Os resultados são mostrados na Tabela III.
TABELA III
Conforme pode ser visto da Tabela III, cada um dos vetores da presente invenção contendo um gene MST produz hGH em um rendimento superior ao do vetor de controle pl4SSH contendo STII nativo. Adicionalmente, entre os vetores da presente invenção, aqueles contendo seqüências STII SD modificadas conduzem a um nível alto de hGH, quando comparados aos vetores contendo a sequência STII SD nativa.
Exemplo 12: Purificação de hGH 0 transformante de E.coli HM10011 preparado no Exemplo 1, foi cultivado em meio LB, enquanto a expressão do gene MST/hGH foi induzida usando IPTG, e a cultura foi centrifugada a 6.000 rpm por 20 minutos para colher as células. A solução periplásmica foi preparada das células, repetindo-se o procedimento do Exemplo de Preparação 4. A solução periplãsmica foi ajustada para pH 5,3 a 6,0 adsorvida em coluna DEAE-Separose (Pharmacia Inc., Suécia) pré-equilibrada para pH 5,8 e, então, a coluna foi lavada com solução de 10 mM de NaCl. hGH foi eluído usando soluções tampão contendo 20 mM, 40 mM e 80 mM de NaCl, respectivamente, e frações contendo hGH coletadas e combinadas.
As frações combinadas foram submetidas a cromatografia de coluna de Fenil Separose (Pharmacia Inc., Suécia) para obter hGH possuindo uma pureza de 99%, que foi adicionalmente purificada por cromatografia de coluna Sephadex G-100 (Pharmacia Inc., Suécia), A fração de hGH purificada foi submetida a eletroforese de gel de poliacrilamida dodecilssulfato de sódio (SDS-PAGE) para determinar a pureza e concentração aproximada de hGH, e então submetida ao ELISA para determinar a concentração exata de hGH nesta fração. A figura 5 reporduz o resultado de SDS-PAGE, onde a prancha 1 mostra as proteínas marcadoras de tamanho de proteína e a prancha 2, o hGH purificado. Conforme pode ser visto na figura 5, o alto nível de hGH puro é obtido por cultivo do transformante da presente invenção.
Adicionalmente, a sequência de aminoãcído de terminal N de hGH foi determinada e o resultado mostra que o hGH produzido de acordo com a invenção não é metionilado no terminal N.
Embora a invenção tenha sido descrita com relação âs concretizações específicas acima, deve ser reconhecido que varias modificações e alterações podem ser feitas à in- venção, pelos versados na técnica, as quais encontram-se dentro do escopo da invenção, conforme definido pelas reivindicações apensas.
REIVIMDICAÇÕES

Claims (12)

1. Peptídeo sinalizador de enterotoxina II de E.coli modificado, CARACTERIZADO pelo fato de que pelo menos um dos segundo, quarto, quinto, décimo segundo, vigésimo e vigésimo segundo aminoácidos de peptídeo sinalizador de enterotoxina II de E. coli tendo a sequência de aminoácidos Met Lys Lys Asn lie Ala Phe Leu Leu Ala Ser Met Phe Vai Phe Ser Ile Ala Thr Asn Ala Tyr Ala (SEQ ID: 1) é substituído como segue: o segundo aminoácido. Lys não é substituído ou é substituído por Vai; o quarto aminoácido Asn é substituído por Ser, Thr ou Lys; o quinto aminoácido Ile não é substituído ou é substituído por Thr ou Ser; o décimo segundo aminoácido Met não é substituído ou é substituído por Gly ou Leu; o vigésimo aminoácido Asn não é substituído ou é substituído por Vai; e o vigésimo segundo aminoácido Tyr é substituído por Gin.
2. Peptídeo sinalizador de enterotoxina II de E. coli (SEQ ID: 1) modificado de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que possui um dos conjuntos que se seguem de substituições de aminoácido: (a) o quarto Asn por Thr e o vigésimo segundo Tyr por Gin (SEQ ID: 13); (b) o quarto Asn por Thr, o vigésimo Asn por Vai e o vigésimo segundo Tyr por Gin (SEQ ID: 14); (C) o quarto Asn por Lys, o quinto IIe por Thr e o vigésimo segundo Tyr por Gln (SEQ ID: 15); (d) o quarto Asn por Ser e o vigésimo segundo Tyr por Gln (SEQ ID: 16); (e) o quarto Asn por Ser, o vigésimo Asn por Vai e o vigésimo segundo Tyr por Gln (SEQ ID: 17); (f) o quarto Asn por Thr, o décimo segundo Met por Gly, o vigésimo Asn por Vai e o vigésimo segundo Tyr por Gln (SEQ ID: 18); (g) o quarto Asn por Thr, o décimo segundo Met por Leu, o vigésimo Asn por Vai e o vigésimo segundo Tyr por Gln (SEQ ID: 19); (h) o quarto Asn por Lys, o quinto Ile por Ser e o vigésimo segundo Tyr por Gln (SEQ ID: 20); (i) o segundo Lys por Vai, o quarto Asn por Lys, o quinto Ile por Thr e o vigésimo segundo Tyr por Gln (SEQ ID: 21) ; e (k) o quarto Asn por Lys, o vigésimo Asn por Vai e 0 vigésimo segundo Tyr por Gln (SEQ ID: 22).
3. Gene CARACTERIZADO pelo fato de que codifica o peptideo sinalizador de enterotoxina II de E.coli (SEQ ID: 1) modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, em que os genes estão representados pelas SEQ ID: nos 46 a 55.
4. Vetor de expressão CARACTERIZADO pelo fato de que compreende o gene como definido na reivindicação 3, fundido com um gene codificando uma proteína heteróloga.
5. Vetor de expressão de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína heteróloga é hormônio do crescimento humano.
6. Vetor de expressão de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma sequência de Shine-Dalgano de enterotoxina II de E.coli modificada da seguinte sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO: 2), inserida imediatamente antes do início do códon do gene da reivindicação 3: 5'-GAGGTGTTTT-3'(SEQ ID NO: 2).
7. Microorganismo CARACTERIZADO pelo fato de que é transformado com o vetor de expressão conforme definido em qualquer uma das reivindicações 4 a 6.
8. Microorganismo de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que é um E.coli transformado.
9. Microorganismo de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato de que o E. coli transformado é E.coli HM10011 (KCCM-10137) ou E. coli MH10012 (KCCM-10138).
10. Processo para produção de uma proteína heteróloga no microorganismo, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende o cultivo de microorganismo transformado conforme definido na reivindicação 7, para produzir e secretar a proteína heteróloga para o periplasma; e recuperar a proteína heteróloga do periplasma.
11. Processo de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o microorganismo transformado é E.COli HM10011 (KCCM-10137) ou E.COli MH10012 (KCCM-10138).
12. Processo de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que a proteína heteróloga é hormônio do crescimento humano.
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